KR102311074B1

KR102311074B1 - 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102311074B1
Application number: KR1020200032660A
Authority: KR
Inventors: 서정훈; 신동규; 차정단; 고은실; 정종훈; 조상민; 강제란; 이솔
Original assignee: 제너럴바이오(주)
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2021-10-08
Also published as: KR20210116032A

Abstract

본 발명은 쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
이에 따라, 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다. 또한, 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다. 또한, 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

Description

쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물 {COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLES CONTAINING CULTURE MEDIUM OF CALLUS FROM Aster yomena AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쑥부쟁이로부터 캘러스를 유도하고 분리한 다음, 그 캘러스를 배양하는데 사용한 배양액을 유효성분으로 함유하여 노화나 산화적 스트레스로 인하여 발생할 수 있는 피부의 주름을 개선할 수 있는 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부는 물리적, 화학적인 외부의 자극으로부터 1차적으로 체내를 보호하는 기능을 갖는다. 사람의 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 피부의 가장 기본적인 역할은 우리 몸으로부터 수분이 증발되는 것을 막아주며 외부로부터 유해성분이 침입하는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부는 항상 외부 자극으로부터 노출되어 있기 때문에 다양한 방어 능력을 가지고 있다. 또한, 피부는 아름다움을 나타내는 표정으로써 피부가 건강하고 깨끗함은 곧 사람의 아름다움과 연관되어 있다고 할 수 있다. 최근 들어, 여성 뿐 아니라 남성들도 피부 노화 등 여러 가지 피부 트러블들에 대한 관심이 많아지면서 이와 관련된 제품들이 많이 개발되고 있다.

피부에 존재하는 멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 자외선 등 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 환경에 대한 세포의 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질로 알려져 있다. 반면, 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨, 검버섯 등을 생성하고 피부노화를 촉진시키고 피부암 유발과도 관련이 있다고 보고되고 있다.

미용에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 미용의 중심에 있는 피부를 관리하기 위한 다양한 방법이 생겼는데, 특히 우리나라는 하얗고 깨끗한 피부에 대한 선호도가 높은 탓에 미백, 노화방지, 주름개선, 자외선 차단 등 다양한 기능성을 갖는 기능성 화장품에 대한 수요가 증가했다. 이러한 수요에 맞춰 여러 종류의 화장품들이 우후죽순으로 출시되었고, 높은 수준의 판매량을 기록하였다.

주름은 나이를 나타내는 하나의 현상으로서, 주름이 생기는 대표적인 원인은 피부의 진피에서 매트릭스를 형성하는 콜라겐의 분해에 기인한다. 피부의 콜라겐은 노화가 진행됨에 따라 생성이 저하되기도 하나, 자외선 등의 외부 자극에 의해 콜라겐 분해 효소(Matrix Metallo Proteinase, MMP-1)의 활성도가 높아지면서 콜라겐이 쉽게 분해되어 주름의 생산이 증가되는 임상 보고들도 많다. 따라서, 최근에는 MMP-1의 생성의 저해 및 활성을 억제하여 근본적으로 생성되는 콜라겐의 분해를 억제하는 제품들도 많이 개발되고 있다.

MMP는 다형핵성호중구(POlymorphonuclear neutrophil), 대식세포(Macrophage), 섬유아세포(Fibroblast)등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포의 기질을 이용한다. 주로 피부에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-9 이외에 여러 가지 효소들이 작용을 하는데 콜라겐 분해와 관련되어 가장 근본적으로 작용하는 효소는 MMP-1이다. 일반적으로 콜라겐 합성을 촉진하는 종래의 물질로는 레티노이드(RE36068), TGF-β(transforming growth factor), 베툴린산(JP8-208424) 등이 있으며, MMP-1의 생성을 억제하는 물질로는 TGF-β(transforming growth factor)가 대표적으로 알려져 있으며, 그 외에도 다양한 천연물들이 MMP-1 생합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 주름 생성을 억제하는 방법은 콜라겐 합성을 촉진하거나, 또는 콜라겐 분해효소의 생성 및 활성을 억제하는 방법을 사용할 수 있으며, 보다 효과적이고 용이하며 안전한 주름개선을 위한 화장료의 개발이 절실이 요구되고 있다.

한편, 화장품 시장이 커짐에 따라, 경쟁이 과도해지고 가격경쟁력을 높이는 과정에서 화장품에 포함되는 물질이 유전자 변형 물질이거나, 환경호르몬을 포함하는 경우가 있어 오히려 피부나 건강상에 문제가 종종 발생했다. 이에 따라 장기적으로 인체에 유해하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 천연물질 추출물을 주성분으로 하는 기능성 화장품에 대한 기대가 높아지고 있다(특허문헌 1 참조).

다만 천연물로부터 직접 추출하여 이용되는 식물유래 유용성분들은 인체에 사용 시 안정성이 보장된다는 점에서 높은 이점이 있지만, 추출물의 수득율이 낮고, 계절, 장소, 기후 등 재배조건과 부위별 등의 다양한 환경적 요인에 따라 생산성과 효능의 차이가 날 수 있어 안정적인 원료 공급이 어렵다는 단점이 있다.

