KR100967073B1

KR100967073B1 - 개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부미백 개선 화장료조성물

Info

Publication number: KR100967073B1
Application number: KR1020080031446A
Authority: KR
Inventors: 유병삼; 문지영; 김재우; 윤명석; 김주호; 임현주; 고재숙; 백지훈
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2010-07-01
Also published as: KR20090105999A

Abstract

본 발명은 피부 미백 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎 추출물이 티로시나아제(tyrosinase)활성을 저해하는 작용과 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2 와 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용이 있음을 밝혔다. 또한 인체 피부 일차 자극 시험을 통해 자극이 없고, 각질량을 감소시키는 등의 안전성과 높은 피부 보습효과를 확인하였으며, 이를 함유한 화장료 조성물은 피부에 매우 안전하며, 높은 피부 미백 개선효과를 나타내므로 이런 효능을 갖는 개서어나무 잎 추출물을 피부 미백 개선용 화장료 조성물에 사용하고자 하는 것이다.

개서어나무추출물, 피부미백, 티로시나아제, 화장료

Description

개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부미백 개선 화장료 조성물{cosmetic compositions containing extract of Carpinus tschonoskii used for skin whitening}

본 발명은 피부 미백 개선 효과를 갖는 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 추출물에 관한 것으로, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎 추출물이 티로시나아제(tyrosinase)활성을 저해하는 작용과 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2 와 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용이 있음을 밝혔다. 또한 인체 피부 일차 자극 시험을 통해 자극이 없고, 각질량을 감소시키는등의 안전성과 높은 피부 보습효과를 확인하였으며, 이 원료를 함유한 화장료 조성물은 피부에 매우 안전하며, 높은 피부 미백 개선효과를 나타내므로 이런 효능을 갖는 개서어나무 잎 추출물을 피부 미백 개선용 화장료 조성물에 사용하고자 하는 것이다.

현재 화장품 업계에서는 과도한 멜라닌(melanin) 생성으로 인한 인체의 기미, 주근깨, 검버섯 형성 및 피부 노화 촉진을 억제하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다(J. H. Kway, et al.. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 19(6), 2004). 척추동물 피부의 멜라노사이트(melanocyte)는 신경관 세포 유래의 수지상 세포이며 피부, 눈, 귀, 중추신경계 등에 존재하고 있다. 멜라노사이트 내의 고도로 분화된 막 결합 세포 내 기관인 멜라노좀(melanosome)에서 멜라닌의 합성이 이루어지며 이것이 피부, 모발 등의 착색에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ken-ichi, et al. J. Proteome research, 2, 69-79 (2003)). 멜라닌 색소는 갈색이나 검은색을 띄는 eumelanin과 황색 또는 홍갈색인 pheomelanin의 2가지 종류가 있으며 이들은 L-티로신으로부터 생성된다. L-티로신은 멜라닌의 metabolic precursor로서 티로시나아제와 O₂로 인해 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 바뀐다. DOPA가 산화되어 DOPA quinone을 형성하게 되고 이것은 quinine 중간체와 높은 반응성을 갖는 thiol류의 물질들에 의해 eumelanin이나 pheomelanin을 생성하게 한다. Glutathione, cysteine, thioredoxin과 같은 thiol물질들이 존재할 경우 DOPA는 cysteinyl DOPA를 형성하고 이것에 의해 pheomelanin이 생성된다. Thiol 물질들이 없어지면 DOPA quinone은 DOPA chrome을 형성한 후 TRP-2(tyrosinase related protein-2)에 의해 tautomerization이 촉진되어 안정한 중간체인 DHICA(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)를 생성한다. 여기에 티로시나아제와 TRP-1(tyrosinase related protein-1)에 의해 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid가 형성되고, 이것으로부터 DHICA Eumelanin이 생성된다. Eumelanin의 다른 종류인 DHI Eumelanin은 DOPA chrome에서 CO₂가 빠지면서 생긴 DHI(5,6-dihydroxy indole)에 티로시나아제가 작용하여 생긴 indole-5,6-quinone으로부터 형성되게 된다(Shola, S. et al. Veterinary Dermatology, 14, 57-65 (2003)). 표피의 멜라노 사이트는 dendritic process를 매개로 하여 주변의 케라티노사이트(keratinocyte)들과 긴밀한 관계를 가지고 있기 때문에 생성된 멜라닌 중합체들을 케라티노사이트를 통해 운반할 수 있게 되고 결과적으로 피부, 모발 등의 착색이 이루어지는 것이다(Prota, G. et al. J. Invest. Dermal, 75, 122-126 (1980), Sober, A.J. et al, Prog Chem Org Natural Products , 31, 521-582 (1974)). 지금까지 알려진 티로시나아제 저해제로 hydroquinone, 4-hydroxyanisole, ascorbic acid, kojic acid, azelaic acid 등이 있으나 피부 안전성, 제형 안정성 등의 문제로 제한된 양만 사용되고 있다(G. Imokawa et al, Cancer Res. 42, 1994-2002 (1982), M. Masuda, et al, Cosmetics & Tolietries, 111, 65-77 (1996)). 이런 이유로 기능성 화장품의 원료로 최근 자연주의와 자연성분을 선호하며 다양한 한방 및 천연자원을 원료로 한 화장품 개발이 활발히 진행되고 있다. 한방이나 천연물을 사용한 화장품은 장기간 사용하여도 부작용이 적고, 그 효과가 지속적이며, 전반적으로 피부를 좋게 한다는 것이 큰 장점이라고 할 수 있다(J. N. Eom, et al. J. SOC. Cosmet Scientists Korea . 30, 93-102 (2004)).

