KR100670237B1 - 홍화씨추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍화씨추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법에 관한 것이다. 본 발명은, 홍화씨로부터 추출ㆍ분리한 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드 3종의 페놀화합물 중 선택된 어느 2종 이상의 페놀화합물로 구성된 홍화씨추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 홍화씨로부터 추출ㆍ분리한 페놀화합물인 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드로 구성된 홍화씨추출물은 천연물로서 피부 부작용이 없으며, 피부의 항주름과 관련한 세포증식효과, 콜라겐합성효과 및 항산화효과에서 우수한 효과를 발휘함으로써, 이를 함유하는 화장료에 적용하는 경우에는 피부의 주름개선에 뛰어난 효과를 가져올 수 있다. 따라서 단순 화장용 제품으로서만이 아닌 특별한 기능성 효과를 발휘할 수 있으므로 제품의 상용화나 상품성에서 탁월한 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.

홍화씨, 세로토닌유도체, 리그난, 플라보노이드, 주름개선, 노화방지

Description

홍화씨추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법{Cosmetic composition containing Safflower Seed Extract and extraction method of cosmetic effective composition from Safflower Seed}

도 1은 본 발명에 따른 홍화씨로부터 화장료 유효성분을 추출하는 방법을 단계별로 설명하기 위한 공정 흐름도이다.

본 발명은 홍화(학명표기 : Carthamus tinctorius Linne, 국화과 Compositae)의 씨추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍화씨로부터 추출ㆍ분리된 페놀화합물(세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드)을 함유하는 피부의 주름개선 화장료 조성물 및 홍화씨로부터 관련 유효성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.

화장품 관련분야에서 피부의 노화를 억제하기 위하여 극복하여야 할 과제 중 주름생성의 억제 또는 주름개선은 매우 중요한 문제이다. 피부에 형성되는 주름은 연령이 높아짐에 따라 자연적으로 발생하기도 하지만, 주위의 유해한 환경으로 인한 섬유아세포의 대사과정이 원활하지 않아 발생하기도 한다. 섬유아세포는 피부의 진피층에 존재하며 세포외 간질에 콜라겐을 생성한다.

여성의 피부는 남성의 피부와는 달리 특징적으로 탄력적이고 부드럽고 촉촉하며, 피지의 분비가 적으며 털이 적은데, 그 이유는 여성호르몬의 영향 때문이다. 여성호르몬인 에스트로겐의 피부에 대한 생리적 작용을 살펴보면 진피에 있는 섬유아세포를 자극하여 콜라겐의 합성과 신진대사를 촉진시키며 또한 피부의 수분유지에 매우 중요한 히아루론산의 합성을 촉진시킴으로 피부에 탄력성, 부드러움, 유연성 및 보습성을 부여한다. 표피에 있는 기저세포의 증식효과를 증가시켜 표피를 좀 더 두텁게함으로써 피부의 세포조직을 강화시킨다. 그리고 피지선을 조절하여 피지선의 성장을 억제함으로써 피지의 생성을 감소시키며, 털의 성장속도를 늦추어 털을 가늘고 짧게 유지시킨다. 그러나 여성호르몬의 분비장소인 생식기관이 나이가 들어감에 따라 점차 기능이 퇴화되어 내분비성 노화를 촉진한다. 이것이 생리적인 피부노화이다.

여성호르몬의 결핍으로 섬유아세포는 콜라겐과 탄력섬유 등의 생성이 억제되어, 피부가 얇아지면 피부의 탄력이 감소한다. 여성호르몬의 결핍으로 인한 피부노화 현상을 억제하기 위한 해결 방법에 관한 연구결과들이 보고되고 있다. 호르몬 대체요법이 대표적인 것으로 부족한 여성호르몬을 직접 공급하는 것이다. 그러나 피부 화장료에서는 여성호르몬을 직접적으로 사용하지 못하기 때문에 다른 방법들이 강구되고 있다. 화장료에서 고려되는 부분은 보습제, 노화억제제, 자유라디칼소거제 및 자외선차단제 등을 처리하여 직접적인 여성호르몬 결핍에 따른 대처방안이 아니라 피부노화의 일반적 억제물질을 이용한 간접적인 대처방안이다.

즉, 피부노화를 억제하기 위한 화장료 시각에서 여성호르몬 유사물질은 섬유아세포의 증식효과와 더불어 콜라겐과 탄력섬유 합성의 증진효과를 갖는 물질이다.

