KR102500081B1 - 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물 - Google Patents
붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의하면, 붉가시나무 추출물을 포함함으로써, 높은 티로시나제 저해 활성 및 멜라닌 저해 활성 등을 가지는 피부미백용 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 우리 인체 내에서 외부 환경과 가장 밀접하게 접하고 있는 신체 기관으로서 인체 내부를 보호하는 생화학적이고 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 기관이다. 이러한 피부가 자외선에 과다 노출되게 되면 주름과 기미, 주근깨, 검버섯 등이 생기게 되며, 오염된 공기 등에 노출되면 아토피와 같은 악성 피부질환에 시달리게 된다.
특히 근자에 세계적으로 공해물질의 과다 배출로 인하여 공기가 심하게 오염되고 있으며 또 프레온 가스 등의 배출로 오존층이 엷어지거나 심지어 일부 지역에서는 파괴됨으로써 자외선에 더욱 강하게 노출되게 되었으므로, 피부보호의 필요성은 더욱 높아졌다.
그러므로 햇빛의 자외선을 적절하게 차단해주고, 이미 손상을 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재 활성화시켜서 세포를 증식시킬 필요가 있다. 그러나 일단 피부에 주름과 기미, 주근깨, 검버섯 등이 발생학 되면 이를 효과적으로 제거하는 것이 중요하다.
이에 따라 최근에는 천연 생약재 추출물들을 포함하는 피부미백용 조성물들이 개발되고 있는데, 이에 관한 종래기술로는 왕자귀나무 추출물을 함유하는 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물(대한민국 공개특허공보 제10-2021-0129476호), 모새나무 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물(대한민국 등록특허공보 제10-1230644호), 개서어나무 잎 추출물을 포함하는 피부미백 개선 화장료 조성물(대한민국 공개특허공보 제10-2009-0105999호) 등이 개시되어 있다.
그러나, 상록활엽수인 붉가시나무를 피부미백용 천연 생약재 소재로 사용한 예는 알려지지 아니하였는 바, 붉가시나무를 피부미백용 천연 소재로 활용하기 위한 연구개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행하여, 자원식물로서 활용가치가 높은 붉가시나무를 이용하여 얻은 추출물이 세포 독성이 없으면서도 피부미백 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 붉가시나무의 새로운 용도로서 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 붉가시나무 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 피부미백용 화장료 조성물은 상기 붉가시나무 추출물을 전체 조성물 대비 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함할 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 붉가시나무 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 피부미백용 건강기능식품 조성물은 상기 붉가시나무 추출물을 전체 조성물 대비 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 붉가시나무 추출물을 포함함으로써, 높은 티로시나제(tyrisinase) 저해 활성, 멜라닌(melanin) 저해 활성 및 MITF의 유전자 발현의 억제를 통한 높은 TRP-1과 TRP-2 억제 활성 등을 가지는 피부미백용 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 티로시나제 활성을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3f는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 붉가시나무 물 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 붉가시나무 물 추출물의 ABTS 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 붉가시나무 물 추출물 처리후 B16F10 세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3f는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 붉가시나무 물 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 붉가시나무 물 추출물의 ABTS 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 붉가시나무 물 추출물 처리후 B16F10 세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
본 발명의 제1 구현예는 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
붉가시나무는 내한성이 약하여 전라남도와 제주도 지방에 분포하며 수직적으로는 높이 170∼500m에서 자생하고, 주로 산록과 계곡의 양지에서 자라는데 음지에서 견디는 힘도 다소 있으며, 내조성 및 내공해성이 우수하다. 목재가 무겁고 잘 쪼개지지 않으며 보존성이 좋아서, 기구재, 기계재, 차량재, 선박재 등으로 이용된다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에서 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 잎 및/또는 가지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에서 상기 붉가시나무 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 에탄올 또는 주정일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 화장료 조성물은 상기 붉가시나무 추출물을 전체 조성물의 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 상기 붉가시나무 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이, 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제2 구현예는 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, “건강기능식품”은 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또한 가공한 식품을 모두를 지칭하며, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물에서 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리 및 껍질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 잎 및/또는 가지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물에서 상기 붉가시나무 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 에탄올 또는 주정일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 건강기능식품 조성물은 상기 붉가시나무 추출물을 전체 조성물의 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물은 상기 붉가시나무 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 다른 식품 성분과 함께 병용하여 사용하는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 예를 들어 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소 재에 첨가하거나, 캡슐, 분말, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
상기 붉가시나무 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 붉가시나무 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 그 성분이나 혼합법은 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 건강기능식품은 상기 붉가시나무 추출물을 전체 조성물의 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 20 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 힘량은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료 수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 상기 건강기능식품이 음료로 사용되는 경우에 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 슈크로오스와 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류; 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르 탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 상기 건강음료 100 mL 당 일반적으로 약 0.01∼0.04 g, 바람직하게는 약 0.02∼0.03 g이다.
