KR101945204B1 - 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 발아 인삼씨 추출물을 함유함으로써 피부 보호 용도, 항노화, 항주름, 피부 탄력 개선, 미백, 피부 보습, 아토피 등의 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 피지 조절, 항염증, 여드름 등의 피부 트러블 증상 예방 또는 개선, 피부 혈색 개선, 각질 제거, 탈모 예방, 항비듬, 모발의 광택 및 부드러움 개선, 얼굴 또는 바디의 볼륨 및 탄력 증진, 얼굴 또는 바디의 라인 개선효과가 뛰어난 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

발아 인삼씨 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{External composition for skin containing germinated seeds of ginseng extract}

본 발명은 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 발아 인삼씨 추출물을 함유함으로써 피부의 전반적인 개선 효과가 탁월한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부의 부작용을 줄이면서도 보습, 미백, 항노화 효과 등에 있어서 상기의 문제를 해결하기 위하여 천연물을 사용한 화장품 등 피부 외용제 조성물이 많이 개발되고 있다. 이에 본 발명자들은 이제까지 널리 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 피부의 전반적인 개선을 위한 피부 외용제로서의 응용 가능성을 연구하였다.

여러 천연물들 중 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로, 한국, 중국, 일본 등지에서 2,000여년 전부터 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 생약으로 사용되어 왔다. 인삼의 지금까지 알려진 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용과 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선 및 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선 및 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 알려져 있다. 인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으나, 인삼 근(뿌리), 인삼엽, 인삼열매 등 그 부위에 따라 진세노사이드 함량과 조성은 큰 차이가 있다.

최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물소재로 연구되고 있다. 그러나, 대부분 인삼근의 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼 다당체를 활용한 연구만 수행되고 있는 실정이다.

국내공개특허 제 2009-0130801호

본 발명의 발명자들은 반복적이고 다양한 실험을 통해, 인삼씨 추출물이 피부에 대하여 안전하면서 충분한 보호 및 개선효과를 제공할 수 있음을 확인하고 연구를 거듭하던 중, 발아 인삼씨 추출물이 발아되지 않은 인삼씨 추출물을 사용할 경우보다 우수한 피부 보호 및 개선 효과를 보임을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 아임계 추출법에 의해 추출된 발아 인삼씨 추출물의 피부 보호 및 개선 효과가 보다 탁월함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 발아 인삼씨 추출물을 유효성분을 함유함으로써 우수한 피부 보호 및 개선효과를 갖는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 아임계 추출법으로 추출한 발아 인삼씨 추출물을 유효성분을 함유함으로써 피부의 보호 및 개선에 유용한 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

보다 상세하게는 본 발명에서 사용되는 발아 인삼씨 추출물은 인삼의 발아된 씨앗에서 추출되는 것이다. 발아 상태의 인삼씨는 발아 이전 상태와 비교하여 생명 현상에 필요한 효능 성분을 더욱 많이 포함하고 있어 보다 강한 효능을 제공할 수 있다.

상기 발아 인삼씨는 인삼씨를 20℃~25℃ 온도의 깨끗한 물에 넣어 배양시킴으로써 발아시킬 수 있다. 이때, 인삼씨는 껍질에 흠집을 내어 발아시키는 것이 바람직하고, 물에 넣어준 후 인삼씨를 하루 1~2회 정도 물을 갈아주며 7~10일간 배양시키는 것이 바람직하다. 낮에는 자연채광이 드는 곳에 두는 것이 좋다.

본 발명에 사용된 발아 인삼씨 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 인삼씨로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

또한, 상기 발아 인삼씨 추출물은 아임계 추출법(Subcritical Water Extraction)으로 추출한 것이 바람직하다. 기존에 사용된 초임계 추출법에서 초임계 유체의 밀도는 액체와 유사하고, 점도와 확산계수는 기체와 유사하다. 따라서 초임계 유체를 추출용매로 사용하면 식물체의 미세기공으로 쉽게 침투하고, 적절한 분자밀도를 갖게 됨으로써 원하는 물질의 분자를 에워싸서 빠져 나오는 방식으로 원하는 물질의 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 초임계 상태로 만들어서 추출용매로 사용할 수 있는 물질로서는 우선 무독성이어야 하고, 초임계 상태가 고온/고압이므로 폭발의 위험성이 없어야 하며, 추출용매로서 용해력이 우수해야 한다. 이러한 조건만 충족시키면 어떠한 물질도 초임계 유체로 만들어서 추출을 할 수 있다.

반면, 본 발명에서 사용되는 아임계 기술은 용매가 임계점을 넘지 못한 상태에서 추출용매로 사용하는 것으로, 용매를 무엇으로 선택하는가에 따라서 초임계 추출과 같은 성능을 낼 수 있으며, 본 발명에서는 용매로서 물을 사용한다. 또한, 초임계 이산화탄소는 극성물질은 추출을 하지 못하므로 유기용매를 보조용매로 함께 사용하여야 하지만, 아임계 물은 추출성능이 더 뛰어나고 조업조건의 변화 범위가 커서 비극성물질 및 극성물질 모두 추출이 가능하다. 뿐만 아니라, 아임계 물로 추출을 하는 경우에는 가수분해 반응도 진행할 수 있다.

