CN103096872B - 包含无花果浆液组分的化妆品组合物以及减轻皮肤色素沉着过度外观的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了化妆品组合物，所述组合物包含来源于新鲜无花果叶的新鲜无花果细胞汁的无花果浆液组分。所述化妆品组合物还包含美容上可接受的载体。所述无花果浆液组分以美容有效量存在于所述组合物中，以实现所期望的亮肤效果。

Description

包含无花果浆液组分的化妆品组合物以及减轻皮肤色素沉着 过度外观的方法

技术领域

本发明涉及通过向皮肤局部施用化妆品组合物而增亮皮肤的领域。本发明还涉及包含无花果浆液组分的局部用亮肤组合物。本发明还涉及通过将所述化妆品组合物局部施用至色素沉着过度区域以破坏黑素合成的一个或多个步骤，而减轻皮肤色素沉着过度外观的方法。

背景技术

人的皮肤包括三个主要层：表皮、真皮、和皮下脂肪层。表皮包括四层（从上至下）：角质层、颗粒层、棘层、和基底层。角质层和颗粒层之间可存在单独的第五层透明层。基底层产生细胞，所述细胞逐渐向上迁移形成其它表皮层。随着这些细胞向上迁移，它们失去它们的中央核，并且开始形成皮肤蛋白（角蛋白）和脂肪（脂质）。当存在于表皮上层中时，这些细胞被确定为角质细胞。黑素细胞是位于表皮基底层中的另一类细胞。黑素细胞造成黑素的产生，黑素是皮肤色素沉着的主要因素。

黑素由黑素细胞内的一系列复杂的反应形成，基本上讲，所述反应涉及作为基质的酶酪氨酸酶和L-酪氨酸。酪氨酸酶催化L-酪氨酸转变成DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）以及DOPA转变成多巴醌。多巴醌进一步经历转变形成黑素。黑素聚集于被称为黑素体的细胞器中，所述细胞器沿着被称为枝状体的黑素细胞细长丝递送至角质细胞。黑素体中有大约1500种基因产物被表达，它们中的600种在任何指定时间被表达，并且它们中的100种据信是黑素体特有的。此外，存在许多调控因子，涉及信号传导、黑素细胞内黑素体传送的、以及黑素体至角质细胞的传送。

黑素的产生可由许多外部和内部活动引发。例如，当皮肤经受紫外线辐射时，黑素细胞产生额外的黑素。然后黑素经由黑素体传送至角质细胞，其随后在皮肤上留下“晒黑”的外观。紫外光被去除后，黑素细胞恢复至正常的黑素产生水平。炎症可通过调节剂如IL-1、内皮素-1、和/或干细胞因子直接刺激黑素细胞，引发色素沉着过度。受损皮肤中产生的或作为副产物由炎性细胞释放的反应性氧物质如过氧化物和一氧化氮可以是黑素细胞的刺激剂。

随着时间的推移，长期的紫外线曝光以及其它内在和外在老化因子可造成角质细胞和/或黑素细胞中永久性的基因表达变化，致使产生与年龄相关的色素沉着斑点。据报告，一些与黑素生成相关的基因（例如酪氨酸酶、TYRP1）的mRNA含量增加光化性斑点（老年斑）。还显著的是表皮内皮素连续递送作用以及干细胞因子在色素沉着过度中的作用。这些变化可造成黑素产生过度，并且从而产生即使避免侵害如紫外线曝光的情况下仍持久存在的色素沉着过度的斑点。即使排除色素沉着斑点，长期的紫外线曝光以及其它内在和外在老化因子也可造成更多的肤色细微变化。这些变化通常被描述为不均匀的肤色或斑点纹状外观。至少一个研究提出，老年斑有时可使人的表观年龄增加10至12岁，并且黑素分布可促进肤色决定的年龄感知。因此，期望提供可改善色素沉着皮肤外观如老年斑的处理组合物和方法。

近年来，消费者对“天然”美容产品的需要日益增加。因此，化妆品制造商已将更多基于植物的材料加入到他们的化妆品制剂中。虽然许多植物因多种普遍认为的作用而被使用数百年或甚至数千年，但是直至当前，仍不能临床证实所传说的效果或根据植物生物活性的潜在科学根据确定新的潜在用途。随着近来科学的发展，研究人员现能够更好地评定至今仅由民间传说支持的植物的功效和/或潜在的新用途。由于科学的新发现并且由于可潜在用作化妆品生物活性物质的植物数量非常巨大，绝大部分植物还未被充分研究。

用于从植物中提取植物组分的许多方法所涉及的技术对植物组织组成和/或组织中包含的受关注生物活性组分有伤害。因此，传统的提取方法通常无法呈现存在于植物细胞中的活性物质全貌，因此不能认识到基于植物的化妆品制剂的全部潜力。此外，许多传统提取方法使用强效化学溶剂，其不是“天然”的，因此是消费者希望避免施用到他们皮肤上的物质。此外，这些基于溶剂的工艺产生有毒的化学垃圾，如果不作为有害废物恰当处理和销毁，其可能危害环境。

然而，不能仅因为物质是“天然的”而担保其不含非期望的物质，使得所述物质适于在皮肤上使用。例如，许多植物包含光敏剂如脱镁叶绿酸和/或接触性过敏原如蛋白质。在天然存在于许多常见植物中的含量下，脱镁叶绿酸和/或蛋白质对大部分人不造成问题。然而，当植物材料通过如提取被浓缩成高浓缩形式时，这些物质可能以造成皮肤刺激和过敏反应（包括皮疹）的含量存在。然而即使当这些物质以它们的天然含量存在时，仍存在许多经历不利皮肤反应的敏感个体。

