JP5819966B2 - フィカス美容液画分を含有する化粧品組成物、及び過剰な色素沈着の発生を低減する方法 - Google Patents
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Description
本発明は様々な組成物に関し、より詳細には、皮膚表面に塗布するための組成物に関する。組成物は、限定するものではないが、溶液、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル、化粧水、スティック、ペンシル、スプレー、エアゾール、軟膏、クレンジング洗剤液及びクレンジング棒状固形物(cleansing liquid washes and solid bars)、シャンプー及びヘアコンディショナー、ペースト、フォーム、パウダー、ムース、髭剃りクリーム、ティッシュ、細片(strip)、パッチ、電気駆動パッチ、創傷被覆材及び粘着性包帯、ヒドロゲル、フィルム形成製品、顔及び皮膚マスク(不溶性シートを有する及び有さない)、ファンデーション、アイライナー及びアイシャドウ等の化粧品等の、非常に様々な製品形態を有し得る。組成物の形態は、組成物中に存在する場合、選択された皮膚科学的に許容可能な特定のキャリアに従い得る。
イチジク属(fig genus)のフィカスは、多数の種からなり、世界中に存在する。フィカス・イチジク属(Ficus genus)は、イチジク種、サボテン科オプンティア属団扇サボテン(L.)ミル(prickly pear cactus Opuntia ficus-indica (L.) Mill)、サボテン科(Barbera et al.,Past and Present Role of the Indian−fig Prickly−Pear(Opuntia ficus−indica(L.)Miller,Cactaceae)in the Agriculture of Sicily.Economic Botany 46(1):10〜20.1992.)と混同されるべきではない。有名なイチジク種としては、フィカス・カリカ(Ficus carica)(一般的なイチジク)、フィカス・レリジオサ(Ficus religiosa)(仏陀が「真理」を探り当てた際に、彼をかくまったインドボダイジュ)、フィカス・エラスチカRoxb(Ficus elastica Roxb.)例えば、ホルネウム(exHorneum)(ゴムの木)、フィカス・バンヤンシス(Ficus behghalensis)(バンヤンノキ)及びフィカス・ラセモーサ(Ficus racemosa)(グロメラータ(glomerata)と同義、大きな房状の木)が挙げられる。
例えば、溶媒抽出による方法など、植物由来の諸化合物を分離するのに用いられる方法により、単離される化合物が決定されることになる。いずれかの特定の抽出技術により結果として得られる諸化合物の種類と数とは、「同類のものは同類のものを溶解する」という一般的原理に従って、抽出溶媒の選定によって決定されるところが大きい。例えば、極性化合物は、極性溶媒を用いることによって抽出されるが、非極性化合物は、非極性溶媒を用いることによって抽出される。このことによって、結果的に、存在するであろう全スペクトルの化合物から狭いスペクトル範囲の化合物のみが単離される。溶媒の極性と、典型的には、従来の溶媒抽出法を用いて単離された原料の種類との間の相互関係は、下図によって表される(Houghton & Raman,Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts(1998))。
得られるFSFは、化粧品成分としての使用に望ましい特性を示す。これらの特性には、安定性、水溶性、フェオホルビド及びタンパク質等の望ましくない物質が存在しないこと、より明るい色、より大きい固形分含量、及びフェニルアラニン等の望ましい化合物がより高濃度で存在すること、が包含される。
本発明の諸FSFは、更に、水溶性である。本明細書で用いられる「水溶性である」は、それらFSFが、いかなる割合ででも(STP下で)水と混和することを意味する。FSFは水溶性であるため、フィカスを含有する組成物の配合柔軟性がより高くなる。例えば、水性の製剤は、感触がベタベタせず、望ましい展延性をもち、触感が軽やかであり、及び皮膚表面からの除去(例えば、洗浄すること)が容易であるために、消費者によってしばしば所望される。
FSFは、また、フェオホルビド、タンパク質、及びフィカスなどの植物中に一般に見出だされる諸物質を実質的に含有していない。これらの物質は、敏感な人に毒性及び/又はアレルギー反応等の安全上の懸念を与えることが知られている。植物に通常見出だされる濃度では、これらの物質は、典型的には、懸念を引き起こすものではない。しかし、例えば、加工処理によって、植物原料が濃縮されるとき、相対的に濃度が劇的に増大して、安全上の懸念を生じる場合がある。いたがって、これらの物質を含有しない組成物は、非常に好ましい。
FSFは、従来のフィカス抽出物に比べ、より明るい色を有する。FSFは、8未満の、幾つかの態様では、7.5未満のガードナーカラー値を有する。特定の態様では、5〜8の、他の態様では、6〜8の、他の態様では、6.5〜8のガードナーカラー値を有する。図8は、14日間の経時促進試験におけるFSFの色差と乾燥フィカス葉抽出物の色差との比較を示す。図10は、様々な濃度の安定剤/保存料を添加した溶媒に含有させた場合の0.55% FSFの色差を示す。図9は、図8の経時促進試験の分析用に作図された検量線図である。