이 추출법에 의하면 인삼씨 추출물을 고체나 반고체 시료에서 온도와 압력에 따른 물의 유전상수(dielectric constant, e)의 변화를 이용하여 단시간 내에 추출할 수 있다. 따라서, 인삼씨 추출물을 아임계 추출법에 의하여 추출함으로써 통상의 용매추출법에 의한 경우보다 추출 속도가 빠르고 물을 추출용매로서 사용하므로 잔류 유기용매 또는 중금속이 없어 인체 및 환경에 무해하다. 한편, 저온공정으로 진행되므로 추출물의 활성이 유지되며 열변성 물질의 추출도 가능하고, 공정자체가 추출물의 분리회수가 용이하여 조업비용이 절감될 뿐만 아니라 용매의 재순환도 가능하다. 그리고 온도와 압력과 같은 추출조건에 따라 유용물질을 선택적으로 얻을 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 아임계 추출법에 의한 인삼씨 추출물은 구체적으로 다음과 같이 제조할 수 있다. 인삼씨를 준비한 후 아임계 추출장치를 이용해서 50~200MPa, 바람직하게는 100MPa의 압력에서 인삼씨를 분해하여 유효 성분을 추출한다. 50MPa 미만의 압력에서는 유효 성분들이 충분히 추출되지 않고, 200MPa 초과 압력에서는 압력 대비 유효 성분 추출 증가량이 미미하기 때문에 상기 범위의 압력에서 추출한다. 추출 후 1.2㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 0.45㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 0.2㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번 필터링하여 이물질 및 미생물을 제거하여 아임계 인삼씨 추출물을 준비할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 인삼씨 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 1~50중량%의 양으로 함유할 수 있다. 이는 상기 유효성분의 함량이 1 중량% 미만이면 성분이 갖고 있는 피부 효능을 기대하기 어려우며, 50 중량%를 초과하면 더 이상 효능이 크게 증가하지 않아 그 원료 효율성이 떨어지기 때문이다.

본 발명의 조성물은 피부를 보호하거나 전반적으로 개선하기 위한 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따른 조성물은 피부 손상 억제 및 피부 보호용일 수 있다. 활성산소의 생성을 억제하고 활성산소에 의해 유발된 산화적 손상을 억제하는 효능이 있는 발아 인삼씨 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 활성산소 또는 자외선 등에 의한 피부 세포의 손상을 억제 또는 예방할 수 있고, 이를 통해 피부를 보호할 수 있다. 이때 상기 피부는 두피 또는 모발일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 활성산소 또는 자외선에 의한 피부 손상 억제하고 콜라겐 생성을 촉진하거나 매트릭스 메탈프로테이나아제(MMP-1)의 생합성을 저해함으로써, 피부의 노화 또는 주름을 예방 또는 개선시킬 수 있고, 피부의 탄력을 개선시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 티로시나제 활성을 저해하고 멜라닌의 생성을 억제시키거나, 피부에 침착된 색소를 미백화시킴으로써 피부 미백용으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 각질형성세포의 분화를 촉진함으로써 오래된 각질세포의 탈락과 새로운 각질세포의 생성 과정인 표피 세포의 분화 또는 각화(keratinization)과정을 도와, 각질을 효과적으로 제거할 수 있으므로 각질 제거용으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)를 정상 범위로 유지함으로써 각질층의 보습인자와 지질의 양을 정상적으로 유지할 수 있도록 하고 트랜스 글루타미네이즈 발현을 촉진할 수 있다. 이로써, 각질형성세포의 분화를 촉진하고 피부 수분을 유지함으로써 피부 보습 및 피부 장벽 기능을 강화시켜 아토피나 건선과 같은 피부 건조 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 피부에 적용 시 과잉으로 분비되는 피지를 억제하고, 활성 산소 제거와 콜라겐 합성을 촉진하여 모공을 축소시키며, 염증 인자의 발현 감소로 피부 트러블 증상을 억제하는 효과를 통하여 모공 축소, 피지 조절 및 피부 트러블 증상 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있고, 나아가 피지의 과다 분비에 의한 여드름, 모공확대, 지루성 피부염 등을 예방 또는 개선시킬 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생합성을 억제함으로써 염증을 예방 또는 개선시킬 수 있고, 이를 통해 여드름을 포함하는 피부 트러블 증상을 완화시킬 수 있다. 또한, 우수한 항산화력으로 인해 피부 자극의 생성을 방어할 수 있다. 여기서 피부는 두피를 포함한다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 두피 또는 모발을 포함하는 피부의 혈색 개선용일 수 있으며, 탈모 예방용, 항 비듬용 또는 모발의 광택 또는 부드러움 증진용으로 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 조성물은 지방세포의 분화를 촉진함으로써 얼굴과 바디의 볼륨 및 탄력을 증진시킬 수 있다. 얼굴과 바디 중 볼륨과 탄력의 증진이 요구되는 부위에 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물을 도포하면, 볼륨과 탄력이 증진되며, 볼륨과 탄력의 증진이 요구되는 부위는 노화로 인해 함몰된 부위일 수 있다. 예컨대, 노화로 인해 함몰된 볼살 등을 들 수 있으며, 함몰된 볼에 본 발명에 따른 조성물을 도포하면 지방세포 분화를 촉진함으로써 볼륨이 증진될 수 있다. 볼륨과 탄력의 증진이 요구되는 부의의 다른 예로는 가슴과 엉덩이 부위를 들 수 있고, 가슴과 둔부에 본 발명에 따른 조성물을 도포하면 가슴과 둔부가 탄력있고 풍만해 지는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 유효성분으로 함유된 발아 인삼 씨 추출물이 지방세포의 분화를 촉진함으로써 얼굴과 바디의 볼륨 및 탄력을 증진시키고, 콜라겐의 생합성을 촉진하고 콜라겐의 분해를 억제함으로써 노화 등의 원인으로 인해 손상된 얼굴과 바디의 라인을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 발아 인삼씨 추출물 또는 아임계 추출법으로 추출한 발아 인삼씨 추출물을 함유함으로써 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 조성물보다 우수한 피부 보호 및 개선 효과를 제공한다.

나아가, 본 발명의 조성물은 피부 보호 효과뿐만 아니라, 항노화, 항주름, 피부 탄력 개선, 미백, 피부 보습, 아토피 등의 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 피지 조절, 항염증, 여드름 등의 피부 트러블 증상 예방 또는 개선, 각질 제거, 피부 혈색 개선, 탈모 예방, 항비듬, 모발의 광택 및 부드러움 개선, 얼굴 또는 바디의 볼륨 및 탄력 증진, 얼굴 또는 바디의 라인 개선 효과에 있어서도 우수한 효과를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물과 비교예의 수분함량 증가율을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물과 비교예의 TEWL(경표피 수분 손실) 측정 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다.

