KR102510555B1 - 방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq./Phellopterus littoralis (A. Gray)Benth) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
이에 따라, 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다. 또한, 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다. 또한, 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

Description

방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLES CONTAINING CULTURE MEDIUM OF CALLUS FROM Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq./Phellopterus littoralis (A. Gray)Benth) AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq./Phellopterus littoralis (A. Gray)Benth)으로부터 캘러스를 유도하고 분리한 다음, 그 캘러스를 배양하는데 사용한 배양액을 유효성분으로 함유하여 노화나 산화적 스트레스로 인하여 발생할 수 있는 피부의 주름을 개선할 수 있는 방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부는 물리적, 화학적인 외부의 자극으로부터 1차적으로 체내를 보호하는 기능을 갖는다. 사람의 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 피부의 가장 기본적인 역할은 우리 몸으로부터 수분이 증발되는 것을 막아주며 외부로부터 유해성분이 침입하는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부는 항상 외부 자극으로부터 노출되어 있기 때문에 다양한 방어 능력을 가지고 있다. 또한, 피부는 아름다움을 나타내는 표정으로써 피부가 건강하고 깨끗함은 곧 사람의 아름다움과 연관되어 있다고 할 수 있다. 최근 들어, 여성 뿐 아니라 남성들도 피부 노화 등 여러 가지 피부 트러블들에 대한 관심이 많아지면서 이와 관련된 제품들이 많이 개발되고 있다.

피부에 존재하는 멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 자외선 등 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 환경에 대한 세포의 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질로 알려져 있다. 반면, 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨, 검버섯 등을 생성하고 피부노화를 촉진시키고 피부암 유발과도 관련이 있다고 보고되고 있다.

미용에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 미용의 중심에 있는 피부를 관리하기 위한 다양한 방법이 생겼는데, 특히 우리나라는 하얗고 깨끗한 피부에 대한 선호도가 높은 탓에 미백, 노화방지, 주름개선, 자외선 차단 등 다양한 기능성을 갖는 기능성 화장품에 대한 수요가 증가했다. 이러한 수요에 맞춰 여러 종류의 화장품들이 우후죽순으로 출시되었고, 높은 수준의 판매량을 기록하였다.

주름은 나이를 나타내는 하나의 현상으로서, 주름이 생기는 대표적인 원인은 피부의 진피에서 매트릭스를 형성하는 콜라겐의 분해에 기인한다. 피부의 콜라겐은 노화가 진행됨에 따라 생성이 저하되기도 하나, 자외선 등의 외부 자극에 의해 콜라겐 분해 효소(Matrix Metallo Proteinase, MMP-1)의 활성도가 높아지면서 콜라겐이 쉽게 분해되어 주름의 생산이 증가되는 임상 보고들도 많다. 따라서, 최근에는 MMP-1의 생성의 저해 및 활성을 억제하여 근본적으로 생성되는 콜라겐의 분해를 억제하는 제품들도 많이 개발되고 있다.

MMP는 다형핵성호중구(Polymorphonuclear neutrophil), 대식세포(Macrophage), 섬유아세포(Fibroblast)등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포의 기질을 이용한다. 주로 피부에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-9 이외에 여러 가지 효소들이 작용을 하는데 콜라겐 분해와 관련되어 가장 근본적으로 작용하는 효소는 MMP-1이다. 일반적으로 콜라겐 합성을 촉진하는 종래의 물질로는 레티노이드(RE36068), TGF-β(transforming growth factor), 베툴린산(JP8-208424) 등이 있으며, MMP-1의 생성을 억제하는 물질로는 TGF-β(transforming growth factor)가 대표적으로 알려져 있으며, 그 외에도 다양한 천연물들이 MMP-1 생합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 주름 생성을 억제하는 방법은 콜라겐 합성을 촉진하거나, 또는 콜라겐 분해효소의 생성 및 활성을 억제하는 방법을 사용할 수 있으며, 보다 효과적이고 용이하며 안전한 주름개선을 위한 화장료의 개발이 절실이 요구되고 있다.

한편, 화장품 시장이 커짐에 따라, 경쟁이 과도해지고 가격경쟁력을 높이는 과정에서 화장품에 포함되는 물질이 유전자 변형 물질이거나, 환경호르몬을 포함하는 경우가 있어 오히려 피부나 건강상에 문제가 종종 발생했다. 이에 따라 장기적으로 인체에 유해하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 천연물질 추출물을 주성분으로 하는 기능성 화장품에 대한 기대가 높아지고 있다(특허문헌 1 참조).

다만 천연물로부터 직접 추출하여 이용되는 식물유래 유용성분들은 인체에 사용 시 안정성이 보장된다는 점에서 높은 이점이 있지만, 추출물의 수득율이 낮고, 계절, 장소, 기후 등 재배조건과 부위별 등의 다양한 환경적 요인에 따라 생산성과 효능의 차이가 날 수 있어 안정적인 원료 공급이 어렵다는 단점이 있다.

KR 10-1997-0005272 A1 (1997. 02. 19.)

