KR20100080370A - 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물은 세포 활성 증진효과, 콜라겐 합성효과, MMP-1 생성억제 효과, 티로시나아제 활성 저해 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 두피 가려움증 및 비듬증 개선, 탈모 방지 및 육모 효과가 뛰어나며, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 보습과 아토피개선, 피부 주름개선 및 피부 미백 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 두피가려움증 완화, 탈모 완화, 육모 효과 및 제형 안정성도 우수하다.

녹두 줄기세포, 배양산물, 나노베지클, 노화, 주름, 미백, 보습, 아토피, 피부개선, 비듬증 개선, 탈모 방지, 육모

Description

녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising Phaseolus Radiatus stem cell cultured products as active ingredient}

본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 일차적인 기능은 온도, 습도 및 자외선 등과 같은 외부자극으로부터 인체를 보호하고, 체온조절, 호흡 및 배설작용 등의 다양한 역할을 수행하는 중요한 기능을 담당한다. 그러나 나이가 들면서 이러한 기능들이 점차 약화되고 피부의 노화가 진행된다. 특히, 피부 장벽의 기능을 수행하는 지질층의 지질조성과 함량이 변화하면서 그 기능이 급격히 저하되어 피부 수분 함량이 감소하게 되면서 피부가 건조해 지고 기미, 주근깨, 색소 침착 및 다양한 피부 병변이 유발된다.

또한 외부로부터 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등과 같은 자극을 받게 되면 피부는 주름생성, 탄력손실 및 각화 등과 같은 피부의 노화가 더욱 가속화 된 다.

인체의 피부는 표피와 진피로 나뉘어져 있으며, 표피의 가장 아래에 있는 기저층에서 새로이 형성된 각질 형성세포는 아래층에서 위층으로 서서히 이동하면서 약 14일 이후에 각질로 변하게 되고, 다시 14일 정도 뒤에는 피부로부터 떨어져 나가는 각화과정이 일어난다. 기저층과 연결되어 있는 진피는 표피에 수분을 공급하고, 피부의 탄력을 유지하는 역할을 하게 된다. 일반적으로, 피부탄력 감소, 피부 주름 등의 피부노화현상은 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소, 엘라스틴의 소실 등에 의해서 나타나는 것으로서, 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

최근, 피부의 주름생성원인 및 개선 방법에 대한 피부 생리학적 연구가 많이 행해지고 있으며, 실제로 화장료에 있어서 피부주름방지를 위해 자외선 차단제, 항산화제, 세포활성촉진제 등이 사용되고 있고, 또한 콜라겐 합성에 따른 피부 주름개선 방법들이 제시되고 있다.

한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 다양한 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 대부분 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.

강력한 분화 능력과 재생 능력에 기초하여, 줄기세포는 재생의학에 큰 가능성을 제시하고 있으며 최근 많은 관심의 대상이 되고 있다.

줄기세포는 미분화 (undifferentiated) 세포로서, 자기 재생 (self-renewal) 능력과 다양한 종류의 조직 또는 기관으로 분화하는 능력을 가진다. 이러한 줄기세포는 크게 동물 유래의 배아줄기세포 및 성체줄기세포와 식물 유래의 식물줄기세포로 나뉘는데, 동물 유래의 줄기세포는 인간의 존엄성을 위협하는 윤리적인 문제 및 부정적인 측면 때문에, 화장품 분야로의 적용 시, 소비자의 부정적인 인식을 고려하여 이를 해결해야만 하는 문제점이 있다.

반면, 식물유래 줄기세포의 경우, 인간줄기세포와 마찬가지로 강한 분화 능력과 재생능력이 있을 뿐만 아니라, 인간줄기세포와 같은 윤리적 문제나 안전성 문제가 없어, 화장품 분야뿐만 아니라, 다양한 분야에서 식물줄기세포의 활용에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.

예를 들어, 식물성장인자의 하나인 카네이틴은 녹색식물의 잎줄기에 소량 존재하는 것으로 피부 탄력 복원과 밀접한 섬유아세포의 기능 저하를 방지하여 피부 세포의 노화를 지연시키고, 잔주름과 색소 침착을 개선하며 피부 거칠음을 완화한다고 알려져 있다. 그리고 옥신은 생장이 왕성한 줄기와 뿌리 끝에서 만들어지는 식물성장 호르몬으로 피부의 탄력과 유연성을 부여하며 강력한 재생효과가 있어 화장품의 주요 원료로 사용된다. 또한 대두나 검은콩 등의 콩과 식물에서 발견되는 3,9-dihydroxy-6H-benzofuro-[3,2-c][1]benzopyran-6-one:3,9-DHBFBP은 항산화 효과를 가지고 있으며 피부의 노화와 주름 생성에 대해 억제효과가 있는 것으로 보고 되고 있다 (Beggs et al.,1985). 이러한 식물성장인자는 특히 식물의 생장점을 이루는 식물줄기세포에 다량으로 존재할 수 있으며, 이러한 성장인자 이외에도 각 식물에 대한 각종 유효 인자들이 다량으로 존재하는 것으로 알려져 있다.

식물에는 싹 말단 생장점 (SAM, Shoot Apical Meristem)과 뿌리 말단 생장점 (RAM, Root Apical Meristem)에 줄기세포가 존재한다. 이 식물줄기세포는 고유의 성격대로 분화하여 뿌리와 줄기 등과 같은 식물의 조직과 기관을 새롭게 만드는 기능을 한다. 이러한 식물 줄기세포를 다능성 (pluripotent) 줄기세포로 분류하는데, 전형적인 기능을 통하여 다양한 기관을 형성할 능력을 가지고 있다는 개념이다. SAM과 RAM에 존재하는 줄기세포는 분화를 통하여 식물의 성장을 이루는데, 줄기세포의 분화 및 줄기세포 밀도를 유지하는 것은 SAM에 이웃하고 있는 OC (organizing center)와 RAM에 이웃하고 있는 QC (quiescent center) 세포와의 communication에 의해서 밀도 및 분화 등이 조절된다 (Trends in plant science, Vol.11 No.5 241-246, 2006).

식물이 동물과 달리 전분화능력 (totipotency)이 있음은 1902년 호주의 식물학자 하버란트 (Gottlieb Haberlandt)에 의해서 밝혀졌다. 식물의 전분화능은 식물세포는 탈분화, 재분화 과정을 통하여 다른 형태의 세포나 조직 또는 식물체 전체 (whole plant)로 분화할 수 있는 능력을 말한다. 각 과정에는 식물호르몬 및 생장인자를 조절하여 전분화 흐름 조절이 가능하다. 좀 더 세부적으로는 식물체를 탈분화 (de-differentiation)시켜, 미분화 (un-differentiated) 세포인 캘러스 (callus)를 얻을 수 있다. 식물체를 표면살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물 호르몬 농도를 함유한 고체배지 (solidified medium)에서 배양하면 캘러스 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 그 상태로 계속 배양하거나, 액체 배지에서 배양하여 현탁배양 (suspension culture)을 이룰 수 있으며, 이를 통하여 많은 양의 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 배지의 식물호르몬 농도 조절을 통하여 배 (embryo)를 발생 시키고, 다시 뿌리나 싹을 형성시킬 수 있다. 이렇게 발생한 배 (embryo)나 싹, 뿌리는 발아 또는 성장을 통하여 완전한 식물체로 발전한다. 즉, 캘러스 세포는 분화 및 재생 능력을 지닌 세포임이 오래 전부터 알려져 있다. 따라서 미분화 세포인 캘러스 세포는 줄기세포의 능력을 가지고 있어 줄기세포라 할 수 있다. 이와 같이 식물의 생장점에 있는 줄기세포 외에도, 분화능력이 있는 캘러스 세포도 줄기세포로 정의할 수 있어 식물 줄기세포에 대한 새로운 정의가 필요하며, 이는 줄기세포에 대한 확장된 개념으로서의 줄기세포를 의미한다. 확장된 개념의 줄기세포는 totipotent embryogenic stem cell로 불리며, 전통적인 식물체의 줄기세포인 pluripotent stem cell과 구별된다 (Trends in plant science, Vol.12 No.6 245-252, 2007). 따라서 배양된 캘러스 세포나 현탁 세포는 식물줄기세포로서 다양한 활용을 기대해 볼 수 있다. 이처럼 확장된 개념의 줄기세포로서 미분화 세포인 캘러스 배양세포가 totipotent embryogenic stem cell로서 줄기세포로 인정되고 있지만, 줄기세포라는 증명을 통하여 궁극적으로 인정된다면 추후 식물줄기세포 활용이 더욱 활발해질 수 있다. 이는 식물체에 존재하는 양이 많지 않고 분리가 어려운 pluripotent stem cell의 문제점을 극복하여, 배양줄기세포로서 충분한 양의 배양이 가능한 totipotent embryogenic stem cell을 활용함으로서 공급의 문제를 근본 적으로 해결할 수 있기 때문이다.

