CN101993911B - 一种活性小分子核素探针平台及其在生物医学中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性小分子核素探针平台,用于标记、检测活体动物及人体内细胞分化增殖、线粒体DNA修复合成、及相关糖和蛋白代谢,本发明的小分子核素探针平台使用稳定且对人体无害的核素氘(2H)标记活体动物或人体,检测核素氘(2H)原子在细胞核DNA及线粒体DNA的丰度,结合其电脑软件系统,实现检测活体动物及人体内细胞分化增殖,及相关糖、蛋白代谢的目的。本发明对人体无毒无害、仅用微量细胞、活体动态、高通量精确研究体内细胞分化增殖、线粒体DNA修复合成、及相关糖、蛋白代谢。可用于生物医学研究、新药及中药筛选研发、农牧业良种筛选培育等领域。
Description
技术领域
本发明设计生物医学技术领域,尤其涉及一种活性小分子核素探针平台及其在生物医学中的应用。
背景技术
细胞分化增殖是生物医学关键点之一。人体各种细胞的分化增殖、更新(以补偿细胞凋亡中损失的细胞)及凋亡与许多疾病有重要关系,人的一生就是全身各种细胞生长、更新、衰老、死亡的过程。特别是今天中国进入老龄化社会,衰老、亚健康状态、恶性增殖性疾病(如肿瘤)、慢性退行性疾病(如老年呆痴症、骨质疏松症、II型糖尿病的胰岛β-细胞凋亡)的研究、及治疗(促进再生或预防凋亡),都与研究人体各种细胞分化增殖、增殖动力学有关。生物医学界近年较注重细胞凋亡,但在细胞凋亡的另一面则是细胞分化、增殖、更新,同样与再生医学、抗衰老医学、重大复杂疾病的防治密切相关。
长期以来,只能从病理切片上静止地观察细胞增殖(采用免疫组织化学、荧光标记技术),或者体外细胞培养进行细胞增殖的实验,这些体外实验结果与体内真实性相比,有极大差异和滞后性。目前世界上常用的两种动物活体内标记方法:(1)3H-thymidine(3H-dT)标记法具有放射性;(2)Bromodeoxyuridine(BrdU)标记法具有生物毒性(在活体内标记DNA后会导致:基因突变、骨髓抑制、杀死敏感细胞、具有致癌性)。上述两种标记方法均不能用于人体活体标记研究。无法获得人体细胞增殖、增殖动力曲线(Nakaguchi T,Usui T,Yamada H,etal.Acute,subacute and chronic toxicities of 5-bromo-2-deoxyuridine in mice and rats.Chemical Abstracts 1971;76:108022s.National Institutes of Health.5-Bromo-2-Deoxyuridine Safety Data Sheet.Bethesda,MD:Division of Safety,Environmental Control and Research Program,NIH,USA,1988)。同时,由于受到生物毒性的影响,用于长期(1周以上)动物标记、检测缓慢增殖细胞时,不同实验室结果常常有很大争议,实验证明:BrdU明显抑制某些缓慢代谢细胞增殖(Jecker P,Beuleke A,Dressendorfer I,et al.Long-term oral application of5-bromo-2-deoxyuridine does not reliably label proliferating immune cells in theLEW rat.J Histochem Cytochem.1997Mar;45(3):393-401)。而人体内许多细胞(如胰岛细胞、神经细胞)的分化、增殖或细胞凋亡又是十分缓慢的(Teta M,LongSY,Wartschow LM,et al.Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice.Diabetes.2005 Sep;54(9):2557-67)。另外两种替代标记方法:PNCA(proliferationcell nuclear antigen)和Ki-67法只可短期标记于细胞分化S期,但当分化后的细胞进入G期,标记即丧失。