KR101230644B1 - 모새나무 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.)의 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로써, 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 안전하고 인간 타이로시나제 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성억제효과를 가져 피부 미백 효과를 가진다.

Description

모새나무 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물{Composition useful for human skin whitening comprising Vaccinium bracteatum Thunb extract}

본 발명은 식물 추출물을 함유한 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물을 함유한다.

피부의 색소침착에 주된 요인인 멜라닌은 피부의 표피에 존재하는 멜라노사이트라는 세포의 세포 내 소기관인 멜라노좀에서 여러단계의 산화반응을 거쳐 합성된다. 특히, 멜라닌의 합성 경로의 주요 반응을 조절하는 효소로서 타이로시나제는 피부 색소 침착을 조절하는 천연물이나 화학물질의 연구개발에 주요 타깃이 되고 있다.

하지만 대부분 피부 색소 침착을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법으로 인간 타이로시나제 대신에 버섯 타이로시나제를 사용하고 있다. 이는 현재까지 인간 타이로시나제를 확보하는데 어려움이 있기 때문이지만 버섯 타이로시나제는 그 단백질의 아미노산 서열과 효소로서 기질에 대한 특이성에서 있어서 인간 타이로시나제와는 상당한 차이가 있는 것이 사실이다. 이러한 사실은 본 발명자의 이전 연구 “파라쿠마린산의 인간 타이로시나제 효소활성 억제효과 및 세포내 멜라닌 합성 억제효과에 관한 연구(Phytother Res . 2010 Aug;24(8):1175 -80.)”에서도 개시되어 있다.

본 발명은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.)를 건조 후 분쇄하는 단계; 용매 추출하는 단계: 및 감압농축하는 단계를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물을 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로써, 상기 화장료 조성물은 피부에 안전하고 인간 타이로시나제 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성억제효과를 가져 피부 미백 효과를 가진다.

도 1은 모새나무 잎의 추출 스킴이다.
도 2는 모새나무 잎의 EtOAc 분획을 TLC 수행 결과이다.
도 3은 모새나무 잎의 액체-액체 추출 후 분획별 인간 타이로시나아제 활성 저해 실험 결과이다.
도 4는 모새나무 잎의 EtOAc 분획을 TLC 수행 한 후 12개의 서브 분획 별 인간 타이로시나아제 활성 저해 실험 결과이다.
도 5는 모새나무 잎의 EtOAc 분획의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 p-쿠마린산 및 본 발명의 모새나무 잎 추출물의 인간 타이로시나아제 활성 저해 실험결과이다.

본 발명의 일 측면은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.)의 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

여기 명세서에서 모새나무 추출물은 모새나무 잎 뿐만 아니라 줄기, 뿌리를 모두 포함한 식물 전체를 의미한다.

또한, 구상나무(Abies koreana Wilson) 추출물 또는 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 추출물의 경우도 잎 뿐만 아니라 줄기, 뿌리를 모두 포함한 식물 전체를 의미한다.

모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.)는 해변의 산지에서 자라는 난대성 상록활엽수로 한국·일본·중국 등지에 분포한다. 모새나무를 포함한 상록수가 근육과 뼈를 강하게 하고 눈에 좋다고는 하나 이에 대한 자료는 찾을 수 없었다. 한편, 최근에는 모새나무 잎 추출물의 항당뇨 효능이 보고된 바 있다(J Ethnopharmacol . 2010 Aug 9;130(3):465-9). 또한 모새나무의 열매는 국내에서 토종 블루베리라 불리기도 한다.

구상나무는 구상나무(Abies koreana Wilson)는 한국 특산종으로 제주도 한라산의 중턱 이상에 숲을 이루고 있고, 전라남도 무등산, 전라북도 덕유산, 경상남도 지리산 등지에 분포한다. 최근에 정원수나 크리스마스트리로도 많이 이용되고 있다. 또한 편백나무가 가장 많이 함유한 항균성 물질인 피톤치드는 단위발생량에서 소나무는 물론 잣나무에 비해 월등하다.

[표 1]

단풍나무(Acer palmatum Thunb.)는 한국이 원산지로 일본과 중국 등지에 분포하는 낙엽활엽교목으로 민간에서는 관절염과 위장병에 효과있다고 알려져있다. 또한 단풍나무 잎 추출물에서 분리한 비텍신(vitexin) 등 플라보노이드의 항산화 효과가 보고되기도 했다(Arch Pharm Res. 2005 Feb;28(2):195-202.)