固形分は、FSF又は抽出物の生理活性部分を含有する。したがて、固形分含量が高くなるほど、植物の活性も高くなる。FSFは、従来の水溶性フィカス抽出物と比べて、より高い固形分含量を有する。FSFは、FSFの5重量%超の固形分(乾物)含量を有し、特定の態様では、5重量%〜20重量%、又は5重量%〜10重量%の固形分含量を有する。
FSFは、皮膚中の色素沈着を制限するものと認識されている少なくとも4種類の異なる作用機構を示す。これらの機構は、チロシナーゼ阻害、トリプシン阻害、COX−2阻害、及び酸化防止活性である。1つの態様では、FSFは、次の色素沈着低減活性:チロシナーゼ阻害IC50(%DM)0.003〜0.06;トリプシン阻害IC50(%DM)0.02〜0.5;COX−2阻害IC50(%DM)0.02〜1;DPPH分析によって測定される酸化防止剤の過酸化物排除能力(1/x DM)1〜15、及び/若しくはORAC分析によって測定される酸化防止剤過酸化物排除能力(1/x DM)0.2〜5の、少なくとも1つを有し、他の態様では少なくとも2つを有し、又は少なくとも3つを有する。本明細書で用いられる「DM」は、乾物(「固形分」)であり、「ORAC」は、酸素ラジカル吸収能であり、また、「DPPH」は、フリーラジカル排除能力の測定である。
幾つかの態様において、組成物中には、FSFと組み合わせて皮膚トーン剤を含有させることが望ましいことがある。皮膚トーン剤は、全体的な皮膚色調を更に改善するよう含められてもよい。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約50重量%、40重量%、30重量%、20重量%、10重量%、5重量%又は3重量%迄の皮膚トーン剤を含有する。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の少なくとも約0.001重量%、0.01重量%、0.1重量%、0.2重量%、0.5重量%又は1重量%の皮膚トーン剤を含有する。好適な範囲は、組成物の約0.1重量%〜約50重量%、約0.2重量%〜約20重量%、又は約1重量%〜約10重量%の皮膚トーン剤の好適な範囲を含む、下限及び上限の任意の組み合わせを含む。皮膚トーン剤の効力はかなり多様であるため、皮膚トーン剤の最適な量は選択される特定の活性物質によって異なり、本明細書に列挙した量は、規準としてのみ使用されるべきである。
色素沈着過剰は、皮膚炎症から生じ得る。色素沈着過剰、より詳細には炎症後色素沈着過剰を引き起こす一過性炎症事象としては、挫創病変、内方発育毛、引っ掻き傷、虫刺され、界面活性剤損傷、アレルゲン、及び短時間の紫外線暴露が挙げられるが、これらに限定されない。炎症後色素沈着過剰を含む、炎症誘導による色素沈着過剰は、本発明の組成物中に抗炎症剤を組み込むことにより対処することができる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約20重量%、10重量%、5重量%、3重量%又は1重量%迄の抗炎症剤を含有する。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の少なくとも約0.001重量%、0.01重量%、0.1重量%、0.2重量%、0.3重量%、0.5重量%又は1重量%の抗炎症剤を含有する。好適な範囲は、下限と上限との任意の組み合わせを含む。好適な抗炎症剤には、非ステロイド系の抗炎症剤(イブプロフェン、ナプロキセン、フルフェナム酸、エトフェナマート、アスピリン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、ピロキシカム及びフェルビナクが挙げられるが、これらに限定されないNSAIDS)、グリシルリジン酸(グリシルリジン、グリシルリキシン酸(glycyrrhixinic acid)及びグリシルレチン酸グリコシドとしても知られている)及びグリシルリジン酸二カリウム等の塩、グリシルレテン酸(glycyrrhetenic acid)、甘草抽出物、ビサボロール(例えば、αビサボロール)、マンジスタ(キイチゴ属の植物、特にクルマバアカネ(Rubia cordifolia)から抽出される)、及びガッグル(guggal)(コミフォラ属の植物、特にコミフォラムクリ(Commiphora mukul)から抽出される)、コーラノキ抽出物、カミツレ、ムラサキツメクサ抽出物、及びムチサンゴ(sea whip)抽出物(ヤギ目の植物からの抽出物)、上記のいずれかの誘導体、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。
本発明の組成物は、1つ以上の日焼け止め活性物質(日焼け止め剤)及び/又は紫外線吸収剤を含んでよい。本明細書において、「日焼け防止活性物質」は、集合的に、日焼け防止活性物質、日焼け止め剤、及び/又は紫外線吸収剤を包含する。日焼け止め活性物質には、日焼け止め剤と物理的日焼け防止剤の双方が含まれる。日焼け止め活性物質は、有機又は無機であってよい。好適な日焼け止め活性物質の例は、「日焼け止め剤」としてPersonal Care Product Council’s International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,Thirteenth Editionに開示されている。