不能反映真实状况(Lohr F,Wenz F,Haas S,et al.Comparison of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)staining andBrdUrd-labelling index under different proliferative conditions in vitro by flowcytometry.Cell Prolif.1995 Feb;28(2):93-104.Mengel M,von Wasielewski R,WieseB,et al.Inter-laboratory and inter-observer reproducibility of immunohistochemicalassessment of the Ki-67 labelling index in a large multi-centre trial.J Pathol.2002Nov;198(3):292-9)。同时这些标记法最后是用免疫组织化学方法来分析结果,需检查大量的标本切片来对比,费工费时,低效。Gillett CE等分析170个实验室、30种不同组织标本,采用免疫组织化学方法常导致很高批内、批间变异系数,无法对比。亦无法用于新药研发中大量候选药物筛选(Gillett CE,Barnes DM,Camplejohn RS.Comparison of three cell cycle associated antigens as markers ofproliferative activity and prognosis in breast carcinoma.J Clin Pathol.1993Dec;46(12):1126-8)。另外两种动物活体标记技术如活体生物发光成影技术(用荧光素酶基因克隆标记动物)和PET技术(使用发射正电子核同位素活体标记,主要用于临床诊断),均为瞬间标记技术,且前者需基因克隆,不能用于人体;后者则不能鉴别细胞的增殖,增殖动力曲线情况。
目前研究绝大多数研究又仅仅于动物,用从动物模型数据解释人体。因为缺乏安全、有效的标记物和测量手段,长期以来,在活体状态,人体内多数细胞分化、增殖、更新及增殖动力曲线是用动物实验数据作为替代,缺乏人体真实数据。但事实证明动物模型数据解释人体有相当局限性,特别在新药的研究中,许多在动物实验成功的药物在人体实验中失败,也证明了人体内生理、病理机制与动物有巨大的差异。
此外,近20年来,整个生物界注重于细胞和分子水平的研究。但是由于人体是以一个整体来完成某一生理功能、或进行某一病理过程,包括细胞分化增殖。最新数据也证明细胞内各种因子(功能基因、RNA、蛋白及小肽)相互作用,相互影响。在每一瞬间,体内有几千个蛋白合成,同时又有几千个蛋白降解。因此单个基因或蛋白功能不能解释整体水平细胞增殖复杂机理。所以,在目前已有大量的体外单基因、单个生物因子实验数据基础上,迫切需要开展整体水平细胞生物学研究。近年来功能基因组、功能蛋白组、功能代谢组及系统生物学研究已成为国际生物学研究前沿。再者,在中医药研究中,由于中医整体观点、中药复方组成、多靶点作用,特别需要一种可以进行人活体、中医药整体研究细胞增殖技术平台。
综上所述,对于活体、特别是人体内细胞分化增殖领域,长期缺乏有效地标记、动态跟踪细胞分化增殖、及增殖动力学方法。因此,本领域迫切需要研发相关技术平台,用于肿瘤、衰老、干细胞、再生医学等重大课题。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的问题在于提供一种活性小分子核素探针平台,用于标记、检测活体动物及人体内细胞分化增殖、线粒体DNA修复合成;本发明的小分子核素探针平台使用稳定且对人体无害的核素氘(2H)标记活体动物或人体,检测核素氘(2H)原子在细胞核DNA及线粒体DNA的丰度,结合其电脑软件系统,实现检测活体动物及人体内细胞分化增殖。
为了解决以上技术问题,一方面,本发明的具体实施方式中提供了一种活性小分子核素探针平台,通过检测核素氘(2H)原子在细胞核DNA及线粒体DNA的丰度而计算细胞增殖率或线粒体DNA合成率,其包括:
(1)活性小分子核素探针,采用稳定核素氘(2H)标记细胞;
(2)DNA的提取和纯化试剂;
(3)酶-化学水解衍生试剂;
(4)分析仪器,用于检测活性小分子核素探针中核素氘(2H)原子在被标记物中的丰度,所述分析仪器包括高效液相分析仪和气相-(激光)/质谱联动装置,其中气相-(激光)/质谱联动装置由自动加样器、20-m DB-17柱、气瓶、激光发生器、质谱仪、电脑组成;
(5)数据分析系统,使用获取的检测数据,结合相应软件可计算细胞增殖率或线粒体DNA合成率。
优选地,所述活性小分子核素探针是重水(2H2O)、重水(2H2O)和13C-葡萄糖的组合剂,或者重水(2H2O)和13C-赖氨酸的组合剂。
作为上述方案的一种优选实施方式,在本发明的是实施方式中具体给出了采用活性小分子重水探针(2H2O)作为标记物,研究生物及人体内细胞分化增殖的活性小分子核素探针平台,该探针平台还包括以下技术特征的部分或者全部:
所述活性小分子核素探针为重水探针(2H2O),用于标记细胞核DNA或线粒体DNA;
所述被标记物的提取试剂为DNA抽提试剂,抽提后的被标记DNA采用核酸纯化柱纯化;
所述分析仪器用于检测核素氘2H原子在DNA上的结合丰度;
所述数据分析系统使用分析仪器获取的核素2H原子在DNA上的结合丰度数据,结合其电脑软件系统计算出细胞增殖率或线粒体DNA合成率。
根据本发明的一个优选实施方案,所述DNA抽提试剂是由3%-8%的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成;
所述核酸纯化柱为LC18 SPE柱;
所述酶-化学水解衍生试剂主要由DNA水解酶、98%冰醋酸、15%乙酸酐、2%甲基咪唑、二氯甲烷组成。
相应地,在本发明的一个优选实施方案中,所述高效液相分析仪采用日本岛津公司的高效液相分析仪系列。而所述的气相-(激光)/质谱联动装置联动装置(the positive chemical ionization GC-MS with a model 5973 mass spectrometerand model 6890 gas chromatograph,美国Agilent公司),由自动加样器、20-mDB-17柱、气瓶、激光发生器、质谱仪、电脑组成。
相应地,根据本发明的一个优选实施方案,所述数据分析系统由以微软2003服务器和甲骨文数据库为基础的电脑软件系统组成。
另一方面,本发明的具体实施方式还给出了本发明的活性小分子核素探针平台,在生物医学研究、新药及中药筛选研发、农牧业良种筛选培育中的运用。
其中,在生物医学研究中的运用包括对恶性肿瘤的检测和对骨质疏松、老年呆痴及糖尿病的研究。
为了详实说明本发明的技术方案,需要对本发明的原理进行相应的阐述,在采用活性小分子重水探针(2H2O)作为标记物,研究生物及人体内细胞分化增殖的活性小分子核素探针平台中,所用的标记物活性小分子重水探针(2H2O)中包含氘(2H,亦称重氢),它是一种核素,为氢的同位素,一个重水分子(2H2O)内含2个氘原子(2H2)。因细胞内外水分子存在动态交换平衡,所以重水分子(2H2O)可以作为外源性标记物与细胞外水分子同时进入细胞内。另外,由于细胞核内DNA新链合成是细胞分化增殖标记,在细胞分裂的S期,当DNA新链开始合成时,原子2H可取代细胞内水分子的氢原子H,掺合于DNA的新链中脱氧核糖嘧啶环的C-H键上(如图1-3所示),在图1和图2中,GNG:糖异生,DNNS:从头核苷酸合成途径,ppp:磷酸核糖焦磷酸酯;在图3中,每一条矩形框代表染色体中的一条DNA链,有背影斜纹的矩形框代表被标记了的DNA链,白色矩形框代表没有标记的DNA链,这是经过两次细胞分裂或克隆扩增的示意图。在第一轮扩增31后,有一半的DNA单链被标记,而第二轮扩增32后6/8的DNA链被标记。