개서어나무 추출물에 대한 선행 발명으로는 세포보호작용을 갖는 개서어나무 추출물(대한민국공개특허번호 10-2008-0009845)과 개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부주름 개선 화장료 조성물(대한민국 출원번호 10-2007-0045764)이 있다.

본 발명자는 안전성이 입증된 천연물 중 미백 활성을 검색한 결과 개서어나 무 잎 추출물의 정제 분획물이 티로시나아제(tyrosinase) 저해 효과가 있고, 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2및 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용이 우수함을 발견하였다. 또한 인체 피부 일차 자극 시험을 통해 자극이 없고, 각질량을 감소시키는 등의 안전성과 높은 피부 보습효과를 확인하였으며, 이 원료를 함유한 화장료 조성물은 임상 시험을 통해 피부에 매우 안전하며, 높은 피부 미백 개선효과를 나타내는 것을 확인하였다.

개서어나무(Carpinus tschonoskii)는 중국, 일본, 우리나라 남부에 자생하며 낙엽 교목으로 높이 15m, 지름 1m.이다. 수피는 회색이며, 잎은 난형*타원형으로 길이 5~12cm, 너비 3~4cm이며 점첨두, 원저이고 불규칙한 복거치가 있으며 뒷면에 털이 있고, 측맥은 14~16쌍이다. 수꽃은 처지고 각 포에 1개씩 달리며, 암꽃은 대가있고 처지고 2개씩 달리며 길이 4~8cm의 화서를 이루고 4~5월에 개화한다. 과수축에는 털이 있으며, 과포는 난상 피침형으로 길이 2~3.2cm이며 첨두이고 가장자리 한측면만 거치가 있고, 견과는 삼각상 난형으로 윗부분에 털이 있으며 10월에 성숙한다. 주로 기구재·곡목(曲木)·세공·활자, 표고버섯 재배용 목재 등으로 쓰고 수형이 깔끔하여 공원수로 심는다. 개서어나무 잎의 주요 성분으로는 미리세틴(myricetin), 캄페롤(kaempferol) 및 쿠에르세틴(quercetin) 등이 동정되었다(Chang et al., Biochem. Syst. Ecol. 32, 35-44 (2004)).

본 발명은 개서어나무 잎을 60~95중량% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 에탄올추출물과 개서어나무잎의 에탄올추출물을 에틸아세테이트로 용매 분획한 분획물을 피부미백성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추출용매로는 에탄올 이외에도 메탄올, 초임계 이산화탄소 유체, 액체질소 등이 사용가능하다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 개서어나무 잎 추출물 또는 용매 분획물의 함량은 0.02 내지 15 중량%의 양으로 포함되는 것이 바람직하다.