特に好適な日焼け止め活性物質は、2−エチルヘキシル−p−メトキシシンナメート(PARSOL(商標)MCXとして市販)、4,4’−t−ブチルメトキシジベンゾイルメタン(PARSOL(商標)1789として市販)、2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン、オクチルジメチル−p−アミノ安息香酸、ジガロイルトリオレエート、2,2−ジヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン、エチル−4−(ビス(ヒドロキシプロピル))アミノベンゾエート、2−エチルヘキシル−2−シアノ−3,3−ジフェニルアクリレート、2−エチルヘキシルサリチレート、グリセリル−p−アミノベンゾエート、3,3,5−トリ−メチルシクロヘキシルサリチレート、アントラニル酸メチル、p−ジメチル−アミノ安息香酸又はアミノベンゾエート、2−エチルヘキシル−p−ジメチルアミノベンゾエート、2−フェニルベンゾイミダゾール−5−スルホン酸、2−(p−ジメチルアミノフェニル)−5−スルホンベンゾオキサゾイン酸、オクトクリレン、酸化亜鉛、ベンジリデンカンファー及びその誘導体、二酸化チタン、並びにこれらの混合物である。
本発明の組成物は、本発明の利益を受け入れ難いほど変更しなければ、様々な他の成分を含有することができる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約0.0001重量%〜約50重量%、約0.001重量%〜約20重量%、又は代替的に約0.01重量%〜約10重量%の任意構成成分を含有することができる。本明細書に列挙した量は規準としてのみ使用されるべきであり、組成物中に使用される任意構成成分の最適な量は、それらの効力がかなり多様であるため、選択される特定の活性物質に依存するであろう。したがって、本発明において有用ないくつかの任意構成成分の量は、本明細書に列挙した範囲外であり得る。
本発明の組成物は、組成物用の皮膚科学的に許容可能なキャリア(「キャリア」と称してもよい)も含有し得る。本明細書で使用するとき、「皮膚科学的に許容可能なキャリア」という語句は、キャリアがケラチン組織への局所塗布に好適であり、良好な審美特性を有し、組成物中の活性物質と適合性があり、安全性又は毒性についていかなる不当な問題も起こさないことを意味する。一態様において、キャリアは、組成物の約50重量%〜約99重量%、約60重量%〜約98重量%、約70重量%〜約98重量%、又は代替的に約80重量%〜約95重量%の濃度で存在する。
以下は、本発明の組成物の非限定的な実施例である。これらの実施例は単に説明のために示すものであり、本発明を限定するものと解釈すべきでなく、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの改変が可能であり、当業者にはこれらのことが理解されよう。実施例においては、特に指定のない限り、全ての濃度が重量%として列挙されており、希釈剤、充填剤などの微量物質は除外し得る。そのため、列挙した配合は、列挙した成分及びこのような成分に関連するいかなる微量物質をも含む。当業者にとって明白なように、このような微量物質の選択は、本明細書に記載したように本発明を作るために選択した特定成分の物理的及び化学的特質によって変わることになる。
*2−SEPPIC,Franceから入手可能なSepiwhite。
*3−Cognis GmbHから入手可能なEmulgade PL 68/50。
*4−SEPPIC,Franceから入手可能なSepigel 305。
*5−Dow Corning,Inc.,Midland,MIから入手可能なDow Corning DC1503。
本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚(特にヒト皮膚、更には顔面皮膚及び手皮膚)を美白化するのに有用である。それら組成物は、とりわけ、色素沈着の過剰な皮膚領域を美白化するのに有用である。
本発明は、メラニン合成(メラニン合成)における1つ以上の段階を阻害するために、色素沈着の過剰な領域に本化粧品組成物を局所適用することによって、皮膚の色素沈着が過剰な外観を低減する方法にも関する。本化粧品組成物は、酵素阻害(トリプシン阻害活性及び/若しくはチロシナーゼ阻害活性)、酸化防止活性(ORAC及びDPPH)、並びに/又はCOX−2阻害をもたらし、それによって、メラニン合成における1つ以上の段階を阻害する。
本発明の組成物は、所与の製品の種類に従来用いられる他の様々な成分を、それらが本発明の効果を容認し難いほど変更しないという条件で含有してもよい。本組成物には、皮膚科学的に許容されるキャリアを含有させることができる。
本発明の組成物は、一般に、局所塗布組成物を製造する技術分野において既知であるような従来の方法によって調製される。このような方法は、通常、加熱、冷却、真空の適用などを用いて又は用いずに、成分を1つ以上の工程で混合して比較的均一な状態にするものである。組成物は、好ましくは、安定性(物理的安定性、化学的安定性、光安定性)、及び/又は活性物質の送達を最適化するように調製される。この最適化には、適切なpH(例えば7未満)、活性剤と錯体になり、ひいては安定性又は分配にマイナスの影響を与え得る物質の排除(例えば汚染鉄の排除)、錯体形成を防止する手法(例えば適切な分散剤又は二重区画包装)の使用、適切な光安定性の手法(例えば日焼け止め剤/日焼け防止剤の組み込み、不透明包装の使用)の使用などが含まれてもよい。