또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.

[실시예 1] 발아 인삼씨 추출물

발아 상태의 인삼씨를 정제수 70%, 알코올 30% 용매에 넣고 25℃에서 6시간 방치하여 활성 성분들을 추출한다. 추출 후에 3㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 1㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번 필터링을 하여 이물질을 제거하고, 마지막으로 제균 필터로 미생물을 제거하여 발아 인삼씨 추출물을 얻는다.

[실시예 2] 발아 아임계 인삼씨 추출물

발아 상태의 인삼씨를 아임계 추출장치를 이용, 40℃에서 20MPa로 4시간 동안 유효 성분을 추출한다. 추출 후 1.2㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 0.45㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 0.2㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번 필터링하여 이물질 및 미생물을 제거하여 발아 아임계 인삼씨 추출물을 얻는다.

[비교예] 일반 인삼씨 추출물

발아 상태가 아닌 인삼씨를 정제수 70%, 알코올 30% 용매에 넣고 25℃에서 6시간 방치하여 활성 성분들을 추출한다. 추출 후에 3㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번, 1㎛ 공극을 갖는 필터에서 1번 필터링을 하여 이물질을 제거하고, 마지막으로 제균 필터로 미생물을 제거하여 일반 인삼씨 추출물을 얻는다.

[시험예 1] 활성산소 생성 억제 실험

자외선(UV) 조사에 의하여 세포에서 발생하는 활성산소(ROS; Reactive oxygen species)를 제거하는 능력을 비교하는 실험을 통하여 항산화 효과를 조사하였다. 양성대조군으로서 일반적으로 항산화 효과를 비교하는데 사용하는 트롤록스(trolox)(Aldrich Co.)를 사용하였다. 또한 시험물질을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다. 인간 HaCaT 각질형성세포 단층 배양 시스템(human HaCaT keratinocytes monolayer culture system:PBoukamp, German Cancer Research Center, Heidelberg. German)에 자외선(UVB 30mJ/cm²)을 처리한 후 실시예1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물, 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 하기 표1과 같이 각각 처리하였다. 그런 다음, ROS의 양을 DCFH-DA(2', 7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc)를 형광플레이트리더로 측정하였다. 자외선을 처리한 대조군에 대한 비율로 ROS 생성 억제 비율을 계산하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.

시험물질 ROS 생성 억제 비율(%)

시험물질	ROS 생성 억제 비율(%)
대조군	0
트롤록스 0.1 mM	42.7
실시예 1(10ppm)	33.2
실시예 1(1ppm)	17.5
실시예 2(10ppm)	39.8
실시예 2(1ppm)	21.3
비교예(10ppm)	19.9
비교예(1ppm)	11.2

상기 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 인간 HaCaT 각질형성세포 단층 배양 시스템(human HaCaT keratinocytes monolayer culture system)에서 대조군에 비하여 UV에 의해 생성된 활성산소를 유의적으로 소거하는 효과를 나타낸다. 이는 항산화 물질의 활성지표로 사용되는 트롤록스와 유사한 정도의 우수한 활성이다. 그러나 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물은 본 발명의 발아된 인삼씨 추출물보다 낮은 활성산소 소거효과를 보인다. 즉, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 일반 피부 손상의 원인이 되는 활성 산소를 보다 효과적으로 소거함으로써 두피와 모발을 포함하는 피부를 보호하고 더 나아가 주름 생성, 탄력 저하 및 색소 침착 등을 예방하는 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 단 세포 겔 전기영동(Single cell gel electrophoresis; SCGE, Comet assay)에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제 활성

사람의 정상 섬유아세포(자체 일차 배양)를 24시간 배양한 후 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물, 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물과 양성대조군인 비타민 E를 각각 농도별로 처리하고 12시간 후에 H₂O₂(최종농도 10-3M)를 처리한 다음 전기영동법으로 염색한 결과를 형광현미경으로 관찰하였다. 이때 이미지 아날라이저(image analyzer)인 KOMET 3.1(Kinetic Imaging, England)를 사용하여 25개의 각 세포에서 DNA 절단의 결과로 나타난 테일(tail)의 길이(um)를 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질 테일 길이(㎛) 저해율(%)

시험물질	테일길이(㎛)	저해율(%)
대조군	121.1	0.0
비타민 E(10ppm)	68.9	43.10
실시예 1(10ppm)	73.3	39.47
실시예 1(1ppm)	91.2	24.69
실시예 2(10ppm)	71.1	41.29
실시예 2(1ppm)	88.4	27.00
비교예(10ppm)	95.2	21.39
비교예(1ppm)	103.1	14.86

상기 표 2의 결과에서, 세포 겔 전기영동에 의한 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 우수한 산화적 DNA 손상 억제 활성을 나타냈으며, 이는 양성 대조군인 비타민 E와 유사한 효과이다. 따라서, 이로 인해 본 발명에 의한 인삼씨 추출물이 히드록실 라디칼(.OH)에 의한 DNA 싱글 스트랜드 브레이크(single strand break)를 억제하는 DNA 산화적 손상억제제로서 작용함을 확인할 수 있다. 이는 두피 또는 모발을 포함하는 피부의 세포의 유전자를 보호하는 중요한 방어 효과이다.

[시험예 3] 프로콜라겐 생성 촉진 효능 실험

상기 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물의 프로콜라겐 생성능을 양성대조군인 비타민 C, 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물과 비교하여 측정하였다. 프로콜라겐은 콜라겐 생성 유도 물질로 콜라겐 생성과 노화 방지에 필요한 물질이며, 비타민 C는 콜라겐의 합성에 필수성분으로 알려져 있다.

