CN110702809A - 一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法 - Google Patents
一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中成药质量控制与评价技术领域,该方法以生物效价作为评价指标;具体地,是以抗肝纤维化的生物效价作为复方木鸡颗粒的评价指标。其中,抗肝纤维化的生物效价是指抑制肝星状细胞增殖的生物效价。本发明所述复方木鸡颗粒质量控制与评价方法操作简单,稳定性高,灵敏可靠,可以作为复方木鸡颗粒理化检测的有效补充,可控制其整体质量并综合评价其整体效应,还可用于评价其他抗肝纤维化药品之间活性的强弱。
Description
发明领域
本发明属于中成药质量控制与评价技术领域,特别涉及一种基于抗肝纤维化生物活性测定的中成药质量控制与评价方法,更特别的是,涉及复方木鸡颗粒的生物质量控制与评价方法。
背景技术
相比化学药物而言,中成药成分复杂,其质量标准的现代化与国际化一直是困扰中药发展的核心,而建立建立科学、可靠的质量控制与评价方法是完善的质量标准的关键。现阶段中成药质量的控制与评价以化学成分的定性定量分析为主要手段。随着中药研究的不断深入,这种模式在中成药质量控制和评价体系中逐渐显现出了局限性。以个别或部分指标性成分的含量作为质量标准的一项指标,虽然可以控制指标性成分的含量,但也仅是控制了其中的某一或某些成分的含量,难以保证所有成分的稳定性和临床疗效的一致性,更难以体现中成药的整体生物效应。生物活性测定法作为一种基于生物活性测定的质量分析手段,其有望成为一种真正符合中医药传统理论、体现中成药临床应用特点、保证中成药安全有效的质量控制与评价方法。
复方木鸡颗粒是在“木鸡汤”基础上发展而来的,由云芝,菟丝子,山豆根,核桃楸皮四味中药组成,自1985年问世以来,因其能够特异性地抑制甲胎蛋白(AFP)升高,在临床中广泛应用,主要用于肝炎,肝硬化,肝癌的治疗,其疗效显著;然而,历版的《中国药典》尚未收载复方木鸡颗粒,其仅被收载于《卫生部药品标准》(中药成方制剂第十六册)中,其被收载于《卫生部药品标准》(中药成方制剂第十六册)中,经碱性酒石酸铜试液、三氯化铁试液和碘化汞钾试液进行理化实验鉴别;其被收载于《国家食品药品监督管理局国家药品标准》中,以苦参碱为对照品进行薄层鉴别,以核桃楸皮为对照药材进行薄层鉴别;尚未建立其生物质量控制与评价方法,因此,建立一种基于生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价的方法具有实际意义。
目前生物活性测定法在中成药领域的研究成果鲜见报道;目前对于中药抗肝纤维化药物的生物活性的测定方法,或者基于生物活性测得的抗肝纤维化类中药的质量评价或检测方法尚未见报道。
本发明前期针对中药成方制剂-复方木鸡颗粒申报了“一种治疗肝硬化、肝炎、肝癌的中药及其生产方法”的专利(专利号:CN02144684.9),保护了它的制备工艺,和“一种复方木鸡颗粒质量控制的方法”的专利(专利号:2017100849106),保护了它的有机成分的质量控制方法;在此基础上,本发明构建一种基于生物活性的复方木鸡颗粒的质量控制与评价方法,该方法可控制复方木鸡颗粒抗肝纤维化的整体质量并综合评价其整体效应,并且该方法还可用于评价其他抗肝纤维化药品之间活性的强弱。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足,本发明提供一种基于生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价的方法,其以生物活性作为质量评价指标。该方法体现复方木鸡颗粒抗肝纤维化的整体效应,与临床用药的有效性直接关联,而且还能比较其他抗癌药品之间抗肝纤维化活性强弱。
为实现上述目的,采用的技术方案是:
一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)对照品溶液的制备
取秋水仙素加入DMEM培养液制得秋水仙素含药培养液,稀释后微孔过滤过滤,得对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备
取复方木鸡颗粒加入到乙醇中,超声溶解,经冷却、过滤、挥干溶剂,得浸膏,计算出膏率;去浸膏溶于DMEM完全培养液,微孔过滤,得供试品溶液;
(3)抑制率的测定
取96孔板,调零组、空白组和给药组,调零组给予培养液,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液,进行培养;调零组和空白组给予培养液,给药组给予含药培养液分别培养,每孔加入10%CCK-8溶液避光培养,测定吸光度(OD值),计算抑制率;
(4)数据处理及活性计算
根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,绘制复方木鸡颗粒抗肝纤维化抑制率曲线,计算IC50值,计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差;
(5)活性强弱分级
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣;抗肝纤维化生物活性低于4.417UI/mg为劣,高于4.417UI/mg且低于5.679UI/mg为可,高于5.679UI/mg且低于6.941UI/mg为良,高于6.941UI/mg为优。
进一步的,所述微孔过滤为0.22μm微孔滤膜滤过。
进一步的,所述步骤(3)中,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液每孔细胞计数为7500±250个,培养时间为12h。
进一步的,步骤(4)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差是按照2015年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法或利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算的。