1つの態様において、使用者は、処置するにあたり色素沈着の過剰な箇所を選択し、次いで、第1の組成物を、1日に少なくとも1回、より好ましくは1日に2回、少なくとも約4週間の間、その色素沈着の過剰な箇所に適用する。もう1つの態様において、第1の組成物は、選択された色素沈着の過剰な箇所に少なくとも約8週間にわたって適用される。第1の組成物は、いかなる形態であってもよい。1つの態様において、本組成物は、色素沈着の過剰な箇所に目薬の容器を用い局所的に適用される溶液の形態である。色素沈着の過剰な箇所に第1の組成物を局所適用することのできる他の塗布器を用いてもよい。例えば、フォームアプリケータ又は綿棒であって、溶液、ローション、又は本明細書に記述される他の形態のような第1の組成物を放出可能なように保持するものを用いて、色素沈着の過剰な箇所に本組成物を適用することができる。もう1つの態様において、本組成物は、1箇所以上の色素沈着の過剰な部位に、より一般的には1箇所以上の顔面皮膚の表面に同時に(すなわち、同一の治療周期内で)適用される。
フィカス・ベンガレンシスの新鮮な葉から得られる生理活性をもつ美容液画分の調製。
図1は、新鮮なフィカス葉から生理活性をもつ美容液画分を調製するためのプロセスの1つの態様を示す概略図である。
**)Y−乾燥重量で1単位の(R)−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
フィカス・ベンガレンシスの細胞汁から得られた美容液画分の特性及びインビトロ活性の比較
新鮮なフィカス葉を様々な場所で収集し、次いで、実施例1に記述されるように細胞汁に加工処理した。この細胞汁を凍結させ、次いで、15リットルの矩形HPDE容器内に−30℃で保管した。実施例1に記述されるのと同一の手順を用いて、同時に1個以上の容器の凍結細胞汁を美容液画分に加工処理した。
乾燥したフィカス・ベンガレンシス葉の水抽出物の調製
空気乾燥したフィカス・ベンガレンシス葉(実施例1で用いられたバッチと同一バッチの葉から収集された)50gを、GM200 Grindomix knife mill(Retsch,Germany)で粉砕して、300μm未満の粒径を有する粒子を得た。粉砕工程は、2,500rpmで20秒、次いで、2,500rpmで10秒、次いで、10,000rpmで10秒から構成した。粉砕した葉を、OMNI Programmable Digital Homogenizer(OMNI International(Kennesaw,GA))により脱イオン水と均質化させた。粉砕した葉35gを水490gと混合し、次いで、ホモジナイザー・プラットホーム上の氷浴に入れた。20mmホモジナイザー・ジェネレイターを用いて、15,000rpmで15分間均質化させた。次いで、イニシエータ2集束マイクロ波プロセッサー(Biotage AB(Uppsala,Sweden))により、ホモジネートを90℃で1分間マイクロ波処理した。マイクロ波処理した原料を、次いで3,200gで30分間遠心処理した。次いで、上澄み液は、真空下で3層のWhatman No:2ペーパーにより濾過し、次いで、塩酸(HCl)を滴加してpH 4.0に調整した。pH調整したろ液を、3,200gで30分間、遠心処理し、次いで、上澄み液を、真空下で0.2μm滅菌フィルターにより濾過した。サンプルに、安定剤:メタ重亜硫酸ナトリウム0.2%、ソルビン酸カリウム0.1%、クエン酸0.1%、安息香酸ナトリウム0.1%を添加した。混合物は、完全に溶解するまでインキュベートした(30分以上)。得られた乾燥葉の水抽出物は、バイアル瓶に入れ、次いで、暗所で室温で保存した。乾燥させたフィカス葉の水抽出物の、特性とインビトロ活性とを表8に示す。
**)X−乾燥重量で1単位のDPPHを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
***)Y−乾燥重量で1単位の(R)−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
**)X−乾燥重量で1単位のDPPHを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
***)Y−乾燥重量で1単位の(R)−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
様々なフィカス種及び場所から得られた美容液画分の特性並びにインビトロ活性
インド及びフロリダ(USA)で収集されたフィカス・ベンガレンシスの新鮮な葉に加えて、次のフィカス種の新鮮な葉を分画し、美容液画分を得た:フィカス・カリカ(Ficus carica)、フィカス・エラスチカ(Ficus elastica)、フィカス・ミクロカルパ(Ficus microcarpa)、及びフィカス・トリゴーナタ(Ficus trigonata)。プエルトリコで生育したフィカス・トリゴーナタを除き、これらのフィカス種はフロリダ(USA)で生育した。
**)X−乾燥重量で1単位のDPPHを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
***)Y−乾燥重量で1単位のト(R)−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
従来のフィカス抽出物対フィカス美容液画分(フィカス・ベンガレンシス)のLC/UV/MSクロマトグラムの比較
フィカス抽出物及びFSFの成分を、240〜500nmでのUV検出と、C18カラムでのLC分離後の、陽イオン(m/z 150〜1150)モード及び陰イオン(m/z 100〜1100)モードの両方のモードでのエレクトロスプレー質量分析とによって検出した。四極子MSで利用されるスパン速度が高速であることから、主成分、及び/又は高イオン化効率を有する成分のみが、マスクロマトグラムで観察された。フィカス美容液画分から得たフィカス抽出物をTOF/MSによって分析し、次いで、この抽出物の質量とインソース・フラグメンテーションのデータとに基づいて構造配置を行った。