KR 10-1997-0005272 A1 (1997. 02. 19.)

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 인체에 대한 안전성이 높은 식물로부터 추출된 물질을 이용하여 피부의 주름을 개선시킬 수 있으면서, 동시에 그 조성물의 일정한 공급과 품질을 함께 유지할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 쑥부쟁이의 세포조직으로부터 유래된 캘러스의 배양액을 이용하여 피부의 주름을 개선할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 쑥부쟁이 유래 캘러스를 이용함에 따라 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

도 1은 쑥부쟁이 캘러스 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과를 나타내는 그래프
도 2는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-3의 mRNA 발현 결과를 나타내는 그래프
도 3은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-9의 mRNA 발현 결과를 나타내는 그래프
도 4는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-13의 mRNA 발현 결과를 나타내는 그래프
도 5는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 HAS-2의 mRNA 발현 결과를 나타내는 그래프
도 6은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 KERATIN 1의 mRNA 발현 결과를 나타내는 그래프
도 7은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포증식율 결과를 나타내는 그래프
도 8은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 tBHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포증식율 결과를 나타내는 그래프
도 9는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포증식율 결과를 나타내는 그래프
도 10은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 SOD 활성 결과를 나타내는 그래프
도 11은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-1 활성 결과를 나타내는 그래프
도 12는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Elastase억제활성 결과를 나타내는 그래프
도 13은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Collagenase억제활성 결과를 나타내는 그래프
도 14는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 t-BHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 TNF-α 활성 결과를 나타내는 그래프
도 15는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 TNF-α 활성 결과를 나타내는 그래프
도 16은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 t-BHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 IL-8 활성 결과를 나타내는 그래프
도 17은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 IL-8 활성 결과를 나타내는 그래프
도 18은 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 t-BHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 IL-8 활성 결과를 나타내는 그래프
도 19는 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 IL-8 활성 결과를 나타내는 그래프

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

실시예 1. 쑥부쟁이 식물체 절편 조직배양을 통한 캘러스 취득

쑥부쟁이의 뿌리, 자엽, 하배축 등 조직별 절편 시료를 배양하였다. 배양 개시 약 2주 후부터 절단면에서 팽창이 이루어지면서 황색의 캘러스가 형성되기 시작하였고, 배양 개시 약 4주 후에는 황색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 그 크기가 약 1 mm 정도에 이르렀다.

한편, 식물생장조절제가 쑥부쟁이의 조직별 절편 시료의 조직배양 체계 확립에 미치는 영향을 알아보기 위해 시료를 약 4주간 배양하였다. 배양한 쑥부쟁이 절편 시료로부터 캘러스 형성 효율을 조사한 결과, MS 기본배지에 1 mg/L 2,4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)를 첨가한 처리구에서 쑥부쟁이의 뿌리 절편으로부터 유래된 캘러스의 형성 효율이 가장 높았다. 배양한지 약 6주 후에는 동일 조성의 새로운 배지들로 계대 보존하였고, 4주 주기로 계대 보존을 반복하면서 쑥부쟁이 유래 캘러스의 인공세포주를 확보하였다.

확보한 쑥부쟁이 유래 캘러스를 이용하여 추출물을 제조하는데, 본 실시예에서는 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 배양한 쑥부쟁이 유래 캘러스 건조 분말과 물을 1:1 내지 1:10 비율로 80℃의 온도로 3시간 동안 환류 추출을 하여 열수추출물을 제조하였다.

또한, 배양한 쑥부쟁이 유래 캘러스 건조 분말과 30% 주정을 1:1 내지 1:10의 비율로 침지한 다음, 실온에서 24시간동안 추출하여 농축한다. 그리고 용매를 제거함으로써 주정추출물을 제조하였다.

실시예 2. 쑥부쟁이 유래 캘러스 현탁배양

1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지 20 ㎖를 250 ㎖ 크기의 삼각플라스크(erlenmeyer flask)에 넣고, 실시예 1에서 증식된 약 1 g의 쑥부쟁이 유래 캘러스를 배지에 옮겼다.

현탁배양은 gyratory shaker(100 rpm)에서 25 ℃ 온도로 암배양을 실시하였다. 약 2주간 배양한 다음 새로운 액체배지 20 ㎖를 추가하였다. 그로부터 약 4주간 더 배양한 다음, 쑥부쟁이 유래 캘러스의 현탁배양세포와 배양배지 5 ㎖을 20 ㎖의 새로운 액체배지가 있는 다른 삼각플라스크에 옮겨 계대배양을 실시하였다. 새로운 액체배지는 1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지다. 그리고 계대배양은 약 4주 간격으로 실시하였다.

이와 같은 현탁배양은 기내 대량생산을 위한 초기 단계로서 현탁배양 체계를 확립하기 위한 작업이다.

실험예 1. 폴리페놀 측정

실시예 1에 따라 제조되는 쑥부쟁이 캘러스 열수추출물 및 주정추출물에 대하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 열수 추출물 보다 30% 주정 추출물에서 22 mg (gallic acid/g) 높은 함량이 측정된 것을 알 수 있다.