此外，由于对天然产物的需求增加，因此出现对保护地球天然资源的关注。消费者期望的许多“天然”成分来源于生物资源，所述生物资源因被收获用于消费品中而缩减和/或毁灭。因此，讽刺地是，消费者对更加地球友好的天然产品的需求恰恰造成他们打算保护的生物资源的毁灭。

因此，需要天然生物活性植物组合物，所述组合物保留它们所期望的生物活性范围，适于局部皮肤施用，并且不使用强效化学溶剂制得。此外，还需要包含此类生物活性物质的化妆品组合物，所述生物活性物质有效地减少皮肤色素沉着过度区域。此外，还需要可以生态无害可持续方式收获并且加工的此类生物活性物质。

本发明的这些和其它目的将根据下面的公开而将变得显而易见。

发明内容

本发明提供来源于新鲜无花果叶细胞汁的无花果浆液组分。本发明还提供包含无花果浆液组分的化妆品组合物。无花果浆液组分以有效获得所期望的亮肤效果的量存在于所述组合物中。

本发明还涉及通过将所述化妆品组合物局部施用至色素沉着过度区域以破坏黑素生成的一个或多个步骤，而减轻皮肤色素沉着过度外观的方法。

附图概述

据信，通过以下说明并结合附图可更好地理解本发明。参考附图不可解释为是对本发明范畴的限制。

图1为由新鲜无花果叶制备生物活性浆液组分的方法的示意图。

图2为叠加在无花果浆液组分LC/UV色谱图上的传统无花果提取物的LC/UV色谱图，表明传统提取物包含更高含量的无花果浆液组分中未检出的后洗脱的（疏水性更大）化合物。

图3为传统无花果提取物后洗脱化合物的LC/UV色谱图以及它们相应的离子提取物色谱图，确定它们为脱镁叶绿酸，为叶绿素降解产物的色素化合物。

图4为叠加在无花果浆液组分LC/UV色谱图上的传统无花果提取物的LC/UV色谱图，表明传统提取物包含更高含量的黄酮醇糖苷。

图5为叠加在无花果浆液组分LC/UV色谱图上的传统无花果提取物LC/UV色谱图的一部分以及相应的离子提取物色谱图，表明无花果浆液组分包含传统无花果提取物中所含约十倍（10x）含量的儿茶素和相关的缩合丹宁。

图6为叠加在无花果浆液组分LC/UV色谱图上的传统无花果提取物LC/UV色谱图的一部分以及相应的离子提取物色谱图，表明两个样品之间的三种咖啡酰奎尼酸异构体含量未呈现显著的不同。

图7为叠加在无花果浆液组分LC/MS色谱图上的传统无花果提取物LC/MS色谱图的一部分，表明无花果浆液组分中游离酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的含量更高。

图8为得自加速老化研究的两张彩色照片，表明干叶无花果提取物相对于FSF的色度稳定性。两种不同的化妆品组合物包含不同含量的无花果浆液组分和不同的防腐剂。

图9为图8加速老化研究的校正曲线图。

图10为得自加速老化研究的彩色照片，其中将包含0.55%FSF以及不同浓度防腐剂的载体进行比较。

具体实施方式

除非另外指明，本文中使用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计，并且所有的测量均在25℃进行。

本发明的组合物可包含本文所描述的基本组分、以及非必需成分，可基本上由或由本文所描述的基本组分以及非必需成分组成。如本文所用，“基本上由组成”是指所述组合物或组分可包括附加成分，只要所述附加成分不会在本质上改变本发明要求保护的组合物或方法的基本和新的特性。

用于涉及组合物的术语“施用”或“应用”是指将本发明组合物施用或铺展在人皮肤表面如表皮上。

如本文所用，术语“皮肤病学可接受的”是指所述组合物或组分适用于和人的皮肤组织接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等。

如本文所用，术语“安全有效量”是指足以明显产生积极有益效果的化合物或组合物的量。

如本文所用，术语“发炎后色素沉着过度”是指因瞬时发炎事件而反应出的色素沉着急性至慢性增加。发炎后色素沉着过度尤其常见于但不限于深色皮肤受试者。瞬时发炎事件消退后，发炎后色素沉着过度通常减退。瞬时发炎事件的例子包括但不限于粉刺损害、内生毛、擦伤、昆虫螫咬、表面活性剂损伤、和短期紫外线曝光。

如本文所用，术语“色素沉着斑点”是指界定的皮肤区域，其中因局部且慢性的或系统性的黑素产生过度而导致色素沉着大于皮肤邻近区域的色素沉着。色素沉着斑点直径通常介于约2mm至约10mm之间，但是更小或更大的斑点也是可能的。色素沉着斑点可包括下列一种或多种：老年斑、晒斑、日光性着色斑、低黑素性病变、雀斑和黄褐斑。

如本文所用，术语“老年斑”是指色素沉着斑点，其中色素沉着归因于由内在或外在老化因子造成的局部且慢性的黑素产生过度。

如本文所用，术语“肤色调节剂”是指调控黑素产生信号、黑素合成、黑素在黑素细胞和角质细胞之间的系统性转移、和/或黑素降解的试剂。肤色调节剂作为淡化或减轻色素沉着的化妆品试剂，可改善不均匀肤色外观。