홍화(紅花, 영명: Safflower)는 국화과(Compositae)에 속하는 일년생 초목으로서 잇꽃(Carthamus tinctorius Linne)의 꽃이고 종자를 홍화자라 한다(한국본초도감, 교학사, 1998). 홍화는 수용성의 황색색소(safflower yellow)와 불용성의 적색색소(carthamin)를 함유하고 있어 예로부터 염료로 널리 사용되어 왔으며(육창수, 한국본초학, 1981), 아울러 한방에서는 어혈, 통경 및 고지혈증 치료제로서 홍화탕 및 활혈통경탕 등의 처방제로 널리 이용되고 있다(본초학, 이상인, 1980).

홍화씨는 한국, 중국 및 일본 등지에서 진정 및 보혈 등의 약용으로 사용되어 왔으며(생약학, 한대석, 1995), 특히 미국 및 인도에서는 식용유 원료로 재배되고 있는 유용한 자원식물이다(안덕균, 육창수, 현대본초학, 1975). 특히 홍화씨유에는 리놀레산을 비롯한 다량의 불포화지방산과 토코페롤을 함유하고 있어 영양상으로 중요할 뿐 아니라, 항산화, 항혈전 및 항고혈압성 신소재로서 널리 이용되고 있다(박인규, 김봉제, 동의보감, 1989; Khan, A. R., Thesis, 18: 81-87, 1929). 반면, 홍화씨유 제조시 부산물로 얻어지는 홍화유박(oil cake)은 단백질 및 식이성 섬유소의 공급원으로서 중요할 뿐 아니라 세로토닌유도체와 리그난 및 플라보노이드와 같은 항산화성 페놀화합물을 함유하고 있다(Sakamura S. et al., Agric. Biol. Chem., 44(12): 2951-2954, 1980; Zhang, H. L. et al., Chem. Pharm. Bull., 44(4): 874-876, 1996; Zhang, H. L. et al., Chem. Pharm. Bull. 45(2): 1910-1914, 1997).

지금까지 국내외적으로 홍화씨의 약리적, 생리적 작용 및 그 주된 생리활성 물질의 분리 및 정제에 관한 많은 연구가 수행되어져 왔다. 홍화씨의 분말 및 추출물은 고지방 및 고콜레스테롤 식이 흰쥐의 지질대사 개선효과(김 등, 한국식품영양과학회지, 28: 625-631, 1999; 문 등, Nutrition Res., 21: 895-904, 2002; 조 등, 한국식품영양과학회지, 30: 112-118, 2001)가 우수하며, 또한 골절 및 골손실 억제효과가 있음이 보고되었다(김 등, 한국식품영양과학회지, 27: 698-704, 1998; 정 등, 약학회지, 43: 526-534, 1999; 서 등, 한국영양학회지, 33: 411-420, 2000). 그리고 홍화씨추출물은 티로시나제(tyrosinase) 저해제로서 멜라닌합성을 억제하는 효과가 있어 미백화장품 소재로서도 주목을 받고 있다(대한민국 공개특허공보 특2001-0084402, 특2002-0046616, 특2003-0001218).

홍화씨의 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드는 에스트로겐 유사활성을 지니고 있는 식물성에스트로겐(phytoestrogen) 성분으로서 기존의 식물성에스트로겐 화합물로 알려진 17 β-에스트라디올 및 제니스테인 성분과 유사하게 뼈 형성을 촉진함으로써 갱년기 여성의 골다공증을 예방할 수 있음을 세포실험 및 동물실험을 통하여 밝힌 바가 있다(김 등, Calcified Tissue Int., 71: 88-94, 2002). 이와 같이 홍화씨유 생산시 부산물로 대량 생산되는 유박에 함유되어 있는 세로토닌유도체와 같은 페놀화합물은 항고지혈증, 항골다공증 및 항산화작용을 가진 생리활성물질로써 크게 주목을 받고 있으며, 이를 식품이나 화장품 및 의약품 신소재로서 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이에 홍화씨의 생리활성물질인 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드를 식품, 화장품 및 의약품의 신소재로 활용하기 위해 이들 성분들을 대량 분리 및 정제하는 방법의 개발이 수행되어져 왔다. 이러한 기술적 연구개발의 배경에 기초하여 본 발명이 안출된 것이다.