이에 본 연구자들은 피부노화를 방지하고 피부 주름을 개선하는 물질을 찾고자 노력하던 중 녹두 줄기세포의 배양산물이 이러한 목적에 부합되어 피부노화방지 및 피부주름개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 효과적으로 사용될 수 있음을 발견하고 이 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 효과적으로 피부에 침투시키기 위하여 나노베시클에 포접하여 화장료에 적용하였으며, 이러한 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 조성물은 피부노화방지 효과 및 피부주름개선효과 뿐만 아니라, 피부미백, 피부보습 및 아토피 개선 등의 다양한 피부 개선효과가 탁월하다.

따라서, 상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 나노베시클에 포접하여 안정화시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 사람의 피부에 도포하여 피부 상태 개선 효과를 달성하는 화장 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 해결 수단, 실시예, 도면 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물은 세포 활성 증진효과, 콜라겐 합성과 MMP-1 생성억제 효과, 티로시나아제 활성 저해 효과 및 멜라닌 합성 억제 효과가 뛰어나며, 이를 화장료에 적용한 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 보습과 아토피개선, 피부 주름개선, 피부 미백, 두피 가려움증 및 비듬증 개선, 탈모 방지 및 육모 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 제형 안정성도 우수하다.

본 발명은 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, 녹두(Phaseolus radiatus, Phaseolus aureus, Mung Bean, Green Bean)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 한해살이풀로서, 약성이 서늘하여 열로 인한 악창이나 종기, 단독(丹毒)에 효능이 있다고 알려져 있으며, 가벼운 해열작용 및 이뇨작용이 있다. 약리 효과로는 실험성 고지혈증 예방 및 치료효과가 알려져 있다. 게다가 녹두 추출물을 함유하는 화장료는 미백(KR 10-0463081), 항산화, 보 습 및 피부보호(KR10-0161333), 자외선 차단 및 광노화 방지(KR10-0858630), 비듬 치료(KR10-0681699), 피부자극완화(KR10-0628649) 등에 대한 효과가 탁월함이 이미 공지되어 있다.

본 명세서에서, "녹두 줄기세포"는 녹두의 다양한 부위로부터 얻은 줄기세포로서, 예컨대, 녹두 전초의 줄기, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃, 또는 발아된 녹두의 발아시점의 조직체인 숙주(녹두의 종자를 물에 불려 싹이 나게 한 녹두의 발아채로, 녹두채(綠豆菜)라고도 한다)의 배축, 떡잎, 뿌리 등에 존재하는 분화능력이 입증된 전능성 배아 줄기세포(totipotent embryogenic stem cell) 및 이의 배양세포를 의미한다.

따라서, 본 발명의 "녹두 줄기세포 배양산물"은, 녹두 줄기세포를 배양하여 얻을 수 있는 배양액 및 배양한 줄기세포를 파쇄하여 얻을 수 있는 모든 추출물을 포함하며, 더 바람직하게는 분화능력이 입증된 녹두의 캘러스 배양세포인 전능성 배아 줄기세포의 배양산물을 의미한다.

더 상세하게는,

본 발명에 사용된 녹두는 다음과 같은 방법으로 발아시킨다. 먼저 깨끗한 물로 녹두 종자를 세척하며 불순물 등을 제거하여 발아하기 쉬운 상태로 만든다. 이후 충분한 양의 물에 24시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어 두고 상온, 빛이 차단된 상태에서 36시간 충분한 양의 물로 면포를 적셔 주어 발아시켰다. 발아된 녹 두 종자의 발아 정도는 녹두 종자의 껍질이 벗겨지면서 녹두 내피가 밖으로 나온 순간을 의미하며, 바람직하게는 싹이 약 0.1-2.0 Cm 정도 나왔을 때를 의미한다.

이러한 녹두 줄기세포는, 녹두를 일정 조건하에서 발아시켜 성장이 우수한 explant를 표면살균하고, 줄기를 잘라 상처를 낸 후, M&S 고체배지 위에 치상하여 캘러스 줄기세포를 유도한다. M&S 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 각 식물 부위에 적절하게 적용하였으며 이때의 옥신은 2,4-D (0.10-0.50mg/l), IAA (0.50-1.00gm/l), NAA (0.5-1.00mg/l)를 싸이토카인은 kinetin (0.10-0.50mg/l)과 BAP (0.50-1.00mg/l)를 여러 가지 농도로 조합하여 첨가함으로써 캘러스 유도효과를 극대화시킨다. 이렇게 하여 얻어진 전능성 배아 줄기세포(Totipotent embryogenic stem cell)인 캘러스 줄기세포의 함량을 보다 많이 확보하기 위해서 현탁배양기 (gyrotory shaker)에서 MS 액체배지를 이용한 현탁배양을 통해 많은 양의 줄기세포를 확보할 수 있고, 대량생산을 위해서는 생물반응기(Bioreactor)를 활용할 수도 있다. 이렇게 얻어진 녹두 줄기세포를 4-8℃ 저온에서 압착추출 (squeeze)하여 줄기세포 배양산물을 얻는다.

상기 녹두 줄기세포 배양산물은 각종 성장인자 및 싸이토카인을 함유하고 있어 피부 구성 세포인 섬유아세포 이동 촉진, 활성화 효과, 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐 합성 증가, 티로시나아제의 활성 억제 효과, 멜라닌 합성 억제, 보습효과 및 아토피개선 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양 산물은 세포 활성 증진효과(실험예 1), 콜라겐 합성 효과(실험예 2), MMP-1 생성억제 효과(실험예 3), 티로시나아제 활성 저해 효과(실험예 4) 및 멜라닌 합성 억제 효과(실험예 5)가 탁월하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001-30중량%, 바람직하게는 0.0001-20중량%이다. 이때 녹두 줄기세포 배양산물의 총 중량이 0.00001중량% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 30중량%를 초과할 때에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "피부 상태 개선"은 다양한 피부 상태의 개선을 의미하는 것으로, 더 상세하게는, 피부 노화방지, 피부 주름개선, 피부 미백, 피부 보습 및 아토피 개선을 의미한다. 또한, 두피 및 모발도 피부에 해당됨에 따라, 두피 가려움 및 비듬증 개선, 탈모 개선 및 육모를 추가로 의미한다. 따라서, 본 발명의 피부 상태 개선용 화장료라 함은, 피부 노화방지용, 피부 주름개선용, 피부 미백용 , 피부 보습용, 두피 가려움증 및 비듬증 개선용, 탈모 개선용 및 육모용 화장료를 일컫는 것이다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 녹두 줄기세포 배양산물 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨대 보존제, 삼투제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 헤어컨디셔너, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로숀, 헤어 페이스, 헤어 겔, 헤어 팩, 헤어 마사지, 헤어 리퀴드, 헤어 스프레이, 헤어 무스, 트리트먼트, 비 에어로졸 무스, 비 에어로졸 스프레이, 에어로졸 무스, 에어로졸 스프레이, 파마제, 탈색제, 샴푸, 린스, 샴푸와 린스 혼합형, 비누, 피부를 세정하기에 적합한 바 또는 타블렛, 비누 바, 비누 타블렛, 수 분산액, 파우더 및 오일의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실 리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료는 유효성분인 녹두 줄기세포 배양산물을 안정화시키고 경피 흡수를 용이하게 하기 위해서 나노베시클에 포접하여 화장료에 함유시키는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 용어 "나노베시클"은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 소적 크기가 10 내지 500nm이며, 바람직하게는 30nm 내지 250nm이며, 가장 바람직하게는 50nm 내지 150nm인 나노화된 리포좀 형태를 의미한다. 상기 나노베시클의 평균 소적 크기가 500nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자하는 기술적 효과 중 피부침투 및 제형 안정성이 매우 미약하다.

상기에서 언급한 용어 "나노베시클"은 수용성 부분과 유용성 부분을 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 콜로이드 입자로, 내부에는 친수성 공간이 있으며 외부로는 닫힌 이중의 지질막을 가지고 있는 미세 소포체(베시클/일종의 주머니)로서 세포막과 유사한 이중막 구조를 가진다. 나노베시클은 중앙의 친수성 공간에 수용성 분자를 내포시키며, 외부의 지질 이중막에는 지용성 분자를 붙이거나, 혹은 양전하 및 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 나노베시클의 가장 큰 특징은 다양성과 신축성으로 구조 변경이 용이하며, 구조와 성분을 달리 함으로서 전혀 새로운 물성과 기능 및 용도가 제공될 수 있다. 여기에 나노베시클은 생체 적합성과 분해성, 안정성이 뛰어난 장점이 있어 다양한 물질로서 화장료 및 약물 전달에 광범위하게 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 녹두 줄기세포 배양산물의 함량은 나노베시클 총 중량에 대하여 0.001-50.0 중량%를 함유된다. 상기 배양산물이 나노베시클의 총 중량의 0.001 중량% 미만인 경우에는 항산화, 노화방지 및 피부주름개선 효과가 극히 미약하며, 50.0 중량% 초과한 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있고 경제적이지 못하다.

이러한 나노베지클은 유화제, 오일성분 및 수성성분으로 제조될 수 있으며, 유화제로는 레시틴, 레시틴 유사유화제, 폴리옥시에틸렌계 유화제, 폴리글리세릴계 유화제, 슈가에스테르계 유화제 등을 포함하는 계면활성제가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 레시틴, 레시틴 유사유화제이며, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 나노베시클에 보조유화제로 폴리솔베이트, 소르비탄올레이트, 소르비탄세스퀴올레이트를 사용할 수 있다.