进一步的,所述步骤(5)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级是通过取多批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值6.310UI/mg的110%、90%、70%作为分级线。
进一步的,所述基于生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,其特征在于,具体包括下述步骤:
(1)对照品溶液的制备
取秋水仙素对照品粉末加入DMEM培养液配制成秋水仙素含药培养液,并稀释成含秋水仙素2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml和16μg/ml含药培养液,经0.22μm微孔滤膜滤过,即得对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备
称取复方木鸡颗粒粉末4.00g至100ml锥形瓶中,加入20ml 50%乙醇超声(功率700W,频率40kHz)20min,取出后静置放冷,滤过并挥干,计算出膏率;取适量浸膏溶于DMEM完全培养液,配制成含药培养液,经0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(3)抑制率的测定
取96孔板,调零组给予培养液,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液,每孔细胞计数为7500±250个,培养12h;调零组和空白组给予150μl培养液,给药组每孔给予150μl含药培养液,培养24h;每孔加入10%CCK-8溶液避光培养2.5h,在450nm下测定吸光度(OD值),计算抑制率;
(4)数据处理及活性计算
根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,绘制复方木鸡颗粒抗肝纤维化抑制率曲线,计算对照品和供试品4组IC50值,按照2015年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法或利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差;
(5)活性强弱分级
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣,取15批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值6.310UI/mg的110%、90%、70%作为分级线,即抗肝纤维化生物活性低于4.417UI/mg为劣、高于4.417UI/mg且低于5.679UI/mg为可、高于5.679UI/mg且低于6.941UI/mg为良,高于6.941UI/mg为优。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明除了可对复方木鸡颗粒进行生物活性的质量控制和评价,还可以对具有治疗肝纤维化作用的其他中成药/复方制剂/中药提取物/中药材进行生物活性评价。
(2)本发明测定方法操作简单,稳定性高,灵敏可靠,所选的肝星状细胞直接与复方木鸡颗粒发挥抗肝纤维化药效相关,可有效表征复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性。本发明有效解决了基于生物活性测定复方木鸡颗粒的质量评价,保证复方木鸡颗粒的临床定性定量使用,作为性状鉴别和理化检测的补充和提高,从多角度共同把控其内在质量,完善现行质量管理条例,并为其他中成药质量评价和控制的研究提供思路和技术参考。
(3)本发明通过检测复方木鸡颗粒抗肝纤维化的生物抑制率,发现绘制抑制率曲线的波动较大,不能直观反应治疗肝纤维化的生物效应;在此基础上计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化的生物活性,反应其整体的治疗肝癌活性,量化治疗肝癌的生物效应,医生可针对病情有意识根据活性强度的分级进行临床用药,为药物联合开发或临床上更安全,有效,准确地遣方用药提供依据。
(4)本发明选择的阳性药秋水仙素为抗肝纤维化的标杆药品,待测药物相对于阳性药的相对生物活性即可表达其在该类药品中的活性强度,因此本发明所述质量评价方法还可用于其他药品间抗肝纤维化活性强度比较。
(5)本发明不仅可以用于评价复方木鸡颗粒终产品或其中间体的质量,还可用于其工艺优化的评价指标,对于其生产过程的监控和管理具有重要意义。
附图说明
图1复方木鸡颗粒抑制率曲线图。
图2 15批复方木鸡颗粒生物活性柱状图。
图3 15批复方木鸡颗粒生物活性评级图。
具体实施方式
一种基于生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)对照品溶液的制备
去秋水仙素加入DMEM培养液制得秋水仙素含药培养液,稀释后微孔过滤过滤,得对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备
取复方木鸡颗粒加入到乙醇中,超声溶解,经冷却、过滤、挥干溶剂,得浸膏,计算出膏率;去浸膏溶于DMEM完全培养液,微孔过滤,得供试品溶液;
(3)抑制率的测定
实验分调零组、空白组和给药组,
取96孔板,调零组给予培养液,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液,进行培养;调零组和空白组给予培养液,给药组给予含药培养液分别培养,每孔加入10%CCK-8溶液避光培养,测定吸光度(OD值),计算抑制率;
(4)数据处理及活性计算
根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,绘制复方木鸡颗粒抗肝纤维化抑制率曲线,计算IC50值,计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差;
(5)活性强弱分级
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣;抗肝纤维化生物活性低于4.417UI/mg为劣,高于4.417UI/mg且低于5.679UI/mg为可,高于5.679UI/mg且低于6.941UI/mg为良,高于6.941UI/mg为优。