본 발명에서는 천연물로서 피부부작용을 초래하지 않으면서도 세포증식효과, 콜라겐합성효과 및 항산화효과를 가지는 유효성분을 추출ㆍ분리하여 피부 화장료에 적용하기 위함에 본 발명이 이루고자하는 기술적 과제가 있으며, 이러한 기술적 과제를 달성하기 위한 홍화씨추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법을 제공함에 본 발명의 목적이 있다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위해 제공되는 홍화씨추출물을 함유하는 화장료 조성물은 홍화씨로부터 추출ㆍ분리된 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드 3종의 페놀화합물 중 선택된 어느 2종 이상의 페놀화합물로 구성된 홍화씨추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 화장료 조성물에 함유되는 홍화씨추출물은 상기 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 10중량%이면 바람직하다. 상기 추출ㆍ분리된 홍화씨추출물의 함량이 전체 화장료 중량대비 0.001중량% 미만인 경우에는 본래 목적하는 피부의 주름개선효과를 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 상기 추출ㆍ분리된 홍화씨추출물의 함량이 전체 화장료 중량대비 10중량%를 초과하는 경우에는 화장료의 안정성에 문제를 발생시킬 수 있으며, 이로 인하여 화장료의 외관이나 사 용시 충분한 화장효과를 발현시킬 수 없는 단점으로 인해 바람직하지 못하다.

한편, 상기 홍화씨추출물을 함유하여 제조된 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류와 같은 기초제품, 색조제품 및 두발제품의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 특히, 전술한 화장료 조성물은 피부의 주름개선용으로 이용되면 더욱 바람직하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제공되는 홍화씨 내 화장료 유효성분 추출방법은, (a)정선하여 선별된 홍화씨를 볶는 단계; (b)상기 볶은 홍화씨를 탈지시키는 단계; (c)상기 탈지된 홍화유박의 전체 중량 대비 2 내지 20배의 에탄올을 이용하여 화장료 유효성분을 추출하는 단계; 및 (d)상기 에탄올로 추출된 화장료 유효성분을 이온수지칼럼크로마토그래피 방법에 의해 분리 및 정제분말화시키는 단계;를 포함하여 진행하면 바람직하다. 이때, 상기 추출용매로 사용된 에탄올의 함량이 상기 수치한정범위를 벗어나는 경우에는 추출효과가 낮아지거나 또는 향후 용매 제거 작업에서 별도의 시간이나 부가적인 작업이 요해지므로, 수치한정범위 내에서 추출이 이루어지는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예, 실험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 또는 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 예들에 한정되는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명에 따른 실시예 및 실험예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것에 불과하므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

추출 실시예 1 내지 3

홍화씨로부터 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드와 같은 화장료 조성물로 이용하기 위한 유효성분인 페놀화합물의 분리 및 정제는 구체적으로 도 1을 참조하여 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 홍화씨로부터 화장료 유효성분을 추출하는 방법을 단계별로 설명하기 위한 공정 흐름도이다.

상기 도 1에 도시된 바에 따르면, 먼저 건조 홍화씨 100g을 250℃에서 10분간 볶은 후(S10), 100메시로 분쇄한 다음 여기에 100% 노르말-헥산 1L를 가하여 2시간 열탕에서 추출하여 기름을 제거하였다(S11). 상기 추출과정을 2회 반복 실시하여 지방을 제거하고 남은 유박(oil cake)에 70% 에탄올용액 1L를 가하여 열탕에서 2시간 추출ㆍ여과하였다. 상기 추출과정을 2회 반복 실시하여 얻은 에탄올추출액을 감압ㆍ농축하여 농축된 에탄올추출물을 얻었다(S12). 다음, 추출물 전량을 미리 20% 에탄올용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP-20(500g)으로 충진시킨 직경 5cm, 길이 50cm의 칼럼에 충진한 후 순차적으로 20% 에탄올용액, 40% 에탄올용액, 60% 에탄올용액, 80% 에탄올용액 및 100% 에탄올 2L를 각각 차례로 용출하였다. 이때, 40%(추출실시예 1), 60%(추출실시예 2) 및 80%(추출실시예 3) 에탄올용액 추출액을 회전식 증발건조기(rotary evaporator)로 40℃ 이하에서 감압ㆍ농축시 켜 하기 표 1과 같이 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드와 같은 페놀화합물을 함유한 정제분말로 홍화씨추출물을 얻었다(S13). 즉, 용출액으로 사용된 에탄올용액의 극성을 달리하여 추출실시예를 각각 구분하였으며, 각 실시예에 따른 홍화씨추출물의 수득량을 하기 표 1에 나타내었다.

추출 실시예	분획 추출용매	홍화씨추출물(mg)
1	40% 에탄올용액	53.1
2	60% 에탄올용액	554.4
3	80% 에탄올용액	184.3

상기 표 1의 홍화씨추출물 활성성분은 세로토닌유도체로서 N-페룰로일세로토닌(N-feruloylserotonin), N-(p-쿠마로일)세로토닌(N-(p-cumaroyl)serotonin) 및 N-페룰로일세로토닌글루코시드(N-feruloylserotonin glucoside)가 함유되어 있으며, 리그난 화합물로서 마타이레시놀(matairesinol), 8'-하이드록시악티제닌(8'- hydroxy arctigenin) 및 마타이레시놀글루코시드(matairesinol glucoside)가 함유되어 있으며, 플라보노이드 화합물로서는 루테오린(luteolin), 아카세틴 7-O-β-D-글루쿠로나이드(acacetin 7-O-β-D-glucuronide) 및 아카세틴(acacetin)으로 확인되었다. 이들 활성성분에 대하여 고속액체크로마토그래피로 함량(%)을 분석하여 하기 표 2에 나타내었다. 이때 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 조건은 다음과 같다.