개서어나무 잎 추출물 또는 용매 분획물의 함량이 0.02 중량% 이하이면 본 발명의 피부미백효과를 기대하기 어려우며,15 중량% 이상 이면 제제화에 어려움이 있다.

본 발명의 개서어나무잎 추출물을 함유하는 화장료조성물은 일반화장수, 유액, 크림제, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등으로 제공될 수 있으며, 통상적인 제제화 방법에 따라 제형화 할 수 있다.

본원발명의 개서어나무 잎 추출물은 티로시나아제(tyrosinase)활성을 저해하는 작용과 멜라닌 형성세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2 와 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용을 나타내며, 이를 함유하는 미백용 화장료조성물은 사람에게 사용했을 때 매우 안전하면서도 색소 침착을 감소시키는 효과를 나타내어 안전한 피부 미백 개선용 기능성 화장품을 제공한다.

실시예 1: 개서어나무 잎 에탄올 추출물의 제조

개서어나무 잎은 한라수목원에서 채취, 동정되었다. 시료를 정제수로 세척하고 건조하여 분쇄하였다. 건조 분쇄된 개서어나무 잎 150g을 80% 에탄올 5L로 상온에서 초음파를 이용하여 4시간 동안 추출한 후 어드반텍 NO. 4 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)여과포로 여과한다. 여액을 감압회전농축기를 이용하여 건조중량 19.3g 을 얻었다.

실시예 2: 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 제조

실시예 1에서 얻은 개서어나무 잎 에탄올 추출물에 대해 용매분획을 실시하였다.

개서어나무 잎 에탄올 추출물 12g을 물에 분산시킨 후 헥산과 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 용매분획을 실시하여 헥산분획 1.29g, 클로로포름 분획 0.82g, 에틸아세테이트 분획 1.98g, 부탄올 분획 2.53g, 물 분획 1.74g을 얻어냈다.

실험예 1: 티로시나아제 저해 효과 실험

본 실험예에서는 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 시료들의 미백 활성을 확인하기 위하여 식품의약청안전청에 고시된 방법을 변형하여 티로시나아제 저해 실험을 하기와 같이 수행하였다.

수득한 시료들을 포함하는 인산화 완충용액 50 ㎕에 150 units/㎖ 버섯 티로시나아제 40 ㎕와 1.5 mM L-티로신 60 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, 37℃에서 10분간 반응시키고 반응 생성물인 도파크롬에 대한 흡광도를 475 ㎚에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 양성 대조 군(positive control)으로 알부틴을 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행한 후, 개서어나무 잎 에탄올 추출물과 용매 분획을 통한 정제 분획물들의 버섯 티로시나아제 활성 억제정도를 비교하였다. IC₅₀은 저해율이 50%일 때의 샘플농도로서, 3번의 반복실험으로 계산되었다.

티로시나아제 저해 효과

시료	저해율(%)				IC₅₀(㎍/㎖)
시료	50㎍/㎖	100㎍/㎖	200㎍/㎖	400㎍/㎖	IC₅₀(㎍/㎖)
에탄올 추출물	19.9	27.8	39.1	45.1	-
헥산 분획	26.7	30.4	32.8	38.8	-
클로로포름 분획	28.3	35.7	44.3	54.7	307.8
에틸아세테이트 분획	26.0	36.7	67.4	83.8	143.7
부탄올 분획	29.3	33.6	39.7	49.4	-
물 분획	16.2	18.1	18.6	30.7	-
알부틴	31.3	50.4	72.7	-	99.3

표 1에서 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 추출물들과 정제 분획물들의 티로시나아제 저해 효과는 농도에 의존하여 증가 되었다. 특히 에틸아세테이트 분획물이 에탄올 추출물 보다 약 2배 이상 저해 효과가 높음을 확인하였다. 따라서, 에틸아세테이트 분획물에 티로시나아제를 저해하는 유효 활성 성분이 존재함을 예상할 수 있다.

실험예 2. B16 melanoma 세포에서 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2의 mRNA 발현 저해 효과

본 실험예에서는 실시예 1과 2에서 수득한 시료들 중 티로시나아제 저해 효과가 가장 높았던 에틸아세테이트 정제 분획물에 대해 B16 melanoma 세포에서 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2의 mRNA 발현 저해 효과 실험을 수행하였다.

