CN102662022A - 大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法 - Google Patents
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Abstract
大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法,属于医药技术领域,尤其是一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的,其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理;乙醚作为萃取溶剂;液相条件中流动相由0.1%甲酸水和-0.1%甲酸甲醇(55:45,V/V)组成;新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。本发明所建立的草乌甲素血浆样品LC-MS-MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2010年版以及SFDA2005年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,尤其是一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。
背景技术
草乌甲素是一种强效镇痛剂和抗炎剂,用于治疗慢性疼痛,类风湿性关节炎、骨关节炎等。中国国家食品与药品监督管理局(SFDA)已于19世纪80年代,批准BLA肌肉注射剂(0.2 mg/2 mL)、片剂(0.4 mg)和软胶囊(0.4 mg)用于临床使用。但二酯-二萜型乌头属生物碱如BLA的潜在毒性可引起心律失常和强心作用,动物研究中,当使用大剂量BLA时,毒性作用如呼吸抑制、脑积水和室性心律失常见于报道。鉴于草乌甲素良好的临床疗效以及潜在的心脏毒性等副作用,了解该药物的药代动力学特征,绘制出具有吸收相、峰浓度、分布相和消除相的完整血药浓度曲线,并对该曲线进行非房室模型和房室模型处理,经处理提取的药动学参数用于解释药物的体内命运、指导新药开发以及指导临床合理用药是十分必要的一项工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。
本发明的大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法,该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的,其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理;乙醚作为萃取溶剂;液相条件中流动相由0.1%甲酸水和-0.1%甲酸甲醇55:45,V/V组成;新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。
血浆样品的处理是LC-MS/MS法测定获得高灵敏度的关键过程。常见的血浆样品处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。曾尝试采用蛋白沉淀法和固相萃取法,但前者蛋白沉淀不完全,药物定量限过高,后者操作繁琐、回收率与灵敏度均非常低。因此,本发明最终采用相对简便、灵敏和回收率更高的液-液萃取法作为草乌甲素血浆样品的处理方法。
在萃取溶剂的选择上,曾采用乙醚-环己烷(4:1)混合溶液、乙醚-正己烷(4:1)混合溶液、乙醚-二氯甲烷(4:1)混合溶液以及正己烷作萃取溶剂进行提取,结果表明混合溶剂的提取效率均不如单纯采用乙醚,正己烷的提取效果虽与乙醚相当,但提出的杂质较多。因此,确定乙醚作为萃取溶剂,提取后的样品纯净、回收率高,几乎无杂质干扰。实验中还考察了碱化试剂(pH 9.0的磷酸盐缓冲液)对提取效率的影响,结果表明碱化处理对药物的提取效率无明显作用,故提取过程未作碱化处理。
液相条件中流动相由0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇(55:45,V/V)组成,加入甲酸可以促进被分析物的离子化,提高检测的灵敏度。采用C18 50mm短柱进行分析,单个样品的分析时间仅为3.5min,大大增加了分析通量,提高了分析速度,有利于大批量样品的的快速,本方法亦可用于临床快速监测患者的血药浓度。
内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要,理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。文献报道草乌甲素血浆样品的测定曾采用酮康唑5、左吡坦6或多潘立酮[i]作为内标,但它们与草乌甲素的结构差别较大,在预实验中发现上述内标无法达到本项目对草乌甲素口服血药浓度测定高灵敏度的要求。为此,我们选择与草乌甲素同属“乌头碱类生物碱”结构的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱作为内标进行尝试,发现乌头碱的定量离子对与草乌甲素过于接近,次乌头碱的出峰时间与草乌甲素过于接近,因此选择出峰时间短,响应值高,峰形良好的新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。