크로마토그래피 : Dionex Summit HPLC

칼럼 : YMC-Pack Pro C₁₈(5㎛, 4.6 I.D.×250㎜)

검출기 : 자외부흡광광도계(측정파장 280, 310, 340㎜)

유속 : 1.0 ㎖/min

이동상 : 용매 A(0.03% 인산, 20% 수용성 메탄올용액), 용매 B(80% 수용성 메탄올용액)의 기울기 용리

활성성분	추출 실시예 1	추출 실시예 2	추출 실시예 3
N-페룰로일세로토닌	-	4.8	5.7
N-(p-쿠마로일)세로토닌	-	4.9	6.3
N-페룰로일세로토닌글루코시드	9.1	2.9	1.3
마타이레시놀	-	-	1.8
8'-하이드록시악티제닌	-	3.2	6.8
마타이레시놀글루코시드	20.8	17.8	-
루테오린	-	-	2.0
아카세틴 7-O-β-D-글루쿠로나이드	4.3	11.6	18.1
아카세틴	0.5	-	0.9

실험예 1

본 발명의 상기 추출 실시예 2에 따라 수득된 홍화씨추출물에 대하여 피부의 주름개선효과를 검정하는 세포증식효과를 보기 위하여 섬유아세포를 이용한 MTT 시험법[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide reduction method]을 수행하였다.

먼저, 인체 정상 섬유아세포(human normal fibroblast)를 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각 웰에 1×10⁴세포가 되도록 분주하여 소태아 혈청(fetal bovine serum) 10%가 포함된 디엠이엠(DMEM, sigma) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간동안 1차 배양한다. 상기 1차 배양단계 이후에 상기 추출 실시예 2에서 수득된 홍화씨추출물의 농도를 하기 표 3과 같이 조절하여 시럼(serum)이 없는 배지로 교체하여 48시간동안 2차 배양한다. 상기 2차 배양단계 이후, MTT 용액(1㎎/㎖, sigma) 100㎕씩을 배지에 첨가한 후, 4시간동안 방치한 다음 배지를 제거한다. 각 웰당 디메칠설폭사이드(dimethyl sulfoxide, sigma) 용액 100㎕씩을 가하여 20분간 교반한 후, 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader)로 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 MTT 시험에서의 대조군은 홍화씨추출물을 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였으며, 홍화씨추출물의 농도에 따라 각각 3회씩 측정된 흡광도의 평균값으로 하기 수학식 1에 따라 계산하여 하기 표 3에 나타내었다.

한편, 홍화씨추출물의 세포증식효과를 판단하기 위하여 식물성 여성호르몬인 피토에스트로겐(phytoestrogen)으로 알려진 호장근으로부터 분리된 레즈베라트롤-80(resveratrol-80, Polygonum Cuspidatum Root Extract, 순도 80% 이상, 바이오스펙트럼)과 대두의 제니스테인-90(genistein-90, Soy Isoflavones, 순도 90% 이상, 바이오스펙트럼) 2종을 비교군으로 설정하여, 홍화씨추출물과 동일한 패턴으로 비교군의 농도를 달리하면서 각 농도별 각각 3회씩 흡광도를 측정하여 평균값을 구하고, 하기 수학식 1에 따라 계산된 결과를 하기 표 3에 함께 나타내었다.

즉, 하기 표 3은 상기 추출 실시예 2로 수득된 홍화씨추출물의 농도를 달리하여 위 방법에 따라 측정한 결과 및 비교군에 대한 결과와 하기 수학식 1을 이용하여 세포의 생존능력을 수치로 계산하여 나타낸 결과이다.

농도(㎍/㎖)	홍화씨추출물		레즈베라트롤-80		제니스테인-90
	흡광도	증식효과	흡광도	증식효과	흡광도	증식효과
0	0.434	100	0.434	100	0.434	100
1	0.504	116	0.468	108	0.423	-
10	0.531	122	0.482	111	0.519	120
50	0.566	130	0.553	127	0.551	127
100	0.644	148	0.139	-	0.406	-

상기 표 3에서 보는 바와 같이 상기 추출 실시예 2에 의한 홍화씨추출물로 처리한 섬유아세포는 저농도(1㎍/㎖)에서도 세포증식효과가 있으며, 100㎍/㎖의 농도에서도 세포증식효과가 촉진됨을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 실시예에 의한 홍화씨추출물은 세포증식효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 홍화씨추출물은 비교군으로 사용하였던 대표적인 식물성 여성호르몬인 제니스테인에 비하여 우수한 세포증식효과를 보였다.