시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어 있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 1 및 2, 비교예 및 비타민 C 각각을 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취한다. 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐 타입-1 C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

비처리군에서의 프로콜라겐 생성 정도를 100으로 하고, 이에 대비하여 시험물질을 처리한 군에서의 프로콜라겐 생성 정도를 구하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

시험물질	프로콜라겐 생성 정도(%)
비처리군	100
비타민 C	120
실시예 1	117
실시예 2	119
비교예	104

프로콜라겐의 생성 정도가 높을수록 콜라겐의 생성 정도가 높아지며, 따라서 피부 주름의 생성을 방지할 수 있다. 상기 표 3에서 보면, 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 시험관내(in vitro)에서 콜라겐의 합성에 필수적인 성분으로 알려져 있는 비타민 C와 프로콜라겐의 생성 촉진 정도가 유사하나, 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물은 실시예 1 및 2에 비하여 프로콜라겐 생성 촉진 정도가 낮은 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2는 프로콜라겐 생성을 효과적으로 촉진시키므로써 피부 내 콜라겐의 생성을 도와 주름개선 효과뿐만 아니라 항노화 효과도 뛰어남을 알 수 있다.

[시험예 4] 미백 효과 시험(쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정)

상기 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물의 멜라닌 생성 억제능을 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물 및 양성 대조군인 하이드로퀴논과 비교하여 측정하였다.

C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM에 10% 우태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoylphorbol)-13-아세테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음, 이틀째부터 3일 연속으로 각 시험물질을 가하여 배양하였다. 시험물질로는 하이드로퀴논과 상기 실시예 1 및 2, 비교예를 각각 10ppm의 농도로 하여 사용하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다(Dooley의 방법).

시험물질	멜라닌 생성 억제율 (%)
비처리군	100
하이드로퀴논(양성 대조군)	41.1
실시예 1	36.1
실시예 2	38.7
비교예	18.3

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 공지된 미백 물질인 하이드로퀴논과 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 그리고 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 우수한 맬라닌 생성 억제율을 보임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 내 멜라닌 생성을 효과적으로 억제함으로써 미백 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

[시험예 5] 피부 보습 시험(인간 각질 형성 세포의 분화 유도 시험)

상기 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물의 피부장벽기능 및 피부 보습능을 확인하기 위하여 흡광도를 이용한 시험을 실시하였다.

먼저, 일차 배양한 인간의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 실시예 1 및 2, 비교예를 하기 표 5와 같이 조성된 배양액에 첨가하여, 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확(cell harvest)하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 뒤, 2% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1㎖를 가하여 3분간 소니케이션(sonication)을 수행하고 난 후, 10분간 끓였다. 이를 1200rpm으로 30분간 원심 분리를 하여 분리한 침전물을 다시 PBS 1㎖에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다.

이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액 일부를 취하여 단백질 함량을 측정하여, 세포 분화 정도의 평가시 기준으로 삼았다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘 농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 시험 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시험물질	사용농도	각질형성세포에서의 분화능 (%)
대조군	Low Ca2 +(0.03 mM)	100
	Hign Ca2 +(1.2 mM)	206
실시예 1	0.1 ppm	178
	0.05 ppm	151
실시예 2	0.1 ppm	183
	0.05 ppm	166
비교예	0.1 ppm	142
	0.05 ppm	120

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 각질형성세포 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)의 양을 측정하여 세포분화 촉진효과를 비교한 결과, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 각질형성세포에서 분화를 촉진할 뿐만 아니라 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 우수한 효능을 보임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 피부의 장벽 기능을 강화하고 피부 보습능을 증진시킴을 알 수 있다.

[제조예 1 및 2, 비교제조예 1 및 2]

상기 실시예 1 및 2, 비교예에서 제조된 추출물을 함유하는 조성물을 하기 표 6의 조성에 따라 통상적인 방법으로 혼합하여 제조하였다.

배합성분	제조예 1	제조예 2	비교제조예 1	비교제조예 2
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100
실시예 1	0.1	-	-	-
실시예 2	-	0.1	-	-
비교예	-	-	-	0.1
식물성 경화유	1.50	1.50	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60	0.60	0.60
글리세롤 스테아레이트	1.00	1.00	1.00	1.00
스테아릴 알코올	2.00	2.00	2.00	2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 & 소디움 스테아로일 락틸에이트	1.00	1.00	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜	1.50	1.50	1.50	1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드	11.00	11.00	11.00	11.00
사이클로메디콘	6.00	6.00	6.00	6.00
방부제, 향	적량	적량	적량	적량
트리에탄올 아민	0.1	0.1	0.1	0.1

(단위: 중량%)

[시험예 6] 피부 수분 지속력 측정

1회 도포시 피부 수분 변화량 및 지속력을 측정하기 위해 상기의 표 6의 조성에 따라 통상적인 방법으로 제조한 제조예 1~2 및 비교제조예 1~2의 수분 증가량을 수분측정기(corneometer)를 이용하여 평가하였다.

먼저, 30세 이상의 여성 25명을 선정하여 양쪽 전박을 흐르는 물에 세정하게 한 뒤, 손목으로부터 5cm 거리의 부위에 지름 1.5cm의 원으로 시험부위를 표시하였다. 피험자들을 23±1℃ 및 45±5% RH가 유지되는 항온-항습실에서 30분간 대기시킨 후 수분측정기(CM825, Courage & Khazaka, Germany)로 시험부위의 수분 함량을 하기의 방법으로 측정하였다.

<수분측정기 측정방법>

피부 표피 내에 존재하는 수분의 양을 센서를 이용하여 수분의 이온정도를 측정, 이를 수치화하여 수분의 양을 계산함으로써 보습력을 측정하였다.

1. 측정하고자 하는 피부부위에 수분측정기(corneometer)의 프로브를 올려놓았다.

2. 프로브를 피부에 누르면 센서를 통하여 피부 전기 전도도(capacitance)가 수치화되어 화면에 표시되었다.

3. 측정부위를 달리 하여, 측정을 반복하였다.

4. 1회 측정 후, 킴와이프와 같은 휴지로 센서를 닦은 후, 재측정하였다.

