KR102020384B1 - 구상나무 유래의 정유를 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리모넨(limonene), 캄펜(camphene), 알파-피넨(alpha-pinene) 및 보르닐 아세테이트(bornyl acetate) 등을 포함하는 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 함유함으로써, 티로시나아제(tyrosinase) 및 멜라닌 합성 관여 유전자 억제 활성, 콜라겐 관련 단백질 및 콜라겐 생합성 등이 증가할 수 있는, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

구상나무 유래의 정유를 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving skin whitening and wrinkle comprising essential oil from Abies koreana}

본 발명은 구상나무 유래의 정유를 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리모넨(limonene), 캄펜(camphene), 알파-피넨(alpha-pinene) 및 보르닐 아세테이트(bornyl acetate) 등을 포함하는 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 함유함으로써, 티로시나아제(tyrosinase) 및 멜라닌 합성 관여 유전자 억제 활성, 콜라겐 관련 단백질 및 콜라겐 생합성 등이 증가할 수 있는, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

소나무과 전나무속에 속하는 구상나무(Abies koreana E.H . Wilson)는 고산수종으로 약 500~1500 m의 고지대에 자생한다.

구상나무는 희귀식물로서 세계자원보존연맹(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, IUCN)의 희귀 및 멸종위기 식물의 분류범주에 약관심종(Near threatened) 으로 등재되어 있으며, 주로 수목의 생육환경, 분포, 형태적 형질과 관련된 분류학적 연구, 재배 육종에 관한 연구가 주로 이루어져있다(Eur. J. Biochem . 255, 139-146 (1998)).

구상나무에 대한 화학적 성분이나 생리활성에 대한 연구 자료는 많지 않으나, 구상나무 잎에 리그난 뿐만 아니라(Korean J. Food Sci . Technol . 31, 260-262 (1999)), 알파-피넨(α-pinene), 캄펜(camphene), 리모넨(limonene), 보닐 아세테이트(bornyl acetate), 보네올(borneol)과 같은 여러 모노테르펜(monoterpene)류의 물질과 페놀성 화합물이 함유되어 있으며(J. Ethnopharmacol . 46, 133-152.8 (1995); Khim. Prir . Soedin . 27, 511-517 (1991)), 모노테르펜으로 구성된 구상나무 잎 정유가 피부병원균이나 E. coli, MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 등의 다양한 미생물에 활성을 가지고 있다고 알려져 있다(Phytother. Res. 21, 1246-1250 (2007); Mol . Med . Rep. 15, 111-116 (2017)).

또한, 구상나무 잎 추출물은 질산(nitric oxide)의 생성이나 암세포에 대한 억제효과나(Exp. Cell Res. 201, 373-379 (1992)), 민간요법에서 소화불량, 혈관 및 폐질환에 효과가 있다고 보고되어 있다(J. Ethnopharmacol . 46, 133-152 (1995).

한편, 구상나무 추출물을 포함하는 피부 상태(피부 보습, 피지분비, 항염, 여드름 등) 개선용 조성물(공개특허공보 제10-2015-0057331호), 구상나무 추출물을 포함하는 모발과 두피 상태 개선용 조성물(공개특허공보 제10-2015-0057332호), 구상나무 추출물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 조성물(공개특허공보 제10-2015-0057333호), 구상나무 추출물을 포함하는 스트레스 완화 및 심리적 안정 증진용 향료 조성물(공개특허공보 제10-2015-0057334호) 등이 알려져 있다.