실험예 2

본 발명의 상기 추출 실시예 2에 따라 수득된 홍화씨추출물에 대하여 피부주름개선의 효과를 검정하는 콜라겐 합성율을 섬유아세포의 배양에 의해 측정하였다. 실험예 1과 동일한 사람의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast)를 96-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2×10⁴세포/웰) 37℃, 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 추출 실시예 2에서 수득한 홍화씨추출물을 농도별로 첨가한 시럼(serum)이 함유되지 않은 디엠이엠(DMEM) 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 마지막 24시간 전에 아스코빅 애씨드(ascorbic acid : 50㎍/㎖)을 첨가하여 콜라겐합성을 촉진시켰다. 각 웰을 세척하고 시럼(serum)이 함유되지 않은 디엠이 엠(DMEM) 배지로 교체한 후 24시간 더 배양하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정키트(Procollagen Type ⅠC-Peptide EIA kit, Takara Bio Inc., 일본)를 이용하여 프로콜라겐 타입Ⅰ C-펩타이드(Procollagen Type I C-Peptide, 이하 'PICP'라 약하기도 함)의 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준 농도곡선을 작성하였다. 각 웰에 퍼록시다제(peroxidase) 효소가 붙어 있는 항체용액을 100㎕ 첨가하고 농도별로 희석한 표준용액과 상기 배양된 배지의 상층액을 각각 20㎕씩 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합액을 37℃에서 3시간 방치한 후 내용물을 모두 제거하고 각각의 웰을 인산완충용액(phosphate-buffered saline) 400㎕로 4회 세척하였다. 상기 웰에 100㎕의 기질용액인 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 첨가한 후 상온에서 15분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위하여 1N 황산용액 100㎕를 첨가하여 혼합한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. PICP양은 표준 농도곡선에 시료의 흡광도를 대입하여 계산하였으며, ng(10^-9g)/(2×10⁴세포)의 단위로 환산하였다.

이 때 홍화씨추출물의 콜라겐합성효과를 판단하기 위하여 대표적인 식물성 여성호르몬인 사이토에스트로겐(phytoestrogen)으로 알려진 호장근의 레즈베라트롤-80(resveratrol -80, Polygonum Cuspidatum Root Extract, 순도 80% 이상, 바이오스펙트럼)과 대두의 제니스테인- 90(genistein-90, Soy Isoflavones, 순도 90% 이상, 바이오스펙트럼) 및 아스코빅애씨드를 3종의 비교군으로 각각 설정하여, 각각 2회씩 실시하여 평균값을 구하였다.

하기 표 4에 상기 추출 실시예 2로 수득된 홍화씨추출물의 농도를 달리하여 사용한 실험 결과 및 상기 3종의 비교군에 대해 실시한 실험 결과를 나타내었다.

농도(㎍/㎖)	홍화씨추출물	레즈베라트롤-80	제니스테인-90	아스코빅애씨드
0.1	253	154	110	220
1	230	160	100	280
10	200	152	71	320

상기 표 3에서 보는 바와 같이 상기 추출 실시예 2에 의한 홍화씨추출물의 콜라겐합성능은 저농도에서 콜라겐 합성량이 증가함을 볼 수 있고, 비교군으로 사용한 대표적인 식물성 여성호르몬인 제니스테인에 비하여 매우 탁월한 효과가 나타남을 알 수 있다. 또한, 실험 농도에서 홍화씨추출물의 콜라겐합성능력은 아스코빅애씨드에 상당하는 것으로 나타난 것을 확인할 수 있다.

실험예 3

본 발명의 상기 추출 실시예 2에 따라 수득된 홍화씨추출물에 대하여 피부주름개선의 효과를 검정하는 항산화효과를 알아보기 위하여 자유라디칼소거시험(Free Radical Scavenging Activity Test)과 활성산소소거시험(Superoxide Dismutase- like Scavenging Activity Test)을 실시하였다.

