KR102433733B1 - 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물에 관한 것이다.
이에 따라, 쑥부쟁이 유래 캘러스를 이용함에 따라 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안정성을 담보할 수 있다. 또한 멜라닌 형성을 억제하는 등 피부 미백활성에 대한 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다. 또한, 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

Description

쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 {COMPOSITION FOR SKIN WHITENING CONTAINING CALLUS EXTRACT FROM Aster yomena AND ITS CULTURE MEDIUM}

본 발명은 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 여러해살이풀인 쑥부쟁이(Aster yomena)로부터 유래한 캘러스 추출물 또는 그 배양액을 이용하여 피부의 미백상태를 개선할 수 있는 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

피부는 물리적, 화학적인 외부의 자극으로부터 1차적으로 체내를 보호하는 기능을 갖는다. 피부에 존재하는 멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 자외선 등 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 환경에 대한 세포의 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질로 알려져 있다. 반면, 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨, 검버섯 등을 생성하고 피부노화를 촉진시키고 피부암 유발과도 관련이 있다고 보고되고 있다.

피부 미백과 밀접한 관련이 있는 색소 침착(pigmentation)은 피부 표피 기저층에 있는 멜라닌 세포(melanocyte)에서 일어난다. 색소 침착은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성에 의하여 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있는데 주로 자외선, 염증, DNA 손상, 활성산소에 의하여 과색소 침착(hyperpigmentation)이 유도된다.

미용에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 미용의 중심에 있는 피부를 관리하기 위한 다양한 방법이 생겼는데, 특히 우리나라는 하얗고 깨끗한 피부에 대한 선호도가 높은 탓에 미백, 노화방지, 주름개선, 자외선 차단 등 다양한 기능성을 갖는 기능성 화장품에 대한 수요가 증가했다. 이러한 수요에 맞춰 여러 종류의 화장품들이 우후죽순으로 출시되었고, 높은 수준의 판매량을 기록하였다.

하지만 화장품 시장이 커짐에 따라, 경쟁이 과도해지고 가격경쟁력을 높이는 과정에서 화장품에 포함되는 물질이 유전자 변형 물질이거나, 환경호르몬을 포함하는 경우가 있어 오히려 피부나 건강상에 문제가 종종 발생했다. 이에 따라 장기적으로 인체에 유해하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 천연물질 추출물을 주성분으로 하는 기능성 화장품에 대한 기대가 높아지고 있다(특허문헌 1 참조).

다만 천연물로부터 직접 추출하여 이용되는 식물유래 유용성분들은 인체에 사용 시 안정성이 보장된다는 점에서 높은 이점이 있지만, 추출물의 수득율이 낮고, 계절, 장소, 기후 등 재배조건과 부위별 등의 다양한 환경적 요인에 따라 생산성과 효능의 차이가 날 수 있어 안정적인 원료 공급이 어렵다는 단점이 있다.

KR KR 10-1997-0005272 A1 (1997. 02. 19.)

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 인체에 대한 안정성이 높은 식물로부터 추출된 물질을 이용하여 피부미백을 개선시킬 수 있는 조성물을 제공하되, 그 조성물의 공급과 품질의 일정성도 함께 유지할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물은 식물인 쑥부쟁이의 세포조직에 의해 배양된 캘러스 추출물과 캘러스 배양액을 각각 또는 함께 이용하여 피부의 미백을 개선시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.

본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물은 쑥부쟁이 유래 캘러스를 이용함에 따라 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안정성을 담보할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 쑥부쟁이 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물은 멜라닌 형성을 억제하는 등 피부 미백활성에 대한 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물 및 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물은 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

도 1은 쑥부쟁이 유래 캘러스 배양액과 B16F10 세포의 멜라닌 합성률간의 관계를 나타내는 그래프
도 2는 쑥부쟁이 유래 캘러스 배양액이 B16F10 세포의 생존률에 미치는 영향을 나타내는 그래프
도 3은 멜라닌 수치(M-value) 변화 추이를 도시한 그래프
도 4는 멜라닌 수치 감소 정도를 도시한 그래프
도 5는 육안평가 색소침착 수치 변화를 도시한 그래프
도 6은 육안평가 색소침착 감소 정도를 도시한 그래프

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명에서 “추출물”은 쑥부쟁이(Aster yomena)로부터 유래된 캘러스(callus) 자체를 의미하거나, 캘러스를 분말화하여, 열수추출법, 알코올 추출물 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 탄소수 1 내지 6의 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(Dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(Dimethyl sulfoxide) 등이 있다.