进一步的,所述微孔过滤为0.22μm微孔滤膜滤过。
进一步的,所述步骤(3)中,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液每孔细胞计数为7500±250个,培养时间为12h。
进一步的,步骤(4)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差是按照2015年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法或利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算的。
进一步的,所述步骤(5)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级是通过取多批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值6.310UI/mg的110%、90%、70%作为分级线。
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述一种基于生物效价的复方木鸡颗粒的质量控制方法。
实施例1
一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,包括下述步骤:
1仪器与试药
1.1仪器
HD2-BCN-1360B型生物洁净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);SUNRISE型酶标仪(瑞士TECAN公司);-80℃超低温冰箱(海尔公司);NKSY系列恒温水浴锅(常州诺基仪器有限公司);US AUTOFLOW型CO2培养箱(德国NUAIRE公司);AE31型倒置相差显微镜(Motic公司);CP225D电子分析天平(德国Sarto-rius分析天平有限公司,十万分之一);KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司);DMEM高糖培养基(美国GIBCO公司);二甲基亚砜(Sigma公司);胰蛋白酶(美国GIBCO公司);细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)(大连美仑生物技术有限公司);对照品秋水仙素来自大连美仑生物技术有限公司(批号:J1225AS),赋值10000UI/mg,UI为秋水仙素抗肝纤维化活性效价单位数;15批复方木鸡颗粒均来自丹东药业集团有限公司(批号:1号:1801032;2号:18010395;3号:18080224;4号:18080258;5号:18090557;6号:180905117;7号:17040177;8号:170401133;9号:17040212;10号:17040259;11号:17070114;12号:17070140;13号:17080197;14号:170801103;15号:171102127)。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
室温下取秋水仙素对照品粉末加入DMEM培养液配制成1mg/ml的秋水仙素含药培养液,并稀释成含秋水仙素2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml和16μg/ml含药培养液,经0.22μm微孔滤膜滤过,即得对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
室温下称取复方木鸡颗粒粉末4.00g至100ml锥形瓶中,加入20ml50%乙醇超声(功率700W,频率40kHz)20min,取出后静置放冷,滤过并挥干,计算出膏率,约为12%;取适量浸膏溶于DMEM完全培养液,配制成生药量为40mg/ml、20mg/ml和10mg/ml含药培养液,经0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。
2.3对照品和供试品IC50值的测定
取培养2-3天、处于对数生长期、生长状态良好的HSC-T6细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化,每孔细胞计数为7500±250个接种于96孔培养板,设置调零组给予培养液、空白组和给药组,培养12h后弃去培养液,调零组和空白组给予150μl培养液,给药组每孔给予150μl含药培养液,继续培养246h后每孔加入10%CCK-8溶液,避光培养2.5h后在450nm下测定吸光度(OD值),根据公式计算抑制率,并绘制抑制率曲线,结果见图1;根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,计算5次测得对照品和供试品IC50值,结果见表1。
表1 15批复方木鸡颗粒及秋水仙素平行4次测得IC50值
2.4生物活性的测定
根据表1中15批复方木鸡颗粒及秋水仙素5次测得IC50值,利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差,结果见表2及图2。
表2 15批复方木鸡颗粒相对于秋水仙素(10000UI/mg)的抗肝硬化生物活性、可信限率及可信限范围
依据以上结果可知,15批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性在4.616-6.993UI/mg,可信限率在3.06%-16.19%,生物活性都在可信限范围之内。本文检测从17年4月至18年9月的15批复方木鸡颗粒样品,在一定程度上较全面的代表了复方木鸡颗粒的实际情况。