자유라디칼소거시험은 안정한 자유라디칼인 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 라디칼(DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, sigma)을 사용하는 방법으로 0.2mM DPPH 용액 1㎖에 상기 추출 실시예 2에 따라 수득된 홍화씨추출물 각각의 농도를 메탄올에 녹여 2㎖로 하여 혼합하고, 실온에서 10분간 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

한편, 상기 자유라디칼소거시험에서의 대조군은 시료액 대신 메탄올을 넣어 같은 방법으로 측정하며, DPPH 용액 대신 메탄올을 넣어 추출물 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 2를 이용하여 자유라디칼소거율을 수치로 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

활성산소소거시험은 잔틴/잔틴옥시다제(xanthine/xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루테트라졸리움(NBT, nitroblue tetrazolium)의 산화에 의한 흡광도 변화를 측정하였다. Na₂CO₃ 2.4㎖, xanthine 0.1㎖, EDTA 0.1㎖, BSA 0.1㎖, NBT 0.1㎖ 및 추출물 시료 0.1㎖을 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 정치한 다음 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

한편, 상기 활성산소소거시험에서의 대조군은 추출물 시료 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하며, 잔틴옥시다제 대신 정제수를 넣어 추출물 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 3을 이용하여 잔틴옥시다제저해율을 수치로 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

이 때 홍화씨추출물의 항산화효과를 비교하기 위하여 식물성 여성호르몬으로 알려진 호장근의 레즈베라트롤-80(resveratrol-80, Polygonum Cuspidatum Root Extract, 순도 80% 이상, 바이오스펙트럼)과 대두의 제니스테인-90(genistein-90, Soy Isoflavones, 순도 90% 이상, 바이오스펙트럼)을 2종의 비교군으로 설정하여, 각각 2회씩 실시하여 평균값을 구하였다.

하기 표 5에서, IC₅₀은 각 자유라디칼과 활성산소 소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 추출물 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 항산화 활성이 강함을 의미한다.

시료	자유라디칼소거율, IC50(mg)	활성산소소거율, IC50(mg)
홍화씨추출물	0.049	0.081
레즈베라트롤-80	0.035	0.059
제니스테인-90	-	0.333

상기 표 5에서 보는 바와 같이 상기 추출 실시예 2에 의한 홍화씨추출물의 항산화활성은 실험농도 1mg에서 약 15%의 소거효과를 보인 대표적인 식물성 여성호르몬인 대두추출물 제니스테인에 비하여 자유라디칼소거능은 50배, 활성산소소거능은 4배의 향상된 항산화효과를 보이는 것으로 나타난 것을 알 수 있었다.

제형 실시예 1 및 그 비교예 1

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.1	0.1
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.1	0.1
4	부틸렌글라이콜	2.0	2.0
5	글리세린	1.0	1.0
6	피이지-1500	0.5	0.5
7	에탄올	4.0	4.0
8	폴리소르베이트 80	0.2	0.2
9	트리에탄올아민	0.1	0.1
10	방부제	미량	미량
11	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.1	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 유연화장수의 성분구성을 상기 표 6과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표 6의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형 실시예 1에 대한 그 비교예 1은 성분 11을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

제형 실시예 2 및 그 비교예 2

번호	성 분	제형 실시예 2	제형 비교예 2
1	세테아릴알코올	1.0	1.0
2	글리세릴스테아레이트	0.5	0.5
3	폴리소르베이트 60	1.0	1.0
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	4.0	4.0
7	마카데이나넛오일	4.0	4.0
8	부틸렌글라이콜	4.0	4.0
9	글리세린	4.0	4.0
10	카보머	0.1	0.1
11	산탄검	0.03	0.03
12	방부제	미량	미량
13	정제수	잔량	잔량
14	아르기닌	0.1	0.1
15	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.2	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 영양화장수의 성분구성을 상기 표 7과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표 7의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 8 내지 12를 성분 13에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 성분 14로 중화하고, 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 8에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 2에 대한 그 비교예 2는 성분 15인 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

제형 실시예 3 및 그 비교예 3

번호	성 분	제형 실시예 3	제형 비교예 3
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.2	0.2
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.1	0.1
4	부틸렌글라이콜	8.0	8.0
5	글리세린	5.0	5.0
6	소듐히아루로네이트	10.0	10.0
7	에탄올	2.0	2.0
8	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.1	0.1
9	트리에탄올아민	0.2	0.2
10	방부제	미량	미량
11	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.5	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 에센스의 성분구성을 상기 표 8과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표 8의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 5 및 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형 실시예 3에 대한 그 비교예 3은 성분 11인 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

제형 실시예 4 및 그 비교예 4

번호	성 분	제형 실시예 4	제형 비교예 4
1	세테아릴알코올	1.5	1.5
2	글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
3	폴리소르베이트 60	1.0	1.0
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	8.0	8.0
7	아프리코드커넬오일	4.0	4.0
8	디메치콘	2.0	2.0
9	부틸렌글라이콜	4.0	4.0
10	글리세린	4.0	5.0
11	마그네슘알루미늄실리케이트	0.4	0.4
12	산탄검	0.03	0.03
13	방부제	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
15	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.2	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 영양크림의 성분구성을 상기 표 9와 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표 9의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 8을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 9 내지 13을 성분 14에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 9에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 4에 대한 그 비교예 4는 성분 15인 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