비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 시클로헥산, 시클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, 메틸렌클로라이드, 석유에테르 및 THF 등이 있다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 하나의 방법으로 제한되지 않고 다양한 방법의 추출 방법을 이용할 수 있다. 가령 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등을 이용할 수 있다. 구체적으로 열수 추출의 경우에는 열탕증류기에서 8~48 시간동안, 80~100℃의 온도로 가열하여 열수 추출물을 얻는다. 냉수 추출의 경우에는 냉수(15~25℃)에 캘러스 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합한 뒤 3일 동안 추출함으로써 냉수추출물을 얻는다. 이 외에 물, 유기용매, 또는 이의 혼합용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수도 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 필터 후 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 오일성 용액, 수중유 또는 유증수 또는 다중 에멀전, 수성 또는 오일성 겔, 액체, 페이스트성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성상에서의 오일분산물의 형태일 수 있으며, 이온성 및/또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유체일 수 있으며, 구체적으로 백색 또는 유색크림, 연고, 밀크로션, 유액(serum), 에센스, 페이스트 또는 무스와 같은 형태일 수 있다. 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 스틱과 같은 고체일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 화장 분야에서 통상적인 보조제, 예컨대 친수성 또는 친지성 겔화제, 친수성 또는 친지성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이다. 그 성질에 따라 이러한 보조제는 지방상, 수성상, 지질 소포체 및/또는 나노 입자에 도입될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 치료제로서 연고, 크림과 같은 외용제의 구성이 될 수 있다.

본 발명은 쑥부쟁이로부터 유래한 캘러스를 이용하여 피부 미백 효능을 가지는 조성물을 제공할 수 있고, 특히 야생 또는 재배한 식물을 이용하는 것이 아닌 식물세포 배양을 통해 획득한 캘러스를 이용한다.

식물세포 배양은 지역적, 계절적인 환경적 영향을 받지 않고 안정한 조건에서 일정하게 공급이 가능하며, 배양 조건의 조절을 통해 특정 유용성분의 발생을 촉진시켜 생산 효율을 증가시킬 수 있다. 또한 지속적인 세포선별을 통해 함유하고 있는 유용성분의 종류와 생산성이 높은 식물세포를 확보할 수 있는 장점이 있다.

실시예 1. 쑥부쟁이 식물체 절편 조직배양을 통한 캘러스 취득

쑥부쟁이의 뿌리, 자엽, 하배축 등 조직별 절편 시료를 배양하였다. 배양 개시 약 2주 후부터 절단면에서 팽창이 이루어지면서 황색의 캘러스가 형성되기 시작하였고, 배양 개시 약 4주 후에는 황색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 그 크기가 약 1 mm 정도에 이르렀다.

한편, 식물생장조절제가 쑥부쟁이의 조직별 절편 시료의 조직배양 체계 확립에 미치는 영향을 알아보기 위해 시료를 약 4주간 배양하였다. 배양한 쑥부쟁이 절편 시료로부터 캘러스 형성 효율을 조사한 결과, MS 기본배지에 1 mg/L 2,4-D를 첨가한 처리구에서 쑥부쟁이의 뿌리 절편으로부터 유래된 캘러스의 형성 효율이 가장 높았다. 배양한지 약 6주 후에는 동일 조성의 새로운 배지들로 계대 보존하였고, 4주 주기로 계대 보존을 반복하면서 쑥부쟁이 유래 캘러스의 인공세포주를 확보하였다.

확보한 쑥부쟁이 유래 캘러스를 이용하여 추출물을 제조하는데, 본 실시예에서는 n-헥산 추출물, 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 배양한 쑥부쟁이 유래 캘러스 건조 분말과 물을 1:1 내지 1:10 비율로 80℃의 온도로 3시간 동안 환류 추출을 하여 열수추출물을 제조하였다. 또한, 배양한 쑥부쟁이 유래 캘러스 건조 분말과 n-헥산, 메탄올, 에탄올 용매를 1:1 내지 1:10의 비율로 침지한 다음, 실온에서 24시간동안 추출하여 농축한다. 그리고 용매를 제거함으로써 n-헥산 추출물, 메탄올 추출물, 에탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 2. 쑥부쟁이 유래 캘러스 현탁배양

1 mg/L 2,4-D{(2, 4-dichlorophenoxy) acetic acid}가 첨가된 MS 액체배지 20 ㎖를 250 ㎖ 크기의 삼각플라스크(erlenmeyer flask)에 넣고, 실시예 1에서 증식된 약 1 g의 쑥부쟁이 유래 캘러스를 배지에 옮겼다.