フィカス美容液画分サンプルの調製:
FSFを、実施例1のように調製した。FSFサンプルは、90:10の水:DMSOで50倍に希釈し(20μLサンプル+100μL DMSO+880μL水)、次いで、以下の条件に従って、LC/UV/MSによって分析した。最終サンプル中のおおよその固形分は約1.26mg/mLであった。
サンプル10.64mgを秤量して、4mLガラスバイアル瓶に入れた。そのバイアル瓶に、DMSO 1.064mLを添加し、30分間音波処理を行い、次いで、時々、ボルテックスして混合した。このサンプル100μLを、4mLのガラスバイアル瓶に添加し、次いで、900μLの水で希釈する。最終サンプル中のおおよその固形分約1mg/mL。
メラニン合成
B16−F1マウス黒色腫細胞株をアッセイに使用する。B16−F1細胞は、American Tissue Culture Collection,Virginia,USAから得られる。アッセイに使用する細胞培養液には、500mLのDulbecco改変イーグル培地(DMEM)、50mLのウシ胎児血清(FBS)、及び5mLのペニシリン−ストレプトマイシン液を含有させる。この培地で培養し、集密度90%まで増殖させたB16−F1細胞は、メラニンを合成する。任意の理論により束縛されるものではないが、メラニン合成は、培養液により及び/又は高培養密度まで増殖させることより誘導されるストレスにより刺激されるものと仮定される。DMEM及びFBSはAmerican Tissue Culture Collectionから入手でき、ペニシリン−ストレプトマイシン液はInvitrogen,Inc.,California,USAから入手できる。分析に使用した装置としては、Formaシリーズのモデル3110(Therma Scientific(Massachusets,USA))などのCO2定温器;Bright Lineモデル(Hauser Scientific(Pennsylvania,USA))などの血球計算板;及びSpectraMax250(Molecular Devices(California,USA))などの紫外線可視光スペクトルプレートリーダーが挙げられる。アッセイは、次の工程を包含する。
チロシナーゼ阻害
チロシナーゼは、メラニン生合成において重要な酵素である。この分析によって、マッシュルーム・チロシナーゼ酵素のもつ、L−チロシンをL−ジヒドロキシフェニルアラニン(L−DOPA)に転化する能力を妨げることのできる薬剤を同定することができる。
チロシナーゼ酵素:マッシュルーム・チロシナーゼ(Sigma−Aldrich(Missouri,USA)より入手可能)
酵素基質:L−チロシン(Sigma−Aldrich(Missouri,USA)より入手可能)
緩衝液:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Invitrogen(California,USA)より入手可能)
陽性対照:4−ヒドロキシフェニル−β−D−グルコピラノシド(アルブチン)(Sigma−Aldrich(Missouri,USA)より入手可能)
ジメチルスルホキシド(DSMO)(Sigma−Aldrich(Missouri,USA)より入手可能)
Falcon(登録商標)1172 Microtest(商標)(非組織培養処理された、透明な平底の96ウェルプレート)
潜在的チロシナーゼ阻害物質
ウェルプレートリーダー:Spectra MAX Plus(Molecular Devices(California,USA)により入手可能)
データ収集及び解析のソフトウェア:SoftMax Pro(Molecular Devices(California,USA)により入手可能)
試薬及び陽性対照の調製
1X PBS 100mLにL−チロシン0.01812gを添加し、1mMの酵素基質の希釈標準液を調製する。L−チロシンが溶解するまで、音波処理する。必要に応じてボルテックスする。使用しないとき、4℃で保存する。
適切なブランクとして、各試験プレートには1X PBS緩衝液を200μLずつ3ウェルに添加する。
色素沈着の減少及びメラニン均一性に関するインビボでの試験
270人の被験者に対し、顔面の領域を分割し、1週間の標準化期間を含む、ラウンドロビン式の9週間のインビトロ試験を対溶媒対照群で実施した。270名の被験者を、以下を含む包含/除外基準に従ってスクリーニングした。
顔の両側の頬の周辺及び/又は眼窩周囲の範囲に、色素沈着を有する。
アトピー、湿疹、乾癬、又は他の慢性皮膚疾患を有すると診断されている。
次の分析法を用いて、諸実施例に記載の様々な物理特性及び化学特性を決定した。
液体サンプルの重量を、液体成分を蒸発させた後の乾燥残渣の重量と比較して乾物濃度(%)を測定した。手順において、使い捨てのアルミニウム秤量皿、Ohaus Explorer E00640天秤(Ohaus社(Pine Brook,New Jersey)より入手)、及びShel Labモデル1400Eオーブン(VWR(West Chester,Pennsylvania)より入手)を用いた。105℃に設定したオーブンでサンプルを12時間乾燥させた。液体サンプルを収容している容器の重量から容器重量を減じて、「湿潤」重量を得た。乾燥後の同一サンプルを収容している容器の重量から容器重量を減じて、「乾燥」重量を得た。すなわち、乾物濃度は、「乾燥」重量を「湿潤」重量で割り、100%をかけた値に相当する。