상기 모새나무 추출물, 구상나무 추출물 또는 단풍나무 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 함유하는 추출물은 모새나무, 구상나무 또는 단풍나무의 잎, 줄기 또는 뿌리를 채취한 후 통상적인 건조 방법, 바람직하게는 자연 건조 시키고, 상기 건조물을 세절 또는 분말 형태로 준비한 다음 추출 용매를 사용하여 추출한다.

추출 용매가 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는, 상기 추출용매는 물, 탄소수 1-4의 저급 알코올 (예. 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 1,3-부틸렌글리콜 등), 탄소수 1-4개의 저급케톤 (예. 아세톤 등), 탄소수 1-4개의 저급 에스테르 (예. 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트 등), 디클로로메탄 클로로포름 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 탄소수 1-4의 저급 알코올, 가장 바람직하게는 물 또는 에탄올을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 구상 나무(Abies koreana Wilson), 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 추출물, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.)를 건조 후 분쇄하는 단계; 용매 추출하는 단계: 및 감압농축하는 단계를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 모새나무를 건조 후 분쇄하는 단계는 구상나무, 단풍나무 또는 이들의 조합을 건조 후 분쇄하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 모새나무 추출물을 통상적인 화장료에 일정 비율로 첨가 혼합하여 화장료를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 모새나무 추출물을 함유하는 화장료의 제형으로는 유연 화장수(스킨), 로션, 에센스, 크림 등 통상의 화장료 제형에 부가되어 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물은 화장료의 총 건조중량에 대하여 0.01∼50중량%, 바람직하게는 0.1∼5중량%의 함량으로 함유한다. 0.01중량% 이하로 함유되면, 본 발명에 따른 추출물의 작용효과인 타이로시나제 저해활성이 거의 나타나지 않으며, 50중량%를 초과하면 화장료의 안정성에 불리할 뿐 아니라 과잉 부가에 따른 작용효과의 상승효과도 나타나지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 상승 혹은 보조할 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 도 있다. 예를 들어 이러한 보조 성분으로서 종래에 미백 작용이 있는 것으로 알려진 알부틴, 아스코르브산 유도체 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예로 보다 자세히 설명하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 모새나무 추출물 제조

모새나무 (Vaccinium bracteatum Thunb.)의 잎 또는 줄기를 정제수로 3회 이상 세척한 후 열풍건조기(50℃)를 이용하여 24시간 이상 완전 건조 시킨 후 분쇄하였다. 80%(V/V) 알코올 수용액을 사용하여, 용매추출법을 이용하여 추출하였다. 추출 시 효율을 높이기 위해 교반기를 이용하여 48시간 이상 교반시켰다. 이를 50℃ 이하에서 감압 농축 후 동결건조하여 분말상의 식물추출물을 얻었다. 모새나무 추출물의 최종 수율은 14.8%였다.

[표 2]

제조예 2-4: 모새나무 추출물을 포함하는 혼합 추출물의 제조

모새나무 추출물 외 구상나무 추출물, 단풍나무 추출물 또는 이들의 조합을 하기 표 1과 같이 조합하였다 조합비율은 각각의 추출물을 동일 중량으로 혼합하였으며, 제조 방법은 상기 제조예 1과 동일하다.

[표 3]

제조예 5: 액체-액체 분배 및 정제

모새나무 추출물(800 mg)을 4 mL 물에 현탁시칸 후 4 mL의 메틸렌 클로라이드(MC)로 2회, 4 mL의 에틸아세테이트(EtOAc)로 2회 액체-액체 분배(partition) 하였다. 합쳐진 MC 층, 합쳐진 EtOAc 층 및 수용액층은 감압하에서 농축하여 MC 분획(165 mg), EtOAc 분획(46.3 mg) 및 수용액 분획(564 mg)을 얻었다. 도 1은 상기 분획을 얻는 과정을 도시하고 있다.