현탁배양은 gyratory shaker(100 rpm)에서 25 ℃ 온도로 암배양을 실시하였다. 약 2주간 배양한 다음 새로운 액체배지 20 ㎖를 추가하였다. 그로부터 약 4주간 더 배양한 다음, 쑥부쟁이 유래 캘러스의 현탁배양세포와 배양배지 5 ㎖을 20 ㎖의 새로운 액체배지가 있는 다른 삼각플라스크에 옮겨 계대배양을 실시하였다. 새로운 액체배지는 1 mg/L 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지다. 그리고 계대배양은 약 4주 간격으로 실시하였다.

이와 같은 현탁배양은 기내 대량생산을 위한 초기 단계로서 현탁배양 체계를 확립하기 위한 작업이다.

이하에서는 실험예를 통해 본 발명에 따른 조성물이 미백효과가 있는지를 증명한다. 실험예 1 내지 3에서 사용될 실험대상세포는 마우스로부터 유래된 B16F10 마우스 멜라노마 세포(이하 “B16F10 세포”라 한다) 각 실험예는 세포생존율과 멜라닌합성 저해 활성을 중심으로 실험을 수행하였다.

실험예 1. 쑥부쟁이 유래 캘러스 추출물의 B16F10 세포에서 미백 효과 확인 실험

1-1. 실험 준비(B16F10 세포의 배양 및 정량)

본 발명에서 사용한 B16F10 세포는 우태아혈청(fetal bovine serum, 이하 “FBS”라 한다)이 10% 함유된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 구체적으로 175 ㎠ 플라스틱 플라스크(SPL life science Co., Ltd. Korea)에 멜라노마 세포주를 5 % FBS 및 1% 항생제(antibiotic)/항진균제(antimycotics)가 함유된 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 2~3일마다 한 번씩 2차 배양하여 세포주를 유지하였다.

그리고 멜라노마 세포가 자란 175 ㎠ 플라스틱 플라스크에서 배지액을 제거하고, CMF-PBS(calcium magnesium free-phosphate buffered saline, pH 7.2)로 세척한 후, 0.25 % 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 다음 세포 배양액으로 중화시킨 후 원심분리(1000 rpm, 3 min)하였다. 남은 세포의 펠렛(pellet)에 배양액을 가한 다음, 멸균 피펫으로 반복 흡입하여 단일 세포 부유액을 제조하였다. 제조한 세포 부유액과 트립판 블루(trypan blue)를 1:1의 비율로 혼합하고, 광학 현미경상에서 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 세포 정량을 실시하였다.

1-2. 실험 과정

1-1.에서 준비된 B16F10 세포를 1X10³ cells/well 의 농도로 5% FBS을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁시켜 96웰 세포배양플레이트(96well cell culture plate)에 넣은 후 1일간 두어 세포를 플레이트에 부착시킨다. 부착된 세포에 50, 25, 12.5 ㎍/㎖ 농도의 시료(실시예 1)를 각각 첨가하고, 24시간 뒤 α-MSH(melanin stimulating hormone)을 처리한 다음 다시 4일간 배양하였다. 배양을 마친 B16F10 세포를 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, 이하 “PBS”라 한다)로 씻고, 1N NaOH 용액을 넣어 세포를 녹인 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌합성(melanogenesis) 저해율을 구하였다. 순수한 DMSO만 처리한 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌합성을 유발한 그룹을 대조군으로 하여 백분율로 표시하였다.

또한, 용매의 종류에 따라 추출된 각각의 시료에 대해서도 실험을 수행하였다. 시료는 n-헥산, 메탄올, 에탄올 및 열수를 이용하여 추출한 추출물이다.

1-3. 실험 결과

	쑥부쟁이 유래 캘러스(메탄올 추출물)
	뿌리	자엽	하배축	코직산
EC50(㎍/㎖)	21.9±2.3	35.9±1.5	18.2±3.2	52.6±3.9
세포독성 (at 50㎍/㎖)	1%	11%	36%	36%

표 1을 참고하면, EC₅₀(half maximal effective concentration)에서의 농도가 뿌리, 자엽, 하배축 순서로 각각 21.9, 35.9, 18.2 ㎍/㎖로 확인되었다. 이를 멜라닌 생성을 억제하는 기준물질인 코직산(kojic acid)의 52 ㎍/㎖과 비교했을 시 높은 멜라닌 생성 억제 효능을 갖는 것을 알 수 있다.

각 시료의 유효농도인 50 ㎍/㎖에서의 세포 생존률은 뿌리, 자엽, 하배축 순서로 각각 99%, 89%, 64%로 높은 생존율을 갖는 것을 알 수 있으며, 특히 뿌리 추출물의 세포독성이 가장 낮은 것을 알 수 있다.