Total RNA 추출은 TRIzol-reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리(12000rpm, 15min)하였다. 상등액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 원심분리(12000rpm, 5min)하여 RNA를 침전시키고 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonat)가 처리된 75%에탄올로 세척한 후 건조시켜 0.1% DEPC 증류수로 녹였다. 260nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, 흡광도260/흡광도280nm의 비율이 1.6~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 선발하여 사용하였다.

cDNA 합성은 Improm-Ⅱ^TM cDNA kit (promega, USA)를 이용하여 1㎍의 total RNA를 oligo(dT) primer, dNTP(0.5μM), 1unit RNase inhibitor 그리고 Improm-Ⅱ^TM reverse transcriptase(2U)로 25℃ 에서 5분, 42℃에서 60분, 그리고 75℃에서 10분간 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다.

Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β-actin을 증폭하기 위하여 1㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10X buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl₂, 1unit Taq poylmerase (promega, USA)를 이용하여 PCR를 실시하였다. PCR증폭은 94℃ 30초, 57~62℃ 45초, 72℃ 45초 25 cycles로 반응시켰다. PCR에 의해 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고, 각 밴드의 density는 Quantity One 1-D Image Analysis Software (Bio-rad. USA)를 이용하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 β-actin의 primer 서열은 아래와 같다.

Tyrosinase:

Forward primer; 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3'

Reverse primer; 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3'

TRP-1:

Forward primer; 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3'

Reverse primer; 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3'

TRP-2:

Forward primer; 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3'

Reverse primer; 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3'

β-actin:

Forward primer; 5'-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3'

Reverse primer; 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3'

개서어나무 잎 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 정제 분획물은 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-2의 유전자 발현을 억제하여 미백 효과가 나타나는 것으로 확인되었다(도 1 참조).

실험예 3. 안전성 평가

본 실험예에서는 수득한 시료 추출물과 정제분획 중 미백 효과가 좋았던 에틸아세테이트 분획의 안전성 조사를 위하여 전문 임상 시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 시료 추출물은 1,3-Butylene glycol(1,3-BG) 용액에 1%(weight/volume)의 농도로 준비하였다.

3-1. 인체 피부 일차 자극 시험

임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 여성 30명 이상을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 시료물질을 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부 평가는 표 2의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 물질에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.

Criterion about the responses after human skin patch test

symbol	grade	clinical observation
+	1	Slight erythema, either spotty or diffuse
++	2	Moderate uniform erythema
+++	3	Intense erythema with edema
++++	4	Intense erythema with edema & vesicles

인체 피부 일차 자극 시험 결과

시료	No. of responder	48시간			72시간			반응도
시료	No. of responder	1+	2+	3+	1+	2+	3+	48h	72h	Mean
개서어나무 잎 에탄올추출물	1	-	-	-	1	-	-	0.0	0.8	0.4
개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	2	2	-	-	-	-	-	1.7	0.0	0.8
대조군 (1,3- BG)	0	0	-	-	-	-	-	0.0	0.0	0.0

표 3에 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 에탄올추출물과 에틸아세테이트 분획이 인체 피부 일차 자극에서 저자극 정도로 나타났다.

3-2. 각질량 측정 결과

미백 효과가 좋았던 개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획의 피부 반응에 의한 피부 표면상태 변화를 보기 위해 Skin Visioscan DM-I-02(Courage+Khazaka, Germany)를 이용하여 첩포 전과 첩포 제거 30분, 24시간 경과 시 시험부위를 측정하여 표피층 표면 변화 정도를 이미지화 하고, 각질량 정도를 측정하였다.

피부일차 자극 반응에 의한 각질량 측정 결과(%/mm²)

시료	D0 (첩포 전)	D1 (30분 경과)	D2 (24시간 경과)	변화량
개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	0.17±0.10	0.13±0.05	0.08±0.06	-0.06±0.11
대조군 (1,3- BG)	0.35±0.15	0.24±0.05	0.45±0.19	-0.01±0.18

표 4에 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획은 시간이 경과함에 따라 각질량이 감소하는 경향을 나타내었다.