제조예 6: TLC 정제 및 분리

상기 제조예 5에서 얻어진 EtOAc 분획을 prep TLC를 수행하였다. 상기 EtOAc 분획을 10%(w/v) 농도로 에탄올에 용해시킨 후 TLC 플레이트(시그마-알드리치, MO, USA)에 연속적인 선으로 적용하였으며, 총 EtOAc 분획 2 mg이 적용되었다. 기준 화합물로, 0.5%(w/v) 농도로 에탄올에 용해된 p-쿠마린산(PCA) 및 퀘세틴(quercetin)이 사용되었으며, TLC 플레이트의 양 끝에 스팟으로 적용하였다. 이 때, 기준물질은 스팟당 5 μg 적용되었다. TLC 어센딩(ascending)은 공기가 차단된 용기에서 클로로포름, 메탄올 및 아세트 산(90:10:1, v/v/v)의 혼합물을 이동상으로 사용하여 수행되었다. 밴드 및 스팟은 UV 램프 하에서 하였다. TLC 플레이트 상 크로마토 그래피 면적은 12개의 수평 섹터들로 나눈 후(도 2) 각각의 섹터들의 TLC 상 흡착제를 긁어낸 후 50 μL 에탄올로 각 분획을 용출하였다. 이러한 방법으로, 상기 EtOAc 분획에 대한 총 12개의 서브 분획을 준비하였다.

제조예 7 : 인간 타이로시나제 준비

실험실상에서 정상의 인간 멜라노사이트는 장시간 배양을 하게 되면 멜라닌의 생성능이 저하되고 생존률도 감소할 뿐 아니라, 배양하는데 비용이 일반 세포에 비해 높다. 이러한 단점은 인간배아신장세포(HEK 293 cell)에 인간 타이로시나제 유전자의 영구적 주입을 통해 극복하였다.

인간배아신장세포(HEK 293 cell)는 미국 세포주.균주은행(American Type Culture Collection)에서 구입하였고 인간 타이로시나제가 영구적으로 발현하는 인간배아신장세포(HEK 293-TYR)을 제작하였다. 배양된 타이로시나제-인간배아신장세포(HEK 293-TYR)는 세포 용해용 용매(10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 120 mM NaCl, 25 mM KCl, 2.0 mM EGTA, 1.0 mM EDTA, and 0.5% Triton X-100, 단백질분해효소 억제제)를 이용하여 세포 용해액을 얻은 후, 13,000 × g 로 15분간 원심 분리하여 그 상층액을 인간 타이로시나제 세포 추출액으로 사용하였다.

인간 타이로시나제 활성 저해 시험

시험예 1 : 모새나무 추출물의 인간 타이로시나제 활성 저해 시험

상기 제조예 1에서 수득한 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 잎의 동결건조 추출물을 80 μg/mL의 농도에서 타이로시나제 효소에 대한 저해력을 측정하여 피부 미백능을 평가하였고 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다.

본 시험은 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에 0.1 M 인산염완충용액(pH 6.8), 인간 타이로시나제로서 세포 용해액 200 μg/mL, 0.5mM L-타이로신, 1 μM L-도파(DOPA), 80 μg/mL 식물 추출액을 포함한 반응액이 200 μL가 되도록 하여 37℃에서 120분간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(reader)를 이용하여 반응생성물인 도파크롬(DOPA chrome)의 흡수파장 490㎚에서 흡광도를 측정한 후 그 저해율을 계산하여 식물 추출물의 피부 미백능력을 평가하였다.

양성 대조군으로 알부틴을 사용하였으며, 상기 방법으로 부터, 제조예 1에 따라 수득된 식물 추출물의 타이로시나제 활성 저해율을 계산하여 아래 표 2에 나타내었다. 알부틴은 피부 미백 효과를 위해 사용되는 대표적인 물질이다.

타이로시나제 활성 저해율(%) = [(ODexp.-ODcon.)/ODblank]×100

ODexp. : 타이로시나제 함유시 식물 추출물 시료 측정값

ODcon. : 타이로시나제 비함유시 식물 추출물 시료 측정값

ODblank : 타이로시나제 함유시 80% 에탄올 수용액 시료 측정값

음성 대조군으로 식물 추출물 대신 80% 에탄올 수용액을 사용하였다.