또한, 용매에 따른 추출물의 멜라닌 합성 저해효과는 표 2에 도시된 바와 같다.

	쑥부쟁이 유래 캘러스
	뿌리	자엽	하배축
n-헥산 추출물	-	-	-
메탄올 추출물	21.9±2.3	35.9±1.5	18.2±3.2
에탄올 추출물	24.9±1.7	40.3±5.0	33.7±1.9
열수 추출물	40.6±10.0	55.9±7.5	58.1±10.5

표 2를 참고하면, n-헥산을 제외한 나머지 용매(메탄올, 에탄올, 열수)는 EC₅₀에서의 유효농도가 코직산 보다 다소 높거나 비슷한 수준으로 나타났고, 이를 통해 쑥부쟁이 유래 캘러스의 추출물이 멜라닌 합성 저해효과가 있는 것을 알 수 있다.

실험예 2. 쑥부쟁이 유래 캘러스 배양액의 B16F10 세포에서 미백 효과 확인 실험 1

2-1. 실험 준비

실험예 1-1과 같은 방법으로 B16F10 세포를 준비하였다.

2-2. 실험 과정

2-1.에서 준비된 B16F10 세포를 1X10³ cells/well 의 농도로 5% FBS을 포함하는 RPMI-1640 배지에 현탁시켜 96웰 세포배양플레이트(96well cell culture plate)에 넣은 후 1일간 두어 세포를 플레이트에 부착시킨다. 부착된 세포에 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001, 0.000001, 0.0000001 ㎕/㎕ 농도의 배양액(실시예 2)을 각각 첨가하고 24시간 뒤 멜라닌합성 저해율을 구하였다. 순수한 DMSO만 처리한 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌합성을 유발한 그룹을 대조군으로 하여 백분율로 표시하였다.

2-3. 실험 결과

도 1에 도시된 바와 같이 EC₅₀은 배양액의 농도가 0.0001인 경우에 발생하는 것을 알 수 있다.

세포독성의 경우 CC₅₀(half maximal cytotoxic concentration)은 배양액의 농도가 0.02인 경우에 발생하는 것을 알 수 있다.

살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌의 활성을 억제함으로써 피부미백 기능을 갖으며, 기미, 검버섯, 여드름, 주근깨, 모반에 의해 발생하는 피부 색소침착을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.

실험예 3. 쑥부쟁이 유래 캘러스 배양액의 과색소 침착증 개선 효능 평가를 위한 인체적용시험

3-1. 시험목적

피부색을 결정하는 인자들에는 멜라닌 세포로부터 유래하는 멜라닌, 말초혈관과 혈색소, 각질층의 두께, 카로텐 등의 다양한 요소들이 있으나 이들 중 멜라닌이 가장 중요한 역할을 한다.

멜라닌은 크게 두 가지 종류로 나누어볼 수 있는데 먼저 피부나 모발에 갈색 또는 검은색을 나타내게 하는 eumelanin과 그 변형인 oxymelanin이 있고, 다른 하나로는 모발에 황색 내지 적갈색의 엷은 색조를 주는 pheomelanin과 그 변형인 trichochrome이 있다.

멜라닌 세포의 수는 민족과 피부색에 관계없이 일정하며 멜라닌 소체의 수, 크기, 멜라닌화의 정도, 멜라닌 소체의 분포 및 각질형성 세포 내에서의 멜라닌 소체의 분해에 의해 피부색이 결정된다. 검은 피부와 흰 피부를 결정하는데 중요한 요소는 멜라닌 소체의 크기와 각질형성세포 내에서의 분포패턴으로서 검은 피부는 큰 멜라닌 소체를 형성하고 세포질 내에 개별적으로 분산되나 흰 피부의 작은 멜라닌 소체는 막으로 둘러싸인 식소체 속에 들어 있다. 이와 같이 인종에 따라 유전적으로 결정되는 피부색은 자외선 이외에 멜라닌 세포 자극 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬, 에스트로겐, 리포트로핀, 갑상선 호르몬이나 안드로겐 같은 호르몬들의 영향에 의해 멜라닌 색소 생성에 영향을 받음으로써 후천적으로 변화할 수도 있다.

우리나라와 같은 아시아계 여성들에게 피부미백은 중요한 미용적 이슈로서 예로부터 밝은 피부는 아름다움의 조건으로 여겨지고 있어 피부색을 밝게 만들어 주는 화장품들이 널리 이용되고 있는데 대표적인 것들이 미백 기능성 화장품이라 할 수 있다.