且氘原子2H掺合的量与DNA新链合成量成正比,因此即可用于标记、示踪细胞增殖。采用气相-(激光)/质谱联动装置,检测氘原子2H在标记细胞核DNA上的丰度,再通过相关的软件可以计算出增殖的细胞率。如图4和图5,通过比较本发明的2H标记法和BrdU标记法,图4为采用2H标记测出的细胞增殖率,图5显示的是本发明氘原子2H标记后靶细胞增殖率与BrdU标记法相关系数,试验数据也证明该技术与常用的BrdU细胞增殖标记法结果具有98.6%正相关。可以精确(2,000--10,000个细胞),高通量(30–200只动物或人体/次)、检测活体内相应靶细胞的DNA合成的速率,即可计算出相应靶细胞增殖、增殖动力代谢曲线。
另外,从安全性上来分析,小分子重水是一种天然物质,没有放射性、亦无生物毒性,(自然饮用水即含有万分之二的重水),小分子重水(2H2O)用于人活体标记、检测,已有50年的发展历史,以前主要是用于水代谢的研究。在动物体内,2H2O标记浓度为3%左右,在人体内,2H2O标记浓度为1.5~2%,在此范围内,对人体和动物都是安全的,这个2H2O浓度是国际科学界在研究人体水代谢中长久使用,并经长期观察无毒性,亦得到美国食品和药品管理局(FDA)的批准。
此外,根据上述分析原理和方法的阐述,本发明的活性小分子核素探针平台还可以用于其他扩展研究:在该平台上如结合外源性13C-葡萄糖双重标记,可用于糖代谢研究。如结合外源性必需氨基酸标记,如13C-赖氨酸双重标记,可用于蛋白质合成代谢研究。
从以上分析可以看出本发明的活性小分子核素探针平台是细胞水平上的原位、动态的标记和活性示踪新技术,也是目前世界上唯一可安全用于人体动态标记、检测细胞分化增殖核素探针平台,较目前其他技术具有显著的优势。
附图说明
图1是本发明中将重水中的2H引入靶细胞合成DNA的流程图;
图2是本发明中将重水中的2H引入靶细胞DNA的脱氧核糖部分C-H键的代谢通路;
图3是本发明中2H标记后靶细胞DNA的半保留复制示意图;
图4是本发明中采用2H标记测出细胞增殖率;
图5是本发明2H标记后靶细胞增殖率与BrdU标记法相关系数;
图6是本发明中采用2H标记测出胰腺切除术(Px)与对照组(sham)在胰岛细胞增殖的影响;
图7是本发明中采用2H标记测出药物对胰岛细胞增殖作用,其中Sham对照组,Px胰腺切除术,CCK促胰液分泌素;
图8本发明中采用2H标记测出年龄对胰岛细胞增殖影响;
图9本发明中采用2H标记测出年龄对肾细胞增殖的影响;
图10本发明中采用2H标记测出年龄对肝细胞增殖的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。本发明实施方式中所公开的一种活性小分子核素探针平台,包括:
(1)活性小分子核素探针,采用稳定核素标记被标记物,所述被标记物包括DNA、糖类和蛋白质;
(2)被标记物的提取和纯化试剂;
(3)酶-化学水解衍生试剂;
(4)分析仪器,用于检测活性小分子核素探针中核素原子在被标记物中的丰度,所述分析仪器包括高效液相分析仪和气相-(激光)/质谱联动装置,其中气相-(激光)/质谱联动装置由自动加样器、20-m DB-17柱、气瓶、激光发生器、质谱仪、电脑组成;
(5)数据分析系统,使用获取的检测数据,结合相应软件可计算细胞增殖率或线粒体DNA合成率以及相关糖、蛋白的代谢率。
其中,在研究生物及人体内细胞分化增殖、及相关糖、蛋白代谢时,所要用到的活性小分子核素探针是重水(2H2O)、重水(2H2O)和13C-葡萄糖的组合剂,或者重水(2H2O)和13C-赖氨酸的组合剂。以下就以采用活性小分子重水探针(2H2O)作为标记物,研究生物及人体内细胞分化增殖为例,详细说明本发明,具体如下:
1、标记物:活性小分子重水(2H2O),为增加活性,可磁化或微波化。在动物体内,2H2O体水丰度为3%左右,在人体内,2H2O体水丰度为1.5~2%,在此范围内,对人体和动物都是安全的,这个2H2O浓度是国际科学界在研究生物水代谢中长久使用,并经长期观察无毒性,亦得到美国食品和药品管理局(FDA)的批准。
2、标记对象:培养细胞组织、或活体动物、或活体人、或植物;。标记对象处于病理状态、或在某一药物处理下。以研究某一病理过程中或某一药物作用下,某种细胞分化、增殖或凋亡的速率。在人体研究中,则选择临床病人志愿者。对照组:采用正常生理对照组、或非药物处理组、或药物治疗前后对比。统计学t检验。P<0.05作为阳性。