실험예 2. 세포외기질 금속함유 단백분해효소(Matrix metalloproteinase, 이하 ‘MMPs’라 한다) mRNA 발현 평가

HaCaT cell(피부각질세포)을 대상으로 UVP+로 유도한 다음, 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 처리하였다. 그리고 Real-time PCR을 이용하여 MMPs의 mRNA 발현을 확인하였다. 구체적으로 MMPs-3, MMPs-9, MMPs-13의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 MMPs-3의 경우 캘러스 배양액의 농도가 증가함에 따라 발현수준이 감소하는 것을 알 수 있으며, 도 3 및 도 4에 도시된 ㅂ바와 같이 Ps-9 및 MMPs-13의 경우 3.9㎕/㎖인 경우 감소하는 것을 알 수 있다.

실험예 3. 히알루론산 합성효소(HAS-2) 및 KERATIN 1(각질형성을 증가시켜 노화를 유발시킨는 유전자 mRNA 발현 평가

HaCaT cell을 대상으로 UVP+로 유도한 다음, 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 처리하였다. 그리고 Real-time PCR을 이용하여 HAS-2 및 KERATIN 1의 mRNA 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 HAS-2는 1.9㎕/㎖ 농도에서 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 그리고 도 6에 도시된 바와 같이 KERATIN 1은 3.9㎕/㎖ 농도에서 발현량이 감소하는 것을 알 수 있다.

실험예 4. 세포증식(cell proliferation) 평가

아무것도 처리되지 않은 HaCat 세포, tBHP(tert-Butyl hydroperoxide)가 처리된 HaCat 세포에 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, 세포의 증식 수준을 평가하였다.

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 쑥부쟁이 캘러스 배양액의 농도가 3.13 ㎕/㎖까지는 유사한 수준으로 보이나, 그 이후인 6.25 ㎕/㎖부터는 점차적으로 세포증식이 증가되는 것을 알 수 있다.

또한, 도 8에 도시된 바와 같이 t-BHP가 처리된 경우 세포증식이 감소되었으나, 쑥부쟁이 캘러스 배양액 0.09 ㎕/㎖ 농도를 처리한 수준으로도 세포증식이 회복되는 것을 알 수 있다.

실험예 5. 세포생존율(cell viability) 평가

UVB가 처리된 HaCat 세포에 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, 세포의 생존율을 평가하였다.

그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이 UVB가 처리되는 경우 세포생존율이 40% 수준으로 감소하는 것을 알 수 있고, 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 처리할 경우 세포생존율이 소폭 회복되는 것을 알 수 있으며, 특히 6.25㎕/㎖ 농도에서 약 80% 수준에 가깝게 회복되는 것을 알 수 있다.

실험예 6. 피부노화관련 단백질 발현 평가

UVB가 처리된 HaCat 세포에 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, SOD, MMP-1, Elastase, collagenase의 발현 억제여부를 평가하였다.

그 결과, SOD의 경우 도 10에 도시된 바와 같이 활성 억제가 감소하는 것을 확인하였고, 이는 곧 SOD의 활서이 증가됨을 의미한다. 그리고 MMP-1의 경우 도 11에 도시된 바와 같이 활성이 농도-의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.

Elastase 및 collagenase의 경우 도 12 및 도 13에 각각 도시된 바와 같이 효소활성의 억제율이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 배양액이 64㎕/㎖의 농도인 경우 약 50% 증가된 수준의 억제율을 보이는 것을 확인하였다.

실험예 7. 염증관련 단백질 발현 평가

tBHP(tert-Butyl hydroperoxide)가 처리된 HaCat 세포 및 UVB가 처리된 HaCat 세포 각각에 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, TNF-α, IL-8, IL-1β의 활성을 평가하였다.

그 결과, TNF-α의 경우 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같이 쑥부쟁이 캘러스 배양액 농도가 증가할수록 TNF-α의 활성이 억제되는 것을 알 수 있다.

또한, IL-8의 경우 도 16 및 도 17에 도시된 바와 같이 쑥부쟁이 캘러스 배양액 농도가 증가할수록 IL-8의 활성이 억제되는 것을 알 수 있다.

또한, IL-1β의 경우 도 18 및 도 19에 도시된 바와 같이 쑥부쟁이 캘러스 배양액 농도가 증가할수록 IL-1β의 활성이 억제되는 것을 알 수 있다.

Claims

쑥부쟁이(Aster yomena) 뿌리 조직의 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법으로서,
쑥부쟁이 뿌리 조직을 배지에서 배양하는 단계;
상기 배양된 쑥부쟁이 뿌리 조직에서 형성되는 캘러스를 분리하는 단계;
상기 분리된 캘러스를 새로운 배지에 옮긴 뒤 배양하는 단계; 및
상기 캘러스를 배양한 뒤 새로운 배지에 계대배양하는 작업을 반복하는 단계;를 포함하고,
상기 배지들은 MS액체배지에 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid가 첨가된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
삭제