色(0〜18のガードナースケール)は、Lovibond Comparator 3000装置(Tintometer Limited(Salisbury,UK))を用い、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、透明のガラス管に入れた試験物品の色を、装置の2個のホイール中に設置した着色ガラス基準と比較することによって測定した。
オスモル濃度は、溶液の凝固点降下を測定し、純溶媒の凝固点と比較することによって決定した。この測定は、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、Advancedモデル3250 Single−Sample Osmometer(Advanced Instruments社(Norwood,MA))で実施した。
屈折率は、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、外部温度制御サーキュレータを取り付けたArias 500屈折計(Reichert Analytical Instruments(Depew,NY))で測定した。
UV吸収スペクトルにおけるピーク、谷、及び変曲点を、セルホルダーに流体ジャケットを備え、外部温度制御サーキュレータが装備されたUltrospec 4300 pro UV/可視分光光度計(Biochrom社(Cambrideg,United Kingdom))により測定した。脱イオン水で希釈したサンプルの測定には、光学距離が1cmの石英キュベットを用いた。測定器制御及びデータ解析は、SWIFT IIソフトウェア・スイート(Biochrom社)のウェブスキャン・アプリケーションにより行った。
エラスターゼ阻害活性は、96ウェルマイクロタイタープレート(Corning 3641)(Corning社(Corning,NY))及びSynergy 2マイクロプレートリーダー(BioTek Instruments社(Winooski,VT))に用いるのに適した動的比色解析法により測定した。基質開裂時の酵素活性は、黄色の呈色により示され、波長410nmでの吸光度の増大として測定された。N−メトキシスクシニル−Ala−Ala−Pro−Val−pNA基質(EPC FH237)及びエラスターゼ(EPC SE563)は、EPC(Elastin Products Company社(Owensville,MO))から入手した。各々のウェル中の反応容積は、200μLであり、エラスターゼ濃度は0.87U/mLであり、基質は363μMであった。本手順は、Elastin Products Company,Inc.Research Biochemicals Catalogue(2004年,全92頁)の第84頁の表題「Assay with N−MeO−Suc−Ala−Ala−Pro−Val−pNA(EPC No.FH237)as substrate」の方法を改変させたものであった。
シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害活性は、Cayman Chemicals COXインヒビタースクリーニング用ELISA分析キット560131によって測定された。
酸化防止活性は、Synergy 2マイクロプレート・リーダー(BioTek Instruments社(Winooski,VT))を用い、BioTekから入手可能な「Performing Oxygen Radical Absorbance Capacity(ORAC)Assays with Synergy HT Multi−Detection Microplate Reader」(www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf)に記載の使用方法に改変を加えたORAC試験により測定した。この分析において、AAPH(2,2’−アゾビス2−アミノ−プロパン)は、蛍光プローブ(フルオレセインナトリウム)を損傷させる活性酸素種を生じる。(R)−トロロックスメチルエーテルなどの酸化防止剤は、この損傷を防止するか又は減速させる。これらの効果は、蛍光発光を測定することによって定量化することができる。励起波長は485nmに設定し、かつ蛍光波長は528nmに設定し、反応溶液量は200μL、AAPH濃度は55mM、フルオレセインナトリウム濃度は1.33μM、及び(R)−トロロックスメチルエーテル濃度範囲は80μM〜2μMで蛍光を読み取った。フルオレセインナトリウム(Fluka 46960)、AAPH(Sigma 440914)及び(R)−トロロックスメチルエーテル(Fluka 93509)はSigma−Aldrich(St.Louis,MO)から得た。AUC(曲線下面積)値は、比率(ウェルの現在の蛍光読取り値をウェルの最初の蛍光読取り値で除したもの)の合計として計算した。(R)−トロロックスメチルエーテルを入れたウェルのAUC値と、試験化合物を入れたウェルのAUC値から、脱イオン水を入れたウェルの平均AUC値を減じて、酸化防止剤による蛍光発光の保護量に相当するAUCを得た。検量線は、(R)−トロロックスメチルエーテルの重量当量のORAC活性を示し、ウェルの酸化防止に関係するAUC関数として作成した。次に、1単位重量の(R)−トロロックスメチルエーテルにより得られる酸化防止効果と同等の酸化防止効果を得るのに必要とされる単位重量として、試験化合物のORAC活性を算出した。