국내 화장품 미백 고시원료에는 나이아신아마이드, 닥나무추출물, 아스코빌글루코사이드, 아스코빌테트라이소팔미테이트, 알부틴, 알파비사보롤, 에칠아스코빌에테르, 감초추출물 등이 있으나 이들 외에 여러 제조사에서 비고시원료 등을 추가로 배합해 제품개발에 이용하고 있다.

국내 식품의약품안전처 가이드라인에 따른 화장품의 미백효과 평가시험은 크게 인공색소침착 후 미백 효과 평가시험(Efficacy evaluation on induced pigmentation)과 과색소침착증에서의 미백 효과 평가시험(Efficacy evaluation on hypermelanosis)으로 분류되며, 전자의 경우 색소침착을 원하는 정도로 인공적으로 유도할 수 있다는 점에서 효능 평가에 이점이 있으나 피험자의 위험이 다소 크며 시험이 까다롭고 더 긴 기간이 소요될 수 있고, 후자의 경우 시험이 간편하고 피험자의 위험이 적지만 객관적인 효능평가가 더 어려울 수 있다.

본 연구는 총 8주간의 기간 동안 과색소침착증이 있는 피험자들을 대상으로 미백 효능 성분이 함유된 화장품의 미백 개선 효과를 평가하는 시험으로서, 시험 시료의 안면부 피부 미백(과색소침착 개선) 효과를 Mexameter를 이용한 기기평가와 피부과 전문의의 육안 평가 및 피험자 주관적 평가를 이용해 평가하였다.

3-2. 시험물질

군	주요성분
시험군	나이아신아마이드(Niacinamide): 2% 쑥부쟁이캘러스배양액: 94.962%
대조군	나이아신아마이드(Niacinamide): 2%

3-3. 피시험자에 관한 내용

가. 피시험자 선정기준

1) 시험책임자 또는 시험책임자의 위임을 받은 사람이 피험자에게 알려주어야 할 사항에 대하여 충분히 설명을 듣고 자발적으로 동의서를 작성하고 서명한 자

2) 피부 질환을 포함하는 급, 만성 신체 질환이 없는 건강한 자

3) 시험기간 동안 추적 관찰이 가능한 자

나. 피시험자 제외기준

지원자와의 면담에 의하여 다음 사항에 해당되는 사람은 피험자에서 제외시킨다.

1) 임신 또는 수유중인 여성과 임신 가능성이 있는 여성

2) 피부질환 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부 외형제를 1개월 이상 사용하는 사람

3) 동일한 시험에 참가한 뒤 6개월이 경과되지 않은 사람

4) 민감성, 과민성 피부를 가진 사람

5) 시험 부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관 확장 등의 피부 이상 소견이 있는 사람

6) 연구 시작 전 3개월 내에 시험 부위에 동일 또는 유사한 효능 화장품 및 의약품 등을 사용한 사람

7) 연구 시작 전 6개월 내에 시험 부위에 시술을 받은 사람

8) 그 외 시험책임자의 판단으로 시험에 부적합하다고 생각되는 사람

다. 피시험자 중도탈락기준

아래의 경우 시험책임자의 판단 하에 중지시키고, 이를 시험결과 산정에서 제외하고 최종 보고서에 기록하여 보고하여야 한다.

1) 시험 부위에 소양감이나 홍반 등의 유해사례가 발생한 경우

2) 피시험자가 실험 진행 과정 중 시험 부위에 과도한 자외선 노출을 하거나 지나친 음주, 흡연 등으로 결과의 평가에 장애가 발생한 경우

3) 피시험자가 실험 진행 과정 중 개인 사정에 의해 추적 관찰이 어려운 경우

라. 피시험자의 숫자와 이에 대한 근거

식품의약품안전처 (Ministry of Food and Drug Safety; MFDS) ‘화장품 표시·광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인 (2018.03)’ 및 대한피부과학연구소 자체 규정에 근거하여, 시험결과의 통계적 유효성을 입증할 수 있도록 20명 이상의 유효데이터를 확보한다.

마. 피험자 관리

본 연구의 의뢰자 및 시험자는 헬싱키 선언의 근본정신을 준수하고, 피험자의 권익을 보호하고자 노력하였으며 연구 수행과 결과 기록 등에 있어 인체시험관리기준 (GCP) 및 관련 국내 법규를 준수하도록 노력한다. 시험 전 모든 피험자들의 시험참여 동의를 받았으며, 식품의약품안전처가 발간한 [화장품 인체적용시험 및 효력시험 가이드라인, 2015]에 따라 피험자들의 동의를 얻는데 마땅히 제공해야 할 모든 정보들을 성실히 전달한다.

3-4. 시험방법

가. 시험물질 적용 방법

실제 사용법과 동일하게 하기 위해 시험의뢰자가 제공한 사용방법을 피험자에게 교육한다.

