CN114646691A - 一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分的分析方法。本发明以含0.1％甲酸的水溶液‑含0.1％甲酸的乙腈溶液为流动相，使用BEH C18色谱柱进行目标化合物分离，采用电喷雾电离三重四级杆质谱在scheduled MRM模式下进行含量测定。15种人参皂苷类成分的线性范围为2‑2000ng/mL，该方法灵敏度高，专属性强，重现性好，实现了对大鼠血浆中15种人参皂苷类成分的同时定量分析。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分的分析方法。
背景技术
丹七通脉片是将丹参总酚酸和三七总皂苷按照特定比例优化混合制成的中药有效部位新药，主要用于治疗慢性稳定性心绞痛(血瘀证)。临床I期和IIa期实验结果表明，丹七通脉片临床应用安全，临床疗效具有一定剂量关系，目前该药正在进行IIb期临床实验。
大鼠体内代谢物表征研究表明，大鼠灌胃丹七通脉片后血浆中可检测到多个人参皂苷类成分，但响应普遍较低，具体浓度未知。另外人参皂苷类成分的紫外最大吸收波长为203nm末端吸收，采用常规紫外检测器定量的专属性和灵敏度均较低。因此，需要一种专属性强、灵敏度高的方法来同时定量分析大鼠血浆中的人参皂苷类成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分的分析方法，该分析方法具有专属性强、灵敏度高的特点。
本发明提供一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片中所含的15种人参皂苷类成分的分析方法，所述15种人参皂苷类成分分别为：Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4，所述方法包括以下步骤：
(1)标准曲线工作溶液的配制
采用甲醇将15种人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4配制成梯度浓度范围在0.04-40μg/mL内的标准曲线工作溶液；
(2)内标(IS)工作溶液的配制
采用甲醇将地高辛配制成1μg/mL的内标工作溶液；
(3)标准血浆样品制备
取190μL大鼠空白血浆样品，加入内标工作溶液10μL，然后分别加入不同浓度的标准曲线工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋，离心，取上清，氮气吹干；残留物用100μL20％乙腈水复溶，涡旋离心，取上清转移至液相小瓶中；
(4)待测血浆样品制备
取200μL待测大鼠血浆样品，加入内标工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋，离心，取上清，氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋离心，取上清转移至液相小瓶中；
(5)样品检测
检测体系
使用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，色谱柱为BEH C18柱，规格为2.1×100mm，1.8μm，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0–6min,5–20％(B)；6–11min,20–20％(B)；11–12min,20–21％(B)；12–12.1min,21–27％(B)；12.1–13min,27–30％(B)；13–20min,30–33％(B)；20–27min,33–55％(B)；27-28min,55-95％(B)；28–31min,95-95％(B)；31-32min,95-5％(B)；32–35min,5-5％(B)；采用电喷雾离子源在负离子模式下使用scheduled MRM进行检测；
标准曲线的建立
采用所述检测体系对标准血浆样品进行检测，以血浆中各待测人参皂苷对照品的浓度为横坐标，待测人参皂苷对照品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，建立各待测人参皂苷的标准曲线；
待测物含量的确定
采用所述检测体系对待测血浆样品进行检测，将各待测物与内标的峰面积比值代入所述的标准曲线中，计算得到血浆中各个待测物的含量。
在具体实施方式中，所述超高效液相色谱的柱温为25℃、30℃、35℃、40℃，优选为30℃。
在具体实施方式中，所述超高效液相色谱的流动相流速为0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min，优选为0.3mL/min。
在具体实施方式中，所述超高效液相色谱的样品的进样量为2μL、5μL、10μL，优选为10μL。
在具体实施方式中，MRM参数设置如下表中所示：
在具体实施方式中，所采用的电喷雾离子源参数如下：毛细管电压为-4.5kV，温度为550℃，Curtain Gas为25psi，GS1为55psi，GS2为55psi，Interface Heater为On。
在具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)标准曲线工作溶液的配制
分别精密称取人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4各5mg，分别置于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，分别制成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液；分别吸取适量体积的上述单一对照品储备液于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成各对照品浓度为40μg/mL的混合对照品储备液；吸取适量体积的上述混合标准品储备液，分别加入甲醇逐级梯度稀释，得到浓度分别为0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10、20、40μg/mL的标准曲线工作溶液；
(2)内标(IS)工作溶液的配制
精密称取地高辛5mg于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成浓度为1mg/mL的内标储备液；吸取适量体积的上述内标储备液，加入甲醇稀释，得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液；
(3)标准血浆样品制备
取190μL大鼠空白血浆样品，加入内标工作溶液10μL，然后分别加入不同浓度的标准曲线工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；
(4)待测血浆样品制备
取200μL待测大鼠血浆样品，加入内标工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；
(5)样品检测
标准曲线的建立
采用如上所述的检测体系对标准血浆样品进行检测，以血浆中各待测人参皂苷对照品的浓度为横坐标，待测人参皂苷对照品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，建立各待测人参皂苷的标准曲线；