本发明所建立的草乌甲素血浆样品LC-MS-MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2010年版以及SFDA 2005年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。特别指出的是,本测定方法最低定量限达到0.02ng/ml,远远超出文献报道的最低定量限0.12ng/ml,可用于动物以及人体口服草乌甲素的药代动力学研究。
附图说明
图1为大鼠肌注不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。
图2为大鼠口服不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。
图3为草乌甲素静脉注射三室模型示意图。其中,中央室1,还存在快分布相2,分布相3。
图4为大鼠静脉注射草乌甲素(0.02mg/kg)的血药浓度-时间曲线。
图5为大鼠口服不同剂量草乌甲素混悬液后平均血药浓度-时间曲线。
图6为大鼠口服药代动力学试验。
具体实施方式
实施例1:草乌甲素大鼠口服药代动力学试验。
草乌甲素片为0.4mg规格,每次1片,1日2-3次,成人体重按照60kg计算,大鼠的给药剂量为人的6倍,则推算大鼠口服剂量应为0.04 mg/kg。预实验按照单倍剂量0.04 mg/kg、5倍剂量0.2mg/kg、10倍剂量0.4mg/kg和30倍剂量1.2mg/kg给予大鼠口服,考察血药浓度-时间曲线具有血管外给药特征的口服剂量。草乌甲素肌肉注射剂的规格为0.2mg/ml,每天1次,与口服剂量的换算方式相同,则大鼠的肌注剂量应为0.02 mg/kg,预实验按照单倍剂量0.02 mg/kg、2倍剂量0.04 mg/kg、3倍剂量0.06 mg/kg和6倍剂量0.12 mg/kg给予大鼠肌注,考察能获得血管外给药特征的肌注剂量。
为了计算草乌甲素口服绝对生物利用度,正式药动学试验采用静脉注射作为对照,肌肉注射药动学预实验对静脉注射剂量的设计具有相同的参考价值。
一、草乌甲素片大鼠口服药代动力学预实验。
1、实验方法:
取体重约250g的SD大鼠16只,分为8组,每组2只,其中4组肌肉注射草乌甲素溶液,剂量分别为0.02、0.04、0.06和0.12 mg/kg;另外4组灌胃草乌甲素混悬液,剂量分别为0.04、0.2、0.4和1.2 mg/kg。大鼠于给药前一天作颈静脉插管手术,术后禁食,自由饮水。给药当天称量体重,根据体重精确计算给药剂量及相应体积。各组大鼠于给药前取空白血。灌胃组于给药后15、30min、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h取血0.3ml,肌肉注射组于给药后10、20、30、45min、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h取血0.3ml,及时补充生理盐水0.3ml。血浆于5000rpm离心10min,取上层澄清血浆,迅速贮存于-20℃冰箱中待测定。
测定大鼠血浆中草乌甲素采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法。具体为:
1.实验药品及仪器
1.1 标准品与试剂
试验制剂:草乌甲素片,云南昊邦制药有限公司生产,批号:110904;
草乌甲素对照品:批号:010302, 含量98.3%,云南昊邦制药有限公司;
新乌头碱 内标:110799-200404 , 中国药品生物制品检定所;
乙醚: HPLC级,国药集团化学试剂有限公司;
甲醇: HPLC级,merk。
1.2 仪器
分析天平: BT25S, Sartorius , Germany;
高速离心机:H-1650,长沙湘仪离心机仪器有限公司;
超声脱气仪:KQ-250DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;
涡旋混合器: XW-80A,上海医科大学仪器厂;
LC-MS/MS仪器组成:
AB Sciex公司4000Q TRAP串联四级杆-线性离子肼质谱仪;
Agilent 1200 Quaternary Pump;
工作站:Analyst 1.5.1;
色谱柱:Phenomenex Luna C18 (50mm×2.00mm,5μm);
保护柱:SecurityGuard Cartridges C184×3.0mm。
1.3 实验动物