제형 실시예 5 및 그 비교예 5

번호	성 분	제형 실시예 5	제형 비교예 5
1	정제수	잔량	잔량
2	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
3	글리세린	1.5	1.5
4	폴리비닐알코올	3.0	3.0
5	폴리비닐피롤리돈	12.0	12.0
6	셀룰로오스검	0.3	0.3
7	마이카	2.0	2.0
8	카올린	2.0	2.0
9	에탄올	5.0	5.0
10	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5	0.5
11	방부제	미량	미량
12	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.2	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 영양팩의 성분구성을 상기 표 10과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표 10의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 첨가한 후, 성분 4 내지 6을 가하여 교반 분산시키면서 70℃로 가열한다. 다음 성분 7 내지 8을 가하여 충분히 분산시킨 고 56℃의 온도로 냉각한다. 성분 10 내지 11을 성분 9에 용해시킨 물질과 분취된 성분 2에 용해시킨 성분 12를 차례로 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 5에 대한 그 비교예 5는 성분 12인 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

제형 실시예 6 및 그 비교예 6

번호	성 분	제형 실시예 6	제형 비교예 6
1	스테아릭애씨드	2.0	2.0
2	세테아릴알코올	0.5	0.5
3	글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
4	폴리소르베이트 60	0.5	0.5
5	소르비탄세스퀴올리에이트	0.7	0.7
6	하이드로제네이티드랩씨드오일	2.0	2.0
7	해바라기유	5.0	5.0
8	스쿠알란	6.0	6.0
9	세틸옥타노에이트	4.0	4.0
10	사이클로메치콘	2.0	2.0
11	부틸렌글라이콜	5.0	5.0
12	글리세린	3.0	3.0
13	마그네슘알루미늄실리케이트	0.6	0.6
14	산탄검	0.05	0.05
15	이산화티탄	10.0	10.0
16	탈크	3.0	2.5
17	하이드레이티드페릭옥사이드	1.3	1.3
18	페릭옥사이드	0.3	0.3
19	페러스-페릭옥사이드	0.15	0.15
20	방부제	미량	미량
21	정제수	잔량	잔량
22	추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물	0.2	-

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 함유한 파운데이션의 성분구성을 상기 표 11과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다. 한편, 상기 표11의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 10을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 11 내지 20을 성분 21에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 11에 용해시킨 성분 22를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 6에 대한 그 비교예 6은 성분 22인 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

피부의 안전성 실험

상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물에 대한 피부안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 제형예 4와 그 비교예 4에서 제조된 영양크림 대하여 한국식품의약품안전청 기준 피부안전성 검사법을 따라 인체 첩포시험을 실시하였다.

피험자로 20세 이상 45세 이하의 건강한 성인 남여 30명을 선정하였고, 첩포시험은 등의 정중선을 피해 양측 등에 부착하였으며 48시간 동안 부착하고 48시간이 지난 후 첩포를 제거하였다. 약 60분간 안정을 취하도록 한 후 첫 판독을 시행하였고, 첩포 부착 후 96시간이 경과한 후 판독을 시행하였다. 판정기준은 하기 표 12에 나타낸 바와 같다.

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포
+++	3	대수포

첩포 부착 후 48시간과 96시간에 판독한 결과를 하기 수학식 4를 이용하여 영양크림 시료에 대한 피부 반응도를 산출하였다.

첩포시험의 검사 결과에 근거하여 계산된 양성 반응을 보인 영양크림 시료의 피부 자극도를 하기 표 13에 나타내었다.

시료	48시간				96시간				반응도(%)
	±	+	++	+++	±	+	++	+++	48시간	96시간	평균
제형 실시예 4	.	.	.	.	.	.	.	.	0.00	0.56	0.28
제형 비교예 4	.	.	.	.	.	.	.	.	0.00	0.00	0.00

상기 표 13에서 보는 바와 같이 함유하는 제형 실시예 4 및 그 비교예 4에서 제조된 영양크림 시료의 피부반응도는 각각 0.28과 0.00으로, 하기 표 14에 따른 피부 반응도 판정 기준에 의하면 무자극으로 민감한 피부에 사용해도 좋은 결과로 나타났다. 따라서 상기 추출 실시예 2에 따른 홍화씨추출물은 천연물로서 피부부작용이 전혀 없는 안전한 성분으로 나타났다.