상기에서 사용된, "레시틴 유사유화제"는 비이온성 계면활성제로서, 난황 및 대두에 다량으로 함유된 천연계면활성제인 레시틴과 화학적 구조가 유사한 화합물을 말한다. 본 발명의 레시틴 유사유화제는 하기의 구조에서 알 수 있듯이 씨트릭애시드(citric acid)와 락틱애시드(lactic acid)의 에스테르 결합에 다시 두개의 글리세롤(glycerol)을 양쪽에 에스테르 결합시키고 다시 결합된 두개의 글리세 린(glycerine)기 OH에 각각 코코넛애시드(coconut acid)를 에스테르 결합시킨 것이며, 이때 R은 탄소수 12-16개인 알킬, 알케닐 또는 알킨닐기로 구성되어 있다. 하기 구조의 화합물은 포스파티딜콜린이 결합된 레시틴과는 달리 씨트릭애시드 락테이트 글리세롤 코코넛 오일의 에스테르 결합으로 연결된 특징을 지닌 것으로, 구체적인 예로는 글리세릴 씨트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트, 글리세릴 코코에이트/씨트레이트/락테이트 등이 있으며, 이로 제한하지 않는다. 상기 레시틴 유사유화제는 화학적으로 합성할 수 있으며, 자연계에서 추출할 수도 있고, 상품화된 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

<레시틴 유사유화제의 구조>

*상기 구조식에서 R1및 R2는 C12-C16의 알킬기, 알케닐기 또는 알킨닐기이다.

또한, 본 발명의 나노베시클에 사용된 "오일성분"은 녹두 줄기세포 배양산물의 포접에 가장 우수한 오일을 사용하였으며, 예를 들어 미네랄오일, 스쿠알렌, 하이드로게네이티드 폴리데센, 하이드로게네이티드 캐스트롤, 파라핀 오일 및 사이클로 파라핀 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 나노 베지클에 사용된 "수성성분"은 본 발명의 유효성분을 비롯한 정제수 등의 물 성분을 의미하며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 나노베시클은 레시틴/유사유화제로서 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/ 락테이트/리놀레이트/올레이트 중의 어느 하나, 오일성분 및 수성성분을 함유하는 나노 베시클에 녹두 줄기세포 배양산물을 포접하여 안정화시킨 화장료를 제조하였며, 피부 보습과 피부 보습에 의한 아토피개선(실험예 9), 피부 주름개선(실험예 10), 피부 미백(실험예 11), 두피 가려움증 및 비듬증 개선(실험예 13, 14), 탈모 방지(실험예 15) 및 육모(실험예 16)에 탁월한 효과를 가질 뿐만 아니라 제형 안정성(실험예 12)도 우수하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 사람의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장 방법을 제공 한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 사람의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 보호 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 또는 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 또는 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 또는 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료는 피부에 적용시 녹두 줄기세포 배양산물의 전달제형으로서 효과가 매우 우수할 뿐만 아니라, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 화장료 조성물 및 녹두 줄기세포 배양산물을 포접한 나노베시클을 포함하는 화장료 조성물을 사람의 피부에 직접 도포하는 화장 방법을 수행하면, 피부 보습과 아토피개선(실험예 9), 피부 주름개선(실험예 10), 피부 미백(실험예 11), 두피 가 려움증 및 비듬증 개선(실험예 13, 14), 탈모 방지(실험예 15) 및 육모(실험예 16) 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 제형 안정성(실험예12)도 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 녹두 줄기세포 배양 및 배양산물 제조

녹두(Phaseolous Radiatus)의 종자를 일정 조건하에서 발아시켜 성장이 우수한 녹두 전초의 줄기, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃 및 발아시점의 조직체(배축, 떡잎, 뿌리)를 표면살균하고, 각각을 잘라 상처를 낸 후, 옥신은 2,4-D (0.10-0.50mg/l), IAA (0.50-1.00gm/l), NAA (0.5-1.00mg/l)를 싸이토카인은 kinetin (0.10-0.50mg/l)과 BAP (0.50-1.00mg/l)이 첨가되어 있는 MS고체배지 (Sigma)위에 치상하여 약 2주일 동안 캘러스 줄기세포를 유도하였다. 이를 별도 분리하여 신선한 고체배지 위에 치상하고, 4-5일 간격으로 계대배양 (subculture) 하여 캘러스를 유지하였다.

이후 Totipotent embryogenic stem cell인 캘러스 줄기세포의 함량을 보다 많이 확보하기 위해서 LB (Luria Bertani) Broth를 사용하여 25℃의 현탁배양기 (gyrotory shaker)에서 28일간 배양하였다. 이렇게 얻어진 녹두 줄기세포를 저온에서 압착추출 (squeeze)하여 줄기세포 배양산물을 얻은 후, 세포 독성실험을 하였다. 그 후, 이 녹두 줄기세포 배양산물을 50% 1,3-부틸렌 글리콜 수용액에 녹였고, 최종 농도를 안전한 농도인 3% (v/v)가 되도록 희석하여 본 발명의 실험에 사용하였다.

비교제조예 1: 녹두 추출물의 제조

녹두 줄기세포 배양액에 대한 비교실험을 위하여 아래와 같이 제조하였다.

녹두 전초를 깨끗한 물로 세척하고 건조한 후 미세하게 분말화하였다. 분말화한 녹두 분말에 70% 알코올 수용액을 상기 분말의 중량의 10배의 양으로 부가한 다음, 5일간 침적시킨 후 와트만 여과지로 여과한 후 7일간 4℃에서 저온 숙성시켰다. 다시 여과하여 감압 농축기를 이용해 농축한 후 농축된 파우더를 50% 1,3-부틸렌 글리콜 수용액에 녹여 최종 농도가 3% (v/v)되게 하여 본 발명의 실험에 사용하였다.

실험예 1. 녹두 줄기세포 배양산물의 세포 활성 증진 효과

상기 제조예 1에서 제조한 녹두 줄기세포 배양산물과 비교제조예 1에서 제조한 녹두 추출물의 세포 활성 증진 효과를 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 녹두 줄기세포 배양산물의 농도는 각 100 ㎍/㎖씩 되게 하여 실험에 이용하였다.

실험은 먼저 인체 정상 섬유아세포를 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1× 10⁴ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이어, 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(실험군)의 최종농도를 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 2.5% 들어 있는 DMEM 배지로 교체한 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 또한, 이에 대한 비교실험으로써 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물 대신에 비교제조예 1의 녹두 추출물을 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 2.5% 들어 있는 DMEM 배지로 교체한 다음, 녹두 줄기세포 배양산물이 포함되지 않은 혈청이 2.5% 들어 있는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 각각의 배양물에 세포 생존율을 보기 위해 5mg/㎖의 MTT 용액 (Sigma)을 10㎕씩 첨가하고, 디메틸설폭시드 용액을 웰당 20㎕씩 가해 용해시킨 다음 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 분석법을 통해 세포활성율을 구하였다. 세포 활성율은 하기 수학식 1에 따라 구하였다.

* D1 흡광도: 실험군의 흡광도, D0 흡광도: 대조군의 흡광도

* 상기 흡광도는 570 nm에서 측정한 값임

녹두 줄기세포 배양산물의 세포 활성 효과

시험 물질 (농도 100㎍/㎖)	세포 활성율 (%)
제조예 1 (줄기)	88.2
제조예 1 (잎)	86.3
제조예 1 (뿌리)	87.3
제조예 1 (엽원기)	87.5
제조예 1 (꽃)	88.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 떡잎)	89.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 배축)	88.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 뿌리)	87.0
비교제조예 1 (녹두 추출물)	68.4

표 1에 결과에 따르면, 녹두의 어느 부위에서 얻은 줄기세포이든 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물은 전반적으로 세포 활성율에서 비교제조예 1의 녹두 추출물에 비해 약 128% 높게 측정되었다. 따라서, 녹두의 어느 부위에서 획득하든 상관없이 녹두 줄기세포 배양산물이면 세포활성 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실험예 2. 녹두 줄기세포 배양산물의 콜라겐 합성 증진 효과

인체 정상 섬유아세포를 48웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1× 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 녹두 줄기세포 배양산물(실험군)의 최종농도를 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 다음, 녹두 줄기세포 배양산물 대신에 비교제조예 1의 녹두 추출물(대조군)을 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 다음, 녹두 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트(Takara, 일본)를 이용하여 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP 양을 ng/㎖로 환산하였으며, 콜라겐 생합성 증가율은 하기 수학식 2에 따라 계산하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

녹두 줄기세포 배양산물의 콜라겐 생합성 증진 효과

시험 물질	콜라겐 생합성 증가율 (%)
제조예 1 (줄기)	45.2
제조예 1 (잎)	44.2
제조예 1 (뿌리)	44.8
제조예 1 (엽원기)	43.8
제조예 1 (꽃)	44.6
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 떡잎)	46.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 배축)	45.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 뿌리)	44.0
비교제조예 1 (녹두 추출물)	34.3

상기 표 2의 결과에 따르면, 녹두의 어느 부위에서 얻은 줄기세포이든 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물은 전반적으로 콜라겐 생합성 증가율이 비교제조예 1의 녹두 추출물에 비해 약 130% 정도 높게 측정되어, 본원 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 콜라겐 생합성 증진 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실험예 3. 녹두 줄기세포 배양산물의 MMP-1 생성 억제 효과

인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1× 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 제조예 1에 따른 녹두 줄기세포 배양산물의 최종 농도를 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 실험군과, 녹두 줄기세포 배양산물 대신에 비교제조예 1의 녹두 추출물을 100 ㎍/㎖로 하여 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 비교군, 녹두 추출물이 포함되지 않은 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트 (Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양을 측정한 뒤, MMP-1의 양을 mg/㎖ 환산하였다. MMP-1 생성 억제율은 하기 수학식 3에 따라 구하였으며 결과는 표 3에 나타내었다.