如本文所用，术语“肤色”是指由系统性而非瞬时性黑素合成造成的皮肤中黑素的总体外观肤色。通常在较大皮肤区域上表征。所述区域理想地为100mm²，但是可想像更大的区域，如整个面部皮肤或任何面部皮肤表面。肤色可由图像分析测定。例如，总体亮度可由L*a*b*色彩空间（International Commission on Illumination）中的L*坐标量度。发色团作图如黑素作图和黑素浓度可用作总体肤色的指示。可由发色团图谱数据计算出平均黑素。此外，可由黑素均匀度确定肤色均匀度，所述黑素均匀度也可由发色团作图数据计算出来。适宜的发色团作图方法论述于下文例子中。

如本文所用，术语“面部皮肤表面”是指下列一种或多种：前额、眶周、脸颊、口周、下颏、和鼻部皮肤表面。

如本文所用，术语“传统提取物”是指通过从植物材料中溶剂提取的化合物制得的那些提取物；所述植物材料可以是脱水的（即干燥的）和/或未脱水的（例如新鲜或仅部分脱水的）植物材料。

I.组合物

本发明涉及多种组合物，并且更具体地讲，涉及施用于皮肤表面的组合物。所述组合物可为多种产品形式，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、霜膏、凝胶、调色剂、棒剂、笔剂、喷剂、气溶胶、油膏剂、清洁液体洗剂和实心棒、洗发剂和毛发调理剂、糊剂、泡沫、粉末、摩丝、剃刮膏、擦拭物、条带、贴片、电动贴片、伤口敷料和粘合剂绷带、水凝胶、成膜产品、面部和皮肤掩膜（具有和不具有不溶性薄片）、化妆品如粉底、眼线笔和眼影膏等。组合物形式可根据所选的具体皮肤病学可接受的载体（如果存在于组合物中的话）。

本发明的组合物可用于减轻与黑素相关的皮肤色素沉着过度的外观。如本文所用，“减轻可见的皮肤色素沉着过度的外观”包括亮肤。亮肤涉及减少、最小化和/或消除皮肤中的现有黑素（治疗性），和/或延缓、最小化和/或阻止皮肤中黑素的形成（预防性），包括皮肤的色素沉着区域。如本文所用，“色素沉着区域”是指高黑素含量的局部区域，并且包括老年斑、褐黄斑、斑块、斑纹、黑斑、黄褐斑、雀斑、发炎后色素沉着过度或日光引发的色素沉着斑点。

A.无花果浆液组分

无花果，无花果属，包括许多种类，并且在世界各地均有发现。无花果属不应与仙人掌科无花果种类刺梨仙人掌（梨果仙人掌）混淆（Barbera等人，“P_{AST AND} P_RESENT R_{OLE OF THE}I_NDIAN-FIG P_RICKLY-P_EAR（O_{PUNTIA FICUS-INDICA}（L.）M_ILLER，C_ACTACEAE）IN THE AGRICULTURE OF S_ICILY”，Economic Botany46（1）:10-20，1992）。无花果属的有名种类包括无花果（普通无花果）、菩提树（佛陀发现“真理”时为佛陀遮蔽的菩提树）、印度榕（橡胶树）、孟加拉榕树（榕树）、和聚果榕（异名丛生榕，巨大的丛生树）。

在果实的总体分类中，无花果是隐头花序的例子，是具有特有的“反转”结构的复果。这些包括一系列核果，它们为肉质中空花托，每个在尖端处具有称为孔口的小开口。小花聚集于内壁，并且是外部不可见的。

作为最早已知的人类食物之一，无花果属物种（无花果）具有悠久的安全特征。在历史上，无花果的新鲜或干燥的果实、树皮、叶、嫩枝、胶乳、和幼枝已被用于多种用途。这些历史上的用途中的一些包括治疗疼痛、溃疡、恶性肿瘤生长、肿瘤、脓肿、痛风、慢性咳嗽、肺疾、慢性痢疾、便秘、风湿、淋病、痔疮、糖尿病、呕吐、湿疹、麻风病和赘疣。

本发明的无花果浆液组分（下文为“FSF”）来源于新鲜无花果叶的细胞汁。采用pH调节、聚焦微波辐射、离心分离、和灭菌过滤，将从新鲜叶中机械分离出的细胞汁分级，获得不含脱镁叶绿酸并且不含蛋白质的无花果浆液组分。所得无花果浆液组分主要包含无花果叶细胞的细胞质。在特定实施例中，无花果细胞汁来源于无花果物种，所述无花果物种选自：孟加拉榕树、无花果、印度榕、细叶榕、佟氏榕、以及它们的组合。

本发明的组合物包含安全且有效量的无花果浆液组分。所述组合物可包含按所述组合物的重量计含量为0.01%至50%，在一个实施例中0.05%至20%，在另一个实施例中0.2%至10%的FSF。在另一个实施例中，所述组合物包含按所述总体组合物的重量计1%至5%，并且在另一个实施例中1%至3%的FSF。

本发明研究人员已发现，当局部施用于皮肤时，与传统无花果提取物相比，无花果浆液组分获得优异的亮肤效果，包括淡化哺乳动物皮肤中的色素沉着区域。本主题发明不受理论的限制，但是据信通过抑制黑素产生（黑素生成）的相关过程起作用，包括阻止反应性黑素细胞的氧/氧自由基（氧化应激反应）刺激，所述刺激导致黑素细胞中开启黑素产生途径（例如可在紫外线或日光曝露下发生）。

无花果浆液组分的制备

用于从植物物质中分离出化合物的方法如通过用溶剂提取决定了分离出何种化合物。与“相似相溶”普遍原理相一致，提取溶剂的选择基本上决定了由任何具体提取技术得到的化合物的类型和数量。例如，通过使用极性溶剂提取出极性化合物，而通过使用非极性溶剂提取出非极性化合物。这使得仅分离出可能存在的所有化合物中的小范围化合物。溶剂极性与使用传统溶剂提取分离出的物质类型之间的相关性由下文图表描述（Houghton&Raman，Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts（1998））。