그러나, 구상나무를 이용하여 피부와 연관된 미백 또는 주름 개선 연구 등은 알려진 바 없기 때문에, 구상나무를 이용한 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 구상나무를 이용하여 티로시나아제(tyrosinase) 및 멜라닌 합성 관여 유전자 억제 활성, 콜라겐 관련 단백질 및 콜라겐 생합성 등이 증가할 수 있는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 구상나무 유래의 정유를 조성물의 전체 중량 대비 0.01~50 중량% 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 구상나무가 구상나무 목본의 잎, 줄기, 수피 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 정유가 리모넨(limonene), 캄펜(camphene), 알파-피넨(alpha-pinene) 및 보르닐 아세테이트(bornyl acetate)를 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의하면, 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 함유함으로써, 티로시나아제(tyrosinase)의 억제활성, 멜라닌 유래 인자들의 mRNA 수준, 콜라겐 관련 단백질 및 콜라겐 생합성 등이 증가할 수 있는, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 B16F10 마우스 멜라노마(mouse melanoma) 세포(A) 및 인간 피부섬유 아세포(HDF)(B)의 생존에 미치는 구상나무 유래 정유(AKE)의 영향을 나타낸 것이다.
도 2는 구상나무 유래 정유의 B16F10 마우스 멜라노마 세포에서의 타이로시나아제 저해활성(A) 및 구상나무 유래 정유(AKE)의 HDF 세포에서의 콜라겐 관련 단백질 조절(B)을 나타낸 것이다.
도 3은 구상나무 유래 정유(AKE)의 멜라닌 합성에 관여하는 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, A는 타이로시나아제, B는 TRP-1, C는 TRP-2의 mRNA 수준을 나타낸 것이다.
도 4는 구상나무 유래 정유(AKE)의 HDF 세포에서의 콜라겐 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, A는 콜라겐 타입 1의 발현, B는 콜라게나아제 타입 1(MMP-1)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 자외선 조건하에 있는 HDF 세포에서 구상나무 유래 정유(AKE)의 처리에 의한 콜라겐 합성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

자연적 노화 또는 자외선에 의한 외부 노화는 피부 세포 활성과 기능을 저하시키고 항상성과 재생을 조절하는 단백질 생합성을 저하시킴으로 유도된다.

첫째, 피부에 자외선을 받으면 색소침착이 유도되는데 이는 자외선 흡수에 의한 피부 세포의 손상을 억제할 목적으로 멜라닌(melanin) 생성이 증가된 결과로서, 멜라닌은 피부와 머리카락의 색상을 조절하는 인자이며 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨, 기미 등의 과색소 현상을 유발하고 피부노화를 촉진시킨다.

멜라닌 합성은 멜라노사이트 내부에 있는 멜라노솜에서 일어나며, 타이로신을 기질로 타이로시나아제(tyrosinase), 타이로시나아제 관련 단백질-1(TRP-1), 타이로시나아제 관련 단백질-2(TRP-2)에 의해 흑갈색의 협력체인 멜라닌을 생성하게 된다.

멜라닌 형성 조절인자로 잘 알려진 microphthalmia-associated transcription factor(MITF)는 타이로시나아제에 결합하여 관련 효소들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.

둘째, 자외선 유도에 의한 콜라겐 합성의 방해는 피부 주름을 유발시킨다. 콜라겐은 섬유아세포에서 합성되어 진피의 대부분을 차지하는 세포외 기질의 주요 성분으로 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)에 의해 분해되는 주요 기질 단백질이다.

상기 MMPs는 피부의 각질형성세포, 섬유아세포를 비롯한 많은 세포들로부터 분비되며, 현재까지 약 20여종 이상의 종류가 있는 것으로 알려져 있다. 이 중 MMP-1은 콜라게나아제 1으로 알려져 있으며, 콜라겐 타입 I과 III을 기질로 하고 있다.

Brenneisen 등의 연구에 의하면 자외선 조사와 활성 산소종에 의해 피부내의 MMPs 활성이 증가되어 진피층 내의 콜라겐 등과 같은 세포외 기질들의 붕괴에 영향을 미치며, MMPs가 광노화에 매우 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다(J. Biochem. 255, 139-146 (1998)).