본 발명의 상기 건강기능식품은 상기 붉가시나무 추출물 이외에 추가적으로 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 상기 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만, 상기 건강기능식품 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
한편, 본 발명의 상기 피부미백용 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 사용되는 상기 붉가시나무 추출물은 세포독성이 없는 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 상기 붉가시나무 추출물은 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명 하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
1. 실험 재료 및 방법
(1). 시료 추출물의 제작
난대 상록활엽수인 붉가시나무의 잎과 가지 시료를 채취한 후 세척하여 30℃의 열풍건조기에서 24 내지 72 시간 동안 건조하고 분쇄하여 시료를 준비하였다.
상기 건조 시료 200g 당 추출용매인 열수를 1,400ml 내지 2,000ml를 사용하여 추출물을 제조하였으며, 바람직하게는 1,800ml를 사용할 수 있다. 이 때, 상기 열수 추출물은 70℃의 온도에서 추출하였다.
(2). 시약 및 기기
DMEM, 소태아 혈청(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, MTS 에세이는 Sigma-Aldrich Chemical (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
프리-스테인드 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Pre-stained sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 표시자들은 Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. TRIzol 시약 및 중합효소 반응 키트들은 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다. 실시간 PCR(Real-time PCR)을 위해 Applied Biosystems사에서 판매하는 타크만 유전자 발현 어세이(Taqman Gene Expression Assay)를 구입하여 유전자 발현을 확인하였다. 구입한 유전자는 하기 표 1과 같다.
(3). MTS 시험법을 이용한 세포 생장률 평가
96-웰 플레이트에 5 × 104 cells/mL로 분주하였고, 미디아-FBS 10% 조건에서 각시료 추출물을 농도별로 24시간 처리하였다. 그 후의 각각 세포 배양액 용량의 1/10 배의 MTS 용해액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 배양한 다음, ELISA 마이크로플레이트 리더(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
(4). 티로시나제 효소의 활성 측정 및 멜라닌 함량 측정
6-웰 플레이트에 1 × 105 cells/mL 의 B16F10 세포 서스펜션을 가하여 CO2 인큐베이터에서 안정화시켰다. 그 후 시료의 추출물을 농도별로 처리하고, 1시간 후에 100 nM의 α-msh 를 각 세포에 처리하여 72시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하였다.
배양이 끝난 세포는 PBS로 세척하고, 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 세포를 용해하였다. 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 티로시나제(tyrosinase) 활성 측정 용액으로 사용하였고, Bradford 법으로 595 nm에서 흡광도를 측정, 동량의 단백질 양을 계산하였다.
시료 50 μL와 10 mM L-DOPA 50 μL를 분주하여 혼합한 후, 37℃에서 30분 반응시킨 뒤 ELISA 리더기로 490 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량은 용해 완충액을 이용하여 세포를 용해한 뒤 4℃, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리를 한 다음, 세포 침전물을 이용하였다.
세포 침전물에 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH 용액을 첨가하여 80℃에서 1시간 동안 멜라닌을 용해시킨 후, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5). 총 페놀 함량 측정
총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu's phenol 시약을 이용한 비색법을 이용하였다. 시료에 Folin-Ciocalteu's phenol 시약을 각각 160 μL를 첨가한 뒤 교반 후 3분간 상온에서 반응시킨 뒤, 10% Na2CO3 용액을 160 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다.
그 뒤 10,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하였으며 상등액을 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질의 검량선 작성을 위해 갈산(gallic acid)을 이용하였다.