[표 4]

표 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 제조예 1은 대조군(알부틴)과 비슷한 타이로시나제 활성 저해효과를 나타냈다. 제조예 1은 대조군(알부틴)과 유사한 정도의 효과를 보였으나, 그 활성 분획은 그 보다 우수한 효과를 보일 것이라 기대할 수 있었다.

시험예 2 : EtOAc 분획의 인간 타이로시나제 활성 저해 시험

상기 제조예 5에서 얻어진 MC 분획, EtOAc 분획 및 수용액 분획을 인간 타이로시나제 효소에 대한 저해력을 측정하여 피부 미백능을 평가하였고 그 결과를 아래 도 3에 나타내었다.

구체적인 실험방법은 시험예 1과 동일하게 진행하였다.

도 3에서 보듯이 EtOAc 분획은 85%의 저해율을 보여 다른 분획과 비교했을 때 가장 저해 활성이 높았다.

시험예 3 : TLC 섹터 서브 분획의 인간 타이로시나제 활성 저해 시험

상기 제조예 6에서 수득한 12개의 EtOAc 서브 분획 용출액에서도 인간 타이로시나제 효소에 대한 저해력을 측정하여 피부 미백능을 평가하였고 그 결과를 아래 도 4에 나타내었다.

구체적인 실험방법은 시험예 1과 동일하게 진행하였다.

도 4에서 보듯이 서브 분획 6-7이 가장 저해 활성이 높았다. 도 2에서는 EtOAc 분획을 p-쿠마린산(PCA) 및 퀘세틴(quercetin)의 기준물질과 함께 어센딩하였는 바, EtOAc 분획의 주요 활성 화합물이 TLC 상에서 p-쿠마린산과 비슷한 이동성을 보였으며, 요오드 증기상에서 유사한 색상 반응을 보였다.

시험예 4: EtOAc 분획의 HPLC 분석

상기 제조예 5에서 얻어진 EtOAc 분획을 photodiode array 검출기를 장착한 HPLC로 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. EtOAc 분획에서 가장 큰 피크를 보이는 피크를 화살표로 나타내었다. HPLC 상 체류시간(retention time)과 UV 흡수 스펙트럼 결과 가장 큰 피크는 p-쿠마린산인 것으로 나타났다.

모새나무 잎의 조 추출물의 p-쿠마린산(PCA)의 함량은 0.8% (w/w)였다. 또한, 효소 어세이 결과, p-쿠마린산의 인간 타이로시나제 활성 저해는 0.5 μg/mL에서 50% 저해율을 보이며, 이는 조 추출물의 저해에 비해 100 배이상 저해율이 높다는 것을 의미한다(도 6). 이러한 결과는 p-쿠마린산이 모새나무의 주요 활성 성분일 수 있음을 의미한다.

모새나무 추출물 및 이를 포함하는 혼합 추출물을 포함하는 미백화장료 제조

실시예 1: 모새나무 추출물 0.05% 함유 미백 화장료 (크림) 제조

상기 제조예 1에 따른 추출물을 0.05% 함유하는 크림은 다음과 표 5와 같이 제조하였다.

[표 5]

실시예 2: 모새나무 추출물 함유 2% 미백 화장료(크림) 제조

상기 제조예 1에 따른 추출물을 2% 함유하는 크림을 다음과 표 6과 같이 제조하였다.

[표 6]

실시예 3-5 : 모새나무 추출물을 포함하는 혼합 추출물 0.05% 함유 미백 화장료 (크림) 제조

상기 제조예 2 내지 4에 따른 추출물을 0.05% 함유하는 크림을 상기 실시예 1과 같이 제조한다.

비교예 1

본 발명의 모새나무 추출물을 함유하지 않은 화장료(크림)의 비교예 1은 다음 표 7과 같다.

[표 7]

시험예 4 : 인체피부 안전성 시험

상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1에서 통상적인 방법에 따라 제조한 제품들의 인체피부에서 자극성을 알아보기 위하여, 인체피부 일차자극 시험을 실시하였다. 화장품은 특정 질환의 치료를 위해 일정기간 사용되는 의약품과 달리 대개 건강한 정상인틀이 일상적으로 장기간 연용하는 제품으로 절대적인 안전성이 확보되어야한다. 따라서, 인체피부 일차자극 시험은 실제 사용조건에서의 피부자극을 예견할 수 있어 필수적으로 수행되고 있다.

