KR101365262B1

KR101365262B1 - 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101365262B1
Application number: KR1020120004054A
Authority: KR
Inventors: 강희철; 홍소영; 금문섭
Original assignee: (주)지에프씨
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-02-21
Also published as: KR20130083330A

Abstract

본 발명은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 배양 유용 물질을 포함하는 배지에서 배양된 캘러스를 포함하는 배양물 또는 상기 배양물로부터 얻은 캘러스를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition for containing Callus and Culture media mixture comprising the same}

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기기도 한다. 따라서, 피부내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타티온(glutathione)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질을 피부외용 연고나, 에센스 등의 화장료에 배합하므로써 피부 미백을 실현하거나, 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선하였다. 그러나 하이드로퀴논은 소정의 미백 효과를 발휘하지만, 피부 자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하며, 코지산은 용액 내에서 불안전하여 화장료의 제조공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 또한, 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다. 한편, 태반 추출물 등은 피부에 자극이 없으나, 미백 효과가 불충분하다.

식물체를 표면살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물호르몬 농도를 함유한 고체배지 (solidified medium)에서 배양하면 callus 세포를 얻을 수 있다. callus 세포는 그 상태로 계속 배양하거나, 액체배지에서 배양하여 현탁배양 (suspension culture)을 이룰 수 있으며, 이를 통하여 많은 양의 세포를 얻을 수 있다. callus 세포는 배지의 식물호르몬 농도 조절을 통하여 배 (embryo)를 발생시키고, 다시 뿌리나 싹을 형성시킬 수 있다. 이렇게 발생한 배 (embryo)나 싹, 뿌리는 발아 또는 성장을 통하여 완전한 식물체로 발전한다.

대한민국 공개특허 10-2011-0033461에는 '백화사설초의 줄기세포를 함유하는 항산화 및 항노화용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

식물 줄기세포(callus)는 2,000년대 후반에 새롭게 등장하여 산업 발달 및 화장품 수요 등에 의해서 많이 개발되고 있는 실정이다. 줄기세포에 대한 관심이 고조되면서 식물 줄기세포의 활용도 모색되기 시작하였고, 이에 따른 식물 줄기세포에 대한 새로운 개념이 정립되었다. 식물 줄기세포는 동물 줄기세포에 비해 증식속도가 빠르며 대량 배양이 쉬운 편이며 인간줄기세포와 같은 윤리적 문제가 없어 식물 줄기세포의 활용에 대한 관심이 점점 높아지고 있다. 이러한 추세에 맞추어 식물 줄기세포에 대한 안정성 및 신뢰성이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 피부 주름 개선 효과가 월등한 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 일 관점인 화장료 조성물은 배양 유용 물질을 포함하는 배지에서 배양된 캘러스를 포함하는 배양물 또는 상기 배양물로부터 얻은 캘러스를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 관점인 화장료 조성물의 제조 방법은 배양 유용 물질을 함유하는 배지에서 식물 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 상기 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 배양 유용 물질을 포함하는 배지에서 배양된 캘러스를 포함하는 배양물 또는 상기 배양물로부터 얻은 캘러스를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 피부 미백 또는 피부 주름 개선 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 실시예와 비교예에 따른 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 대해 처리 농도에 따른 티로시나제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예와 비교예에 따른 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 대해 처리 농도에 따른 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예와 비교예에 따른 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 대해 처리 농도에 따른 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예와 비교예에 따른 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 대해 처리 농도에 따른 세포 활성도를 나타낸 것이다.

배양 유용 물질은 식물로부터 유래된 절편(예를 들면, 종자의 줄기 또는 자엽으로부터 얻을 수 있음)을 배양하기 위한 배지에 포함될 수 있다. 그 결과, 캘러스의 유도를 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 티로시나제 활성, 엘라스타제 억제 활성을 촉진할 수 있다.