SD大鼠来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
2. 实验方法和结果
2.1 LC-MS/MS分析条件
色谱条件:色谱柱:Phenomenex Luna C18 (50mm×2.00mm,5μm);流动相:1%甲酸水:1%甲酸甲醇=55:45;流速:400μl/min;进样体积: 5μl。
质谱条件:草乌甲素和新乌头碱的离子化采用电喷雾离子源,正离子模式。在Q1扫描模式下,草乌甲素和内标产生了质子化的母离子[M+H]+ 。在MS/MS谱图中可观察到草乌甲素的主要离子为m/z 645.2,草乌甲素强度最高的子离子为m/z 552.6;内标的主要离子为m/z 632.4,内标最强的子离子为m/z 572.6。
2.2 标准溶液的配制
2.2.1 草乌甲素标准液配制
精密称定草乌甲素对照品0.37mg,置10ml量瓶中,用甲醇溶解并定容,即得草乌甲素标准储备液(1)(37μg/ml)。精量草乌甲素储备液(1)270μl,用甲醇稀释至10ml即得草乌甲素储备液(2)浓度为1μg/ml;精密吸取草乌甲素标准储备液(2)适量,用水稀释至草乌甲素系列标准液浓度为0.2、0.5、2、10、40、80和200ng/ml,用于血浆标准曲线配制。
2.2.2 内标工作液配制
精称新乌头碱对照品0.63mg,置10ml量瓶中,用甲醇定容即得内标贮备液(1)10.063 mg/ml。精量内标贮备液(1)793μl,用甲醇稀释至5ml即得内标贮备液(2)浓度为10μg/ml;精量内标贮备液(2)1ml,用甲醇稀释至10ml即得内标液浓度1μg/ml;精密吸取内标贮备液(3)0.1ml,用甲醇稀释至10ml,得内标工作液浓度为10ng/ml。
2.3 血浆样品处理方法
将空白血浆自冰箱取出于室温下解冻并恢复至室温,7000rpm离心5min,精密吸取血浆90μl,加入内标新乌头碱溶液(10ng/ml)10ml和草乌甲素系列标准溶液10ml,于旋涡混合器上混匀,加入乙醚2ml,混匀,静置分层后吸取乙醚层,于35℃水浴中氮气流吹干,最后加入流动相100ml复溶,进样5ml测定浓度。
2.4 方法专属性
按上述条件测得的典型色谱图,血浆中几乎无内源性杂质及代谢产物,不干扰草乌甲素及内标新乌头碱的测定,方法的专属性符合要求。草乌甲素和内标的保留时间分别约为2.4~2.5min和1.3~1.4min。
2、实验结果:
(1)肌注组:大鼠分别肌注0.02(1倍剂量)、0.04(2倍剂量)、0.06(3倍剂量)和0.12mg/kg(6倍剂量),结果表明大鼠给予0.02mg/kg单倍剂量肌注即可检测到完整的血药浓度-时间曲线。
(2)口服组:大鼠分别给予1倍剂量0.04mg/kg、5倍剂量0.2mg/kg、10倍剂量0.4mg/kg和30倍剂量1.2mg/kg灌胃给药,结果表明大鼠给予单倍剂量0.04mg/kg灌胃即可检测到完整的血药浓度-时间曲线,特别是能够检测到处于消除相末端的血药浓度。大鼠1倍、5倍和30倍剂量口服的血药浓度峰值出现在15min,提示草乌甲素口服吸收非常迅速,有可能胃部即为最佳吸收部位,因此吸收相的取样点应重新设计,拟为2、5、10 min。
二、草乌甲素片大鼠口服药代动力学研究。
1、实验方法:
取体重约250g的SD大鼠24只,分为4组,每组6只,其中1组尾静脉注射草乌甲素溶液,剂量为0.02mg/kg,另外3组分别灌胃草乌甲素混悬液0.04、0.12、0.36mg/kg。大鼠于给药前1天作颈静脉插管手术,术后禁食,自由饮水。给药当天称量体重,根据体重精确计算给药剂量及相应体积,分别于给药前取空白血,于给药后2、5、10、20、30min、1、1.5、2、3、4、6、8、10取血0.3ml,及时补充生理盐水0.3ml。血浆于5000rpm离心10min,取上层澄清血浆,迅速贮存于-20℃冰箱中待测定。
测定大鼠血浆中草乌甲素采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法。具体如上述。
2、实验结果:
(1)大鼠静脉注射草乌甲素的药代动力学分析:大鼠尾静脉注射草乌甲素溶液后草乌甲素在血浆中消除迅速,消除半衰期为1.18 h,清除率为1.86 L/hr/kg,表观分布容积为1.96 L/kg。
利用Winnolin软件模拟草乌甲素在大鼠体内的房室模型特征,结果表明草乌甲素在体内呈三室模型特征,即除中央室1外,还存在快分布相2和分布相3,拟合的三室模型方程为: C(T)=12.20*EXP(-19.61*T)+9.02*EXP(-2.74*T)+5.08*EXP(-0.77*T)。
进一步求算获得三室模型的快分布相半衰期为2.12 min,分布相半衰期为15.16 min,中央室消除相半衰期为53.79 min。根据草乌甲素片说明书的描述,大鼠静脉注射草乌甲素的血药浓度-时间曲线亦呈开放式三室模型,三相的半衰期分别为:快分布相半衰期( t 1/2π )=2.87min,分布相半衰期( t 1/2α )=11.6min,消除相半衰期( t 1/2β )=5h。