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 인체에 대한 안전성이 높은 식물을 이용하여 피부의 주름을 개선시킬 수 있으면서, 동시에 그 조성물의 일정한 공급과 품질을 함께 유지할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 방풍의 세포조직으로부터 유래된 캘러스의 배양액을 이용하여 피부의 주름을 개선할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스의 배양액은 방풍 유래 캘러스를 이용함에 따라 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 Elastase 저해 활성 평가 결과를 나타내는 그래프
도 2는 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 Collagenase 저해 활성 평가 결과를 나타내는 그래프
도 3은 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 MMP-1의 생성 저해 활성 평가 결과를 나타내는 그래프
도 4는 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 MMP-3 mRNA의 발현 평가 결과를 나타내는 그래프
도 5는 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 MMP-9 mRNA의 발현 평가 결과를 나타내는 그래프
도 6은 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 Filaggrin mRNA의 발현 평가 결과를 나타내는 그래프
도 7은 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 AQP-3 mRNA의 발현 평가 결과를 나타내는 그래프
도 8은 본 발명에 따른 방풍 유래 캘러스 배양액의 HAS-2 mRNA의 발현 평가 결과를 나타내는 그래프

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

방풍은 신농본초경 및 본초강목 등 본초서에 실려 있는 방풍의 경우 중국에 자생 또는 재배하는 Saposhnikovia divaricate(=Ledebouriella divaricata)로 그 뿌리를 사용하며 관방풍, 원방풍 이라한다.

중국에서 방풍 뿐만 아니라 같은 과 식물인 천방풍(Ligusticum brachylobum) 및 운방풍(Seseli yunnanensis)등을 방풍으로 대용하기도 한다. 우리나라에서는 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunberg), 기름나물(Peucedanum terebinthaceum (Fisch.) Fisch. ex Turcz.), 갯방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt et Miquel)의 뿌리를 대용한다.

대한약전에서는 미나리과의 갯방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt et Miquel) 의 뿌리 및 뿌리줄기를 ‘海防風’으로, 대한약전외한약 (생약)규격집에는 갯기름나물(Peucedanum japonicum Thunberg)의 뿌리를 ‘植防風’이라 따로 기록한다.

실시예 1. 방풍 유래 캘러스 유도

1-1. 식물의 준비

캘러스 유도 배양을 위해 방풍 잎 및 줄기를 세척한 후 5 mM 살리실산 (Salicylic acid) 용액에 2분간 표면 소독한 후 70% 에탄올에 10초, 1% 락스에서 10초간 침지하면서 잎과 줄기의 표면을 살균하고, 멸균수로 15분씩 3회 세척한 다음 2시간 동안 무균 상에서 실온 건조하였다. 건조 후 위의 과정을 한 번 더 반복하여 표면 살균된 잎과 줄기를 약 1 cm × 1 cm 크기로 잘라서 캘러스 유도에 사용하였다.

1-2. 방풍 유래 캘러스 유도

방풍의 잎자루, 자엽, 하배축 등 조직별 절편 시료를 배양하였다.

배양 배지로는 M&S(Murashige & Skoog)배지와 M&S Modified 배지, 2,4-D (2.4-dichlorophenoxy acetic acid) 캘러스 배지를 캘러스 유도에 사용하였다. 각 각의 배지 조성액에 agar 8 g/L, sucrose 10.09 g/L, MOPS 0.5 g/L를 첨가하여 pH 5.7로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 무균 상에서 페트리접시에 분주하여 사용하였다.

살균과정을 거친 각 부분의 바깥조직들을 세로방향으로 잡아당기면 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 목부, 전형성층(잔가지) 또는 형성층(줄기), 사부, 피층, 표피로 구성되는데, 벗겨진 조직들의 가장 안쪽조직 즉, 목부가 배지면에 닿도록 배양하였다.

살균된 잎과 줄기의 절단면이 각 각의 배지에 접촉하도록 한 후 실온에서 약 4주간 배양 하였다.

그 결과 배양 개시 약 2주 후부터 절단면에서 팽창이 이루어지면서 투명한 캘러스가 형성되기 시작하였고, 배양 개시 약 4주 후에는 투명한 캘러스 증식과 함께 클럼프(clump)의 크기 신장이 이루어지면서 그 크기가 약 1 mm 정도에 이르렀다.

한편, 식물생장조절제가 방풍의 조직별 절편체의 조직배양 체계 확립에 미치는 영향을 알아보기 위해 배양한 방풍 절편체로부터 캘러스 형성 효율을 조사한 결과, MS 기본배지에 1 mg/L 2,4-D를 첨가한 배지에서 방풍의 잎자루 절편체로부터 유래된 캘러스의 형성 효율이 가장 높았다.

배양한지 약 4주 후에는 동일 조성의 새로운 배지들로 계대 보존하였고, 2주 주기로 계대 보존을 반복하면서 방풍 유래 캘러스의 인공세포주를 확보하였다.