배양 유용 물질은 쿼세틴(quercetin), 실리마린(silymarin), 리포산(lipoic acid) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 배양 유용 물질은 특별히 제한되지 않지만, 배지 중 10mg/L-100mg/L의 농도로 첨가될 수 있다.

배양 유용 물질은 캘러스를 유도하기 전 단계에서 배지에 포함된 후 캘러스를 유도할 수도 있지만, 배지에서 캘러스를 유도하는 단계 중에 포함될 수도 있다. 바람직하게는, 캘러스를 유도하기 전 단계에서 배지에 포함될 수 있다.

배양 유용 물질이 첨가되는 배지는 특별히 제한되지 않고, 통상의 고체, 또는 액체 배지를 포함할 수 있다. 예를 들면, MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지와 B5(Gamborg et al., 1968) 배지, SH(Schenk and Hildebrandt, 1972) 배지, LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지, WPM(Lloyd and McCown, 1980) 배지 등을 포함할 수 있다.

가장 널리 사용되는 배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지이며 담배의 조직배양을 위해 고안된 배지이다. MS배지의 특징은 높은 농도의 ammonium, nitrate, potassium이다. LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지의 경우는 MS 배지와 비슷하지만 일부 유기물의 조성에 차이가 난다. White 배지(White, 1963)는 낮은 농도의 염이 특징이고 토마토 뿌리를 배양하기 위해 고안되었다. B5 배지는(Gamborg et al., 1968) 대부분의 callus를 배양하기 위해 고안되었고, ammonium ion보다 nitrate ion의 함량 비율이 높은 것이 특징이다. SH 배지(Schenk and Hildebrandt, 1972) 쌍자엽과 단자엽 식물의 callus를 배양하기 위해 개발되었다. NN(Nitsch and Nitsch, 1969) 배지는 약배양을 위해 개발되었고, MS 배지보다 낮은 염농도를 지녔지만 White 배지보다는 높다.

새로운 종을 배양할 경우는 이미 보고된 유연관계가 높은 식물종의 배양결과를 참고로 하여 배지를 선택하는 것이 유리하다. 식물조직으로부터 callus만을 유도할 경우에는 특별한 배지 설정을 위해 각종의 배지를 테스트할 필요가 없다. 오히려 2～3가지의 배지에 농도 및 조합을 달리한 생장조절제의 선택이 훨씬 효과적인 경우가 많다.

생장조절제는 줄기와 뿌리의 분화 및 세포의 생장에 관여하는 필수적인 요소이다. 따라서 대부분의 식물 조직배양에 있어서 생장조절제의 종류, 농도 및 조합처리는 성공적인 배양을 위해서 가장 중요한 요건이다. 옥신 (auxin)으로서는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA(naphthalatene acetic acid), IBA (indole-butric acid) 및 IAA(indole-acetic acid) 등이 흔히 사용되고, 사이토키닌 (cytokinin)의 경우는 kinetin(6-furfuryl-amino purin), BA(banzyladenine), zeatin{6-(4-hydroxy-3-methyltrans-2-butenylamino) purine} 등을 널리 사용한다. 이외에도 세포의 분화 및 증식에 작용하는 천연추출물, 예컨대, 야자유, 과일 주스, 자작나무즙, 맥아 추출물 또는 옥수수유 등을 배지에 추가로 첨가할 수도 있다.

바람직한 캘러스 유도 및 배양방법은 다음과 같다: 먼저, 식물체의 조직 일부를 분리하여 소독한 후 탄수화물이나 아미노산과 같은 유기 성분, 질소, 인산, 칼륨과 같은 무기 양분 및 옥신과 같은 식물 호르몬을 함유한 한천 배지에서 배양한다. 얼마 후에 이 조직의 세포가 세포 분열을 하여 세포의 덩어리인 callus가 생기면, 배지로부터 callus를 분리하여 신선한 고체 배지 위에 치상한다. 이후, 일정기간 간격으로 계대배양(subculture)한다. 대량 생산을 위해 상기 배양된 callus를 agar만 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 현탁배양(suspension culture)한다.