그 후에 양쪽 전박에 각각 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2를 시험부위에 동일양 도포하여 흡수시킨 후, 항온-항습실에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 경과시 시험부위의 수분 함량을 측정하였다. 수분 함량 증가율은 제조예 1~2 및 비교제조예 1~2를 도포하기 전 상태대비 계산된 수치이며, 표 7 및 도 1에 평균결과를 나타내었다.

	도포 전	30 분	1 시간	2 시간	4 시간	6 시간
대조군 (무도포)	26.20	26.11	26.21	26.15	26.19	26.17
제조예 1	26.22	42.23	40.44	38.72	36.94	34.57
제조예 2	26.17	42.81	41.51	40.17	38.93	36.66
비교제조예 1	26.19	29.20	27.55	26.12	25.6	25.1
비교제조예 2	26.21	37.21	36.22	33.14	29.25	27.22

상기 표 7과 도 1에서 알 수 있듯이, 발아 인삼씨 추출물이 함유된 제조예 1~2를 도포한 경우, 일반 인삼씨 추출물을 함유한 비교제조예 2의 처방을 1회 도포시보다 피부에 더 높은 수분량이 오랫동안 지속된다는 것을 볼 수 있다. 특히 발아 아임계 인삼씨 추출물을 사용한 제조예 2의 경우 도 1에 나타난 바와 같이 제조예 1 보다 우수한 피부 수분 지속력을 나타냄을 확인할 수 있다.

[시험예 7] 피부 보습효과 측정

장기적인 피부 보습력 개선효과를 측정하기 위하여 TEWL(경표피수분손실, Trans Epidermal Water Loss)를 측정하였다. 이때 상기 시험예 6과 동일한 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2를 사용하여 시험을 진행하였다.

먼저, 30세 이상 여성 30명에게 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2를 매일 2회 4주간 양쪽 뺨에 도포하도록 하고, 도포 전, 도포 후 2주, 도포 후 4주 경과한 시점에서 항온, 항습 조건 (24℃, 상대습도 40%)에서 하기 방법으로 TEWL(경표피 수분 손실, Trans Epidermal Water Loss)을 측정하였다.

<TEWL 측정 방법>

피부에서 증발하는 수분의 양을 면적과 시간에 따라 계산하여 증발하는 수분량을 온도와 보습 전자센서로 읽고 수치화하여 피부의 보습력을 측정하였다.

1. 환경조건: 온도, 습도가 일정하게 유지되고, 측정자와 피검자 외에 최소한의 인원만 남도록 했다. 이때, 가급적 공기의 흐름을 차단하였다.

2. TEWL 프로브를 피검자의 측정부위에 올려놓았다.

3. 측정부위에 프로브를 올려놓을 때 피부에 자국이 남을 정도로 무리한 힘이 가해지지 않도록 가볍게 올려놓고 지면과 90도의 각도를 이루도록 하였다.

4. 시간이 지날수록 피부의 TEWL 수치가 일정해지는 값을 약 1~3분간 측정하였다.

5. 프로브의 손잡이는 가급적 멀리 잡아서 측정자의 체온이 전해지지 않도록 주의하였다.

6. 면적 당 시간당 증발하는 수분량(g/m²/h)을 계산하였다.

측정된 TEWL을 통하여 보습력을 비교하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 제조예 1~2의 경우 비교제조예 2에 비해 수분 증발량이 현저히 줄었다는 것을 볼 수 있다. 즉, 2주 후에 일반 인삼씨 추출물을 사용한 비교제조예 2의 경우 피부 수분량이 약 104%로 줄었으나, 본 발명의 제조예 1~2의 경우 모두 125% 이상 유지되고 있었다. 특히 발아 아임계 인삼씨 추출물을 사용한 제조예 2의 경우 4주 경과 후에도 약 120%의 피부 수분을 유지하고 있어 우수한 피부 보습력을 가짐을 알 수 있었다.

[시험예 8] 피부 탄력 향상 효능 확인

사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 수분 증가량을 수분측정기(corneometer)를 이용하여 평가하였다.

30~40대의 건강한 여성 110명을 각각 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2의 4개 군에 대해 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면 왼쪽에 도포하게 한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 표 8의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8(R8(왼쪽)-R8(오른쪽)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과
제조예 1	69
제조예 2	73
비교제조예 1	52
비교제조예 2	58

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 제조예 1 및 2는 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 비교제조예 2를 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가된다. 따라서, 발명의 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

[시험예 9] 피부 주름 개선 효능 확인

본 발명의 조성물의 사람에 대한 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2를 이용하였다.

상기 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 110명을 각각 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2의 4개 군에 대해 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표 9의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후 임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
제조예 1	41	43.2	45	15.9	11
제조예 2	33	32.8	36	12.4	7
비교제조예 1	69	68.6	76	31.2	22
비교제조예 2	58	58.1	63	26.5	18

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값

R4: 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5: 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 제조예 1 및 2는 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 비교제조예 2에 비하여 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 알 수 있었다.

[시험예 10] 혈색 개선 효과

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물의 피부 혈액 순환 촉진 효과를 평가하기 위하여, LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)를 이용하여 피부에서의 혈액순환 정도를 측정하였다. LDPI는 피부에서의 혈액순환을 측정하는 기기로 널리 알려져 있고 현재 사용되고 있는 기기로서, 피부의 모세혈관에서 혈액의 속도 및 양 뿐만 아니라 소동맥과 소정맥에서의 흐름까지 측정해 낼 수 있는 매우 민감한 기기이다.

항온항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, LDPI를 이용하여 초기값을 측정하였다. 먼저 평소 손발이 차가운 여성 30명의 이마 아래 부분의 초기 혈류량을 LDPI로 측정하였다. 그런 다음 상기 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2를 1주일 동안 피시험자들에게 사용하도록 한 후에 측정한 혈류량과 상기 초기 측정값을 비교한 결과(피부 혈류량 변화)를 하기 표 10에 나타내었다.