실험예 4. 피부 보습 효과 평가

본 실험예에서는 수득한 시료 추출물의 정제분획 중 미백 효과가 좋았던 에틸아세테이트 분획의 피부보습 효과 평가를 위하여 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 시료 추출물은 1,3-Butylene glycol 용액에 1%(weight/volume)의 농도로 준비하였다.

임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 여성 60명 이상을 선정하였다. 피험자를 대상으로 시료를 전박 내측에 3㎎/㎠의 농도로 도포하고, 도포 1시간 후에 Corneometer CM 825(Courage+Khazaka, Germany)를 이용하여 피부 수분량을 측정하였다.

시료 도포 1시간 후 피부 수분량

시료	Corneometer CM 825(도포 1시간 후)
시료	Mean	Minimum	Maximum	Std. Error of Mean	Std. Deviation	Sig.
개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	62.67	45	78	1.41	8.82	0.015*
대조군 (1,3- BG)	44.13	32	59	1.3	8.13	-

표 5에서 나타난 바와 같이 개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획은 통계분석 결과 대조군에 비해 피부보습효과가 높게 나타남을 확인하였다.

실시예 3. 개서어나무 잎 추출물 함유 화장료 조성물 제조

실시예 1에서 수득한 개서어나무 잎 에탄올추출물을 함유한 피부 미백용 크림 조성물을 표 6의 조성으로 아래와 같이 제형화하였다.

수상용해조에 1~3을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 4~11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 45℃까지 냉각한 뒤 원료12~14를 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 30℃까지 냉각시켜 개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제조하였다.

비교예 1 : 수상용해조에 1~3을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 4~11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 45℃까지 냉각한 뒤 원료12~13을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 30℃까지 냉각시켜 조성물을 제조하였다.

개서어나무 잎 추출물 함유 크림제 조성 (단위 중량%)

	원 료	실시예 3	비교예 1
1	정제수	100까지	100까지
2	부틸렌글라이콜	8.00	8.00
3	산탄검	0.03	0.03
4	아라키딜알콜베헤닐알콜아라시딜글루코사이드	4.00	4.00
5	세테아릴알코올	5.00	5.00
6	마카다미아터니폴리아씨드오일	1.00	1.00
7	디메치콘	1.00	1.00
8	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00	5.00
9	토코페릴아세테이트	0.10	0.10
10	사이클로펜타실록산*사이클로헥사실록산	3.00	3.00
11	글리세릴스테아레이트*피이지-100스테아레이트	1.50	1.50
12	방부제	적량	적량
13	조합향료	적량	적량
14	개서어나무추출물	10.00	-

본 발명에 의한 피부 미백용 조성물의 효과를 입증하기 위하여 실험예 5와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 5. 피부 미백 효과 평가 시험

본 실험예에서는 실시예 3에서 제조된 크림에 대한 피부 미백 효과 및 안전성에 대한 임상 평가를 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다. 임상용 제품은 개서어나무 잎 에탄올추출물 10중량% 함유한 크림상으로 준비하였다.

건강한 피부를 가진 만 18세 이상의 여성 피험자 20명을 대상으로 피험자들의 전박에 자외선을 조사하여 색소침착을 유도 한후 8주간 실험군(실시예 3)과 대조군(비교예 1) 각각을 사용하게 하였다. 사용 전과 사용 후 2주, 4주, 6주, 8주 시점에서 시험부위의 피부색을 육안평가 및 Mwxameter와 Spectrophotometer를 이용한 기기측정 방법을 이용하여 제품의 피부 미백 효과를 평가하였다.

5-1. 육안평가

제품사용 전과 사용 2주, 4주, 6주, 8주 후 시점에서 피부 미백 효과를 평가하였다. 평가 기준은 0~9점 척도를 사용하여 2명의 시험자가 평가하였다.(표 7)

그 결과 실험군이 대조군(비교예 1)에 비해 제품 사용 4주, 6주, 8주 후 시점에서 실험군이 대조군에 비해 피부색이 개선됨을 확인하였다.(도 2a, 2b 참조)

5-2. Mexammeter를 이용한 멜라닌 지수 측정

실험군과 대조군의 제품 사용전과 사용 2주, 4주, 6주, 8주 후 시점에서 멜라닌 지수 측정을 통해 피부색 개선 정도를 평가하였다. 그 결과 실험군(실시예 3)이 대조군(비교예 1)에 비해 제품 사용 4주, 6주, 8주 후 시점에서 멜라닌 지수가 감소하였다.(도 3 참조)