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣,取15批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值2.218UI/mg的110%、90%、70%作为分级线,即抗肝纤维化生物活性低于4.417UI/mg为劣,高于4.417UI/mg且低于5.679UI/mg为可,高于5.679UI/mg且低于6.941UI/mg为良,高于6.941UI/mg为优。15批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性评级图见图3。
本研究建立的中药复方制剂木鸡颗粒的生物活性方法操作简单,稳定性高,灵敏可靠,具有可行性,可为其药效的整体性,质量的可控性,用药的安全性提供保障。
Claims (6)
1.一种基于抗肝纤维化生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)对照品溶液的制备
取秋水仙素加入DMEM培养液制得秋水仙素含药培养液,稀释后微孔过滤过滤,得对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备
取复方木鸡颗粒加入到乙醇中,超声溶解,经冷却、过滤、挥干溶剂,得浸膏,计算出膏率;去浸膏溶于DMEM完全培养液,微孔过滤,得供试品溶液;
(3)抑制率的测定
调零组、空白组和给药组,调零组给予培养液,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液,进行培养;调零组和空白组给予培养液,给药组给予含药培养液分别培养,每孔加入10%CCK-8溶液避光培养,测定吸光度(OD值),计算抑制率;
(4)数据处理及活性计算
根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,绘制复方木鸡颗粒抗肝纤维化抑制率曲线,计算IC50值,计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差;
(5)活性强弱分级
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣;抗肝纤维化生物活性低于4.417 UI/mg为劣,高于4.417 UI/mg且低于5.679 UI/mg为可,高于5.679 UI/mg且低于6.941 UI/mg为良,高于6.941 UI/mg为优。
2.根据权利要求1所述的质量控制与评价方法,其特征在于,所述微孔过滤为0.22 μm微孔滤膜滤过。
3.根据权利要求1所述的质量控制与评价方法,其特征在于,所述步骤(3)中,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液每孔细胞计数为7500±250 个,培养时间为12 h。
4.根据权利要求1所述的质量控制与评价方法,其特征在于,步骤(4)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差是按照2015年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法或利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算的。
5.根据权利要求1所述的质量控制与评价方法,其特征在于,所述步骤(5)中,复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级是通过取多批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值6.310UI/mg的110%、90%、70%作为分级线。
6.根据权利要求1所述的质量控制与评价方法,其特征在于,所述基于生物活性的复方木鸡颗粒质量控制与评价方法,其特征在于,具体包括下述步骤:
(1)对照品溶液的制备
取秋水仙素对照品粉末加入DMEM培养液配制成秋水仙素含药培养液,并稀释成含秋水仙素2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml和16 μg/ml含药培养液,经0.22 μm微孔滤膜滤过,即得对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备
称取复方木鸡颗粒粉末4.00 g至100 ml锥形瓶中,加入20 ml 50%乙醇超声(功率700W,频率40 kHz)20 min,取出后静置放冷,滤过并挥干,计算出膏率;取适量浸膏溶于DMEM完全培养液,配制成含药培养液,经0.22 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(3)抑制率的测定
取96孔板,调零组给予培养液,空白组和给药组给予HSC-T6细胞悬液,每孔细胞计数为7500±250 个,培养12 h;调零组和空白组给予150 μl培养液,给药组每孔给予150 μl含药培养液,培养24 h;每孔加入10%CCK-8溶液避光培养2.5 h,在450 nm下测定吸光度(OD值),计算抑制率;
(4)数据处理及活性计算
根据对照品和供试品的给药浓度及抑制率,绘制复方木鸡颗粒抗肝纤维化抑制率曲线,计算对照品和供试品4组IC50值,按照2015年版《中国药典》生物检定统计法项下的直接测定法或利用药典生物检定统计BS2000软件的直接测定法计算复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性及实验误差;
(5)活性强弱分级
根据复方木鸡颗粒抗肝纤维化活性分级为优、良、可、劣,取15批复方木鸡颗粒抗肝纤维化生物活性的平均值6.310 UI/mg的110%、90%、70%作为分级线,即抗肝纤维化生物活性低于4.417 UI/mg为劣、高于4.417 UI/mg且低于5.679 UI/mg为可、高于5.679 UI/mg且低于6.941 UI/mg为良,高于6.941 UI/mg为优。
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2019
- 2019-10-12 CN CN201910967830.4A patent/CN110702809B/zh active Active
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