화장료 사용 전후 LDPI 결과-피부 혈류량

시험물질	1주 사용 후 피부 혈류량 변화율(%)
제조예 1	11
제조예 2	14
비교제조예 1	1
비교제조예 2	5

상기 표 10의 결과에서, 본 발명의 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 제조예 1및 2는 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 비교제조예 2 보다 피부 혈류량을 현저하게 증가시키며, 이러한 혈액 순환 촉진을 통해 혈색이 개선되는 것을 확인할 수 있다. 이는 궁극적으로 본 발명에 의한 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 조성물이 피부의 영양분을 효과적으로 전달하고 피부 노화를 억제하며 지연시키는 데 기여할 수 있음을 시사한다.

[시험예 11] 피지 분비 억제 효과

<5α-리덕타아제 활성 억제를 통한 피부 과분비 억제 효과>

5α-리덕타아제 활성 억제 효과를 확인하기 위해서 HEK293-5αR2 세포에서 [¹⁴C]테스토스테론이 [¹⁴C]디하이드로테스토스테론(DHT: dihydrotestosterone)으로 변환되는 비율을 측정하였다. HEK293 세포에 p3 x FLAG-CMV-5αR2를 형질감염시켜서 24 웰 플레이트에 웰당 2.5 x 10⁵ 세포로 넣고 배양하였다(Park et al., 2003, JDS. Vol. 31, pp. 191-98). 다음날 효소 기질과 저해제가 첨가된 새로운 배지로 바꿔주었다. 배지의 기질로는 0.05μCi [¹⁴C]테스토스테론(Amersham Pharmacia biotech, UK)을 사용하였다.

5α-리덕타아제 활성 억제 정도를 확인하기 위해서 본 발명에 따른 발아 인삼씨 추출물인 실시예 1및 2와 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물인 비교예를 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 이 때 인삼씨 추출물을 넣지 않은 것은 음성대조군으로 사용하고, 피나스테라이드(finasteride)를 넣은 것을 양성대조군으로 사용하였다. 이 후 배양 배지를 수거하여 스테로이드를 800 ㎕ 에틸아세테이트로 추출한 다음 상부의 유기용매층을 분리하여 말린 후 남은 잔유물을 다시 50 ㎕ 에틸아세테이트로 녹여서 실리카 플라스틱시트 카이젤겔 60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254) 상에서 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 용매로 하여 전개하였다.

플라스틱 시료를 공기 중에서 건조한 후, 동위원소의 양을 측정하기 위하여 바스 시스템을 사용하였는데, 건조된 플라스틱 시트와 엑스레이 필름을 함께 바스 카셋트에 넣어 1주일 후에 필름에 남아있는 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 측정한 다음 하기 수학식 2 및 3에 따라 전환율 및 저해율을 각각 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

시험물질	전환율(%)	저해율(%)
음성대조군	48.0	-
양성대조군	27.6	42.5
실시예 1	32.2	32.9
실시예 1	29.8	37.9
비교예	41.1	14.4

상기 표 11의 결과에서, 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시켜 세포질 내에 있는 수용체 단백질과 결합해 핵 내로 들어가 피지선 세포를 활성화하고 분화를 촉진시켜 피지선 내에서 피지를 과분비시키는 역할을 하는 5α-리덕타아제의 활성을 본 발명에 의한 실시예 1 및 2의 발아 인삼씨 추출물이 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 효과적으로 억제함으로써 테스토스테론의 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 차단하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 조성물이 5α-리덕타아제의 활성을 효과적으로 억제시킴으로써 피지의 과분비를 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<피지 분비 억제 효과>

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 피지 분비 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 피지분비가 많다고 느끼는 피험자 남녀 30명을 선정하여 지정된 부위에 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 피지감소의 효과에 대한 판정은 피지량 측정기(Sebumeter SM810, C+K Electronic Co., 독일)를 사용하여 2주 및 4주 경과 후 평균 피지 감소율(%)을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

시험물질	피지 감소율(%)
	2주 경과 후	4주 경과 후
제조예 1	33	24
제조예 2	39	31
비교제조예 1	3	1
비교제조예 2	11	7

상기 표 12의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1 및 2의 발아 인삼씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 제조예 1및 2는 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 비교제조예 2보다 과잉으로 분비되는 피지를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 12] LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생합성 억제 효과

인체 섬유아세포(자체 일차 배양)를 105 개의 농도로 12공 평판배양기에 배양한 다음 LPS처리를 한 후, 실시예 1의 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물, 비교예의 일반 인삼씨 추출물 1 ppm, 50 ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) 웨스턴블랏(Westren blot) 방법을 사용하여 생성된 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 양을 정량하였다. 대조군을 100으로 하여 농도계(densitometer)로 측정한 값과의 비교치를 하기 표 13에 나타내었다. 이때 대조군은 인삼씨 추출물을 처리하지 않고 배양한 미처리군이다.

시험물질(농도:ppm)		COX-2 생합성(%)
실시예 1	50	35
	1	49
실시예 2	50	28
	1	41
비교예	50	52
	1	77
대조군	-	100

상기 표 13의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1의 발아 인삼씨 추출물과 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물은 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 염증반응 유발인자인 LPS로 유도된 사이클로옥시게나제-2의 생합성을 농도 의존적으로 감소시켜 염증반응을 억제함으로써, 피부 트러블 증상을 완화시킬 수 있는 효능을 나타내었다.

[시험예 13] 지질합성(Lipogenesis) 억제 시험

생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecos modified eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1×05 세포/웰로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 1㎍/㎖ 인슐린(insulin), 0.5mM IBMX 및 0.25μM 덱사메타손(dexamethasone)을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)로 분화 유도를 하고 실시예 1 및 2, 비교예 및 카페인(양성대조군)을 50μM씩 처리한 다음 처리 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.

본 발명에 따른 조성물의 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 수단 III 염색(S4136, sigma-aldrich)을 실시하였다. 지방 세포를 인산염 버퍼 내에서 4% 파라포름알데하이드(pH 7.2)로 상온에서 고정한 후에 PBS(phsphate buffered saline)로 수세해준 후에 수단 III으로 염색한 후에 사진을 찍어서 육안 비교하였다. 음성 대조군은 시험물질이나 비교물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 양성 대조군으로 카페인 50μM을 처리하였다. 지방 축적 억제 정도는 염색된 정도를 +++, ++, +, -로 나누어 등급을 부여하였다. 그 결과를 표 14에 나타내었다.