3、标记途经:或口服、或腹腔注射、或静脉注射、或添加于培养液的方式。
4、在肿瘤检测中,标记待检肿瘤病人,收集相应细胞,检测细胞分化增殖,与正常人群对照。衰老、亚健康状态筛选诊断中,标记待检病人,收集相应细胞,检测细胞分化增殖及线粒体DNA合成,与正常人群对照,在新药、中药筛选中,给予标记动物或人刺激细胞分化、增殖的药物、或预防细胞凋亡的保护药物。然后进行标记如上文,根据研究的设计、细胞特性、药物作用的靶点等不同,观察药物对特定某种细胞分化、增殖或凋亡的作用
5、细胞样品获得:在不同标记时间点,采用处死动物、或活体穿刺组织(对动物或人体),或抽取2-20ml外周血,或在手术治疗病人时、切除病变组织时,取得5mg相应组织,然后针对不同细胞,采用不同分离手段获得纯净细胞作为待测样品,(特定纯净细胞分离可参考相关文献,例如:对于人体免疫细胞分离,采用流式细胞仪(multi-parameter fluorescence-activated cell sorting、FACS方法)。而在糖尿病研究中,为取得胰岛细胞,可采用胶原酶消化、Fiocll梯度离心分离法等)。获得细胞后,为了确定是否获得相应纯净细胞,可采用相应组织化学染色技术对待测细胞进行鉴定。亦可用激光微刻技术取得样品。
6、细胞GC/MS样品:获得待测纯净细胞后,提取细胞核中DNA:根据DNA试剂合指导提取DNA。取1-5微克DNA量,采用酶--化学水解法切断DNA链,并经LC18SPE柱、高效液相分析仪纯化,获得DNA链上标记脱氧核糖,再次化学水解、衍生,制成GC/MS样品。
7、样品的检测:在气相(GC)-(激光)/质谱(MS)联动仪上(the positivechemical ionization GC-MS with a model 5973 mass spectrometer and model 6890gas chromatograph,Agilent公司),自动加样器,20-m DB-17柱,250-275波长,即可测得样品H2的丰度,该丰度量与DNA合成量成正比直线关系,进而可以计算新分化的细胞量。根据经验,含10,000个细胞的样品即可获得稳定可靠的细胞更新结果。
8、数据计算:利用甲骨文数据库电脑软件,计算出细胞增殖及增殖动力曲线。也可反向计算细胞凋亡。同时与正常值对比,即可获得待测细胞增殖、更新结果。同理,测得样品13C的丰度。获得相关糖、蛋白代谢率。
以下是本发明的优选实施例,结合上述详细说明,各实施例就本发明在生物医学研究、中药新药筛选研发及农牧业良种筛选培育中的运用详细说明本发明。
实施例1
本发明的活性小分子核素探针平台在医学研究领域的运用:
本探针平台用于医学研究领域,活体动物、或人体重水标记,采用如上述详细说明中给出的方法,分析相应细胞的增殖率,可以获得在生理状态或疾病状态下、活体动物或人体的大量真实可靠的整体水平细胞分化增殖、增殖动力学的最终结果;及糖代谢,用于代谢病研究、某些蛋白代谢,用于蛋白抗体研究。
比如利用恶性肿瘤细胞,特别是来源于上皮细胞位于泌尿道、呼吸道、消化道的癌瘤具有快速增生、易于脱落的特征。本试剂盒探针标记人体,分析相应细胞的增殖率,可对恶性肿瘤研究。在对骨质疏松动物模型或病人进行标记,可获得骨皮质细胞增殖动力学数据。而对老年呆痴动物模型或病人进行标记,可获得相应神经细胞增殖动力学数据。而对糖尿病动物模型或病人进行标记,可获得相应关键胰岛细胞增殖动力学数据,如图6所示,采用氘(2H)标记测出胰腺切除术(Px)与对照组(sham)在胰岛细胞增殖的影响,通过比较正常情况与胰腺切除术(Px)的胰岛细胞增殖,从而研究胰腺切除术(Px)对胰岛细胞增殖的影响。
实施例2
本发明的活性小分子核素探针平台在研究亚健康-衰老中的运用:
线粒体DNA是细胞核外唯一的遗传物质,与核DNA共同编码线粒体蛋白,衰老时线粒体DNA突变增加,修复合成减少,致使线粒体功能下降,进而导致全身性生理功能的降低,是衰老的重要原因,运动或某些保健品可增加线粒体DNA修复合成,减少DNA突变,提高老年人有氧能力,延缓衰老进程。因此,检测线粒DNA修复合成是一项敏感的衰老、亚健康状况筛选,诊断及临床治疗效果判断指标,如图8、9、10所示,分别通过比较不同周龄(week-old)的胰细胞、肝细胞、肾细胞的细胞增殖情况,从而研究细胞或者生物体在不同的生长时期的衰老情况。