녹두 줄기세포 배양산물의 MMP-1 생성 억제 효과

시험 물질	MMP-1 생성억제율(%)
제조예 1 (줄기)	86.9
제조예 1 (잎)	85.8
제조예 1 (뿌리)	87.3
제조예 1 (엽원기)	86.1
제조예 1 (꽃)	87.0
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 떡잎)	88.3
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 배축)	87.1
제조예 1 (발아시점의 조직체 - 뿌리)	86.7
비교제조예 1 (녹두 추출물)	74.3

표 3의 결과에 따르면, 녹두의 어느 부위에서 얻은 줄기세포이든 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물은 전반적으로 MMP-1 생성억제율이 비교제조예 1의 녹두 추출물에 비해 약 116% 높게 측정되어, 본원발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 MMP-1 생성 억제 효과가 우수한 것을 알 수 있었다.

상기 실험예 1-3을 통해 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 세포활성 증진 효과, 콜라겐 합성 증진 효과 및 MMP-1 생성 억제 효과가 뛰어남을 확인하였다.

실험예 4. 녹두 줄기세포 배양산물의 티로시나아제 활성 억제 효과

본 실험예는 상기 제조예 1에서 수득한 녹두 줄기세포 배양산물의 티로시나아제 활성 저해도를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다. 또한 티로시나제 억제 효과가 있는 것으로 알려진 알부틴을 양성대조군으로 하여 티로시나아제 활성 저해도를 측정하였으며, 비교군으로 비교제조예 1의 녹두 추출물을 사용하였다. 먼저, 티로시나아제 활성 저해 기질로는 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)에 용해한 1.5 mmol/ℓ의 티로신 (시그마사, 미합중국)을 사용하였다. 녹두 줄기세포 배양산물은 0.05 M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)을 이용하여 각 0 내지 3.0%(v/v)의 농도별로 희석하여 시료액을 제조하고 상기 농도별 시료액 240 ㎕에 티로신 40 ㎕를 각각 첨가하고, 티로시나아제 (시그마사, 1,500 U/㎖) 20 ㎕을 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음, 490 nm에서 흡광도 (실험군 흡광도, 다만 녹두 추출물0%의 경우는 대조군 흡광도)를 측정하였다.

녹두 줄기세포 배양산물은 줄기, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃, 발아시점의 조직체 (배축, 떡잎, 뿌리)의 배양산물을 모두 이용하였으나, 모든 부위에서 유사한 패턴을 나타내어 줄기 배양산물만 농도별 결과를 기재하였고, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃 및 발아시점의 조직체 (배축, 떡잎, 뿌리)의 배양산물은 나머지 농도는 모두 생략하고 0.5%의 결과만을 기재하였다.

티로시나아제 활성 저해도는 하기 수학식 4에 따라 계산하였으며, 결과는 하기 표 4에 기재하였다.

시료 (부피(v/v)%)	티로시나아제 활성 저해도 (%)
녹두 추출물 0.50	35.2
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (줄기)	47.2
녹두 줄기세포 배양산물 1.00 (줄기)	49.8
녹두 줄기세포 배양산물 1.50 (줄기)	56.9
녹두 줄기세포 배양산물 2.00 (줄기)	61.6
녹두 줄기세포 배양산물 2.50 (줄기)	70.4
녹두 줄기세포 배양산물 3.00 (줄기)	92.1
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (잎)	47.9
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (뿌리)	48.1
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (엽원기)	47.1
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (꽃)	48.3
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (발아시점의 조직체 - 떡잎)	49.3
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (발아시점의 조직체 - 배축)	48.5
녹두 줄기세포 배양산물 0.50 (발아시점의 조직체 - 뿌리)	48.2
알부틴 2.50	71.2

상기 표 4의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 0.50~3.00 부피%로 처리했을 때 티로시나아제 활성 억제에서 탁월한 효과를 나타내었다. 또한 상기 티로시나아제 활성 저해도는 녹두 줄기세포 배양산물 농도에 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 그리고 동일 농도의 알부틴과 비교했을 때에도 알부틴의 효과와 유사하거나 높게 나타난 것으로 보아 녹두 줄기세포 배양산물의 미백 효과가 우수함을 알 수 있다. 게다가, 0.5%의 농도에서 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물이 녹두 추출물에 비해 최소 134% 정도의 증가율을 보여 녹두 추출물에 비해 멜라닌 저해 효과가 훨씬 탁월함을 알 수 있었다.

실험예 5. 녹두 줄기세포 배양산물의 멜라닌 합성 억제 효과

멜라닌 생성 저해효과가 이미 알려진 녹두추출물을 비교군으로 하고(비교제조예1의 녹두 추출물 이용) 및 미백제로 잘 알려진 알부틴을 양성 대조군으로 하여 본 발명의 녹두 줄기세포 배양액의 멜라닌 생성 저해율을 조사하였다. 실험은 하기의 방법으로 실시하였다.

생쥐 유래의 흑색종 세포 B-16 F1 (Melanocyte, B16-F1 한국세포주은행)을 12-웰 플레이트 (Falcon, 미합중국)에 1×0⁴ cell/well이 되도록 접종한 후에 하루 동안 배양하여 세포를 안정화 시킨 다음, 제조예 1에 따른 녹두 줄기세포 배양산물을 각 웰당 0 내지 2.0%의 농도별로 처리하여 3-4 일 동안 배양하였다. 배양한 플레이트는 원심분리한 후 배양액을 제거하고, 디메틸설폭사이드 (DMSO)에 용해한 1N NaOH 용액 500 ㎕로 세포를 용해한 후 90℃ 수조 (water bath)에서 10분간 가열하였다. 이를 다시 원심분리한 후 그 상등액을 570 ㎚의 파장에서 흡광도 (실험군의 흡광도, 다만 녹두 추출물 0%의 경우는 대조군 흡광도)를 측정하였다. 측정한 값은 하기 수학식 5에 따라 멜라닌 생성 저해도 (%)를 계산하였으며, 그 결과를 표 5에 기재하였다. 녹두 줄기세포 배양산물은 줄기, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃 및 발아시점의 조직체 (배축, 떡잎, 뿌리)의 배양산물을 모두 이용하였으나, 모든 부위에서 유사한 패턴을 나타내어 줄기 배양산물만 농도별 결과를 기재하였고, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃, 발아시점의 조직체(배축, 떡잎, 뿌리)의 배양산물은 나머지 농도는 모두 생략하고 0.5%의 결과만을 기재하였다.

실험 시료 (부피%)	멜라닌 생성저해도(%)
녹두 추출물 0	0
녹두 추출물 0.5	31.2
녹두 추출물 1.0	49.7
녹두 추출물 1.5	55.9
녹두 추출물 2.0	79.3
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (줄기)	36.6
녹두 줄기세포 배양산물 1.0 (줄기)	56.8
녹두 줄기세포 배양산물 1.5 (줄기)	68.4
녹두 줄기세포 배양산물 2.0 (줄기)	86.8
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (잎)	36.4
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (뿌리)	36.8
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (엽원기)	36.2
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (꽃)	37.0
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (발아시점의 조직체 - 떡잎)	37.5
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (발아시점의 조직체 - 배축)	37.2
녹두 줄기세포 배양산물 0.5 (발아시점의 조직체 - 뿌리)	36.8
알부틴 0.5	50.4

상기 표 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물과 녹두 추출물은 모두 멜라닌 생성저해에서 탁월한 효과를 나타내었다. 또한, 0.5%~2.0%의 농도로 녹두 줄기세포 배양산물을 처리한 경우의 멜라닌 생성저해 효과는 처리 농도에 의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 그리고 50% 멜라닌 생성 저해도를 나타내는 농도의 알부틴과 비교했을 때 알부틴 만큼의 멜라닌 생성저해 효과를 나타내었다. 게다가, 0.5%의 농도에서 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물이 녹두 추출물에 비해 최소 116% 정도의 증가율을 보여 녹두 추출물에 비해 멜라닌 저해 효과가 훨씬 탁월함을 알 수 있었다.

실험예 6: 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 나노베지클의 제조

상기 실험예 1 내지 실험예 5를 통해 효과가 입증된 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)을 제형 내에서 안정화시키고 경피 흡수를 용이하게 하기 위해서 하기 표 6의 조성으로 나노베지클을 제조하였다.