ガラスコーティングされたポリプロピレン96ウェルマイクロタイタープレート(カタログ番号400 062)(SUN−SRi(Rockwood,TN))、及びSynergy 2マイクロプレートリーダー(BioTek Instruments社(Winooski,VT))を用い、フリーラジカル捕捉活性、すなわち、DPPH(2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル)のフリーラジカル捕捉活性を、速度論的比色分析法に改変を加え測定した。吸収波長は、515nmで測定した。各々のマイクロプレートウェル中の反応溶液量は200μLであり、DPPHの初期濃度は114μMであった。陽性対照としてL−アスコルビン酸を用いた。DPPH(Sigma D9132)及びUSP L−アスコルビン酸(Sigma A−2218)はSigma−Aldrich(St.Louis,MO)から入手した。反応の化学量論を計算し、1単位重量のDPPHをクエンチするのに必要とされる被験化合物の単位重量として表した。この方法では、W.Brand−Williams et al,published in LWT−Food Science and Technology,Volume 28,Issue 1,1995,pp 25〜30中の記事「Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity」に記載の手順を改変した。
1.12個の加熱ブロックを作動させ指定温度に加熱し、並びに冷蔵庫を作動させ、実験を行う前少なくとも4時間の間、指定温度で保持する。加熱ブロックに配置した12個のサンプルに加えて、1個のサンプルを室温で残し、また、もう1個は冷凍して、全部で14種の異なる温度を与える。それら温度は、5℃、室温(約23℃)、32℃、36℃、40℃、44℃、48℃、52℃、56℃、60℃、64℃、68℃、72℃及び75℃である。加熱ブロックは、20mLバイアル瓶に適合するように圧延されたアルミニウム製インサートブロックを備えている。これらのインサートブロックは、加熱ブロックの加熱されたポケットブロックの内側で適合する。各々の加熱ブロックは、独立した温度調節器と温度センサーとを有し、かつ、反応ブロックの温度は0.1℃の変動範囲で制御されることが望ましい。
2.ヘッドスペースをできるだけ少なくして14個のバイアル瓶を充填する。バイアル瓶は、全て同一寸法であるならば、オートサンプラーバイアル瓶からシンチレーション用バイアル瓶までの様々な寸法であってよい。本実施例の目的のためには、20mLバイアル瓶を用いた。
3.ノートの参照番号及び温度を記したラベルを各バイアル瓶用に作成する。できるだけ小さくかつ狭いラベルを作ることが最善である。カラー写真で色を評価する場合には、バイアル瓶には温度を記さずに、特大のラベルを1枚作成する。
4.バイアル瓶中の生成物を観察する際に邪魔にならないように、ラベルを各々対応するバイアル瓶に貼り付ける。通常、ラベルをふたにテープで留めて、端から端までを読み取る細長い垂直タブとすることで、ラベルが観察の邪魔にならないようにする。写真を撮る際には、バイアル瓶中のサンプルが良好に観察できるよう、このラベルは、バイアル瓶上の何らかの印とは反対側に移動させて表示させることができる。
5.色を評価する場合には、デジタルカメラでサンプルの初期写真を撮る。左端には最低温度で処理するサンプルを置き、処理温度が昇順になるようサンプルを右側に一列に並べる。この際、バイアル瓶中のサンプルが明瞭に見えるように配置する(バイアル瓶上のいかなるラベルも印刷物も視界を遮らないようバイアル瓶の向きを変える)。画像中で容易に読み取れるように特大のラベルを表示させる。一貫性を保つため、バイアル瓶とカメラとの位置が分かるように実験台の上に印を付け、後でそれらの相対位置を再現できるようにする。フラッシュはオフにすることが推奨される。
6.次のような種類のサンプルに関しては、以下の方法で写真を撮る:
a.透明な溶液:白色の背景に向かって撮影する。フラッシュを用い、卓上スタンドは用いない。
b.不透明なサンプル:黒色の背景に向かって撮影する。フラッシュはオフにし、卓上スタンドを用いる。
7.化学分析を行う場合、初期値の読み取りのために各々のバイアル瓶をサンプリングする。
8.加熱ブロック及び冷蔵庫の中にサンプルを配置し、日付と時間とを記録する。
9.予め設定した時点で(初期設定で、3、7及び14日を用いる)加熱ブロック及び冷凍庫からサンプルを取り出し、少なくとも30分間室温に戻す。
10.色を評価する場合、ステップ4でバイアル瓶とカメラとの位置を知るために作成したマークを用いて、新たな画像を撮影する。各々の時点で、この操作を繰り返す。
11.化学分析を行う場合、この時点で各々のバイアル瓶をサンプリングする。各々の時点で、この操作を繰り返す。
12.色を評価するため、結果間の差異を最も良好に識別できる時点の画像を選択する。安定性の表を用いて、6ヶ月及び1年室温処理した場合と等価な時間経過を表わす線を、画像上に引くことができる。その表で、任意の時点で6ヶ月及び2年に対応する促進温度を見出だし、次いで、この温度により、どのバイアル瓶間に線を引くべきかを判断する。(例えば、図10を参照されたい。)
13.化学分析のために、各々の時点に関し温度に対し濃度をプロットする。データ間に平滑な線を引き、許容できない閾値に及ぶ温度を記録する。安定性の表において、時間に対してこの温度を参照し、相当する室温を得る。色がLab色度計で測定される場合、この手法は色分析に応用することができ、濃度に代えて色差がプロットされる。