待测物含量的确定
采用如上所述的检测体系对待测血浆样品进行检测，将各待测物与内标的峰面积比值代入所述的标准曲线中，计算得到血浆中各个待测物的含量。
有益效果
本发明建立了一种基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱的分析方法，可以对大鼠灌胃丹七通脉片后血浆中15种主要的人参皂苷类成分进行同时定量分析，该方法具有重现性好的优点。对液相色谱条件进行了系统优化，15种人参皂苷类成分的分离度较好，且15种人参皂苷类成分的线性范围为2-2000ng/mL；采用scheduled MRM模式进行检测，相比于常规MRM方法减少了需要同时扫描的离子对数目，提高了信噪比和检测灵敏度。本发明为研究丹七通脉片中15种主要人参皂苷类成分的药代动力学特征提供了方法依据。
附图说明
图1为本发明中15种待测人参皂苷的LC-MS/MS总离子流图。其中，1：20-O-glc-Rf；2：NR1；3：Rg1；4：Re；5：NR4；6：NR2；7：Rb1；8：Rg2；9：S-Rh1；10：R-Rh1；11：Rb3；12：Rd；13：NK；14：Rk3；15：Rg3，IS：内标。
具体实施方式
为了更加清楚地阐释本发明的目的和技术方案，下面结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限以下实施例。实施例中使用到的试剂与仪器如下：
乙腈为色谱纯(Merck,Darmstadt,Germany)，超纯水由Milli-Q系统制备(Millipore,Bedford,MA,USA)纯化，甲酸为质谱纯(Tokyo Chemical Industry,Tokyo,Japan)，其他试剂为分析纯。15种人参皂苷对照品包括人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4。
Sartorius BT25S电子天平(Sartorius Inc.,Germany)，上海睿祺2200型超声波清洗机，5804R高速离心机(eppendorf,Hamburg,Germany)，Agilent 1290超高效液相色谱系统，AB Sciex 4000Q-trap三重四级杆质谱。
实施例1：
通过以下方法同时定量大鼠血浆中丹七通脉片15种人参皂苷类成分，所述方法包括以下步骤：
(1)单一对照品储备液的配制：分别精密称取人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4各5mg，置于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，分别制成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液；
(2)标准曲线工作溶液的配制：分别吸取适量体积的上述单一对照品储备液于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成各对照品浓度为40μg/mL的混合对照品储备液；吸取适量体积的上述混合标准品储备液，分别加入甲醇逐级梯度稀释，得到浓度分别为0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10、20、40μg/mL的标准曲线工作溶液；
(3)内标(IS)工作溶液的配制：精密称取地高辛5mg于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成浓度为1mg/mL的内标储备液；吸取适量体积的上述内标储备液，加入甲醇稀释，得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液；
(4)标准曲线的建立：取190μL大鼠空白血浆样品，加入内标工作溶液10μL，然后分别加入不同浓度的标准曲线工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；以血浆中各待测物对照品的浓度为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，建立各待测物的标准曲线；
(5)血浆样品制备：取200μL大鼠血浆样品，加入内标工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残渣用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；
(6)样品检测：使用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，色谱柱为BEH C18柱，规格为2.1×100mm，1.8μm，柱温为30℃，流动相为含0.1％甲酸的水溶液(A)和含0.1％甲酸的乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0–6min,5–20％(B)；6–11min,20–20％(B)；11–12min,20–21％(B)；12–12.1min,21–27％(B)；12.1–13min,27–30％(B)；13–20min,30–33％(B)；20–27min,33–55％(B)；27-28min,55-95％(B)；28–31min,95-95％(B)；31-32min,95-5％(B)；32–35min,5-5％(B)；流速为0.3mL/min，进样量为10μL；采用电喷雾离子源在负离子模式下进行检测，毛细管电压为-4.5kV，温度为550℃，Curtain Gas为25psi，GS1为55psi，GS2为55psi，Interface Heater为On。采用scheduled MRM模式，MRM离子对及参数设置见表1。将各待测物与内标的峰面积比值代入步骤(4)的标准曲线中，计算得到血浆中各个待测物的含量。
表1 15种人参皂苷类成分的MRM参数设置
实施例2：方法学考察
(1)标准曲线与线性范围：按照标准曲线的建立方法，以血浆中各待测物对照品的浓度为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，各待测物的标准曲线方程和线性范围见表2。
表2 15种人参皂苷类成分的标准曲线与线性范围
(2)准确度和精密度：采用LQC、MQC和HQC评价日间和日内的准确度和精密度，准确度和精密度相对标准偏差小于15％，表明建立的方法准确、可靠。日内和日间的精密度和准确度分别见表3和4。
表3 15种人参皂苷类成分的日内准确度和精密度
表4 15种人参皂苷类成分的日间准确度和精密度
(3)基质效应和提取回收率：采用LQC、MQC和HQC分别评价人参皂苷类成分提取回收率和基质效应。相对标准偏差小于15％，表明无明显的基质干扰，且提取回收率符合定量标准，结果如下表5所示。
表5 15种人参皂苷类成分的提取回收率和基质效应
从以上结果可以看出，本发明建立的基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱的分析方法，可以实现中药丹七通脉片中15种人参皂苷类成分在大鼠血浆中的同时定量分析，且表现出灵敏度高，专属性强的特点。
Claims (10)