따라서, 피부의 노화를 완화시키기 위해서는 멜라닌 억제 또는 콜라겐 합성을 촉진 할 수 있는 핵심 요소를 발굴하고, 이를 조절할 수 있는 물질을 찾는 것이 중요하다고 볼 수 있다.

본 발명의 상기 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물은 상기 구상나무 유래의 정유를 조성물의 전체 중량 대비 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~30 중량%, 보다 바람직하게는 5~20 중량% 포함할 수 있다.

상기 구상나무 유래의 정유를 0.01 중량% 미만으로 포함하는 경우에는 유효성분의 양이 너무 적어 피부 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 없고, 50 중량%를 포과하여 포함하는 경우에는 제형상의 문제가 발생할 수 있다.

상기 구상나무 유래의 정유(essential oil)는 증류(hydrodistillation) 법, 즉 구상나무의 잎과 증류수의 혼합물을 가열하고, 열에 의해 휘발된 증기를 냉각관에서 응축시켜 수집된 물과 정유의 응축물에서 물을 제거한 후, 여과한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 구상나무는 구상나무 목본의 잎, 줄기, 수피 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 잎, 열매 또는 이들의 혼합물, 보다 바람직하게는 잎일 수 있다.

본 발명의 상기 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 정유는 리모넨(limonene), 캄펜(camphene), 알파-피넨(alpha-pinene) 및 보르닐 아세테이트(bornyl acetate) 등을 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 상기 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

(1). 식물정유 추출

본 실험의 공시재료인 구상나무는 광릉수목원 내에서 채취한 잎을 사용하였다. 채취한 잎은 곧바로 4℃ 이하에서 냉장 보관하였고, 잎과 잔가지를 분리한 후 잎만을 잘게 자른 후 정유 추출용 시료로 사용하였다.

정유(essential oil)의 추출은 증류(hydrodistillation) 법으로 추출하였고, 10 L 둥근 플라스크에 1kg의 잎과 증류수를 첨가하고 가열용 맨틀(MS-DM608 heating mantle, MTOPS^®,Yangju,Korea)을 이용하여 가열하였으며, 가열 온도는 102±1℃로 설정하였다.

열에 의해 휘발된 증기는 냉각관에서 응축시킨 후 modified dean stark trap에서 수집하였고, 물과 정유가 응축되어 있는 트랩에서 물을 제거하여 정유를 얻었다.

상기에서 얻은 정유는 황화나트륨 무수물(anhydrous sodium sulfate)을 사용하여 수분을 제거하고, 0.45μm의 주사 필터를 이용하여 여과한 후, 시험에 사용될 때까지 4℃에서 냉장 보관하였다.

(2). 내부표준물질 용액 및 성분분석용 시료의 제조

내부표준물질로 n-헵탄올과 n-테트라데카노에이트 메틸에스테르를 사용하였다. 내부표준물질 용액은 100㎕의 n-헵탄올과 n-테트라데카노에이트 메틸에스테르를 메탄올과 디클로로메탄의 혼합액(3:1, v/v)에 녹여 100 ppm농도로 제조하였다.

정유의 성분분석을 위해서 각 식물정유 20㎕를 취하여 내부표준물질 용액을 넣어 최종 5㎖ 부피로 맞추어 균질화한 후 분석에 사용되었다. 정성분석을 위한 표준물질은 내부표준용액으로 희석하여 1~1,000 ppm 수준의 농도가 되도록 하였다.

(3). 정성 및 정량 분석

정유의 성분 분석은 GC/MS 장비(Trace 1310/ISQ-LT, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 수행하였다. 이때, 컬럼은 DB-5MS 모세관 컬럼(길이 60 m, 내부직경 0.25 mm, 코팅필름 두께 0.25 ㎛; Agilent, CA, USA)을 사용하였다.