本发明的无花果浆液组分不通过溶剂提取制得，而是通过将植物叶中存在的新鲜细胞汁与植物物质其余部分分离制得。由于该细胞汁未经历提取处理，因此它包含存在于新鲜无花果叶中的所有化合物。相反，提取物仅包含可用具体溶剂分离的小范围化合物。因此，所得无花果浆液组分包含比提取物更广范围的潜在活性化合物。

此外，许多提取物不是由新鲜叶制得的，而是由因脱水而已经历降解的干燥植物材料制得。在脱水期间，细胞壁受损，造成化合物经诸如水解、氧化、聚合、美拉德反应和异构化机理而降解。当提取干燥叶时，所得提取物由此包含这些原本不存在于新鲜植物物质中的降解产物；此外，提取物仅包含可由具体溶剂分离出的该范围化合物。因此，所得干燥叶提取物的组成显著不同于无花果浆液组分的组成。

制备无花果浆液组分组合物的方法包括以下步骤：（a）从干净、新鲜、未萎蔫的无花果叶中分离出无花果细胞汁，获得新鲜的无花果细胞汁，其中在所述分离之前或期间不加入外来液体；（b）将所述新鲜无花果细胞汁过滤获得不含纤维的细胞汁；并且（c）将所述不含纤维的细胞汁分级获得无花果浆液组分。分级步骤包括以下步骤：（1）从所述不含纤维的细胞汁中去除叶绿素，以获得上层清液I；（2）从上层清液I中去除色素和蛋白质，形成无花果浆液组分；并且（3）任选将稳定剂加入到所述无花果浆液组分中。

在一些实施例中，稳定剂选自：抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、以及它们的混合物。在特定实施例中，稳定剂选自：偏亚硫酸氢钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯钠、戊二醇、以及它们的混合物。

在特定实施例中，从不含纤维的细胞汁中去除叶绿素的步骤包括：（i）将所述不含纤维的细胞汁的pH调节至约3，以获得经pH调节的不含纤维的细胞汁；（ii）将所述经pH调节的不含纤维的细胞汁在约90℃下加热约1分钟；（iii）将所述经pH调节的不含纤维的细胞汁冷却至约30℃；并且（iv）使所述经pH调节的不含纤维的细胞汁分离成沉淀I和上层清液I。

在特定实施例中，从上层清液I中去除色素和蛋白质包括：（i）将上层清液I的pH调节至7.5以形成经pH调节的上层清液I；（ii）使经pH调节的上层清液I分离成沉淀II和上层清液II；（iii）将上层清液II的pH调节至3.6以形成经pH调节的上层清液II；并且（iv）使经pH调节的上层清液II分离成沉淀III和无花果浆液组分。

使用新鲜无花果叶制备无花果浆液组分。本文制备方法保持原本存在于无花果叶中的生物活性组分的完整性，获得具有优异活性的无花果浆液组分。收割和运输期间小心地保持叶片完整性，以使环境因素如水分损失和生物降解最小化。在可能的最短时间内完成所有步骤，以使新鲜叶与阳光、高温以及其它不利环境因素的接触最小化。

在特定实施例中，无花果叶选自的无花果物种：孟加拉榕树、无花果、印度榕、细叶榕、佟氏榕、以及它们的组合。

以一定的方式实施收割，如通过手工或机械切割来收割，以避免或最小化对叶片的砍劈、捣碎、压碎或其它类型损伤。以一定的方式实施收割和运输，以避免因水分损失而造成的萎蔫。在一个实施例中，用于制备无花果浆液组分的新鲜无花果叶包含它们收割时存在的至少90%，在另一个实施例中至少95%，并且在另一个实施例中至少98%的原有含水量。

由于一次可收割至多30%的无花果植株叶而不会不利地影响植株的生存能力，因此相同植株可重复许多次叶片再生，以供未来收割。因此，在其整个自然寿命期间，无花果植株可持续生长，并且是周围生态系统的一部分，同时提供叶片重复收割，以用于制备生物活性化妆品组合物。该收割方法是优选的，因为它促进了自然资源的可持续性。

虽然不是优选的，但是仍可使用可持续性较差的采集方法，如去除植株主要部分并且不留下供再生长的活体部分的大规模机械收割。然而即使采用该更具破坏性的收割方法，仍需谨慎以使无花果叶损伤最小化，所述损伤在所收集叶中可造成微生物生长，水分损失，氧化、聚合、异构化和水解过程加剧（即非期望的分解代谢过程）。例如，在本发明的一个实施例中，手工切割并且收集整株植株形式的无花果植株。在另一个实施例中，采用收割设备切割植株叶。

应使切割植株材料至加工设备的运送时间以及叶与阳光、高温以及其它不利环境因素的接触最小化，以防止如上所述的非期望降解过程的影响。例如，在本发明的一个实施例中，用于进一步处理的植株的运送时间自切割时间计不超过30分钟。在另一个实施例中，对经历长距离运输的植株进行切割后加工处理，所述加工涉及将无花果叶立即放入到Styrofoam冷却器内，所述冷却器包含数袋冷冻凝胶包，以有助于在过夜运送至加工设备期间保持新鲜和天然含水量。也可采用实现上述效果的其它切割后加工。