나노베지클의 제조 (함량: 중량%)

성분		제조예 2	제조예 3	제조예 4	제조예 5	제조예 6	제조예 7	제조예 8	제조예 9	제조예 10	제조예 11	제조예 12	제조예 13	제조예 14	제조예 15
A	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
	레시틴	0.1	4	10	20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	글리세릴 시트레이트/ 락테이트/ 리놀레이트/ 올레이트	-	-	-	-	0.1	1	4	10	20	-	-		-	-
	글리세릴 코코에이트 / 시트레이트/ 락테이트	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.1	1	4	10	20
B	미네랄 오일	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3
	트윈 60	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
C	녹두 줄기세포 배양산물	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

먼저, A상과 B상을 각각 80℃까지 가열하여 완전히 용해하고 B상을 A상에 혼입한 후 호모믹서를 이용하여 3,500rpm으로 혼합물을 유화시켰다. 유화된 혼합액을 40℃ 까지 냉각한 후 C상을 넣고 호모믹서를 이용하여 3,500rpm으로 교반한 후 고압미세균질기를 이용하여 1,000bar의 압력으로 각각 3회 통과시켜 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 나노베지클을 제조하였다.

실험예 7: 나노베지클 입자의 입도분포

본 발명의 화장료 조성물의 나노베지클 입자의 입도 분포를 분석하기 위해 상기 실험예 6의 제조예 2 내지 15의 나노베지클 입자의 입도를 측정하였다. 상기 나노베지클 입자의 입도는 제타사이저엔에스 (Zetasizer NS) 장비를 이용하여 본 발명의 레시틴 유사 유화제로 제조된 제조예 13의 나노베지클의 입도 분포 (도 2)가 기존 나노베지클 제조에 통상적으로 사용되고 있는 유화제인 레시틴에 의한 제조예 3의 입도 분포 (도 1)에 비해 그 균일도가 더 우수함을 알 수 있다.

실험예 8 : 녹두 줄기세포 배양산물을 함유한 나노베지클의 저장 안정성시험

상기 실험예 6에서 제조한 제조예 2 내지 15의 조성물의 안정성 시험을 실시하였다. 안정성 평가는 조성물의 침전상태, 색상, 변취 정도를 4℃, 25℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도 순환의 조건에서 8주 동안 확인하였으며 그 결과를 표 7에 나타내었다.

상기 표 7의 결과에서도 알 수 있듯이, 유화제로 레시틴을 사용하여 제조된 나노베지클 (리포좀/제조예 2 내지 제조예 5)의 경우 4℃, 25℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도 순환의 조건에서 침전과 합일이 발생하나, 레시틴 유사유화제인 글리세릴 코코에이트/씨트레이트/락테이트를 포함하는 제형의 경우에는 침전이나 변색 또는 변취 없이 안정하였다.

제형예: 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 제형의 제조

이에, 상기 실험예들을 근거로 하여 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물 또는 녹두 줄기세포 배양산물을 포접하여 안정화한 나노베시클을 사용하여 여러 가용화 제형과 유화 제형의 화장료 조성을 하기에 제형예로 제시하나, 제형예는 그 조성을 상세히 설명하지만 본 발명의 화장료 조성물이 처방예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 제형예에서 사용한 녹두 줄기세포 배양산물은 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물 중 줄기로부터 얻은 배양산물을 3% (w/v) 사용하였으며, 줄기 이외에 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃 또는 발아시점의 조직체인 배축, 떡잎, 뿌리의 배양산물도 동일한 농도로 적용될 수 있다. 또한, 하기 제형예는 녹두 줄기세포 배양산물을 포접하여 안정화한 나노베시클 형태인 제조예 13를 포함하는 조성으로 제조하였다.

제형예 1. 유연화장수 (스킨로션)

하기 표 8와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량(중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	1.0
글리세린	5.0	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0	3.0
PEG 1500	1.0	1.0
알란토인	0.1	0.1
DL-판테놀	0.3	0.3
벤조페논-9	0.04	0.04
EDTA-2Na	0.02	0.02
소듐 히아루로네이트	5.0	5.0
에탄올	10.0	10.0
옥틸도데세스-16	0.2	0.2
폴리솔베이트 20	0.2	0.2
향	0.02	0.02
정제수	to 100	to 100

제형예 2. 영양화장수 (밀크로션)

하기 표 9와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량(중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	3.0
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5	1.5
세테아릴알콜	1.5	1.5
라놀린	1.5	1.5
폴리솔베이트 60	1.3	1.3
솔비탄스테아레이트	0.5	0.5
경화식물류	1.0	1.0
광물류	5.0	5.0
스쿠알란	3.0	3.0
트리옥타노인	2.0	2.0
디메치콘	0.8	0.8
카르복시비닐폴리머	0.12	0.12
글리세린	5.0	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0	3.0
소듐히아루로네이트	2.0	2.0
트리에탄올아민	0.12	0.12
향	0.01	0.01
정제수	to 100	to 100

제형예 3. 영양크림

하기 표 10과 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량(중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	10.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
세테아릴알콜	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6
경화식물류	1.0	1.0
광물류	5.0	5.0
스쿠알란	3.0	3.0
트리옥타노인	2.0	2.0
디메치콘	1.2	1.2
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0	3.0
소듐히아루로네이트	2.0	2.0
트리에탄올아민	1.0	1.0
향	0.02	0.02
정제수	to 100	to 100

제형예 4. 마사지 크림

하기 표 11과 같이 마사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량 (중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	1.0
친유형 모노스테아린산글리세린	1.5	1.5
세테아릴알콜	1.5	1.5
스테아린산	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6
이소스테아릴 이소스테아레이트	5.0	5.0
광물류	35.0	35.0
스쿠알란	5.0	5.0
디메치콘	0.5	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12	0.12
글리세린	6.0	6.0
트리에탄올아민	0.7	0.7
향	0.01	0.01
정제수	to 100	to 100

제형예 5. 에센스

하기 표 12와 같이 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량 (중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	5.0
글리세린	10.0	10.0
베타인	5.0	5.0
PEG 1500	2.0	2.0
알란토인	0.1	0.1
DL-판테놀	0.3	0.3
EDTA-2Na	0.02	0.02
벤조페논-9	0.04	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1	0.1
소듐 히아루로네이트	8.0	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
트리에탄올아민	0.18	0.18
옥틸도데칸올	0.3	0.3
옥틸도데스-16	0.4	0.4
에탄올	6.0	6.0
향	0.02	0.02
정제수	to 100	to 100

제형예 6. 팩

하기 표 13과 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)	함량 (중량%)
제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-
제조예 13의 나노베시클	-	5.0
폴리비밀알콜	15.0	15.0
셀룰로스 검	0.15	0.15
글리세린	3.0	3.0
PEG 1500	2.0	2.0
DL-판테놀	0.4	0.4
사이크로덱스트린	0.15	0.15
알란토인	0.1	0.1
글리시리진산 모노암모늄	0.3	0.3
니코틴아미드	0.5	0.5
에탄올	6.0	6.0
PEG 40 경화피마자유	0.3	0.3
향	0.02	0.02
정제수	to 100	to 100

제형예 7. 바디 로션

하기 표 14와 같이 통상의 방법에 따라 바디 로션 제형의 화장료를 제조하였다. 간단히 언급하면, 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기 부위, 3% 농도(w/v))을 포함하는 화장료(실시예 1), 제조예 3의 나노베지클(녹두 줄기세포 배양산물을 포접한, 레시틴 함유 나노베지클)을 함유하는 화장료 (실시예2), 제조예 13의 나노베지클(녹두 줄기세포 배양산물을 포접한, 레시틴 유사유화제 함유 나노베지클)을 함유하는 화장료(실시예 3), 녹두 추출물, 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 모두 함유하지 않는 화장료 (비교예 1), 비교제조예 1의 녹두 추출물을 함유하는 화장료 (비교예 2)를 제조하였다.

성분	실시예1	실시예2	실시예3	비교예1	비교예2
제조예1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	3.0	-	-	-	-
제조예3의 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 나노베지클 (레시틴 함유)	-	3.0	-	-	-
제조예13의 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 나노베지클 (레시틴 유사유화제 함유)	-	-	3.0	-	-
녹두 추출물	-	-	-	-	3.0
바셀린	7.0	7.0	7.0	7.0	7.0
유동파라핀	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
밀납	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
폴리솔베이트 60	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	6.0	6.0	6.0	6.0	6.0
글리세린	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
토코페릴아세테이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
향	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

상기 표의 단위는 함량 (중량%)이다.

실험예 9. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 보습효과

녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 화장료의 피부에 대한 보습 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 7에서 제조한 화장료인 녹두 줄기세포 배양산물(줄기) 함유 화장료 (실시예 1), 녹두 줄기세포 배양산물 함유 나노베지클 (레시틴 함유) 포함 화장료 (실시예 2), 녹두 줄기세포 배양산물을 함유 나노베지클 (레시틴 유사유화제 함유) 포함하는 화장료 (실시예 3), 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않는 화장료 (비교예 1), 녹두 추출물을 함유 화장료 (비교예 2)를 이용하여 실험을 시행하여 평가하였다.