1-3. 액체현탁배양

고체 증식배지와 동일한 조성으로 활성탄과 고형제를 제외한 배지를 사용하였다. 세포와 배지의 비율을 1:10으로 하였으며, 25℃±1로 조절된 암실에서 분당 회전수를 100~130rpm으로 조절한 회전 교반기를 이용하여 배양하였다. 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 계대배양 주기는 2주일로 고정하였다.

구체적으로, 1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지 100 ㎖를 250 ㎖ 크기의 삼각플라스크(erlenmeyer flask)에 넣고, 1-2에서 증식된 약 10 g의 방풍 유래 캘러스를 배지에 옮겼다.

현탁배양은 gyratory shaker(100 rpm)에서 25 ℃ 온도로 암배양을 실시하였다. 약 2주간 배양한 다음 새로운 액체배지 400 ㎖를 1ℓ크기의 삼각플라스크에 넣고, 방풍 유래 캘러스의 현탁배양세포와 배양배지 100 ㎖를 옮겨 계대 배양을 실시하였다.

이와 같은 현탁배양은 기내 대량생산을 위한 초기 단계로서 현탁배양 체계를 확립하기 위한 작업이다.

실험예 1. 엘라스틴 분해효소 저해 활성 평가

MMPs를 이루는 주요성분 중 하나인 엘라스테이즈(elastase)는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 경 단백질인 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소이며, 콜라겐과 엘라스틴 같은 결합조직을 지지하고 구성하는 모든 단백질들을 가수분해하기 때문에 엘라스테이즈를 저해하는 활성을 나타내면 피부주름을 개선할 수 있다.

방풍캘러스배양액을 UV처리한 후 농도별로 처리했을 때 엘라스테이즈 억제효과가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 2. 콜라겐 분해효소 저해 활성 평가

콜라겐의 감소는 주름생성원인과 밀접한 관계를 가지고 있기 때문에 콜라겐 분해효소의 기능을 억제시켜 콜라겐 감소를 억제함으로써 노화를 지연시킬 수 있다.

방풍캘러스배양액을 UV처리한 후 농도별로 처리했을 때 콜라게네이즈(collagenase) 억제효과가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 3. 세포외기질 금속함유 단백분해효소(Matrix metalloproteinase, 이하 ‘MMPs’라 한다) 1의 생성 저해 활성 평가

피부에 주름이 생기게 되는 원인 중 하나로 콜라겐(collagen)의 분해가속화가 있는데, 이는 자체적인 콜라겐 생합성량이 감소하거나, 그 분해효소인 MMP-1의 발현 증가가 그 원인으로 알려져 있다. MMP-1은 섬유성 콜라겐 1형과 3형의 콜라겐을 1차로 분해함으로써 콜라겐의 분해를 가속화한다.

피부세포에 UV 처리 한 후 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 MMP-1의 발현이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 4. 주름생성과 관련된 유전자의 mRNA 발현 평가

(1)MMP-3

MMP-3는 젤라틴(gelatin), 프로테오글라이칸(proteoglycan), 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin)과 type III, IV 콜라겐을 포함한 다양한 세포외 기질의 분해를 담당하는 pro-MMP-1을 활성화시키는 효소로서, 주름 생성에 중요한 역할을 한다.

피부세포에 UV를 처리한 후 주름 생성에 관련된 인자들의 활성을 확인한 결과, 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 농도의존적으로 MMP-3 유전자 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

(2)MMP-9

MMP-9은 각종 염증성 자극에 의해 유도되고 기저막 성분을 분해하는 것으로 알려져 있다.

피부세포에 UV를 처리한 후 기저막 형성에 관련된 인자들의 활성을 확인한 결과, 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 농도의존적으로 MMP-9 유전자 발현이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

(3)필라그린(filagrin)

피부세포에 UV를 처리한 후 수분 조절에 관련된 인자들의 활성을 확인한 결과, 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 농도의존적으로 필라그린 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

(4)아쿠아포린 3(aquporin 3, 이하 ‘AQP-3’라 한다)

피부세포에 UV를 처리한 후 피부보습 관련 인자들의 활성을 확인한 결과, 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 농도의존적으로 AQP-3 유전자 발현이 다소 감소하는 것을 확인하였다.

(5)Hyaluronan synthase 2(이하 ‘HAS-2’라 한다)

자외선에 노출된 피부에서 히알루론산 감소로 인한 피부 주름 및 노화 증가 그리고 피부장벽 악화 등으로 인한 방어 작용으로 히알루론산 생성에 관여하는 HAS 유전자 발현을 확인한 결과, 방풍캘러스배양액을 농도별로 처리시 유의적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

방풍캘러스배양액은 콜라겐과 엘라스틴 분해에 관여하는 다양한 효소들의 발현(혹은 생성)억제효과를 통해 피부노화 및 주름개선 효과를 나타내었다.

그리고 피부보습 및 피부장벽을 강화에 관여하는 인자들의 발현 증가로 인해 피부노화를 억제하였다.

Claims (4)

1. 방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq./Phellopterus littoralis (A. Gray)Benth) 잎 및 줄기 조직의 캘러스(callus) 배양액 2~8 ul/mL를 유효성분으로 하고, 배지는 MS액체배지에 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid가 첨가된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
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