피부의 평균 반응도	판정 기준
0.0 ~ 0.9	무자극
1.0 ~ 2.9	경자극
3.0 ~ 4.9	중자극
5.0 이상	강자극

피부의 주름개선효과 측정 실험

본 발명에 따른 추출 실시예 2의 홍화씨추출물을 함유하는 제형 실시예를 실제 피부에 적용한 적용예와 이에 대비되는 비교예를 하기와 같이 설정하여 피부에 대한 주름에 영향을 미치는 정도에 대한 상대적 비교시험을 실시하였다.

즉, 제형 실시예 4와 그 비교예 4의 영양크림을 피부에 각각 도포했을 때 피부의 주름개선 효과를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성층으로서 정상, 지성, 건성, 복합성 피부의 소유자 20명에게 안면 왼쪽 부분에는 제형 실시예 4의 영양크림(적용예)을, 안면 오른쪽 부분에는 제형 비교예 4의 영양크림(대조군)을 아침과 저녁으로 1일 2회 8주간 지속적으로 사용하게 하였다. 적용예 또는 대조군을 사용하기 전 및 도포 후 8주 시점에서 각각 항온ㆍ항습(22±2℃, 50±5% RH) 조 건에서 실리콘(Silflo, Flexico Ltd., England)을 이용하여 피험자의 시험 부위에 레플리카(replica)를 제작하였다. 이렇게 제작된 레플리카는 주름의 깊이와 피부의 거칠기를 측정하는 컴퓨터 영상 시스템인 스킨비지오메터(Skin Visiometer SV 600, CK Electronic GmbH)를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 R1 내지 R5의 값으로 나타내었다. 여기서 R1은 피부거칠기(skin roughness), R2는 최대거칠기(maximum roughness), R3는 평균거칠기(average roughness)를 각각 나타내며, 이들(R1 내지 R3)은 피부주름의 깊이 정도를 나타내는 지수이며, R4는 수학적 평균거칠기(arithmetic average roughness), R5는 매끈한 정도(smoothness depth)를 각각 나타내며, 이들(R4 및 R5)은 피부의 거칠음 정도를 나타내는 지수이다.

상기에서 측정된 R1 내지 R5의 결과를 하기 수학식 5를 이용하여 주름감소율을 산출하여 평균값을 표 15에 나타내었다.

	R1 감소율	R2 감소율	R3 감소율	R4 감소율	R5 감소율
제형 실시예 4	19.90	19.74	21.38	22.13	19.62
제형 비교예 4	2.04	1.51	4.22	7.69	7.87
주름개선효과	17.86	18.23	17.16	14.44	11.75

상기 표 15에서와 같이 제형 비교예 4를 사용한 경우에 비하여 본 발명의 추출 실시예 2의 홍화씨추출물을 함유한 제형 실시예 4의 영양크림을 사용한 경우에 주름깊이(R1 내지 R3)의 감소 및 거칠음(R4 및 R5)의 감소가 나타남을 알 수 있었다.

결과적으로 상기 표 15에 나타난 결과를 통해 확인할 수 있는 사실은 본 발명에 따른 추출 실시예 2에 의해 제조된 홍화씨추출물을 함유하는 화장료는 피부의 주름개선에 우수한 효과를 발휘하고 있음을 알 수 있었다.

이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다.

본 발명에 따르면, 홍화씨로부터 추출ㆍ분리한 페놀화합물인 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드로 구성된 홍화씨추출물은 천연물로서 피부부작용이 없으며, 피부의 항주름과 관련한 세포증식효과, 콜라겐합성효과 및 항산화효과에서 우수한 효과를 발휘함으로써, 이를 함유하는 화장료에 적용하는 경우에는 피부의 주름개선에 뛰어난 효과를 가져올 수 있다. 따라서 단순 화장용 제품으로서만이 아닌 특별한 기능성 효과를 발휘할 수 있으므로 제품 상용화나 상품성에서 탁월한 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (7)

1. 홍화씨로부터 추출ㆍ분리한 세로토닌유도체, 리그난 및 플라보노이드 3종의 페놀화합물 중 선택된 어느 2종 이상의 페놀화합물로 구성된 홍화씨추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 홍화씨추출물 함유 피부주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물에 함유되는 홍화씨추출물 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 10중량%인 것을 특징으로 하는 홍화씨추출물 함유 피부주름 개선용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 홍화씨추출물 함유 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류 중 선택된 어느 하나의 제형으로 제조됨에 이용되는 것을 특징으로 하는 홍화씨추출물 함유 피부주름 개선용 화장료 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 홍화씨추출물 함유 화장료 조성물은 기초제품 화장료, 색조제품 화장료 및 두발제품 화장료 중 선택된 어느 하나의 화장료 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 홍화씨추출물 함유 피부주름 개선용 화장료 조성물.
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