보습 효과 측정은, 온도 25℃, 상대습도 45%, 공기의 흐름이 없는 실내에서 실시하였으며, 건강한 여성 50명을 5개 그룹 (A, B, C, D, E)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예 1의 화장료를, B그룹을 대상으로는 실시예 2의 화장료를, C그룹을 대상으로는 실시예 3의 화장료를, D그룹을 대상으로는 비교예 1의 화장료를, E그룹을 대상으로는 비교예 2의 화장료 적당량을 팔의 상박에 하루에 3회 6주간 도포한 후, TEWAMETER TM210 (C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 경피수분손실량 즉, TEWL (Transepidermal Water Loss)값을 시간 변화에 따른 TEWL 값 변화량 △TEWL로 측정하고, CORNEOMETER CM 820 PC (C+K electronic GmbH. Germany)를 이용하여 표피 수분량에 따른 전기전도도의 변화로 0에서 150까지 피부의 수분량을 수치화하여 보습효과를 측정하였다. 이 때, △TEWL 값이 작을수록 보습(지속)효과가 우수한 것으로 평가된다. 실시예 1, 2, 3 및 비교예 1, 2의 화장료에 대한 피부보습효과 측정 실험결과는 하기 표 15에 나타내었다.

피부보습효과

시험제품	△TEWL	Corneometer Value
실시예 1	1.2	120
실시예 2	1.0	126
실시예 3	0.9	128
비교예 1	6.1	86
비교예 2	2.3	111

상기 표 15의 결과에서도 알 수 있듯이, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3은 녹두 줄기세포 배양산물을 전혀 함유하지 않는 화장료 (비교예 1) 또는 녹두 줄기세포 배양산물 대신에 녹두 추출물만을 함유하는 화장료 (비교예 2)에 비해 경피수분 손실량이 적은 것으로 측정되었으며, 이러한 결과로부터 녹두 줄기세포 배양산물에 의해 경피수분 손실량이 매우 개선되어 녹두 줄기세포 배양산물이 보습 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 특히, 레시틴 유사유화제를 함유한 나노베시클에 녹두 줄기세포 배양산물을 포접한 화장료(실시예 3)의 △TEWL 값은 0.9g/hm²로 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하지 않는 화장료(비교예 1)에 비해 경피수분손실량이 6주 후 매우 효과적으로 개선되었음을 알 수 있었다.

또한, 피부의 수분량을 측정한 Corneometer value에서도, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3이 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않는 화장료 (비교예 1) 및 녹두 추출물만을 함유하는 화장료 (비교예 2)에 비해 측정된 피부 수분량이 높아, 나노베시클에 유효성분을 포접시킬 경우 화장료의 보습효과가 매우 효과적임을 증명하였으며, 특히, 나노리포좀의 구성으로서 레시틴보다는 레시틴 유사유화제를 함유하는 경우의 화장료가 피부의 수분량이 조금 더 높은 것을 확인하여, 유사유화제 함유 나노베시클이 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 피부 보습용 화장료의 전달제형으로 더 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 10. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 피부주름개선효과

녹두 줄기세포 배양산물을 포함하는 화장료의 피부 주름 개선 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 7의 바디 로션 제형의 화장료를 이용하였다. 피부주름개선효과의 측정은 다음과 같이 기기적 평가방법과 전문 인력에 의한 육안평가방법으로 시행하였다.

10-1. 기기 평가

30세 이상의 건강한 여성 50명을 5개 그룹 (A, B, C, D, E)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예 1의 화장료를, B그룹을 대상으로는 실시예 2의 화장료를, C그룹을 대상으로는 실시예 3의 화장료를, D그룹을 대상으로는 비교예 1의 화장료를, E그룹을 대상으로는 비교예 2의 화장료를 상기 표 15에 따라 제형하여 팔의 상박 왼쪽 2 X 2 ㎠의 면적에 (2회/일, 0.2g/회) 3개월간 도포하고, 투명한 실리콘 재질의 용액을 이용하여 피부주름의 레플리카 (Replica)를 떠서 피부주름측정기 (SKINVISIOMETER SV400, C+K Electronics GmbH Germany)로 피부주름 변화를 측정함으로써 피부주름의 개선정도를 관찰하였다. 레플리카의 상을 CCD 카메라로 3차원 분석하고, 각각의 주름의 거칠기 (R_m: m은 1이상의 정수)의 합을 주름의 개수로 나눈 값이 하기 수학식 6의 평균주름거칠기(R_z)로 주름개선 효과를 분석하였다. 실험결과는 하기 표 16에 나타내었다.

상기 표 16의 결과에서도 알 수 있듯이, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3 및 녹두 줄기세포 배양산물을 전혀 함유하지 않는 화장료인 비교예 1, 2의 화장료를 3개월 (T3) 사용 후 피부 주름의 높이 (거칠기)를 측정한 결과값의 차이인 △Rz 값으로 나타내었으며(△Rz = Rz(T0) (사용 전 평균주름거칠기)- Rz(T3) (3개월 사용 후 평균주름거칠기)), 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 평균주름거칠기 값의 차이는 각각 -27.3㎛, -28.7㎛ 및 -29.4㎛로, 녹두 추출물을 함유하는 비교예 2의 화장료(-18.7㎛(p < 0.01)) 및 녹두 줄기세포 배양산물과 녹두 추출물이 전혀 함유되지 않은 비교예 1의 화장료(-5.3㎛)에 비해 큰 폭으로 주름의 높이가 줄어들어, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유할 경우 화장료의 주름 개선 효과가 상당히 탁월함을 알 수 있었다. 게다가, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 중에, 나노베시클을 함유하는 화장료인 실시예 2(레시틴 함유 나노베지클) 및 실시예 3(레시틴 유사유화제 함유 나노베지클)의 화장료가 주름의 개선효과가 더 크며, 특히, 레시틴 유사유화제를 함유한 나노베시클에 포접시킨 화장료(실시예3)의 주름개선효과가 조금 더 우수하였다. 이 결과에서, 피부 주름 개선 효과가 탁월한 녹두 줄기세포 배양산물 함유 화장료의 전달제형으로 나노베지클(나노리포좀)이 더 효과적이며, 나노베지클 중에서도 레시틴 유사유화제 함유 나노베시클이 가장 우수하다는 것을 확인하였다.

10-2. 전문가의 육안평가

30세 이상의 여성 50명을 5개 그룹 (A, B, C, D, E)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예 1의 화장료를, B그룹을 대상으로는 실시예 2의 화장료를, C그룹을 대상으로는 실시예 3의 화장료를, D그룹을 대상으로는 비교실시예 1의 화장료를, E그룹을 대상으로는 비교실시예 2의 화장료를 상기 표 15에 따라 제형하여 주름이 있는 눈가를 중심으로 3개월간 도포하면서 피부주름의 개선정도 (ΔW)를 1개월 간격으로 (T0, T1, T2, T3) 측정하였다. 측정은 두 명의 전문가의 이중맹검법 (double-blind test)에 의한 객관적 평가 (표 17)와 피검자의 주관적 평가 (표 18)를 다음의 global photodamage score (0 : none, 1 : none/mild, 2 : mild, 3 : mild/moderate, 4 : moderate, 5 : moderate/severe, 6 : severe, 7 : very severe, Ref. : Arch Dermatol vol. 137 (8):1043-1051, 2001)에 근거하여 평가하였다.

상기 표 17 및 18의 피부주름개선에 대한 전문가의 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가 결과에서도 알 수 있듯이, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3은 녹두 줄기세포 배양산물을 전혀 함유하지 않는 화장료인 비교예 1, 2의 화장료에 비해 피부주름 개선효과에 대한 전문가의 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가에서 모두 피부주름 개선 효과를 나타내었으며, 피부에 도포 후 3개월 이후의 피부주름의 개선정도(ΔW: T3- T0)는 2.2 내지 2.9의 범위로 측정되었다.

반면, 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않은 화장료 (비교예 1)는 전문가의 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가 결과, 피부에 도포 후 3개월 이후의 피부주름의 개선정도를 나타내는 ΔW(T3- T0)값이 각각 0.9, 1.2로 이는 유의한 범위의 개선효과는 아니며, 통상적인 화장료의 장시간 사용에 의한 결과로 판단된다. 아울러 레시틴을 활용해 녹두 줄기세포 배양산물을 포접한 리포좀을 함유한 화장료(실시예 2)보다도 레시틴 유사유화제를 함유한 나노베시클에 포접한 화장료(실시예 3)에서 더 효과적인 피부주름 개선효과를 갖고 있어, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 전달 제형으로는 유사유화제를 함유한 나노베시클이 가장 우수함을 알 수 있었다.

반면 녹두 추출물을 함유하는 화장료 (비교예 2)는 전문가의 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가의 ΔW(T3- T0)값이 각각 1.7, 1.8로 측정되어 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않은 화장료(비교예 1)과 같이 유의한 범위의 개선효과가 나타나지 않은 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 본원 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료는 피부 주름 개선 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 제형으로는 나노베지클에 포접한 실시예 2 및 3의 경우 나노베지클에 포접하지 않은 실시예1에 비해 피부 주름 개선 효과가 더 탁월하였으며, 특히 레시틴 유사유화제를 함유하는 나노베지클에 포접한 실시예 3의 피부 주름개선 효과가 가장 탁월하여, 레시틴 유사유화제 함유 나노베지클이 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물의 전달 제형으로 더 우수하다는 것을 알 수 있었다.