14.安定性の表は、25kcal/モルの活性化エネルギーを前提としている。大抵の加水分解及び類似の反応は、ほぼこのエネルギー付近であり、又はより高い。エネルギーがより高い場合、生成物はより安定であり、その表は、室温での安定性が、実際のものより小さい(過小評価)と予測する。時々、エネルギーはこれより低い。そのため、化学分析を行う場合には、上記で得られたデータを用い、アレニウスプロットにより反応エネルギーを計算して、前提が正しいことを確認することが推奨される。
15.追加:写真からのLabカラーの抽出:
i.全ての写真をCDに移す。Optimas等の色測定ソフトウェア、及び必要なあらゆる周辺機器を搭載したコンピュータを用いて、各々のサンプルの平均Labカラーを測定する。
ii.左端の5Cサンプルから始め、次いで、右上から移動し、次いで、左隅へ引き下げて、平均化された色を有するようにバイアル瓶の領域を選定する。5Cサンプルを標準的基準として設定する(この設定は開始時にのみ5 Cサンプルを用いて実施する)。
iii.各々の温度サンプルのために、L、a、b、標準偏差、及びdEcmc値を記録する。各々の写真に関し白色点(各成分が255、255、255である点)を記録する。
Claims (12)
- 美白化が所望される、色素が過剰に沈着している皮膚領域に、哺乳動物の皮膚の領域を美白化するのに適した化粧品組成物を局所適用する工程を含む、皮膚の色素沈着過剰の発生を低減する、方法(但し、人間を治療する方法を除く)であって、
前記化粧品組成物が、新鮮なフィカス葉汁から得られる有効量のフィカス美容液画分と、皮膚科学的に許容可能なキャリアとを含み、
前記フィカス美容液画分は、次の工程、
a.清浄で新鮮でしおれていないフィカス葉からフィカス細胞汁を分離して、新鮮なフィカス細胞汁を得る工程であって、前記分離工程の前にも前記分離工程の間にも外因性の液体を添加しない、工程と、
b.前記新鮮なフィカス細胞汁を濾過して、繊維を含有していない細胞汁を得る工程と、
c.前記繊維を含有していない細胞汁を分画して、フィカス美容液画分を得る工程であって、前記分画工程が、
(1)前記繊維を含有していない細胞汁からクロロフィルを除去して、上澄み液Iを得る工程と、
(2)前記上澄み液Iから色素及びタンパク質を除去して、フィカス美容液画分を生成する工程と、
(3)前記フィカス美容液画分に安定剤を添加する工程と、を含む、フィカス美容液画分を得る工程と、
を含む方法によって取得され、
前記上澄み液Iから色素及びタンパク質を除去する工程c.(2)が、
i.上澄み液IのpHを7.5に調整して、pH調整済み上澄み液Iを生成する工程と、
ii.pH調整済み上澄み液Iを、沈殿物IIと上澄み液IIとに分離する工程と、
iii.上澄み液IIのpHを3.6に調整して、pH調整済み上澄み液IIを生成する工程と、
iv.pH調整済み上澄み液IIを、沈殿物IIIとフィカス美容液画分とに分離する工程と、を含む方法(但し、人間を治療する方法を除く)。 - 前記工程c.(3)の安定剤が、酸化防止剤、キレート化剤、保存料、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記工程c.(3)の安定剤が、メタ重亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、ペンチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項2に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記化粧品組成物が、室温で、少なくとも6ヶ月の間安定である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記フィカス葉が、フィカス・ベンガレンシス(F. benghalensis)、フィカス・カリカ(F. carica)、フィカス・エラスチカ(F. elastica)、フィカス・ミクロカルパ(F. microcarpa)、フィカス・トリゴーナタ(F. trigonata)、及びこれらの組合せからなるフィカス種群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記フィカス美容液画分が、フェオホルビド(pheophorbides)を実質的に含有しない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記フィカス美容液画分が水溶性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記フィカス美容液画分が、8未満のガードナーカラー値を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記化粧品組成物が、メラニン形成(メラニン合成)における1つ以上の段階を阻害するのに有効な量で適用される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記化粧品組成物が、メラニンを形成する酵素活性を阻害するのに有効な量で適用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記化粧品組成物が、COX−2活性を抑制するのに有効な量で適用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
- 前記化粧品組成物が、酸化防止活性、フリーラジカル捕捉活性若しくはこれらの両方の活性を増大させるのに有効な量で適用される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法(但し、人間を治療する方法を除く)。
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