캘러스는 꽃마리( Trigonotis peduncularis ), 적소두( Phaseolus angularis ), 또는 회화나무( Sophora japonica )로부터 유래될 수 있다. 캘러스는 꽃마리, 적소두 또는 회화나무의 종자를 발아시킨 뒤 생장점을 분리하거나 식물체의 줄기, 잎, 또는 뿌리의 절편으로부터 유도될 수 있다.

캘러스는 캘러스 유도 후 얻은 캘러스를 포함하는 배양물 상태로 화장료 조성물에 포함될 수도 있지만, 상기 배양물로부터 캘러스만을 분리한 후 화장료 조성물에 포함될 수도 있다. 바람직하게는, 화장료 조성물의 용도를 고려하여 캘러스만을 화장료 조성물에 포함시킬 수 있다.

캘러스를 포함하는 배양물로부터 캘러스를 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, filter paper를 이용한 필터를 통해 캘러스와 배양액을 분리하는 방법, 100㎛ 이하의 stainless steel망을 통과시켜 분리하는 방법, 원심분리를 통해 캘러스와 배양액을 분리하는 방법 등으로 수행할 수 있다.

상기 배양물 또는 상기 캘러스는 상기 화장료 조성물 중 0.01 내지 10중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위에서, 초과량 사용 없이 캘러스 또는 배양물의 활성을 발현할 수 있다.

상기 배양물 또는 상기 캘러스는 그 자체로 화장료 조성물에 포함될 수도 있지만, 동결 건조시키고 분말화한 후 통상적으로 사용되는 보습제에 녹인 다음 포함시킬 수도 있다. 보습제는 예를 들면, 1,3 부틸렌 글리콜(1,3 Butylene Glycol), 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol: PG), 디프로필렌 글리콜(Dipropylene Glycol:DPG), 글리세린(Glycerin: Glycerol) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 이들에 제한되는 것은 아니다.

배양유용물질이 포함된 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물은 배양유용물질이 포함되지 않은 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 비해 티로시나제 억제 활성이 현저하게 높았다. 그 결과, 본 발명의 화장료 조성물은 적은 양으로도 피부 미백 용도로 사용될 수 있다.

배양유용물질이 포함된 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물은 배양유용물질이 포함되지 않은 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 비해 엘라스타제 저해 활성이 현저하게 높았다. 그 결과, 본 발명의 화장료 조성물은 적은 양으로도 피부 주름 개선 용도로 사용될 수 있다.

배양유용물질이 포함된 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물은 배양유용물질이 포함되지 않은 배지로부터 유도된 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 비해 항산화 활성이 현저하게 높았다. 그 결과, 본 발명의 화장료 조성물은 적은 양으로도 항산화 활성이 필요한 화장 용도로 사용될 수 있다.

화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 관점인 화장료 조성물의 제조 방법은

배양 유용 물질을 함유하는 배지에서 꽃마리, 적소두 또는 회화나무 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및

상기 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

꽃마리, 적소두, 회화나무 종자를 발아시켜 캘러스를 유도하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용가능하다.

본 발명에 있어서, 꽃마리, 적소두, 회화나무 종자로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지로써, 종래에 캘러스 유도 배지로 가능한 것은 모두 적용할 수 있으며, 일 예시로써, MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa, Cat No. M0222)에 IAA 2mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L 첨가된 배지를 이용할 수 있다. 이외에도, 식물의 기초배지는 모두 다 적용가능 할 것이다.

캘러스는 꽃마리, 적소두 또는 회화나무 종자를 발아한 후 줄기, 잎, 또는 뿌리의 절편으로부터 유도될 수 있다.

배양 유용 물질에 대한 상세 내용은 상술한 바와 같다.

배양 조건은 특별히 제한되지 않지만, 온도 25±1℃, 암조건으로 4~8주간 수행될 수 있다.

캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 얻은 후, 이로부터 화장료 조성물은 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 : 배양 유용 물질이 함유된 배지에서 유도된 꽃마리 , 적소두 또는 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물 제조

꽃마리(Trigonotis peduncularis), 적소두(Phaseolus angularis), 회화나무(Sophora japonica) 종자를 각각 70% 에탄올에 1분 동안 침지한 후 멸균수로 세척하였다. 1% 차아염소산나트륨으로 20분간 소독한 후 멸균수로 3회 세척하였다. filter paper에서 건조하였다. agar 8g/L, sucrose 30g/L가 첨가된 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)와 WPM(Lloyd and McCown, 1980)배지에 종자를 각각 파종하였다.

배양기의 온도를 25℃로 유지하고 암실 배양하여 종자로부터 발아를 유도한다. 발아된 종자의 자엽 및 줄기를 절단하여, IAA 2mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L 및 쿼세틴 100mg/L가 첨가된 MS 배지(pH 5.8)와 WPM 배지(pH 5.8)에 치상하였다. 25℃에서 4주 경과한 후, 배지에 치상된 자엽 및 줄기의 절편에서 캘러스가 유도되었다. 다시 4주 경과 후, 꽃마리, 적소두, 회화나무 각각으로부터 유도된 캘러스 또는 그 배양물을 채취하였다.

채취한 캘러스 또는 그 배양물은 동결 건조시킨 후 1,3 부틸렌 글리콜에 녹여 하기 실험예에서 사용하였다.

비교예 : 배양 유용 물질이 함유되지 않은 배지에서 유도된 꽃마리 , 적소두 또는 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물 제조

상기 실시예에서, 발아된 종자의 자엽 및 줄기 절편을 IAA 2mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L가 첨가된 MS 배지(pH 5.8)와 WPM 배지(pH 5.8)에서 치상하고 캘러스를 유도한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 캘러스 또는 그 배양물을 채취하였다. 채취한 캘러스 또는 그 배양물은 동결 건조시킨 후 1,3 부틸렌 글리콜에 녹여 하기 실험예에서 사용하였다.

실험예 1: 티로시나아제 억제 활성 측정

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물의 피부 미백 효과를 알아보기 위하여 티로시나아제 활성 저해 실험을 하였다. 티로시나아제 활성 저해 기질로는 인산나트륨 완충액 (pH6.4)에 용해한 L-DOPA 10mM 을 사용하였다.

캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 0.1M 인산나트륨 완충용액을 이용하여 희석하여, 하기 표 1에 기재된 농도(단위:%)로 제조하였다. 상기 농도별 시료액 240㎕에 L-DOPA 40㎕을 각각 첨가하고 티로시나아제 (500U/ml) 20㎕을 첨가한 후 37℃에서 10분동안 반응시킨 다음 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 동일 농도의 아스코르브산을 사용하였다. 아스코르브산은 티로시나제 억제 활성이 있다고 알려져 있다. 티로시나제 활성 억제율을 하기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 1과 도 1에 나타내었다.

<수학식 1>

티로시나아제 활성 억제율 (%) = 100-[(b-b')/a] X100

(상기 식에서 a는 티로시나아제만 넣은 것의 흡광도, b는 티로시나아제와 캘러스 또는 그 배양물을 함께 넣은 것의 흡광도, b' : 캘러스 또는 그 배양물을 넣고 티로시나아제는 넣지 않는 것의 흡광도이다).