5-3. Spectrophotometer CM-2500d를 이용한 피부색 측정 결과

제품 사용 전과 사용 2주, 4주, 6주, 8주 후 시점에서 spectrophotometer CM-2500d를 이용하여 피부색을 측정하였다. 결과는 Individual Typology Angle(ITA°)Value를 구하여 비교하였다. 측정 결과 실험군의 ITA° Value가 대조군과 비교하여 각 평가 시점마다 증가한 것으로 확인하였고, 각 시점별 ITA° Value의 분석 결과 실험군(실시예 3)이 대조군(비교예 1)에 비해 피부 미백 효과더 우수함을 확인하였다.(도 4 참조)

5-4. 피부 안전성 평가

제품사용 2주, 4주, 6주, 8주 후 시점에서 피험자들에게 설문을 통한 안전성 평가를 시행하였다. 평가시점마다 설문과 시험자의 관찰에 의해 주관적 자극감과 객관적 자극 등의 피부 안전성을 평가하였다. 그 결과 총 20명의 피험자 중 시험기간 동안 부작용을 호소하는 피험자는 관찰되지 않았다(표 8).

안전성 평가 결과

항목 (n=20)		2주		4주		6주		8주
항목 (n=20)		시험군	대조군	시험군	대조군	시험군	대조군	시험군	대조군
주 관 적 자 극 감	가렵다	0	0	0	0	0	0	0	0
	바늘로 찌르듯이 아프다	0	0	0	0	0	0	0	0
	근질거린다	0	0	0	0	0	0	0	0
	화끈거린다	0	0	0	0	0	0	0	0
	따끔거린다	0	0	0	0	0	0	0	0
	뻣뻣하다	0	0	0	0	0	0	0	0
	당긴다	0	0	0	0	0	0	0	0
객 관 적 자 극	홍반	0	0	0	0	0	0	0	0
	부종	0	0	0	0	0	0	0	0
	인설	0	0	0	0	0	0	0	0
	뽀드락지, 좁쌀 등	0	0	0	0	0	0	0	0
	기타	0	0	0	0	0	0	0	0
총 부작용자 수		0	0	0	0	0	0	0	0

이상의 결과로부터 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎 추출물은 티로시나아제 활성을 저해하고, 멜라닌 형성세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2와 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용이 있음을 확인하였다. 또한, 개서어나무(Carpinus tschonoskii) 잎 추출물을 함유하는 화장료조성물은 피부미백효과와 인체피부 일차자극 시험을 통해 자극이 없고, 각질량을 감소시키는 등의 안전성과 높은 피부 보습효과를 확인하였다.

도 1은 B16 melanoma 세포에서 Tyrosinase/TRP-1/TRP-2의 mRNA 발현 저해효과를 나타낸 것이다.

도 2a는 본 발명에 의한 시험군과 대조군의 피부 미백효과의 육안평가 결과 1(표 6 참조)

도 2b는 본 발명에 의한 시험군과 대조군의 피부 미백 효과 육안평가 결과 2(표 6 참조)

도 3은 본 발명(표 6 참조)에 의한 시험군과 대조군의 멜라닌 지수 측정 결과(멜라닌 지수가 낮을수록 미백 효능 증가)

도 4 는 본 발명(표 6 참조)에 의한 시험군과 대조군의 피부색 측정 결과(ITA° Value가 높을수록 미백 효능 증가)

Claims

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개서어나무 잎 에탄올추출물을 조성물 전체중량의 0.02 내지 15 중량% 함유하는 피부 미백용 화장료조성물.
개서어나무 잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획물을 조성물 전체중량의 0.02 내지 15 중량% 함유하는 피부 미백용 화장료조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 피부미백효과가 티로시나아제(tyrosinase) 저해효과 및 멜라닌 형성세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 TRP-2와 티로시나아제의 유전자 발현을 억제하는 작용에 기인한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서, 각질량을 감소시키고, 색소 침착을 감소시키는 효과가 있는 피부 미백용 화장료조성물.