草乌甲素静脉注射的非房室模型药代动力学参数:
参数 | k | t1/2 | Tmax | Cmax | AUClast | AUCINF | Cl | MRT | Vz |
单位 | 1/hr | hr | min | ng/mL | hr*ng/mL | hr*ng/mL | L/hr/kg | hr | L/kg |
平均 | 0.5999 | 1.18 | 10 | 19.59 | 10.71 | 10.79 | 1.86 | 1.05 | 3.20 |
SD | 0.1038 | 0.20 | 2.24 | 0.73 | 0.72 | 0.13 | 0.08 | 0.65 | |
RSD | 17.31% | 16.60% | 11.43% | 6.80% | 6.66% | 6.73% | 8.03% | 20.25% |
(2)大鼠口服草乌甲素的非房室模型药代动力学分析:本项目建立的草乌甲素血药浓度测定方法学的定量限为0.02 ng/ml,使大鼠在口服高、中、低剂量草乌甲素8-10 h后依然能够检测到位于定量限附近的血药浓度,最低检测浓度小于Cmax的1/100(中国药典2010版要求至少检测到Cmax的1/10),梯形法计算的AUClast占AUCINF 达95%以上(中国药典2010版要求至少达80%以上),从而保证了草乌甲素口服完整血药浓度曲线的获取,在此基础上提取的药动学参数精确可靠。
大鼠口服高、中、低剂量草乌甲素后,平均血药浓度-时间曲线以及每只大鼠的血药浓度-时间曲线均呈完整的血管外给药的药代动力学特征,血药浓度随给药剂量的提高而增加。草乌甲素口服后吸收非常迅速,低、中、高剂量于10min即达峰浓。通常药物的胃排空时间是20min左右,据此推测胃可能是草乌甲素吸收的最佳部位。结合草乌甲素的理化性质分析,在胃酸状态,草乌甲素结构呈离子状态,亲水性和溶解度增强,溶出快,有利于药物迅速吸收达到峰浓度;而在进入十二指肠和空肠环境后,随着pH的升高,草乌甲素逐渐从离子状态过渡到分子状态,亲脂性增强,溶解度和溶出度反而降低,影响药物的吸收速度和程度;文献报道指出pH5.0为草乌甲素由离子态转变为分子态的拐点,pH 5.0又正对应十二指肠的pH区间,因此草乌甲素在进入十二指肠后溶解度迅速降低而影响吸收,这可能是草乌甲素吸收半衰期极短,10min血药浓度达峰后又迅速下降的原因。
低、中、高剂量草乌甲素口服后血药峰浓度分别达到2.61、6.28和12.85 ng/ml。Weng等[ii]根据人体肌肉注射草乌甲素后起效时间与血药浓度的关系推算草乌甲素最低有效浓度为0.2 ng/ml,本实验草乌甲素口服单倍剂量0.04 mg/kg至第4 h时依然保持在0.2 ng/ml以上,据此推算口服维持药效时间应可达4 h。
草乌甲素口服低、中剂量的绝对生物利用度几乎相等,约为15%,按照AUC与剂量比值相同则可判断为线性动力学[iii],则草乌甲素在0.04-0.12 mg/kg范围内为线性动力学特征。高剂量0.36mg/kg给药的绝对生物利用度为10.32%,比低、中高剂量的绝对生物利用度显著降低(p<0.05),因此高剂量与低、中剂量比较呈非线性药代动力学特征。
草乌甲素口服后吸收速度的个体差异较大,低、中、高剂量的达峰浓度Cmax相对标准偏差RSD分别为68.12%、54.47%、47.15%,而吸收程度的个体差异相对较小,低、中、高剂量的AUCinf的相对标准偏差RSD分别为23.80 %、37.08 %和18.10 %。
大鼠口服草乌甲素的房室模型药代动力学分析:
利用Winnolin软件对大鼠口服高、中、低剂量草乌甲素的血药浓度-时间曲线进行模型拟合,发现不同剂量均符合二室模型,模型方程的普遍表达式为:
C(T)=A*EXP(-ALPHA*T)+B*EXP(-BETA*T)+C*EXP(-K01*T)。
大鼠口服高、中、低剂量草乌甲素的二室模型参数见表,其中K01为吸收速度常数,远远大于K10(消除速度参数)和K12(分布速度参数),表明草乌甲素口服吸收速度远大于其分布速度和消除速度,低、中、高剂量的吸收半衰期K01_HL均小于5min,吸收时滞LT也极短,小于2min。;基于二室模型拟合的参数进一步证实了草乌甲素口服吸收迅速,几乎没有吸收时滞。
草乌甲素片大鼠口服的二室模型药代动力学参数:
Claims (1)
1.大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法,该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的,其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理;乙醚作为萃取溶剂;液相条件中流动相由0.1%甲酸水和-0.1%甲酸甲醇55:45,V/V组成;新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120912 |