然后温和地洗涤无花果叶，以在加工前去除污垢颗粒和其它碎片。在一个实施例中，在防止引发叶中细胞汁释放、造成损伤、或去除有价值组分的条件下，采用短时间低压冲洗实现洗涤。例如，在本发明的一个实施例中，在小于或等于5分钟内，用小于或等于1kg/cm²的水压实现无花果叶的洗涤。残余的水洗液不应包含任何绿色或黄色色素；不存在此类色素表明不存在后续损伤。然后从洗过的叶上去除多余的水，以保持干物质含量尽可能接近天然含量。

然后将洗过的新鲜无花果叶机械分离，从主要包含细胞壁的富含纤维的材料中释放出细胞汁，所述细胞汁包含大部分的实质细胞的细胞内物质。重要的是，分离过程期间不加入外来溶剂（例如水、己烷、丙酮、乙醇）。如本文所用，“外来溶剂”是指原本不存在于植物物质中，但是为了从植物物质中分离（例如提取）出化合物的目的而与植物物质接触的任何溶剂。

从洗过的叶中释放细胞汁包括碾磨、浸泡、和挤压，以获得细胞内液体内容物（即细胞汁）并且使其与富含纤维的物质分离。在一个实施例中，使用具有5HP引擎和一组筛网的锤磨机（型号VS35，Vincent Corporation，Tampa，FL）碾磨叶，以在最短时间内获得具有适宜小尺寸的叶组织颗粒，而不显著增加生物质温度。在该实施例中，设锤磨机以在≤10秒处理期间内产生≤2.0厘米的最大浸透叶颗粒尺寸，其中新鲜浸透叶的温度增加仅小于或等于≤2℃。

使碾磨并且浸透的无花果叶的曝露最小化，以防止如上所述的非期望分解代谢过程的影响。短时间内处理无花果叶，并且温度无显著增加。碾磨和浸泡后立即挤压无花果叶，以从浸透的新鲜叶中获得细胞汁。在一个实施例中，这采用配备压缩空气承载的锥体的水平连续螺旋压榨机（Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，Tampa，FL）来实现。该实施例中，锥体上的压力保持在大于或等于15kg/cm²的水平，螺杆转速为12rpm，并且细胞汁温度增加小于或等于5℃。

该处理获得富含纤维的物质和细胞汁。然后从细胞汁中去除残余的小纤维颗粒，因为它们可吸收有价值的细胞汁组分，并且还可能堵塞设备软管和泵。例如，这些颗粒可通过过滤或低速离心去除。在一个实施例中，通过采用具有全自动卸料单元的连续式离心机（型号12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA）净化，去除这些颗粒。在2升/分钟流速下，≤2,250g的细胞汁净化保留时间≥100秒。该方案获得不含纤维的细胞汁。收集包含小纤维颗粒的沉淀，并且与新鲜叶处理后产生的其余富含纤维的物质合并。

如果此时需要，可将细胞汁冷冻于气密非反应性容器中，以保存用于后期加工。在一个实施例中，将细胞汁快速放置于密封的15升矩形HDPE容器中，并且在–30℃下冷冻。固态冷冻细胞汁保持在该低温下，以供进一步利用。

然后优选通过短时间（例如小于或等于2分钟）内液化并且液化期间使细胞汁温度增加最小化（例如小于或等于20℃），将冷冻的细胞汁转变回液态。短液化时间和低幅度升温使细胞汁的变性和氧化损伤最小化。这获得生理化学与生物化学特性与冷冻前所测那些基本上相同的细胞汁。

细胞汁包含三种主要类型的组分：（i）膜结合的叶绿体、线粒体、内质网、胞核、溶酶体、过氧化物酶体、液泡、高尔基氏体；和（ii）非膜结合的核糖体、微管；以及（iii）与上述类别无关的组分如细胞质。由于细胞器和它们的片段以及非期望的色素和蛋白质存在于细胞汁中，因此需要分级获得具有所期望功能特性组合的个人护理成分，所述特性包括但不限于颜色、溶解度、透明性、稳定性和体外活性。

采用多种处理将细胞汁分级，所述处理包括pH调节、聚焦微波辐射、离心分离和真空过滤。然后用防腐剂和抗氧化剂稳定所得分离的细胞汁浆液组分，获得最终无花果浆液组分。

将细胞汁的pH调节至≥3.0（pH调节1）。在一个实施例中，采用滴定方法，使用5.0N盐酸（HCl）调节接近中性（7.0）的细胞汁pH，以将细胞汁pH降至≥3.0（pH调节1）。

然后从调节过的细胞汁中去除叶绿素。除了该色素非期望地存在于化妆品成分中以外，叶绿素还可转化成被认为是毒性化合物的脱镁叶绿酸（Bergstrom，L.C.、Vucenik，I.、Hagen，I.K.、Chernomorsky S.A.、Poretz R.D.，“In-vitro photocytotoxicity oflysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladdercarcinoma cells.”–J.Photochem.Photobiol.，24,1,17–23,1994），并且是造成皮肤刺激的原因（Kato T.，Yamada K.，“Relationship between appearance ofphotosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder.”–J.FoodHyg.Soc.Japan，36,632–634,1995）。

在一个实施例中，通过加热，然后冷却调节过的细胞汁，接着使沉淀与上层清液分离，实现叶绿素的去除。在特定实施例中，调节过的细胞汁立即用频率2,450MHz的聚焦微波辐射处理。在该聚焦微波处理（FMP）期间，细胞汁温度短暂升至90℃，在该温度下保持1分钟，然后使细胞汁温度立即降至≤30℃。然后使用连续式离心机CEPA LE（Carl PadbergZentrifugenbau GmbH，Germany），在15,000rpm和≥30秒保留时间下快速分离处理过的细胞汁。所处理细胞汁的分离形成绿色的糊剂状沉淀（“沉淀I”）和浅褐色稍乳浊的液态上层清液（“上层清液I”）。该上层清液I用于进一步分级。