실험예 11. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 피부 미백효과

상기 표 14의 조성으로 제조된 화장료인 녹두 줄기세포 배양산물(줄기) 함유 화장료 (실시예 1), 녹두 줄기세포 배양산물 함유 나노베지클 (레시틴 함유) 포함 화장료 (실시예 2), 녹두 줄기세포 배양산물을 함유 나노베지클 (레시틴 유사유화제 함유) 포함하는 화장료 (실시예 3), 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않는 화장료 (비교예 1), 녹두 추출물을 함유 화장료 (비교예 2)를 이용하여 피부 미백 실험을 시행하였다.

피부 미백 실험은 사람을 대상으로 색소침착 개선에 대한 시험을 실시하였으며, 기미, 주근깨 및 색소침착증을 갖고 있는 건강한 성인 남녀 50명을 대상으로 5개 그룹 (A, B, C, D, E)으로 나눈 후, A그룹을 대상으로는 실시예 1의 화장료를, B그룹을 대상으로는 실시예 2의 화장료를, C그룹을 대상으로는 실시예 3의 화장료를, D그룹을 대상으로는 비교예 1의 화장료를, E그룹을 대상으로는 비교예 2의 화장료를 각각 1일 2회씩 12주간 도포한 후 피부색의 변화를 크로마메타 (Minolta CR300)를 이용하여 측정하고, 색의 밝기 변화값(ΔL)을 얻었으며, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 동시에 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 19에 나타내었다. 이때 색소침착 개선정도는 하기의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

<색소침착 개선 평가 기준>

-3: 매우 악화

-2: 악화

-1: 약간 악화

0: 변화 없음

1: 약간 개선

2: 개선

3: 매우 개선

상기 색소침착 개선 정도에 대한 평가결과를 나타낸 표 19에 의하면, 크로마메타에 의한 피부색의 밝기 변화(ΔL) 측정값은 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3을 도포한 A, B, C 그룹의 평균 ΔL값의 범위는 6.60 내지 6.54 에 포함된 반면, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하지 않는 화장료인 비교예 1 및 비교예 2를 도포한 D, E 그룹의 평균 ΔL값은 각각 0.39, 4.47 로 측정되어 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 색소침착 개선 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

또한, 색소침착 개선 정도에 대한 숙련자에 의한 객관적 평가 및 피검자의 주관적 평가 결과에서도, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3의 평가결과는 2.3 내지 2.5 (개선)이었고, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하지 않는 화장료인 비교예 1 및 비교예 2의 결과 값은 0.1 내지 1.3 (변화없음 내지 약간 개선)으로 평가되어, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료가 피부 색소침착도 효과적으로 개선시키는 것으로 나타났다.

실험예 12. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 피부 안전성 실험

상기 표 14의 조성으로 제조된 화장료인 녹두 줄기세포 배양산물(줄기) 함유 화장료 (실시예 1), 녹두 줄기세포 배양산물 함유 나노베지클 (레시틴 함유) 포함 화장료 (실시예 2), 녹두 줄기세포 배양산물을 함유 나노베지클 (레시틴 유사유화제 함유) 포함하는 화장료 (실시예 3), 녹두 줄기세포 배양산물 및 나노베지클을 함유하지 않는 화장료 (비교예 1), 녹두 추출물을 함유 화장료 (비교예 2)를 이용하여 피부 안전성 실험을 수행 하였다.

실험은 피검자 45명(평균연령 22세, 연령분포 19세-34세)을 5그룹으로 나누어 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단, 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외하였다.

시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시킨 다음 A그룹에는 실시예 1의 화장료를, B그룹에는 실시예 2의 화장료를, C그룹에는 실시예 3의 화장료를, D그룹에는 비교예 1의 화장료를, E그룹에는 비교예 2의 화장료를 각각 15μg씩 Chamber에 적하시킨 후 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 도포하여 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하며 피부반응은 하기 표 20의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 실험결과는 하기 표 21에 나타내었다.

국제접촉피부염연구회의 판정 기준

기호	판 정 기 준	평 가	Mean Score
±	Doubtful or slight reaction and erythema	미소자극	0∼0.9
+	Erythema + Induration	경자극	1.0∼2.9
++	Erythema + Induration + Vesicle	중자극	3.0∼4.9
+++	Erythema + Induration + Bullae	강자극	5.0이상
-	Negative	무자극	0

피부 안전성

경과시간	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예2
24시간	0	0	0	0	0
48시간	0	0	0	0	0

상기 표 21에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료인 실시예 1, 2 및 3 및 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하지 않는 화장료인 비교예 1 및 비교예 2 모두 평균 자극정도가 0으로 피검자 전원에서 자극을 보이지 않아 피부에 안전한 제형임을 알 수 있었다.

제형예 8. 모발용 화장료

녹두 줄기세포 배양산물이 포함된 모발용 화장료는 하기 표 22의 조성에 따라 샴푸를 제조하여 실험에 사용하였으며, 원료인 30 % 암모늄라우레스설페이트, 30 % 암모늄라우릴설페이트, 코카마이드엠이에이, 폴리쿼터늄-10 등을 물에 첨가한 후 이 혼합물을 온도가 60 ℃가 될 때까지 가온하여 균일하게 용해시킨 다음 40 ℃까지 냉각시켰다. 여기에 5.0 %(v/v)의 녹두 줄기세포 배양산물, 디메치콘, 색소, 향료, 구연산, 소듐클로라이드 및 메칠클로로이소치아졸리논·메칠이소치아졸리논 혼합액을 투입하여 혼합한 후 실온으로 냉각하여 실시예 4의 샴푸 제형의 화장료를 제조하였다. 이때 비교예는 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하지 않는 샴푸(비교예 3), 녹두 추출물을 함유 하는 샴푸 (비교예 4), 상기 녹두 줄기세포 배양산물 대신에 비듬 감소 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 피록탄올 아민(비교예 5), 아연피리티온(비교예 6), 피록탄올 아민 및 아연피리티온의 혼합물(비교예 7)을 사용하여 실시예와 동일한 방법으로 제조하였다. 하기 표 22의 각 성분의 함량은 g으로 표시하였다.

원료명	실시예 4	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6	비교예 7
30% 암모늄라우레스설페이트	40.0	40.0	40.0	40.0	40.0	40.0
30% 암모늄라우릴설페이트	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
코카마이드엠이에이	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
폴리쿼터늄-10	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
디메치콘	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
색소 (청색 1호)	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
녹두 줄기세포 배양산물(줄기)	5.0	-	-	-	-	-
녹두 추출물	-	-	5.0
피록탄올 아민	-	-	-	1.0	-	1.0
아연피리티온	-	-	-	-	1.0	1.0
소듐클로라이드	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
향료	적량	적량	적량	적량	적량	적량
구연산	적량	적량	적량	적량	적량	적량
메칠클로로이소치아졸리논· 메칠이소치아졸리논 혼합액	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

실험예 13. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 비듬 감소 효과

상기 제조예 1의 녹두 줄기세포 배양산물(줄기)을 포함하는 제형예 8의 모발용 화장료를 이용하여 녹두 줄기세포 배양산물의 비듬 감소 효과를 측정하였다. 비듬 감소 효과를 측정 방법은 비듬이 비교적 많은 남녀 60명을 선정하여 제형예 8의 모발용 화장료 조성물 (실시예 4) 및 비교실험군으로 녹두 줄기세포 배양산물을 포함하지 않는 샴푸 (비교예 3), 녹두 추출물을 함유 하는 샴푸 (비교예 4), 녹두 줄기세포 배양산물 또는 녹두 추출물 대신에 종래의 비듬증 개선용 샴푸의 주성분으로 사용되는 피록탄올 아민이 함유된 샴푸 (비교예 5), 종래의 비듬증 개선용 샴푸의 주성분으로 사용되는 아연피리티온이 함유된 샴푸 (비교예 6), 피록탄올 아민 및 아연피리티온의 혼합물이 함유된 샴푸 (비교예 7)를 각각 1개월 동안 사용하게 한 뒤 비듬 감소율을 측정하였다.

시험 개시 전에 통상의 샴푸로 세발하고 3일간 누적된 비듬을 채집하여 채집된 비듬의 중량을 측정하고, 실시예 4의 샴푸로 세발하고 시험 종료 후 3일간에 누적된 비듬의 중량을 측정한 뒤 이를 비교 평가하였다. 이때 누적된 비듬의 채취는 진공 흡입 장치를 사용하여 직접 두피로부터 채취하였으며, 하기 수학식 7에 의해 비듬 감소율을 구한 뒤 그 결과를 표 23에 나타내었다.