1.一种同时定量大鼠血浆中丹七通脉片中所含的15种人参皂苷类成分的分析方法，所述15种人参皂苷类成分分别为：Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4，所述方法包括以下步骤：
(1)标准曲线工作溶液的配制
采用甲醇将15种人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4配制成梯度浓度范围在0.04-40μg/mL内的标准曲线工作溶液；
(2)内标(IS)工作溶液的配制
采用甲醇将地高辛配制成1μg/mL的内标工作溶液；
(3)标准血浆样品制备
取190μL大鼠空白血浆样品，加入内标工作溶液10μL，然后分别加入不同浓度的标准曲线工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋，离心，取上清，氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋离心，取上清转移至液相小瓶中；
(4)待测血浆样品制备
取200μL待测大鼠血浆样品，加入内标工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋，离心，取上清，氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋离心，取上清转移至液相小瓶中；
(5)样品检测
检测体系
使用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行检测，色谱柱为BEH C18柱，规格为2.1×100mm，1.8μm，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(B)，梯度洗脱程序如下：0–6min,5–20％(B)；6–11min,20–20％(B)；11–12min,20–21％(B)；12–12.1min,21–27％(B)；12.1–13min,27–30％(B)；13–20min,30–33％(B)；20–27min,33–55％(B)；27-28min,55-95％(B)；28–31min,95-95％(B)；31-32min,95-5％(B)；32–35min,5-5％(B)，采用电喷雾离子源在负离子模式下使用scheduled MRM进行检测；
标准曲线的建立
采用所述检测体系对标准血浆样品进行检测，以血浆中各待测人参皂苷对照品的浓度为横坐标，待测人参皂苷对照品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，建立各待测人参皂苷的标准曲线；
待测物含量的确定
采用所述检测体系对待测血浆样品进行检测，将各待测物与内标的峰面积比值代入所述的标准曲线中，计算得到血浆中各个待测物的含量。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的柱温为25℃、30℃、35℃或40℃。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的柱温为30℃。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的流动相流速为0.2mL/min、0.3mL/min或0.4mL/min。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的流动相流速为0.3mL/min。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的样品的进样量为2μL、5μL或10μL。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述超高效液相色谱的样品的进样量为10μL。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其中，MRM参数设置如下表中所示：
9.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所采用的电喷雾离子源参数如下：毛细管电压为-4.5kV，温度为550℃，Curtain Gas为25psi，GS1为55psi，GS2为55psi，InterfaceHeater为On。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分析方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)标准曲线工作溶液的配制
分别精密称取人参皂苷Rk3、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、NR2、Rg2、Rg3、Rg1、NR1、Rd、NK、Re、20-O-Glc-Rf、Rb3、Rb1、NR4各5mg，分别置于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，分别制成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液；分别吸取适量体积的上述单一对照品储备液于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成各对照品浓度为40μg/mL的混合对照品储备液；吸取适量体积的上述混合标准品储备液，分别加入甲醇逐级梯度稀释，得到浓度分别为0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10、20、40μg/mL的标准曲线工作溶液；
(2)内标(IS)工作溶液的配制
精密称取地高辛5mg于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成浓度为1mg/mL的内标储备液；吸取适量体积的上述内标储备液，加入甲醇稀释，得到浓度为1μg/mL的内标工作溶液；
(3)标准血浆样品制备
取190μL大鼠空白血浆样品，加入内标工作溶液10μL，然后分别加入不同浓度的标准曲线工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；
(4)待测血浆样品制备
取200μL待测大鼠血浆样品，加入内标工作溶液10μL，再加入正丁醇1mL，涡旋3min，4℃4000rpm离心10min，取上清900μL，40℃氮气吹干；残留物用100μL 20％乙腈水复溶，涡旋3min，4℃14000rpm离心10min，取上清90μL转移至液相小瓶中；
(5)样品检测
标准曲线的建立
采用所述检测体系对标准血浆样品进行检测，以血浆中各待测人参皂苷对照品的浓度为横坐标，待测人参皂苷对照品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归，建立各待测人参皂苷的标准曲线；
待测物含量的确定
采用所述检测体系对待测血浆样品进行检测，将各待测物与内标的峰面积比值代入所述的标准曲线中，计算得到血浆中各个待测物的含量。
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