进一步处理上层清液I以显著去除褐色色素以及其它非期望的化合物，包括残余的蛋白质。该处理包括pH调节和分离。调节上层清液I的pH，以使pH增至约7.5（pH调节2）。在一个实施例中，经由滴定方法，使用50%氢氧化钠（NaOH）将细胞汁上层清液I的pH从～3.0增至～7.5，实现pH调节2（pH调节2）。pH调节2获得颜色更深的物质和更高的乳浊度，其随后经由分离变澄清。在一个实施例中，通过使用连续式离心机CEPA LE（Carl PadbergZentrifugenbau GmbH，Germany），在15,000rpm和≥30秒保留时间下实现澄清化。该分离获得褐色糊剂状沉淀（沉淀II）和褐色稍乳浊的上层清液（上层清液II）。

然后将上层清液II进行pH调节（pH调节3）和过滤。调节上层清液II的pH以将pH降至约3.6（pH调节3）。在一个实施例中，使用5.0N盐酸（HCl）对上层清液II进行滴定，以将pH值降至pH～3.6（pH调节3）。此类处理获得颜色更浅的滴定过的上层清液II，然而其乳浊度稍增加。通过具有0.2微米孔径的膜进行灭菌过滤，处理经pH调节的上层清液II。所得滤液为浅色透明的无花果浆液组分（FSF）。FSF主要包含无花果叶细胞的细胞质。

可通过加入抗氧化剂、稳定剂、螯合剂和防腐剂，进一步稳定浆液组分。在一个实施例中，将下列添加剂加入到无花果浆液组分中：0.2%偏亚硫酸氢钠、0.1%山梨酸钾、0.1%苯甲酸钠、和0.1%对羟基苯甲酸甲酯钠。在该实施例中，培养混合物直至达到添加剂完全溶解（≥30分钟）。然后将1.9%戊二醇加入到混合物中。

FSF特性

所得FSF呈现出使其适用于化妆品成分的特性。这些特性包括稳定性，水溶解度，不存在不期望的物质如脱镁叶绿酸和蛋白质，颜色更浅，更高的固含量，并且存在更高含量的所期望化合物如苯丙氨酸。

稳定性研究显示，经由这些方法由FSF制得的化妆品成分在室温下稳定至少6个月。如本文所用，“稳定”是指STP（标准温度和压力：25℃，1atm）下在黑暗干燥区域中储存时，组合物的物理或化学特性在指定期间内无显著变化。这些特性包括颜色和化学组成。在一些实施例中，FSF和包含它的组合物稳定至少6个月，在其它实施例中稳定至少12个月，并且在其它实施例中稳定至少24个月。在特定实施例中，所述组合物稳定6至24个月、12至24个月、或6至12个月。

水溶解度

本发明的FSF也是水溶性的。如本文所用，“水溶性”是指FSF可以任何比例（STP下）与水混溶。由于FSF是水溶性的，因此配制包含无花果的组合物时允许更大的灵活性。例如，水基制剂由于它们的不油腻感、所期望的铺展性、亮肤感、以及从皮肤表面上去除的方便性（例如冲洗）而通常受到消费者欢迎。

然而，使用溶剂提取的非水溶性传统无花果提取物呈现配制难题比如相分离、沉析、结晶以及水基组合物中活性物质浓度的不均匀性。为了克服与非水溶性活性物质相关的配制问题，通常使用更复杂的制剂如乳液（其通常向组合物中引入油性和/或油腻感的物质）。这致使组合物具有油腻、厚重和/或粘性的皮肤感觉，致使组合物不易从皮肤表面上去除，并且致使生产工艺更加昂贵和/或复杂。在许多情况下，这些制剂还会阻碍活性物质向皮肤的递送。

然而，由于FSF是完全水溶性的，它可掺入到水基制剂中，而不存在与非水溶性传统无花果提取物相关的上述问题。这导致更大的配制灵活性，从而使得提供具有优异的消费者期望属性的无花果组合物成为可能。

此外，由于FSF是完全水溶性的，因此它比非完全水溶性的溶剂提取物更加生物可利用。这使得活性组分从FSF至皮肤的递送更加有效。

此外，传统溶剂提取物因它们的水不溶性，其许多潜在生物活性的测定是不可行的。例如，在当前研究中，由于溶剂提取物是水不溶性的，因此不可能测定它们的IC₅₀值。

安全性/过敏性

FSF还基本上不含通常存在于植物（包括无花果）中的物质脱镁叶绿酸和蛋白质。已知这些物质产生安全性问题，如毒性和/或敏感个体的过敏性反应。在植物中通常存在的含量下，这些物质通常不产生问题。然而，当植物物质被浓缩时，如通过加工，相对浓度含量显著增加，并且可能产生安全性问题。因此，高度优选不包含这些物质的组合物。

脱镁叶绿酸是色素化合物，其为叶绿素降解产物。除了造成产品变色以外，已知这些色素还是生物毒素以及皮肤光敏剂。（Bergstrom，L.C.、Vucenik，I.、Hagen，I.K.、Chernomorsky S.A.、Poretz R.D，“In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropicimmunoliposomes containing pheophorbide a with human bladder carcinomacells.”–J.Photochem.Photobiol.，24,1,17–23,1994）；（Kato T.、Yamada K.，“Relationship between appearance of photosensitization and total pheophorbidelevel in spirulina powder.”–J.Food Hyg.Soc.Japan，36,632–634,1995）。