시료	저해율%
음성 대조군	+++
양성 대조군	+
실시예 1	+
실시예 2	++
비교예	-

상기 표 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 2에 따른 발아 인삼씨 추출물은 공지된 지질합성 저해 물질인 카페인과 동등하거나 그보다 우수한 지질합성 저해 효과가 있고, 비교예의 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 지질합성 저해 효과가 뛰어남을 알 수 있다. 따라서, 지질합성이 억제됨으로써 피지가 감소되어 여드름 발생을 억제할 수 있다.

[시험예 14] 여드름 개선과 피지분비 감소 및 자극 유무의 시험

여드름을 보유하고 있는 120명을 10명씩 3개 군으로 나누고 각각의 군에 해당하는 피험자에게 상기 제조예 1~2 및 비교제조예 1~2로부터 제조된 화장료 조성물을 한 달간 사용하게 하였다. 여드름 개선 척도는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기의 표 15에 10명의 평균점수로 표기하였다.

여드름 소멸 시기는 소멸이 판독된 일수를 기준으로 하였으며, 여드름 재발은 유무로 1개월 뒤의 결과를 기준으로 하였다. 피지 분비감소는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기 표 15에 10명의 평균점수로 표기하였다. 피부자극의 유무는 (자극반응을 보인 명수)/(총 시험자수)로 보았다.

	염증성 여드름 개선	면포성 여드름 소멸시기	여드름 재발	피지분비 감소	자극 유무
제조예 1	3.8	3.6	1.6	3.4	1.7
제조예 2	4.2	4.4	1.4	3.8	1.8
비교제조예 1	1.4	1.2	4.2	1.5	1.2
비교제조예 2	2.2	2.4	3.8	1.9	1.5

상기 표 15에 나타낸 바와 같이, 제조예 1~2는 비교제조예 1~2에 비해 여드름이 재발되지 않았고, 전반적으로 여드름 개선에 대해 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 발아 아임계 인삼씨 추출물을 함유하는 제조예 2는 발아 인삼씨 추출물을 함유하는 제조예 2보다 여드름 개선, 피지 분비 및 자극 완화효과에 있어서 모두 우수한 효과를 갖는다.

[시험예 15] 비듬균에 대한 항균효과

비듬원인균인 피티로스포룸 오발레를 대상으로 실시예 1 및 2, 비교예, 아연피리치온, 피록톤올아민 및 천연물로서 항비듬용 제품에 널리 사용되고 있는 티트리오일(Tea tree oil)의 항균효과를 최소성장억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 측정법을 이용하여 비교 시험하였다.

MIC 측정법은 다음과 같다.　각 시료를 액상배지에 일정농도 간격으로 희석한 후 피티로스포룸 오발레를 접종하여 배양한 다음, 시료농도별 균체의 성장 정도를 관찰하여 균 성장을 억제하는 최소농도를 판정하였다.

성분명	실시예 1	실시예 2	비교예	아연피리치온	프록톤올아민	티트리오일
MIC(ppm)	800~1000	700~850	1300~1500	5~10	100~200	800~1000

MIC 측정에 의하면, 실시예 1 및 2의 MIC는 대표적인 항 비듬균 소재인 아연피리치온이나 피록톤올 아민에 비해 낮은 것으로 나타났으나, 천연 티트리 오일의 MIC가 1000ppm인 것에 비하면 천연성분으로서는 상당히 우수한 것으로 나타났다.　또한, 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물인 비교예보다도 효능이 우수한 것으로 나타났다.이상의 실험 결과로부터, 발아 인삼씨 추출물은 인삼씨 추출물보다 염증억제효과가 우수하여 가려움 등 두피 트러블 증상 완화효과가 기대되며 화학합성 항균제인 아연 피리치온이나 피록톤올 아민에 비해 항균력은 낮은 것으로 나타났으나, 항균성 천연물로서 현재 많은 제품에 적용되고 있는 티 트리오일과 유사한 비듬균 성장억제 효과가 나타났다. 발아 인삼씨 추출물이 천연물로서 인체에 안전하기 때문에 그 사용량을 높일 수 있다는 점을 고려한다면, 항비듬 및 항가려움 원료로서 충분한 활용가치가 있다 할 것이다.

[제조예 3 및 4, 비교제조예 3]

상기 실시예 1 및 2와 비교예의 추출물을 함유하는 조성물을 하기 표 17의 조성으로 통상적인 방법에 따라 혼합하여 제조하였다.

성분 (중량%)	제조예 3	제조예4	비교제조예 3
실시예 1(발아 인삼씨 추출물)	0.1	-	-
실시예 2(발아 아임계 인삼씨 추출물)	-	0.1	-
비교예(일반 인삼씨 추출물)	-	-	0.1
카프릴릭카프릭트리글리세라이드	70	70	70
에탄올	10	10	10
물	잔량	잔량	잔량

[시험예 16] 탈모 방지 효과 시험

본 발명에 따른 조성물의 탈모 방지 효과를 시험하기 위하여 상기 표 17에서 제조된 조성물을 사용하여 초기 탈모 현상이 있는 피검자 30명을 대상으로 탈모 방지 효과에 관한 실험을 16주 동안 진행하였다. 상기 제조예 4 및 5와 비교제조예 6의 조성물을 1일 1회씩 16주 동안 사용한 후, 16주가 경과한 다음 머리를 감을 때 다시 탈락모를 수집하여 개수를 세었으며, 그 결과를 표 18에 나타내었다.