나. 사용장비

1) Mexameter (The Mexameter® MX 18, CK electronic GmbH, Germany)

Mexameter® MX 18은 반사율 분광 광도계로 녹색광(568nm)과 적색광(660nm)을 5mm 크기로 피부에 방출한 후 반사되는 광선을 광감지기로 감지하여 정량화된 멜라닌(melanin) 지수와 홍반(erythema) 지수를 나타내는 측정 기기이다. 조사된 2개의 광파장은 피부 멜라닌 색소(melanin pigments)에 따라 흡수율이 각각 다른데, 이 때의 각기 다른 빛의 흡수율을 잡아내어 이를 멜라닌 수치로 측정할 수 있다. 홍반 역시 2개의 다른 광파장에 의한 피부의 빛 흡수 정도를 측정함으로써 알 수 있다. 홍반을 측정할 때 사용되는 광파장 중 하나는 혈색소(hemoglobin)의 흡수 스펙트럼 정점을 측정하기 위해, 다른 하나는 빌리루빈(bilirubin)에 의해 발생되는 색의 영향을 피하기 위해 사용된다. 멜라닌과 홍반의 측정결과는 각각 M (Melanin index)값과 E (Erythema index)값으로 숫자화되어 나타나며 단위는 임의 단위 (Arbitrary unit, AU)를 사용한다. 멜라닌 함량이 높을수록 M (Melanin index)값은 상승하며, 붉은 정도가 강할수록 E (Erythema index)값은 상승하게 된다. 측정 방법으로는 과색소 부위에 살짝 압력을 가하여 밀착시킨 후 각각 5번씩 측정을 하고 5회 측정한 평균값을 사용한다.

2) VISIA® CR (Canfield, USA)

고화질 디지털 이미지 분석 장비로서 일반광, 편광, 자외선광의 3종의 광원을 사용하며 색소침착, 모공, 기미, 피지 등의 피부상태를 자체 분석 프로그램을 통해 화상분석으로 계측하는 장비이다. VISIA는 8가지 모드를 사용하여 안면부 분석이 가능하며, 백분위(Percentiles), 특징합계(Feature Counts), 절대점수(Absolute Scores)를 데이터 표시 형식으로 사용한다.

다. 시험 순서

1) 첫 번째 방문

- 피험자는 시험 방법과 일정 및 위험성과 가능한 이상반응 등에 대해 설명을 듣고 기초정보를 작성하고 동의서에 서명한다.

- 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후 30분간 항온항습 조건 (20~24℃, 40~60%RH)에서 안정을 취한다.

- VISIA® CR을 이용하여 안면 사진 촬영을 실시한다.

- 과색소 침착증 병변의 한 곳을 찾아 사진상에 표기하고, Mexameter를 이용하여 과색소 침착증 병변의 Melanin 수치를 측정한다.

- 피부과 전문의에 의한 육안 평가를 실시한다.

- 피험자 주의사항과 시료 사용법을 교육한 후 시료를 배포한다.

- 시험기간 동안 매일 전화 등의 방법으로 시료 사용의 순응도를 체크한다.

2) 두 번째 방문 (시험 2주 후) /세 번째 방문 (시험 4주 후)

- 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후 30분간 항온항습 조건 (20~24℃, 40~60%RH)에서 안정을 취한다.

- VISIA® CR을 이용하여 안면 사진 촬영을 실시한다.

- 첫 번째 방문일에 표기한 동일 부위에서 Mexameter를 이용하여 양측 과색소침착증 병변의 Melanin 수치를 측정한다.

- 피부과 전문의에 의한 육안 평가를 실시한다.

- 피험자에 의한 주관적 평가를 실시한다. A, B 시료 사용 부위의 호전 정도를 다음과 같은 척도로 주관적 평가한다.

: 변화 없음 (no change), 조금 호전되었음 (improved), 매우 호전되었음 (much improved)

- 피부과 전문의가 피부 이상반응의 유무를 평가한다.

3) 네 번째 방문 (마지막 방문, 시험 8주차)

- 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후 30분간 항온항습 조건 (20~24℃, 40~60%RH)에서 안정을 취한다.

- VISIA® CR을 이용하여 안면 사진 촬영을 실시한다.

- 첫 번째 방문일에 표기한 동일 부위에서 Mexameter를 이용하여 양측 과색소침착증 병변의 Melanin 수치를 측정한다.

- 피부과 전문의에 의한 육안 평가를 실시한다.

- 피험자에 의한 주관적 평가를 실시한다. A, B 시료 사용 부위의 호전 정도를 다음과 같은 척도로 주관적 평가한다.