1㎕의 시료를 250℃ 주입구에 20:1 분할비로 주입하였으며, 운반 가스는 헬륨으로 사용하였다. 오븐 온도는 최초 50℃에서 5분간 유지하고 10℃/min로 65℃까지 승온한 후 30분간 유지, 5℃/min로 120℃까지 승온한 후 15분간 유지, 1℃/min으로 140℃까지 승온한 후 11분간 유지, 10℃/min로 250℃까지 승온한 후 5분간 유지, 20℃/min으로 325℃까지 승온한 후 6분간 유지하였다.

또한, 화합물의 검출은 질량분석기로 하였고, 인터페이스와 이온소스의 온도는 250℃로 하였다. 질량 스펙트럼은 EI-positive 스캔 범위 35-550 m/z로 0.2 scans·s^-1의 속도로 TIC (total-ion chromatogram)를 획득하였다.

시료에 존재하는 화합물들의 정량은 각 피크의 질량스펙트럼을 표준 라이브러리 및 표준물질의 것과 비교하여 정성한 다음, 내부표준물질 피크의 면적과 목적 화합물 피크의 면적비율과 농도간의 직선적 상관성을 이용한 내부표준물질 정량법을 통하여 정량하였다.

시료에 존재하는 물질들 중 표준물질이 확보되지 않은 물질들의 정성은 시료의 TIC 에서 S/N 비율 100 이상의 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11(National Institute of Standards and Technology, MD, USA) mass spectral library와 비교하여 수행하였다.

이 때, NIST library-search 프로그램의 매취(match) 값이 가장 높은 것을 선택하여 모노테르펜류와 세스퀴테르펜(sesquiterpene)류를 중점적으로 확인하였고, 피크들의 체류시간(RT)과 비교 확인된 화합물명을 목록화하였다.

(4). 세포주 및 세포배양

미백과 관련된 연구에 사용된 세포는 B16F10 마우스 멜라노마(mouse melanoma) 세포로 한국세포주연구재단(Seoul, Korea)에서 구입하였다.

B16F10 마우스 멜라노마 세포는 Dulbeco's modified eable's medium(DMEM) 배지로 각각 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)과 1% 항생제(penicillin-streptomycin)를 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂의 세포배양기에서 배양하였다.

항 주름과 관련된 연구에 사용한 세포는 인간 피부 섬유 아세포(human dermal fibroblast; HDF) 세포로 CEFOBIO(Seoul, Korea)에서 구입하였다. HDF는 DMEM 배지로 각각 10% FBS와 1% 항생제를 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂의 세포배양기에서 배양하였다.

(5). 자외선 B 처리

배양접시에 담긴 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고, 플레이트의 덮개를 개방한 상태에서 UVB를 조사하였다. 이 때 자외선 B(Ultraviolet-B)는 UV-B 램프(Vilber Lourmat UV lamp, France)를 이용하여 60 mJ/cm²의 강도로 30 분간 조사하였다.

(6). 세포 생존율 측정

B16F10 마우스 멜라노마 세포와 HDF(human dermal fibroblast) 세포를 이용해 CCK-8 어세이(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)를 통한 추출물에 대한 세포성장 억제 활성효과를 확인하였다.

세포를 96-웰 플레이트에 웰당 세포를 1×10⁴씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적당한 농도로 희석한 식물정유를 웰당 200㎕씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다.

혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 2번 세척하여 제거한 후, 10% CCK-8 용액을 웰당 100㎕씩 처리하고 빛을 차단하여 90분 동안 37℃에서 반응시켰다.

마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 450nm에서 흡광값을 측정하여 세포의 생존율을 계산하였다.

(7). 타이로시나아제 저해활성 측정

B16F10 마우스 멜라노마(mouse melanoma) 세포주의 타이로시나아제 활성은 Martinez-Esparza 외의 연구자들의 빙법(Eur . J. Biochem . 255, 139-146 (1998))을 사용하였다.

6-웰 플레이트에 웰당 세포를 3×10⁵개 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건의 세포배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지로 2번 세척하고, 다시 혈청이 포함되지 않은 배지로 37℃, 5% CO₂조건의 세포배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.

혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적정 농도로 희석한 식물정유를 웰당 2㎖씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 Phosphate-buffered saline(PBS)로 2번 세척하고 세포만 마이크로튜브에 옮겨서 라이시스 버퍼(0.1 M sodium phospate(pH6.8), 1% Triton X-100)를 이용하여 세포를 용해하여 13,000 rpm, 25분 동안 원심분리 하였다.

상등액으로 단백질 정량을 하여 각각의 샘플에 동일한 단백질 양(20 μg/㎕)과 L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 버퍼(2 mg/ml, 0.1M sodium phospate(pH6.8), Sigma, MO, USA) 180㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광값을 측정하여 계산하였다.

(8). 프로콜라겐 타입-1( Procollagen type- 1)의 생합성 측정

HDF를 96-웰 플레이트에 웰당 세포를 1×10⁴개를 분주하고, 37℃, 5% CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지로 2번 세척하고, 다시 혈청이 포함되지 않은 배지를 채워 37℃, 5% CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다.

혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적정 농도로 희석한 식물정유를 웰당 200㎕씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다(양성 대조군; Transforming growth factor(TGF)-β 5 ng/ml). 배양 후 배지를 모아 3,000 rpm, 3분 동안 원심분리하여 상등액을 얻어 실험에 사용하였다.

세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 프로콜라겐 타입-1 C 펩타이드(PIP) EIA 키트(Takara Bio, Japan)을 사용하여 프로펩타이드(propeptide)의 양을 측정하였다.

(9). 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

HDF를 60mm 디쉬에 4×10⁵개 분주하고, 37℃, 5% CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 혈청이 포함되지 않은 배지로 2번 세척하고, 37℃, 5% CO₂세포배양기에서 24 시간 배양하였다.

혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적정 농도로 희석한 식물정유를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 2번 세척하고 세포를 마이크로튜브에 옮겨 세포 라이시스 버퍼(150mM NaCl, 50mM Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜린산, 0.1% SDS, 단백질 저해제 칵테일(Roche, IN, USA)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 세포를 용해시켰다.

세포 용해액을 14,000 rpm, 4℃, 30분 동안 원심분리하여 단백질만 포함하고 있는 상층액을 얻어서 BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량하였다.

정량된 20㎍/㎕의 단백질을 Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrrlamide Gel에 전기영동시킨 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겨 실온에서 1시간 동안 블로킹 버퍼(5% skin milk in Tris Buffered Saline with Tween-20(TBST)에서 배양하였다.

1차 항체를 종일 보관 후 TBST로 3회 세척하고, 2차 항체는 2시간 배양한 다음 TBST로 3회 세척하여 ECL 검출시약(AbClon, Seoul, Korea)을 이용하여 단백질 발현을 현상하였다.

(10). 전체 RNA 분리 및 cDNA 합성

60mm 디쉬에 B16F10 마우스 멜라노마 세포를 8×10⁵개 분주하고, 37℃, 5% CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 혈청이 포함되지 않은 배지로 2번 세척, α-MSH 250 nM를 먼저 처리하고 4시간 후에 적정 농도로 희석한 식물 정유를 처리하여 48시간 동안 배양하였다.

배지를 제거한 후 PBS로 세포를 두번 세척한 다음, TRIzoI(Invitrogen, NY, USA)를 각 디쉬에 500㎕를 분주하여 세포를 용균(lysis)시킨 후, 클로로포름 200㎕를 분주하여 20초간 위 아래로 흔들어 주었다.

그 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액 200㎕를 이소프로판올 300㎕가 들어 있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였고, 상층액을 제거한 후 75% 에탄올-디에틸파이로카버네이트(DEPC) 워터를 1㎖ 분주하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. 뉴클레아제 유리수(nuclease free water; NFW)를 20㎕ 분주하여 녹인 후 RNA 양을 측정하였다.