如图2中所示，传统无花果提取物（实例3中）包含后洗脱（即更疏水的）化合物，其在FSF（实例1中）中未检出。如图3中所示，传统无花果提取物后洗脱化合物的LC/UV色谱图以及它们相应的离子提取物色谱图证实这些化合物为脱镁叶绿酸。（参见实例5）

蛋白质，包括植物如无花果中的那些，可造成过敏性个体的接触性皮炎。与病原性蛋白质物质接触后不久，此类个体可经历如急性荨麻疹或皮肤水泡泡疹的症状，通常伴有瘙痒、灼热、和/或刺痛。（V.Janssens等人，“Protein contact dermatitis:myth orreality?”，British Journal of Dermatology，1995；132:1-6）因此，高度期望皮肤护理物质包含尽可能少的蛋白质。

采用凯氏定氮法测定FSF的总蛋白质含量（实例1，表3）。FSF中未检出蛋白质。如本文所用，“基本上不含蛋白质”是指采用凯氏定氮法测定，总蛋白质含量小于1%（0%至1%）。在一些实施例中，FSF的蛋白质含量为0%至1%，在其它实施例中为0%至0.5%，并且在其它实施例中为0%至0.25%。

色度/色度稳定性

FSF具有比传统无花果提取物更浅的颜色。FSF具有小于8，并且在一些实施例中小于7.5的格氏色度值。特定实施例具有5至8，在其它实施例中6至8，并且在其它实施例中6.5至8的格氏色度值。图8表明14天加速老化研究中FSF相对于干叶无花果提取物的色差。图10表明0.55%FSF在具有不同含量稳定剂/防腐剂的载体中的色差。图9是为图8加速老化研究分析建立的校准图表。

本发明研究人员已确定传统提取物中的多种受关注组分不存在于和/或以非常低的含量存在于FSF中，所述受关注组分造成它们之间的色度和色度稳定性差异。例如，图4表明传统提取物包含较高量的可能为黄酮醇糖苷的物质。黄酮醇糖苷可与鞣酸（存在于FSF和传统提取物中）组合形成聚合物色素。因此，较高含量的黄酮醇糖苷可导致传统提取物中形成较高含量的色素化合物。此外，类黄酮和鞣酸的多酚结构致使对诸如氧化、热和光的因素非常敏感，这可潜在解释传统提取物中的色素含量随时间推移而增加。

固含量

固体包含FSF或提取物中的生物活性部分。因此，固含量越高，植物活性越高。与传统水溶性无花果提取物相比，FSF具有更高的固含量。FSF具有按所述FSF的重量计大于5重量%，并且在特定实施例中5重量%至20重量%，或5重量%至10重量%的固体（干物质）含量。

FSF生物活性

FSF表现出至少四种确认的可调控皮肤中色素沉着产生的不同作用机制。这些机制是酪氨酸酶抑制作用、胰蛋白酶抑制作用、COX-2抑制作用、和抗氧化剂活性作用。在一个实施例中，FSF具有下列色素沉着活性降低中的至少一种，在其它实施例中具有下列色素沉着活性降低中的至少两种，或至少3种：0.003至0.06的酪氨酸酶抑制IC50（%DM）；0.02至0.5的胰蛋白酶抑制IC50（%DM）；0.02至1的COX-2抑制IC50（%DM）；以及由DPPH测定法（1/x DM）测得的1至15的抗氧化剂清除过氧化物能力，和/或由ORAC测定法（1/x DM）测得的0.2至5的抗氧化剂清除过氧化物能力。如本文所用，“DM”为干物质（“固体”），“ORAC”为氧自由基吸收能力，并且“DPPH”为自由基清除能力的量度。

此外，由实例6的B16黑素抑制测定法证实，与传统无花果干叶溶剂提取物相比，FSF在抑制黑素产生方面更有效。例如，在0.01浓度下，FSF获得比传统提取物（23%黑素抑制）高两倍以上的黑素合成抑制度（48.1%黑素抑制）。

因此，本发明提供了用于调节皮肤中黑素生成（即黑素抑制）的方法。据信，涉及皮肤中黑素浓度的多种色素沉着过度形式（例如雀斑、老年斑、褐黄斑、斑块、斑纹状色素沉着等）是由表皮中存在的黑素细胞和角质细胞的变化所引起的。位于表皮底层的黑素细胞随着老化而丧失它们正常的调节过程，并且产生过多的色素。该过度产生导致表皮内的角质细胞中形成致密的黑素核周团块，形成色素沉着过度区域。

色素沉着皮肤的传统疗法包括施用抑制黑素形成的某些亮肤剂。本领域提出的这些物质的作用机制为酪氨酸酶抑制作用和/或黑素合成中其它步骤的抑制作用。酪氨酸酶存在于表皮黑素细胞的黑素体中，并且催化由酪氨酸形成黑素的关键步骤。（参见Goldsmith，L.A.的“PHYSIOLOGY,BIOCHEMISTRV,AND MOLECULAR BIOLOGY OF THE SKIN”，Oxford University Press，第873-903页，N.Y.1991）。酪氨酸酶催化酪氨酸的羟化以及DOPA至DOPA奎宁的氧化。因此，将抑制剂结合至酪氨酸酶的活性位点，致使黑素形成减少。一般参见Prota，G.的“Melanins and Melanogenesis”，Academic Press，Inc.（SanDiego1992）。