本探针平台标记人体后,从全血中分离纯化总DNA(包括未成熟红细胞、粒细胞、血小板细胞核DNA,线粒体DNA)及线粒体DNA,采用如上述详细说明中的方法分析相应细胞的增殖率,线粒体DNA合成率,方法简便、易行、且敏感。并可用于抗衰老、抗亚健康保健品筛选研发。
实施例3
本发明的活性小分子核素探针平台用于新药的研发:
本探针平台用于新药的研发实用领域,可以快速、高通量筛选出在人体内真正有效的促进或抑制细胞增殖的新药。或发现老药新用。并同时节约大量研究经费。特别在多药物、多靶标综合治疗复杂疾病如肿瘤、艾滋病、糖尿病的药物筛选。
方法:给予动物、或人待筛选的药物、化合物或生物活性物(小肽、蛋白因子等),并同时进行本探针平台标记活体动物或人体,采用如上述详细说明中的方法,分析相应细胞的增殖率,可获得待筛选的药物、化合物或生物活性物(小肽、蛋白因子等)刺激或抑制细胞增殖的作用,指导筛选新的药物或药物组合,发现新药。如图7所示,可以采用2H标记测出药物对胰岛细胞增殖作用,从而筛选出在人体内真正有效的促进或抑制细胞增殖的新药,其中Sham对照组,Px胰腺切除术,CCK促胰液分泌素,从图中可以看出CCK促胰液分泌素能够促进细胞增殖。
实施例4
本发明的活性小分子核素探针平台在中医、中药研究中的运用:
本探针平台亦可用于阐明中医整体理论的代谢通路,中药复方的作用位点,筛选新的中药复方。方法:本探针平台探针标记活体动物、或人体,给予待筛选的单味中药、中药组方、中药提取物,采用如上述详细说明中的方法,分析相应细胞的增殖率,可获得待筛选的单味中药、中药组方、中药提取物化合物刺激或抑制细胞增殖的作用。指导筛选新的中药物或中药物组合,发现新中药。
实施例5
本发明的活性小分子核素探针平台用于干细胞筛选及再生医学的研究:
本探针平台亦可用于筛选干细胞、用于再生医学研究,其方法为:本探针平台标记活体动物、或人体,移植待筛选的干细胞;可同时给予药物、化合物或生物活性物,或单味中药、中药组方、中药提取物;采用如上述详细说明中的方法,分析相应细胞的增殖率,可获得待筛选干细胞在体内分化增殖。用于再生医学研究。
实施例6
本发明的活性小分子核素探针平台用于农业、畜牧业、水产业良种筛选、培育:
重水标记植物、或动物、或水产生物,采用如上述详细说明中的方法,分析相应细胞的增殖率,可以用于农业、畜牧业、水产业良种筛选、培育。
以上所述是本发明的优选实施方式而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和变动,这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种活性小分子核素探针平台,通过检测核素氘(2H)原子在细胞核DNA及线粒体DNA的丰度而计算细胞增殖率或线粒体DNA合成率,其包括:
(1)活性小分子核素探针,采用稳定核素氘(2H)标记细胞;
(2)DNA的提取和纯化试剂;
(3)酶-化学水解衍生试剂;
(4)分析仪器,用于检测活性小分子核素探针中核素氘(2H)原子在被标记物中的丰度,所述分析仪器包括高效液相分析仪和气相-激光/ 质谱联动装置,其中气相-激光/ 质谱联动装置由自动加样器、20-m DB-17 柱、气瓶、激光发生器、 质谱仪、电脑组成;
(5) 数据分析系统,使用获取的检测数据,结合相应软件可计算细胞增殖率或线粒体DNA合成率;
所述活性小分子核素探针为重水探针 (2H2O),用于标记细胞核DNA或线粒体DNA;
被标记物DNA或线粒体DNA用DNA的提取试剂抽提,抽提后的被标记DNA采用核酸纯化柱纯化;
所述分析仪器用于检测核素氘2H原子在DNA上的结合丰度;
所述数据分析系统使用分析仪器获取的核素重氢2H原子在DNA上的结合丰度数据,结合其电脑软件系统计算出细胞增殖率或线粒体DNA合成率;
所述DNA抽提试剂是由3%-8%的聚乙二醇和1mol/L的氯化钠配制而成的浓缩液和DNA提取液组成;