: 변화 없음 (no change), 조금 호전되었음 (improved), 매우 호전되었음 (much improved)

- 피부과 전문의가 피부 이상반응의 유무를 평가한다.

- 마지막 방문일에 시험을 종결하고 시료를 회수하였으며, 피험자들에게 시험 참여비를 지급한다.

라. 평가 및 분석 방법

1) Mexameter를 이용한 과색소침착증 개선 효과 평가

- 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후, 시험 8주 후에 시험 부위와 대조 부위의 피부 색소수치(M-Value)를 기기적으로 측정한다.

- 과색소침착증 개선 정도를 아래의 수학식 1과 같이 백분율 (%)값으로 도출한다.

2) 피부과 전문의에 의한 과색소 육안 평가

- 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후, 시험 8주 후에 시험 부위와 대조 부위의 피부 색소 등급을 다음과 같은 척도로 평가한다.

피부 색소 등급 개선 정도를 수학식 2와 같이 %값으로 도출한다.

3) 피험자에 의한 과색소 주관적 평가

- 시험 2주 후, 시험 4주 후, 시험 8주 후에 시험 부위와 대조 부위의 과색소 호전 정도를 다음과 같은 척도로 주관적 평가한다.

: 변화 없음 (no change), 조금 호전되었음 (improved), 매우 호전되었음 (much improved)

4) 피부과 전문의에 의한 안전성 평가

- 시험기간 중 피험자 방문일 마다 시료 사용에 의한 부작용 (홍반, 부종, 인설, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림 및 기타 이상증) 발생 여부를 평가한다.

마. 통계 분석 방법

1) Minitab 19 (Minitab® 19.2, Minitab Inc.) 프로그램을 이용해 유의성을 확인한다.

- 결과 값은 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)을 통해 정규 분포로 추정되는 경우, 아래의 모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인한다.

- 동일 그룹 내 전후 결과값 비교: 시험 전, 후 측정한 값의 비교는 paired t-검정을 이용하며, 3 회 이상 반복 측정한 경우, 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인한다.

- 2 이상의 상이한 그룹간 결과값 비교: 두 그룹간 결과값의 비교는 Welch’s t-검정을 이용하며, 3 이상의 그룹간 결과값 비교는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인한다.

- 반복 측정한 2 이상의 상이한 그룹의 결과값 비교: 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하며, 그룹간 초기 측정 값이 유의하게 다른 경우 초기 측정값을 공변량으로 한 공분산분석(Analysis of Covariance)을 통해 그룹간 결과값의 차이를 확인한다.

- 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)에서 정규성이 기각되는 경우, 아래의 비모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인한다.

- 동일 그룹 내 전후 결과값 비교: 시험 전, 후 측정한 값의 비교는 Wilcoxon signed rank 검정을 이용하며, 3 회 이상 반복 측정한 경우, Friedman 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인한다.

- 2 이상의 상이한 그룹간 결과값 비교: 두 그룹간 결과값의 비교는 Mann-Whitney U 검정을 이용하며, 3 이상의 그룹간 결과값 비교는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인한다.

- 반복 측정한 2 이상의 상이한 그룹의 결과값 비교: Friedman 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 그룹간 결과값의 차이를 확인한다.

- 모든 자료는 연속형 변수는 평균과 표준편차로, 범주형 변수는 빈도와 백분율로 요약한다.

3-5. 시험 결과

피험자의 기본 정보는 표 5에 기재된 바와 같다.

피험자 기본 정보 통계 값은 표 6에 기재된 바와 같다.

Mexameter 측정 값(피부색소지수, M-value, A.U.)은 표 7에 기재된 바와 같다.

멜라닌 수치(M-value) 측정값 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)은 표 8에 기재된 바와 같다.

멜라닌 수치(M-value) 동질성 통계 결과(Welch's t-test)는 표 9에 기재된 바와 같다.

멜라닌 수치(M-value) 측정값 전후 비교 통계, 반복측정분산분석은 표 10에 기재된 바와 같다.

멜라닌 수치(M-value) 측정값 전후 비교 통계(사후 검정, Tukey method)은 표 11에 기재된 바와 같다.

멜라닌 수치(M-value) 측정값 그룹간 비교 대조 통계 결과(반복측정분산분석)은 표 12에 기재된 바와 같다.

멜라닌 (Melanin) 색소 감소 정도 대조군과의 비교 평가는 표 13에 기재된 바와 같다.