올리고(dT) 15 프라이머(500㎍/㎖) 1㎕, 추출한 0.5㎍ RNA와 NFW를 75℃에서 5분간 반응시킨 후, 5 x 리액션 버퍼, MgCl₂, PCR 뉴클레오타이드 믹스, 리보뉴클레아제 저해제, 역전사 효소(Reverse Transcription System, Promega, WI, USA)를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.

(11). 실시간 PCR (Real-Time PCR )

합성한 cDNA와 2 x SYBR green mix(TaKaRa, Japan), 프라이머(Bioneer, Daejeon, Korea), ROX(TaKaRa)를 각각 넣어 ABI step one plus(Thermo Fisher Scientific) 기기를 이용하여 95℃ 10분, 95℃ 3초, 60℃ 3초, 95℃ 15초, 60℃ 1분, 95℃ 15초(45싸이클)로 실시간 정량분석을 한 뒤, 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.

프라이머 정보는 하기의 표 1과 같다.

(12). 통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 결과의 유의성을 검정하기 위해 분산분석(ANOVA)을 실시한 후, p<0.05 수준에서 Bonferronl correction을 실시하였으며, 그 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 이는 Prism(ver. 5.0, GraphPad Software, Inc., CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

2. 결과

(1). B16F10 마우스 멜라노마 및 HDF 생존에 미치는 구상나무 유래 정유의 영향

구상나무 유래 정유가 피부 관련세포, 즉 미백과 연관된 B16F10 멜라노마 및 주름과 연관된 HDF에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 농도에 따른 생존율 측정을 하였다.

이를 위하여 구상나무 유래 정유의 농도는 10^-2~10^-6까지 10배수의 범위에서 처리하였다. 구상나무 유래 정유 10^-5~10^-6의 농도에서는 두 세포주 모두 약 90% 이상 세포 생존율을 보이며, 통계적 유의성을 나타내었다.

도 1의 Adptj 보는 바와 같이, B16F10 멜라노마의 경우, 10^-4 이상의 농도에서는 급격한 세포 독성을 나타내는 것을 알 수 있었으며, 도 1의 B에서 보는 바와 같이, HDF의 경우 10^-4 이후의 농도에서 20% 이상의 세포 독성 유도를 나타내었다. 따라서 이후의 실험은 구상나무 유래의 정유 10^-5 농도에서 진행하였다.

(2). 구상나무 유래의 정유에 의한 B16F10 멜라노마 세포에서의 타이로시나 아제 저해 활성

타이로시나아제는 흑갈색의 멜라닌 색소 생성에 관여하는 효소로써 타이로시나아제 활성 억제는 피부 내에서 멜라닌 폴리머의 합성을 효과적으로 저해한다고 알려져 있다(Physiol . Rev. 84, 1155-1228 (2004)).

이러한 방법으로 구상나무 유래 정유의 타이로시나아제 저해효과를 측정하여 도 2의 A와 같이 분석하였다. 본 실험에는 음성 대조군 Arbutin 1 mg/ml과 양성 대조군 α-MSH 250 nM을 사용하였으며, 처리후 48시간 이후 타이로시나아제 저해를 측정하였다.

정상군을 100%로 기준하였을 때 음성 대조군은 약 2.1배의 저해효과 억제를 보였으며, 양성 대조군은 약 2.4배의 저해효과 개선을 보였다. 이를 비교하였을 때 구상나무 유래의 정유는 음성 대조군 수준 이상인 약 2.8배의 저해효과 억제를 보였고, 양성 대조군과 비교하였을 경우에도 약 9.3배의 저해효과 억제를 보였다.

(3). 구상나무 유래의 정유 처리에 의한 멜라닌 합성에 관여하는 주요 mRNA 발현 조절

피부에서 멜라닌은 효소반응을 통해 타이로시나아제, TRP-1, 그리고 TRP-2로부터 합성된다. 이는 피부세포로부터 멜라닌 합성 정도를 확인할 수 있는 세포신호 인자이다.