所述核酸纯化柱为LC18 SPE柱;
所述酶-化学水解衍生试剂主要由DNA水解酶、98% 冰醋酸、15% 乙酸酐、2% 甲基咪唑、二氯甲烷组成。
2.根据权利要求1所述的活性小分子核素探针平台,其特征在于:所述数据分析系统由以微软2003服务器和甲骨文数据库为基础的电脑软件系统组成。
3.根据权利要求1所述的活性小分子核素探针平台,其特征在于:所述活性小分子核素探针的标记途径包括口服、腹腔注射、静脉注射或添加于培养液。
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CN113740310A (zh) * | 2020-05-29 | 2021-12-03 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种筛选或评价药物的方法 |
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2009
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Non-Patent Citations (6)
Title |
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Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA;R. A. Neese et al.;《PNAS》;20021126;第99卷(第24期);摘要,图1,第15346页Method * |
Measurement of cell proliferation by heavy water labeling;Robert Busch et al.;《Nature protocols》;20071121;第2卷(第12期);第3049页Figure5a,第3051页左栏倒数第5行,第3053页DNA preparation (A)and(B),第3052页Preparation of mass spectrometers for isotope-ratio analysis,第3049页左栏第1-2段 * |
R. A. Neese et al..Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA.《PNAS》.2002,第99卷(第24期),15345–15350. |
Robert Busch et al..Measurement of cell proliferation by heavy water labeling.《Nature protocols》.2007,第2卷(第12期),3045-3057. |
S. M. Turner et al..Measurement of TG synthesis and turnover in vivo by 2H2O incorporation into the glycerol moiety and application of MIDA.《Am J Physiol Endocrinol Metab》.2003,第285卷E790-E803. * |
Stephen F.Previs et al..Quantifying rates of protein synthesis in humans by use of 2H2O:application to patients with end-stage renal disease.《Am J Physiol Endocrinol Metab》.2003,第286卷E665-E672. * |
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Publication number | Publication date |
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