종류	농도에 따른 티로시나아제 억제율(%)
종류	0	3.125	6.25	12.5	25	50	100
비교예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	84.5	85.7	88.3	89.2	90.8	92.1
비교예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	87.3	89.1	90.6	91.7	93.1	94.2
비교예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	81.2	83.4	85.8	87.1	89.5	90.4
실시예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	94.2	94.8	96.9	97.2	97.8	98.3
실시예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	95.2	96.7	98.2	98.6	98.9	99.1
실시예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	87.6	90.4	93.7	95.1	95.8	97.3
양성 대조군	0	0	16.6	35.3	56	62.3	66.7

상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 배양 유용 물질을 적용하여 꽃마리, 적소두, 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물의 티로시나아제 억제능은 배양 유용 물질을 적용하지 않고 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물보다 향상된 티로시나아제 억제 활성을 나타내었다. 또한, 저농도에서도 티로시나아제 활성 억제에 탁월한 효과를 나타내었으며, 양성대조군인 아스코르브산과 비교했을 대에도 훨씬 높은 저해능을 보였다.

실험예 2 : 자유라디컬 소거능 측정

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물의 항산화 효능 여부를 확인하기 위해 자유 라디컬 소거능을 측정하였다.

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 0.1M 인산나트륨 완충용액을 이용하여 희석하여, 하기 표 2에 기재된 농도(단위:%)로 제조하였다. 상기 농도별 시료액 240㎕에 100μM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합하고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96웰 플레이트에 담아 남아 있는 DPPH 양을 520 nm에서 흡광도로 측정하였다. 그리고 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 동일한 방법으로 흡광도(음성 대조군의 흡광도)를 측정하였다. 하기 수학식 2에 의해 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 계산하였다. 양성 대조군으로 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C)을 사용하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.

<수학식 2>

자유라디컬소거능(%)=100-(시료처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)]

종류	농도에 따른 항산화 효능(%)
종류	0	6.25	12.5	25	50	100
비교예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	6.3	24.4	37.9	42.1	48.4
비교예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	3.4	16.8	19.5	34.6	38.8
비교예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	4.8	15.4	20.1	31.7	37.2
실시예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	8.9	33.2	49.2	54.6	58.1
실시예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	18.4	25.3	36.1	48.3	52.4
실시예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	0	15.3	19.8	31.4	45.2	50.4
양성 대조군	0	16.6	35.3	56	62.3	66.7

상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 배양 유용 물질을 적용하여 꽃마리, 적소두, 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물은 배양 유용 물질을 적용하지 않고 꽃마리, 적소두, 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물에 비해 자유 라디칼 소거능이 우수하여 항산화 효능이 뛰어났고, 특히 저 농도에서도 상대적인 항산화 활성이 매우 우수한 것으로 나타났다.

실험예 3 : 엘라스타아제 활성 저해 측정

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물의 주름 개선 효과를 확인하기 위해 엘라스타제 저해 활성 시험(elastase inhibition assay)을 실시하였다.

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 0.1M 인산나트륨 완충용액을 이용하여 희석하여, 하기 표 3에 기재된 농도(단위:%)로 제조하였다. 기질 0.5mM N-석시닐-알라닌-알라닌-알라닌-p-니트로아닐라이드(N-succinyl -(Ala)₃-p-nitroanilide) 200㎕에 상기 제조한 시료 20㎕를 첨가하였다. 효소 0.4U 엘라스타제를 10㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응한 후 분광분석기로 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 올레아놀릭산(oleanolic acid)를 사용하였다. 엘라스타제 저해 활성 정도는 수학식 3을 이용하여 계산하였으며, 그 결과를 표 3, 도 3에 나타내었다.

<수학식 3>

엘라스타제 저해 활성(%)=100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)

종류	농도에 따른 엘라스타 저해 활성(%)
종류	0.001	0.01	0.1	1
비교예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	30.6	45.2	32.9	19.1
비교예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	32.1	35.6	31.2	29.1
비교예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	11	15.6	18.8	13.9
실시예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	35.6	55.4	42.3	34.1
실시예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	40.2	44.7	41.2	34.5
실시예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	19.3	21.7	28.3	25.4
양성 대조군	7.7	15.9	22.7	26.1

상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양 유용 물질을 적용하여 꽃마리, 적소두, 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물의 티로시나아제 억제능은 배양 유용 물질을 적용하지 않고 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물보다 향상된 엘라스타제 활성 억제능을 나타내었다. 또한, 저농도에서도 양성대조군인 올레아놀릭산보다 월등한 엘라스타제 저해 활성을 보여주었다.