구상나무 유래 정유가 멜라닌 합성 관련 유전자인 타이로시나아제, TRP-1, TRP-2의 발현에 미치는지 확인하기 위해, 실시산 PCR로 유전자 발현을 확인하였다.

도 3의 A에서 보는 바와 같이, 구성너무 유래의 정유는 α-MSH에 의해 증가된 타이로시나아제, TRP-1, TRP-2의 mRNA 수준을 확연히 감소시키는 것을 알 수 있다. 자세히 살펴보면, 타이로신의 경우 양성 대조군 단독 처리에 비해 58% 정도 발현이 감소하였고, 음성 대조군과 비슷한 수준으로 감소됨을 알 수 있다.

TRP-1의 경우 도 3B에서 보는 바와 같이, 양성 대조군 단독 처리 대비 약 64% 감소를 보였고, 음성 대조군과 마찬가지로 비슷한 수준으로 발현됨을 알 수 있었다.

TRP-2의 경우 도 3의 C에서 보는 바와 같이, 양성 대조군 대비 발현율 60% 감소 및 음성 대조군보다는 1.4배 발현 증가를 보였다.

따라서, 구상나무 유래의 정유가 B16F10 멜라노마 세포내의 신호를 조절하여 멜라닌의 생성 억제에 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

(4). 구상나무 유래 정유에 의한 HDF 세포에서의 콜라겐 관련 단백질 조절

피부 주요성분인 콜라겐은 섬유아세포에서 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 구성하고 있다. 콜라겐의 농도에 따라 피부 세포간의 견고성, 지탱 능력, 세포 증식 및 분화에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

콜라겐의 부족 또는 결함은 피부 주름을 유발하며 이는 propeptide의 감소로부터 야기된다. 본 연구에서는 HDF 에서 콜라겐 생합성 증가를 확인할 수 있는 pro-collagen type I C-peptide(PIP) 효소 면역분석(enzyme immunoassay)를 실시하였다.

구상나무 유래 정유의 콜라겐 생합성량 결과, 도 2의 B에서 보는 바와 같이, 양성 대조군인 TGF-β 처리에 의한 생합성보다는 낮지만 정상군 보다는 약 12% 개선된 PICP 생합성률을 보였다.

또한, 구상나무 유래 정유 처리에 의해 HDF에서 콜라겐 타입 1(collagen type 1)의 발현에 미치는 영향을 알아보고자, 구상나무 유래 정유를 HDF 세포에 처치하고 48시간 뒤 면역 분석을 시행하였다.

도 4의 A에서 보는 바와 같이, 콜라겐 타입 1의 단백질 발현이 정상군에 비해 약 2.3배 증가함을 알 수 있었다.

콜라겐은 콜라게나아제에 의해 분해가 되는데, 이는 전사인자인 AP-1에 의해 유도되는 MMP-1에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다. MMP-1은 콜라게나아제 타입 1으로 알려져 있으며, 이의 감소는 콜라겐 타입 1이 분해되지 않음을 시사하는 것이다.

도 4의 B에서 보는 바와 같이, MMP-1의 발현이 정상군 대비 약 15% 정도 감소한 것으로 보아, 구상나무가 피부섬유아세포의 콜라겐을 증가시키는 과정을 개선시키는 것을 알 수 있다.

(5). 자외선 조건하에 있는 HDF 세포에서 구상나무 처리에 의한 콜라겐 합성 개선

자외선은 외부스트레스, 즉 활성 산소종의 증가를 통해 노화를 유발하는 것으로 알려져 있으며, 인공적인 자외선 처리 조건은 노화 상태를 조절하는 피부 관련 연구를 진행하는데 중요한 수단이다.

HDF에 적절한 자외선 유도를 확인하기 위해 조사 세기별 콜라겐 타입 1을 확인한 결과, 도 5의 A에서 보는 바와 같이, 60 mJ/cm²까지는 발현을 유지하는 것을 알 수 있었다.