비듬감소율(%)=

삼푸 제형예	비듬감소율(%)
실시예 4	84.9%
비교예 3	-2.1%
비교예 4	52.6%
비교예 5	52.5%
비교예 6	47.2%
비교예 7	68.2%

상기 표 23의 결과를 살펴보면, 통상적인 샴푸 (비교예 3)는 비듬을 오히려 증가시키는 것으로 나타났지만, 녹두 줄기세포 배양산물이 함유된 본 발명의 샴푸 (실시예 4)는 비듬 감소율이 우수했으며, 또한, 녹두 추출물을 함유 하는 샴푸 (비교예 4), 양성대조군인 피록탄올 아민이 함유된 샴푸 (비교예 5), 아연피리티온이 함유된 샴푸 (비교예 6), 피록탄올 아민 및 아연피리티온의 혼합물이 함유된 샴푸 (비교예 7) 보다 우수한 비듬 감소율을 나타내어 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료가 우수한 비듬 개선 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 14. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 두피 가려움증 완화 효과 및 자극 평가

상기 제형예 8에서 제시한 실시예 4 및 비교예 3 내지 비교예 7의 샴푸를 이용하여, 두피의 가려움을 많이 느끼는 피검자 60명을 선정하고 매일 1회씩 사용하게 한 뒤 하기의 판정 기준에 따라 두피 가려움증 완화 효과 및 두피 자극 여부를 평가하여 그 결과를 하기 표 24에 나타내었다.

<가려움증 완화 판정기준>

가려움증 완화효과가 매우 좋다 : 5, 가려움증 완화효과가 좋다 : 4, 가려움증 완화효과가 보통이다 : 3, 가려움증 완화효과가 없다 : 2, 가려움증 완화효과가 전혀 없다 : 1

<자극 평가 판정 기준>

자극이 많이 있다 : 1, 자극이 있다 : 2, 자극이 보통이다 : 3, 자극이 없는 편이다 : 4, 자극이 전혀 없다 : 5

삼푸 제형예	가려움증완화효과	자극 평가
실시예 4	4.6	4.8
비교예 3	2.1	2.5
비교예 4	3.5	3.7
비교예 5	3.5	2.3
비교예 6	3.3	2.2
비교예 7	3.7	2.1

상기 표 24의 결과에 따르면, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 본 발명의 샴푸 (실시예 4)는 비듬 개선 효과가 있는 것으로 알려진 성분을 어느 것도 함유하지 않는 샴푸 (비교예 3), 녹두 추출물을 함유 하는 샴푸 (비교예 4), 기존의 비듬증 개선용 샴푸 (비교예 5 내지 비교예 7)에 비해 가려움증을 보다 더 완화해 주면서 자극이 거의 없는 것으로 나타났다.

특히 가려움증 완화 효과 측정 결과, 아연피리티온이 함유된 샴푸(비교예 6)의 경우, 상기 실험예 13의 표 23 에서 나타낸 것처럼 약 70%의 비듬 감소율을 나타냈지만, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 실시예 4의 조성물에 비해 가려움증 완화 효과가 떨어지고 자극도 있는 것으로 확인되었다.

비듬증 개선 및 비강성 탈모증을 예방하기 위해 제품에 이용되는 성분들(아연피리치온, 피록톤올아민)들은 충분한 효과를 나타내기 위해서는 0.5 % ~ 2.0 %를 사용하여야 하는데 이 성분들은 눈에 대한 자극성이 커서 모발 화장품 중에 다량 첨가하여 사용하기에는 적당하지 못하다. 이러한 양을 제품에 사용할 경우 인체에 대한 안전성의 문제가 발생하기 때문에 사용량에 대한 규제가 있는 실정이다.

또한, 샴푸와 같은 모발 제품들은 많은 계면활성제를 사용하기 때문에 두피의 자극이 많이 나타날 수 있으나, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료는 여러 가지 샴푸의 원료에 의해 나타날 수 있는 자극을 최소화하고, 두피에 대한 부작용 없이 가려움 등을 효과적으로 방지하는데 매우 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 15. 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료의 탈모 감소 효과

상기 제형예 8에서 제시한 실시예 4 및 비교예 3 내지 비교예 7의 샴푸를 이용하여, 비교적 비듬 및 탈모량이 많은 피검자 30 명을 대상으로 탈모 방지 효과에 관한 실험을 12주 동안 진행하였다. 상기 실시예 4 및 비교예 3 내지 비교예 7의 샴푸를 1일 1회씩 12주 동안 사용한 후, 12주가 경과한 다음 머리를 감을 때 다시 탈락모를 수집하여 계수한 다음 그 결과를 표 25에 나타내었다.

표 25에서 알 수 있는 바와 같이, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 제형인 실시예 4의 삼푸로 처리할 경우 탈락모의 개수가 유의하게 감소하였으며, 탈모 감소 효과가 있는 것으로 알려진 물질을 포함하지 않는 샴푸(비교예 3), 녹두 추출물을 함유 하는 샴푸 (비교예 4), 기존의 비듬증 개선용 샴푸 (비교예 5 내지 비교예 7)의 샴푸에 비해서도 훨씬 탈모 감소 효과가 좋은 것을 확인하였다.

실험예 16. C57BL /6 마우스의 모발 생장 효과

상기 제형예 8에서 제시한 실시예 4, 비교예 3 및 4의 샴푸를 이용하여 하기와 같이 모발 생장 효과를 실험하였다. 발모 촉진 효능을 평가하기 위해, 등쪽 피부의 색이 pink color를 보이는 휴지기 체모의 6주령의 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 먼저, Animal clipper를 이용하여 조심스럽게 마우스 등판의 털을 깎아내고, 깎은 부위에 붓을 사용하여 0.2ml의 시료를 충분히 도포한 후 약 3분간 마사지를 하고 증류수로 충분히 헹구어 주었다. 시료 처리는 매일 1회씩 실시하였으며, 양성대조군에서 털이 자라 등을 완전히 덮히는 2주 동안을 관찰하였다. 이때 비교를 위해 대표적인 발모 촉진용 약물인 미합중국 특허 제 4,596,912호에 공개되어 있는 업존사(Upjohn Co., Ltd)의 3% 미녹시딜(Minoxidile)(비교예 7)를 양성대조군으로 사용하였다. 이때, 모발생장은 하기 표 26의 모발성장정도 및 평가방법에 따라 평가하였으며, 사진촬영을 하여 객관성을 높였다.

모발 성장 정도	점수화	판정
0-20%	-	효능 없음
20-40%	±	미약
40-60%	+	양호
60-80%	++	우수함
80%이상	+++	매우 우수함

도포 14일 후의 육모 효능 평가 결과

샴푸	모발성장정도	점수화	판정
실시예 4	88%	+++	매우 우수함
비교예 3	5%	-	효능 없음
비교예 4	40%	±	미약
비교예 8	98%	+++	매우 우수함

도 27의 결과에서도 알 수 있듯이, 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료 제형인 실시예 4의 삼푸는, 유효성분으로 아무것도 넣지 않은 비교예 3의 화장료에 비해 매우 탁월한 모발생장효과를 보였으며, 어느 정도 모발 생장효과가 있다고 알려진 녹두 추출물을 함유하는 화장료(비교예 3)의 경우에 비해서도 약 200% 정도 높은 모발 생장 정도를 보였다. 게다가, 본 발명의 녹두 줄기세포 배양산물을 함유하는 화장료는, 대표적인 발모 촉진제로 알려진 비교예 8의 화장료(미녹시딜 3%)에 가까운 정도의 우수한 모발 생장 정도를 나타내는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 레시틴으로 제조된 나노베시클 입자의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

도 2는 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트로 제조된 나노베시클 입자의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

Claims (17)

1. 녹두 줄기세포 배양산물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 녹두 줄기세포 배양산물은 녹두 전초의 줄기, 잎, 뿌리, 엽원기, 꽃 및 발아시점의 조직체(배축, 떡잎, 뿌리)로 구성된 군으로부터 선택되는 부위의 줄기세포를 배양하여 얻은 배양액의 추출물 또는 배양한 줄기세포를 파쇄한 후 추출하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 두피 가려움증 및 비듬증 개선용인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 탈모 방지용인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 육모용인 것을 특징으로 하는 모발 화장료 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹두 줄기세포 배양산물은 나노베시클에 포접하여 안정화시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 나노베시클은 레시틴 또는 하기 구조식 1로 정의되는 레시틴 유사 유화제, 오일성분 및 수성성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

    <구조식 1>

    

    상기 구조식에서 R1및 R2는 C12-C16의 알킬기, 알케닐기 또는 알킨닐기이다.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 레시틴 유사유화제는 글리세릴코코에이트/시트레이트/락테이트 또는 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹두 줄기세포 배양산물의 함량은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
15. 제 11 항에 있어서, 상기 녹두 줄기세포 배양산물은 나노베시클 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림, 스프레이, 헤어컨디셔너, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로숀, 헤어 페이스, 헤어 겔, 헤어 팩, 헤어 마사지, 헤어 리퀴드, 헤어 스프레이, 헤어 무스, 트리트먼트, 비 에어로졸 무스, 비 에어로졸 스프레이, 에어로졸 무스, 에어로졸 스프레이, 파마제, 탈색제, 샴푸, 린스, 샴푸와 린스 혼합형, 비누, 피부를 세정하기에 적합한 바 또는 타블렛, 비누 바, 비누 타블렛, 수 분산액, 파우더 및 오일로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
17. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 사람의 피부에 적용하여, 피부노화방지, 피부주름개선, 피부 미백, 피부보습, 아토피 개선 효과, 두피 가려움증 및 비듬증 개선 효과, 탈모방지 및 육모 효과로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효과를 달성하는 것인 화장 방법.

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