실험예 4 : 세포 독성 측정

상기 실시예와 비교예에서 얻은 꽃마리 캘러스, 적소두 캘러스, 회화나무 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 대상으로 세포 독성 여부를 조사하였다.

WST(water soluble tetrazolium salt)는 수용성의 tetrazolium salt로서 살아있는 세포와 반응하여 오렌지색 수용성의 formazan을 생성한다. 따라서 이 양을 측정함으로써 시험물질에 대한 세포독성을 측정하는 방법이다.

본 발명의 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물이 피부 자극이 없음을 확인하기 위해 인간각질형성세포(HaCat)에 대한 독성 경도를 측정하였다. 인간 각질형성세포(ATCC,USA)를 96웰 플레이트에 5 X 10³ cells/well씩 동일하게 헤마싸이토미터(hemacytometer)를 이용하여 계수한 후 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 배양액을 제거하고 본 발명의 제조예의 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 0-2(w/v)% 각 웰에 100-200 ㎕씩 넣고 DMEM 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 배양하였다. 그 후 각 웰 당 WST를 10㎕씩 첨가하고 동일조건에서 4시간 추가로 배양하였다. 그 후 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) leader로 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 경도(cell viability)는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다. 양성대조군으로는 DMEM(10% FBS)을, 음성대조군으로는 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 이용하였다. 세포 활성도를 하기 식 4에 따라 계산하고, 양성 대조군의 세포 활성도에 대한 값을 100으로 보았을 때의 값을 표 4와 도 4에 나타내었다.

<수학식 4>

세포 활성도(%) = (시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도) X 100

종류	농도에 따른 세포 활성도(%)
종류	0.125	0.25	0.5	1	2
비교예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	98.7	94.3	92.1	89.6	86.3
비교예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	94.2	92.6	91.2	86.1	85.3
비교예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	99.3	97.2	94.8	90.2	86.7
실시예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	103.4	97.6	94.3	91	89.7
실시예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	98.2	96.4	94.1	91.8	90.1
실시예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	104.6	102.8	100	97.6	95.4
음성 대조군	16.5

상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 배양 유용 물질을 적용하여 꽃마리, 적소두, 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물은 상기 처리농도에서 음성대조군에 비해 세포 독성이 현저히 낮았다.

제제예 1: 화장수의 제조

하기 표 5에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법으로 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예의 꽃마리로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	2.0
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	잔량
계	100.0

제제예 2: 영양로션의 제조

하기 표 6에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법을 사용하여 영양로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예의 적소두로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	3.0
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐(1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	잔량
계	100.0

제제예 3: 영양로션의 제조

하기 표 7에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법을 사용하여 영양로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예의 회화나무로부터 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물	3.0
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐(1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	잔량
계	100.0

Claims

배양 유용 물질을 포함하는 배지에서 배양된 캘러스를 포함하는 배양물 또는 상기 배양물로부터 얻은 캘러스를 유효성분으로 포함하고,
상기 배양 유용 물질은 쿼세틴이고,
상기 캘러스는 꽃마리(Trigonotis peduncularis), 적소두(Phaseolus angularis), 또는 회화나무(Sophora japonica)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용 또는 피부 주름 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양물 또는 상기 캘러스는 상기 화장료 조성물 중 0.01 내지 10중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
배양 유용 물질을 함유하는 배지에서 식물 종자로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및
상기 얻은 캘러스 또는 캘러스를 포함하는 배양물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 배양 유용 물질은 쿼세틴이고,
상기 식물은 꽃마리(Trigonotis peduncularis), 적소두(Phaseolus angularis), 또는 회화나무(Sophora japonica)인 화장료 조성물의 제조 방법.