상기 시험은 건강한 성인남녀 30명을 대상으로 각 화장료의 적당량(20 μl)을 첩포시험용 IQ 챔버에 적하시켜 등 부위에 48시간 첩포한 후, 챔버를 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 경과 시점에서 피부상태 변화를 육안으로 판독하였다. 피부반응의 평가 기준 및 점수는 아래의 표 8에 나타낸다.

[표 8]

첩포 제거 후 30분에 1차 판정, 다시 24시간 경과 후 2차 판정하여 아래와 같은 식에 따라 그 반응도를 계산하였다. 1차, 2차 판정의 평균 반응도로 인체피부에 대한 자극도를 나타내었으며 그 결과는 하기의 표 9에 나타낸다.

자극도 = [(반응점수 × 반응자 수) / 최대 반응점수(4) × 총 시험자 수(n)]×100×1/2

[표 9]

표 9에서 보는 바와 같이 비교예 1과 본 발명에 따른 조성물의 평균 반응도는 인체피부 일차자극 측면에서 저자극 범주로 모두 피부 자극이 없음을 확인 할 수 있다.

시험예 6. 인체피부에 대한 피부 미백 효과 시험

실시예 1 내지 5 및 비교예 1에서 제조한 제품들의 인체피부에서 미백 효과 시험을 실시하여 그 결과는 아래 표 7 및 표 8에 나타냈다.

인체피부에 대한 피부 미백 효과 시험은 건강한 성인남녀 20명을 대상으로 피험자의 양쪽 전박부 내측에 1.5cm×1.5cm의 구멍이 4개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피험자의 최소홍반량(MED) 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 인공 색소침착을 유도하였다. 상기에서 제조된 본 발명에 따른 크림과 대조 크림을 각 색소침착 부위에 8주간 1일 2회 아침, 저녁으로 시험부위에 도포하게 하였다. 평가는 제품 사용 전과 8주간 사용 후에 멕사메터(Mexameter)와 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 각각 멜라닌 지수와 피부색을 평가하였다.

멕사메터를 이용하여 측정한 멜라닌 지수는 아래 표 10에 나타낸다. 멜라닌 지수는 값이 작을수록 미백 효과가 큰 것이다.

[표 10]

표 10에서 보이듯이, 실시예 1 내지 5는 멜라닌 지수에서 비교예 1에 비해 우수하고 제조예 1의 함량이 증가할수록 그 효과도 증가함을 알 수 있다.

피부색에 대한 효과는 분광광도계에 의해 측정된 L*, a*, b*값을 이용하여 피부의 흰 정도를 반영하는 ITA°(Individual Typological Angle) 값을 계산하여 표 10에 나타내고 ITA°값 계산식은 다음과 같다. 특히, ITA°값은 클수록 미백 효과가 큰 것이다.

ITA° = arctg [(L* - 50) / b*] × (180 / π).

L*: 명도인자; 밝기

b*: 색채인자; 파랑-노랑

[표 11]

표 11에서 보이듯이 실시예 1 내지 5는 피부색에 있어 비교예 1 보다 우수한 피부 미백 효과를 확인 할 수 있었다. 또한, 그 효과는 제조예 1의 함량이 증가할 수록 우수함을 알 수 있었다.

Claims (5)

1. 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 추출물로써, 상기 모새나무 추출물은 모새나무 잎, 뿌리, 줄기 또는 이들의 조합을 함유하나, 모새나무 종자 또는 과실은 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 구상 나무(Abies koreana Wilson), 단풍나무(Acer palmatum Thunb.) 추출물, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
   
3. 제 1항 또는 제 2항 있어서, 상기 추출물의 총 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대해 건조 중량으로 0.01-50 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 모새나무(Vaccinium bracteatum Thunb.) 잎, 뿌리, 줄기 또는 이들의 조합을건조 후 분쇄하는 단계, 여기에서 모새나무 종자 또는 과실은 함유하지 않으며;
   용매 추출하는 단계: 및
   감압 농축하는 단계를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 모새나무 잎, 뿌리, 줄기 또는 이들의 조합을 건조 후 분쇄하는 단계는 구상나무, 단풍나무 또는 이들의 조합을 건조 후 분쇄하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법.
   

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