Zeng 외의 연구자들에 따르면, 본 연구 결과와 마찬가지로 60 mJ/cm²에서 자외선 유도된 활성 산소종을 유도할 수 있다고 보고한 바 있다 (Mol . Med . Rep. 15, 111-116 (2017)).

따라서, 60 mJ/cm²자외선 조사 상태에서 구상나무를 처리하였을 때 collagen type 1의 발현이 조절되는지를 확인해 보았다. 도 5의 B에서 보는 바와 같이, 자외선 조사를 하지 않은 위의 연구에서는 10^-5 농도에서 의미 있는 결과를 도출한 반면, 자외선 조건하에서는 10배 희석된 10^-6 농도에서 발현이 개선된 것을 알 수 있었다(정상군 대비 약 50% 회복).

이는 자외선에 영향을 받아 환경이 나빠진 HDF에 의한 것으로 유추된다. 하지만 자외선 조건하에서도 구상나무가 콜라겐 타입 1을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

(6). 피부개선을 유도하는 구상나무 유래 정유

구상나무 유래 정유의 특징 및 피부관련 추가 연구를 위해 구성요소 및 함량을 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 리모넨, 캄펜, 알파-피넨, 보르닐 아세테이트가 주요 구성물질임을 알 수 있다. 특히, 리모넨의 경우 항암 연구가 많았으나, 최근 항염증 및 항생제활성을 유도하여 피부 콜라겐 합성 증가와 염증세포 감소 등의 효과를 보인 연구가 보고되었다 (Exp . Cell Res. 201, 373-379 (1992)).

또한, 알파-피넨의 경우, Ferula oil에 21.36% 함유되어 있으며, 항산화 및 항생제활성을 나타냄이 보고되었다 (Mol . Med . Rep. 15, 111-116 (2017)). 따라서, 구상나무 유래 정유 또는 구별된 이의 추출물은 항산화에 의한 피부 노화 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 구상나무 유래 정유의 피부개선 효과를 확인하기 위해, 미백 및 항주름 기능 관점에서 살펴보았다. 미백 효과를 측정하기 위해, 타이로시나아제 저해활성 억제 및 관련 세포신호인자 들의 발현을 확인하였고, 항주름 기능을 알아보기 위해 콜라겐 및 연관 단백질 분석을 실시하였다.

이러한 결과는 구상나무 유래 정유가 피부 개선 더 나아가 피부 노화억제에 효과적일 것으로 판단된다.

이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예 및 실험예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.

본 발명은 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 함유함으로써, 티로시나아제(tyrosinase)의 억제활성, 멜라닌 유래 인자들의 mRNA 수준, 콜라겐 관련 단백질 및 콜라겐 생합성 등이 증가할 수 있는, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

<110> Republic of Korea(National Institute of Forest Science) <120> Cosmetic composition for improving skin whitening and wrinkle comprising essential oil from Abies koreana <130> 11004 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of tyrosinase <400> 1 gatgggaatg ctctgcctaa ta 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of tyrosinase <400> 2 acaggtgtga aggtctcaaa g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TRP-1 <400> 3 gccttctttc tcccttcctt ac 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TRP-1 <400> 4 ctgctggtct ccctacattt c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TRP-2 <400> 5 ggctggagca ctctgtaaat 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TRP-2 <400> 6 tgggtttagt tctagccctt tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of GAPDH <400> 7 aaggtcatcc cagagctgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of GAPDH <400> 8 ctgcttcacc accttcttga 20

Claims (5)

1. 구상나무 유래의 정유를 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 구상나무 유래의 정유는 조성물의 전체 중량 대비 0.01~50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 구상나무는 구상나무 목본의 잎, 줄기, 수피 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 정유는 리모넨(limonene), 캄펜(camphene), 알파-피넨(alpha-pinene) 및 보르닐 아세테이트(bornyl acetate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.

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