(6). 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 96 웰 플레이트에 농도별 시료 10 μL에 10% 알루미늄 나이트레이트와 1M 퍼태슘 아세테이트를 각각 4 μL, 메칸올을 82 μL를 첨가한 뒤, 40분간 암소 반응을 시킨 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질의 검량선 작성을 위하여 루틴(rutin)을 이용하였다.
(7). DPPH 저해 활성도 측정
자유라디칼의 활성 측정은 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 농도별 시료와 동량의 1 mM DPPH를 가한 후, 상온에서 30분간 암소반응 시킨 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고, 시료를 넣은 것은 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다.
저해율 (%) =
(8). ABTS 저해 활성도 측정
ABTS 용액은 7.4 mM ABTS와 2.45 mM K2S2O8를 섞어 16시간 동안 냉암소에 보관하여 준비하였으며, 흡광도값이 0.7~0.8 사이에 도달하게 50% 에탄올로 희석하여 사용하였다. 96-웰 플레이트에 ABTS 용액과 농도별 시료를 혼합하여 실온에서 20분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고, 시료를 넣은 것은 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다.
저해율 (%) =
(9). 세포배양
마우스 멜라노마 세포(mouse melanoma cell)로부터 유래된 B16F10 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 페니실린/스트렙토마이신 100 unit/mL과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
2. 실험 결과
(1). 붉가시나무 추출물의 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서의 티로시나제 저해 활성
티로시나제(tyrosinase)는 멜라닌 형성의 반응에 관여하는 효소로서, 전사 인자인 MITF 와도 밀접한 관계가 있다. 따라서 타우린이 멜라닌 형성의 과정 중 어느 단계에서 작용하여 억제효과를 나타내는지 규명하기 위하여, 티로시나제의 활성을 확인하였다.
B16F10 세포에서 각시료를 농도별로 처리하여 72시간 후 측정하였으며, 대조군으로는 코지산(100μg/mL)를 사용하였고, 그 결과는 대조군(control) 대비 백분율로 나타내었다.
도 1a 및 도 1b는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 티로시나제 활성을 나타낸 것이다.
도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 붉가시 잎(QTL)은 티로시나제 저해 활성이 100μg/mL 농도에서만 나타났고, 붉가시 나뭇가지(QTB)에의 모든 농도에서 티로시나제 활성이 저해되었으며, 100μg/mL 농도에서는 코지산(kojic acid)과 비슷한 수준의 저해효과를 보임을 알 수 있다.
(2). 붉가시나무 추출물의 B16F10 멜라노마 세포에서의 멜라닌 저해 활성
멜라닌은 세포 내의 소기관인 리보솜에서 티로시나제 효소의 생합성에서 합성되기 시작한다. 이 효소의 작용으로 아미노산의 일종인 티로신에서 몇 단계의 합성을 거쳐 기저층의 멜라닌 세포 흑색소포 표면에 침착하여 검고 갈색의 작은 멜라닌(melanin) 입자가 만들어 진다.
붉가시나무 추출물의 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 생합성 저해 활성을 측정하였다. 도 2a 및 도 2b는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 멜라닌 함량을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 붉가시나뭇의 잎은 50μg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 억제 효과를 나타내었으며, 붉가시나뭇의 가지에서는 농도 의존적으로 멜라닌 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
(3). 붉가시나무 추출물의 MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현
멜라닌은 생합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달 물질이 관여하고 있다. 그중 MITF는 멜라닌 합성과정에 중요한 전사 조절 인자로서, TRP-1 과 TRP-2의 전사를 촉진한다. 붉가시나무 추출물의 미백효과 검증을 위하여 멜라닌 합성 관련 인자들의 발현 정도를 측정하였다.
도 3a 내지 도 3f는 붉가시나무 물 추출물 및 코지산 처리후 B16F10 세포의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3f에서 보는 바와 같이, 붉가시나무의 잎 추출물을 처리하였을 때에는 TRP-1의 유전자 발현이 감소하였으며, TRP-2는 100μg/mL에서만 감소하였다. 붉가시나무의 가지 추출물에서는 모든 유전자의 발현이 저해되었으며, 특히 TRP-1과 TRP-2는 코지산(K)보다 더 높은 저해 활성을 보임을 알 수 있다.