처리군	탈락모개수평균(개)/표준편차
대조군	82.80 / 10.32
제조예3	52.23 / 7.41
제조예 4	44.71 / 6.85
비교제조예 3	72.36 / 9.22

상기 표 18에 나타난 바와 같이, 발아 인삼씨 추출물을 함유한 조성물인 제조예 3 및 4를 처리한 경우 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물을 함유하는 비교제조예 3에 비해 탈락모의 개수가 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 17] 모발 광택 증진 효과

모발시료 0.1g을 샴푸 0.1g으로 세척한 후 흐르는 물에 깨끗이 씻은 다음, 모발시료를 25℃, 50% 습도 조건에서 6시간 건조시켰다. 그런 다음, 상기 표 17의 제조예 3 및 4와 비교제조예 3의 조성물을 각각 0.1g씩 도포하고, 다음과 같은 방법으로 코니어포토미터를 사용하여 광택을 측정하였다.

모발시료를 할로겐 램프가 장착되어 있는 코니어포토미터에서 광택을 측정하였다. 상기 코니어포토미터는 빛의 입사각은 30도이며, 0부터 90도까지의 반사된 값을 얻을 수 있다. 광택도는 아래와 같은 식으로 계산하였다.

광택은 난반사가 적고 정반사가 많이 일어날수록 좋은 결과를 보이는 것이며, 측정결과를 하기 표 19에 나타내었다.

처리군	d	Sf	G
대조군	6.49	68.41	10.54
제조예 3	6.32	110.23	17.44
제조예 4	6.29	137.52	21.86
비교제조예 3	6.43	92.3	14.35

상기 표 19의 결과로부터, 발아 인삼씨 추출물을 함유한 조성물인 제조예 3 및 4를 처리하였을 경우 비교제조예 3에 비해 모발 광택이 유의하게 개선됨을 확인할 수 있다.

[시험예 18] 지방세포 분화 촉진 효과 확인

인간의 골수 중간엽줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersbille, MD, USA)에서 구입하여 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 지방세포 분화는 인도메타신(indomethacin) 대신 트로글리타존(troglitazone, TRO)을 사용하여 중간엽줄기세포의 지방세포 분화를 유도한 점을 제외하고는 론자사에서 권장하는 방법을 사용하여 진행하였다. 구체적으로, 중간엽줄기세포의 배양액에 인슐린 1g/ml, 덱사메타손(dexamethasone, DEXA) 1M, 이소부틸메틸잔틴 (isobutylmethylxanthine, IBX) 0.5mM 및 TRO 2M을 넣고 배양하여 중간엽줄기세포를 지방세포로 분화시켰다. 실험군의 경우, 지방세포 분화 유도시에 실시예 1의 발아 인삼씨 추출물, 실시예 2의 발아 아임계 인삼씨 추출물, 비교예의 일반 인삼씨 추출물, 트로글리타존 (troglitazone), 글리벤클라마이드 (Glibenclamide) (Sigma-aldrich, U.S.A로부터 구입)를 각각 10M 처리 후 (10일 동안 이틀 간격으로 처리), 각각 10M을 배지에 첨가하였다. 중간엽줄기세포의 지방세포 분화 유도 10일 후, 세포 배양액을 제거하고 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세포를 세척한 뒤, 10% 포르말린/PBS 용액 0.2ml/cm²을 사용하여 세포를 10분간 고정시켰다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올 용액 0.5ml/cm²로 1회 세척하고, 오일레드오(Oil Red O)를 60% 이소프로판올에 녹인 염색액을 0.2ml/cm²로 10분간 지방세포 내의 지질체를 염색하였다. 염색된 오일레드오를 100% 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후, 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 20에 나타내었다. 각 데이터 값은 IDX (-) 음성 대조군으로 보정하였다.

처리군	Oil Red 상대적 염색 비율
대조군	1.00
실시예 1	2.75
실시예 2	3.12
비교예	1.54

상기 표 20에서 볼 수 있는 바와 같이 발아 인삼씨 추출물은 발아되지 않은 일반 인삼씨 추출물보다 지방세포의 분화 촉진효과가 우수함을 확인할 수 있었다 (P value <0.01).

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물을 화장료의 형태로 제형화할 경우, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스 또는 팩 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학조성물일 수 있다. 상기 약학 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 로션, 크림, 연고 또는 젤 등으로 제형화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 경피 투여되는 것이 바람직하다.

상기 약제학적 조성물의 유효성분인 발아 인삼씨 추출물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 투여량은 0.0001 mg/kg/일 내지 대략 2000 g/kg/일 범위이다.

하기에 본 발명에 따른 화장료 조성물 및 약학 조성물의 제형예를 설명하나, 하기 예시 이외에도 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 유연 화장수(스킨 로션)

하기 표 21에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
글리세린	3.5
올레일알코올	1.5
에탄올	5.5
폴리솔베이트 80	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 2] 영양 화장수(밀크 로션)

하기 표 22에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 3] 영양 크림

하기 표 23에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 4] 맛사지 크림

하기 표 24에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 맛사지 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 5] 팩

하기 표 25에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	적량
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 6] 국소 투여용 약제(패취제)

하기 표 26에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 패취제를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
발아 인삼씨 추출물	1.0
베타-1,3-글루칸	3.0
디에틸아민	0.7
아황산나트륨	0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)	1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 (Cetomacrogol 1000)	1.0
점성의 파라핀 오일	2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르 (Cetiol LC)	2.5
폴리에틸렌글리콜400	3.0
폴리아크릴산(Carbopol 934P)	1.0
정제수	잔량
계	100

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (6)

1. 발아된 인삼씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 트러블 증상의 억제 또는 완화용 피부 외용제 조성물로서,
   상기 피부 트러블 증상은 피부 염증 및 여드름으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 발아된 인삼씨 추출물은 발아된 인삼씨의 아임계 추출물인 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 발아된 인삼씨 추출물의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 1~50중량%인 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 발아된 인삼씨 추출물은 발아된 인삼씨의 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 아임계 추출물은 발아된 인삼씨를 아임계 추출장치에서 50~200MPa의 고압에서 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 사이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)의 생합성을 억제하여 피부 트러블 증상을 억제하거나 완화시키는 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.

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