기기평가는 Mexameter의 M-value 측정을 통해 이루어졌으며 평가의 신뢰성을 높이기 위해 부위당 총 5회 반복 측정을 실시하였다. 시험 시료를 사용한 시험 부위의 피부색소지수 (M-value)는 시료 사용 2주 후부터 시료 사용 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 감소하였으며, 대조 시료를 사용한 대조 부위의 경우 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)의 차이를 확인할 수 없었다. 또한 대조 시료를 사용한 대조 부위와의 비교 결과에서도 시험 부위가 대조 부위에 비해 피부색소지수 (M-value)가 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 감소함을 확인할 수 있었다.

전문가의 육안평가 결과(score)는 표 14에 기재된 바와 같다.

육안평가 결과(visual score)에 대한 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test) 결과는 표 15에 기재된 바와 같다.

육안평가 결과(Visual Score) 전후 비교 통계(반복측정분산분석) 결과는 표 16에 기재된 바와 같다.

육안평가 결과(Visual Score) 전후 비교 통계(사후 검정, Tukey method) 결과는 표 17에 기재된 바와 같다.

육안평가 결과(Visual Score) 그룹간 비교 대조 통계 결과(반복측정분산분석)는 표 18에 기재된 바와 같다.

육안평가 색소침착 감소 정도(Score) 결과를 정리한 것은 표 19에 기재된 바와 같다.

전문가 육안평가에서는 시험 부위는 주차별 통계 검정에서는 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 보였으나 사후 검정에서는 차이를 확인할 수 없었으며, 대조 부위의 경우 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)의 차이를 확인할 수 없었다. 또한 그룹 간 비교 통계결과에서도 시험 부위와 대조 부위 간 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)의 차이를 확인할 수 없었다.

피험자의 주관적 평가 결과는 표 20에 기재된 바와 같다.

피험자의 주관적 평가 결과를 정리한 것은 표 21에 기재된 바와 같다.

피험자의 주관적 평가는 시험 2주 후, 시험 4주 후, 시험 8주 후 시험일에 이루어졌으며, 시험 부위와 대조 부위의 호전 정도를 세 단계로 나누어 평가하였다. 시험 2주차에는 시험 부위와 대조 부위가 호전되었다고 판단한 사람이 각각 10명, 9명이었으며, 4주차에는 시험 부위와 대조 부위가 호전되었다고 판단한 사람이 각각 14명, 10명, 매우 호전되었다고 판단한 사람은 0명, 2명이었고, 8주차에는 시험 부위와 대조 부위가 호전되었다고 판단한 사람이 각각 13명, 10명이었으며, 매우 호전되었다고 판단한 사람은 2명, 1명으로 8주 간의 시험 기간 동안 대조 부위보다 시험 부위가 호전되었다고 판단한 피험자가 더 많았다.

시험기간 동안 발생한 피부 이상증 결과는 표 22에 기재된 바와 같다.

시험기간 동안 모든 피험자로부터 피부이상반응은 관찰되지 않았다.

결론적으로 쑥부쟁이 캘러스 배양액을 사용한 시험 부위는 대조 시료를 사용한 대조 부위에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부색소지수(M-value)가 감소하여 시험 시료의 안면부 과색소침착증 개선을 통한 피부 미백에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

또한 시료 사용기간 동안 특별한 이상반응이 관찰되지 않아 안전하고 효과적인 미백(과색소침착증 개선) 기능성 시료인 것으로 판단된다.

Claims (8)

1. 쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 추출물을 유효성분으로 하고,
   상기 쑥부쟁이 유래 캘러스는 쑥부쟁이의 뿌리, 자엽 및 하배축 중 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 피부 미백 개선용 화장료 조성물.
2. 쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하고,
   상기 쑥부쟁이 유래 캘러스는 쑥부쟁이의 뿌리, 자엽 및 하배축 중 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 피부 미백 개선용 화장료 조성물.
3. 삭제
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 피부 미백 개선은 멜라닌의 합성을 억제함으로써 개선하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 개선용 화장료 조성물.
   
5. 쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 추출물을 유효성분으로 하고,
   상기 쑥부쟁이 유래 캘러스는 쑥부쟁이의 뿌리, 자엽 및 하배축 중 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 예방 또는 개선을 위한 피부외용제 조성물.
6. 쑥부쟁이(Aster yomena) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하고,
   상기 쑥부쟁이 유래 캘러스는 쑥부쟁이의 뿌리, 자엽 및 하배축 중 어느 하나로부터 유래된 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 예방 또는 개선을 위한 피부외용제 조성물.
7. 삭제
8. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서,
   상기 피부 색소침착은 기미, 검버섯, 여드름, 주근깨 또는 모반에 의한 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 예방 또는 개선을 위한 피부외용제 조성물.

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