(4). 붉가시나무 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가진다. 이들은 페놀릭 하이드록실(OH)기를 가지기 때문에, 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하며, 피부미백, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다.
붉가시나무의 잎 추출물 및 가지 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량은 하기 표 2에 나타내었다. 전반적으로 붉가시나무의 잎 추출물이 가지 추출물 보다 더 높은 폴리페놀을 함유하고 있고, 반면에 붉가시나무의 가지 추출물이 잎 추출물 보다 더 높은 플라보노이드를 함유하고 있음을 알 수 있다.
| 구분 | 폴리페놀 | 플라보노이드 |
| 잎 | 170mg | 23.8mg |
| 가지 | 156mg | 37.9mg |
(5). 붉가시나무 추출물의 DPPH 자유라디칼의 소거 활성
DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유라디칼으로서, 피부미백제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는데, 이것은 다양한 천연소재로부터 피부미백 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다.
자유라디칼은 인체내에서 지질 또는 단백질 등과 결합하여 노화를 일으키기 쉬우나, 페놀성 화합물의 경우 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강하여 인체 내에서 자유라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용할 수 있다.
도 4는 붉가시나무 잎 및 가지 물 추출물의 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 붉가시나무 잎, 가지의 추출물과 비타민 C(Vit.C)의 DPPH 소거 활성을 농도별로 측정하여 비교한 결과, 붉가시나무의 가지는 비타민 C와 비슷하거나 더 높은 DPPH 소거 활성능을 나타냄을 알 수 있다.
(6). 붉가시나무 추출물의 ABTS 자유라디칼의 소거 활성
ABTS와 퍼태슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 암소에 방치하면 ABTS+이 생성되는데, 붉가시나무 추출물의 항산화력에 의해 ABTS+이 소거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색된다. 이와 같이 ABTS+ 탈색 반응은 이미 생성된 자유라디칼의 제거 정도를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS+의 소거 활성능을 측정하는 방법으로서, 소수성과 친수성 모두에 적용 가능한 실험 방법이다.
도 5는 붉가시나무 잎 및 가지의 물 추출물의 ABTS 자유라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 5에서 보는 바와 같이, 붉가시나무의 ABTS+이 소거능은 DPPH와 유사한 경향을 나타내었으며, 잎의 경우 모든 농도에서 비타민 C와 유사한 활성을 나타냄을 알 수 있다.
(7). 붉가시나무 추출물의 세포독성 평가
어떤 화합물이나 혹은 식물에서 추출한 물질의 생명 활동을 조사하기 위한 전제조건으로서 세포 대사에 영향을 주지 않는지를 조사해 보아야 한다. 각 시료의 추출물이 세포 생존율에 영향을 주는지를 검사하기 위하여, B16F10 멜라노마 세포에 시료 추출물을 처리하고 세포 MTS 방법으로 생존율을 측정하였다. 이 때, 붉가시나무 추출물의 농도는 10~500μg/mL 범위에서 처리하였으며, 모두 독성이 없는 농도에서 진행하였다.
도 6은 붉가시나무 잎 및 가지의 물 추출물 처리후 B16F10 세포의 세포 생존율을 나타낸 것이다.\
도 6에서 보는 바와 같이, 붉가시나무의 잎과 가지 추출물에서는 500μg/mL 농도에서 만 독성이 나타났다. 상기 실험은 모두 독성이 없는 농도에서 진행하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (10)
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 가지 추출물을 유효성분으로 포함하되, 상기 붉가시나무 가지 추출물의 농도는 10~50㎍/mL인 피부미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 붉가시나무 가지 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 붉가시나무 가지 추출물을 전체 조성물 대비 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb) 가지 추출물을 유효성분으로 포함하되, 상기 붉가시나무 가지 추출물의 농도는 10~50㎍/mL인 피부미백용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 붉가시나무 가지 추출물의 추출 용매는 물 또는 유기용매인 것을 특징으로 하는 피부미백용 건강기능식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 피부미백용 건강기능식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 붉가시나무 가지 추출물을 전체 조성물 대비 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 건강기능식품 조성물.
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