黑素产生的非酶步骤涉及氧化过程。经由非酶或自发化学反应发生DOPA醌至黑素的转变，所述反应中的一些涉及反应性氧物质（ROS）或氧自由基。黑素细胞的氧化应激反应如通过刺激反应性氧/氧自由基物质（例如可在紫外线或日光接触下发生）导致开启黑素细胞内黑素产生的途径。已使用多种抗氧化剂/自由基清除剂以辅助破坏这些过程，从而获得亮肤有益效果。

已知，源自花生四烯酸的代谢物用作皮肤的强效炎性调节剂，尤其是响应于环境侵害如紫外线、烟雾以及其它此类刺激物的强效炎性调节剂。在该途径中，膜磷脂被磷脂酶A2转变成花生四烯酸（AA）。形成后，AA被两个竞争性生物途径中的一个利用；环加氧酶（COX）途径或5-脂氧合酶途径。COX炎性途径中最紧密相关的酶是COX-2，其催化花生四烯酸转变成暂时分子PGH2，其快速转变成前列腺素如PGE2。前列腺素是自分泌的或旁泌的，用作局部信使，负责诱发刺激位点处炎性响应。

将无花果浆液组分吸收到皮肤中，抑制了COX-2，阻止源自花生四烯酸的代谢物转变成前列腺素。净效应为基本和诱导的前列腺素库量减少。前列腺素含量降低致使炎性响应直接降低，并且所有所得下游信使作用降低。这些信使作用中的两个包括黑素细胞中的黑素合成作用以及成纤维细胞中胶原产生的抑制作用。

已知，前列腺素通过提高酪氨酸酶的量刺激黑素细胞，所述酪氨酸酶是负责产生黑素的酶。黑素细胞的刺激和黑素的过度产生导致色素沉着过度，观察到所述色素沉着过度为皮肤区域颜色变深。因此，由炎症造成的变色称为发炎后色素沉着过度，是前列腺素对黑素细胞的直接刺激造成的。由无花果浆液组分对COX2抑制作用造成的前列腺素产生减少，致使黑素产生减少，并且获得色调更均匀的皮肤。

前列腺素PGE₂已显示对减少多种细胞中I型和/或III型胶原合成具有显著的效应，所述细胞包括人体真皮成纤维细胞、大鼠系膜细胞、和大鼠肝星状细胞[参照]。由于I型和III型是构成皮肤真皮的胶原的主要形式，因此这证实，响应于炎症的高含量PGE₂会造成对胶原合成的抑制。AA和PGE₂已显示对胶原合成具有抑制效应。加入源自天然的COX-2抑制剂（包括ω-3脂肪酸EPA和DHA）能够抵消由PGE₂造成的胶原合成抑制作用，致使胶原合成净增加。因此，无花果浆液组分可能通过抑制COX2而改善皮肤肌理，抑制COX2降低了造成胶原抑制的前列腺素的形成。

已出乎意料地发现，当局部施用于皮肤时，与传统无花果提取物相比，无花果浆液组分获得优异的亮肤效果，包括淡化哺乳动物皮肤中的色素沉着区域。此外，分析测试已表明，本发明的无花果浆液组分经由多种作用机制破坏黑素合成，影响酶途径和非酶途径。与传统无花果提取物相比，FSF具有增强的生物活性，包括下列中的一种或其组合：酶抑制活性、自由基清除活性、抗氧化剂活性、和黑素合成抑制活性。酶抑制活性包括但不限于下列中的一种或其组合：酪氨酸酶抑制活性、弹性蛋白酶抑制活性、胰蛋白酶抑制活性、和环加氧酶-2（“COX-2”）抑制活性。抗氧化剂活性包括但不限于氧自由基吸收能力。

虽然本发明研究人员还已经以举例的方式表明，传统无花果提取物可提供色素沉着过度效果，但是这些传统提取物不是同样有效的，并且它们具有使得它们适宜性降低从而较不适用于化妆品组合物中的特性。

如图5中所证实的，FSF具有较高含量（约10倍）的儿茶素和相关的缩合丹宁。缩合丹宁（原花色素）比如儿茶素为一类黄烷醇。原花色素基本上为类黄酮比如儿茶素的聚合物链。据信，丹宁用作人体的生物抗氧化剂（自由基清除剂），并且普遍相信可有效地抵抗皮肤的氧化性损伤，如因老化造成的损伤。此外，抗氧化剂可有助于防御内在和环境压力的影响如吸烟和污染，以及维持正常的身体代谢过程。（Kehrer，J.P.的“Crit.Rev.”，Toxicol.，1993,23,21）。图7还表明，FSF包含较高含量的游离的必需氨基酸：酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。然而，如图6中所示，两个样品之间检出的三种咖啡酰奎尼酸异构体的含量未显示显著的不同。

B.肤色调节剂

在一些实施例中，可能期望在组合物中包含肤色调节剂与FSF的组合。可包含肤色调节剂以进一步改善整体肤色。当存在时，本发明组合物包含按所述组合物的重量计至多约50%、40%、30%、20%、10%、5%、或3%的肤色调节剂。当存在时，本发明组合物包含按所述组合物的重量计至少约0.001%、0.01%、0.1%、0.2%、0.5%、或1%的肤色调节剂。适宜的范围包括下限和上限的任何组合，包括按所述组合物的重量计约0.1%至约50%；约0.2%至约20%；或约1%至约10%适宜范围内的肤色调节剂。本文所列的量仅用作指导，因为具体活性物质的效能确实显著不同，肤色调节剂的最佳量取决于所选的具体活性物质。

适宜的肤色调节剂包括但不限于糖胺、维生素B3化合物、熊果苷、脱氧熊果苷、1,3-二羟基-4-烷基苯如己基间苯二酚、二月桂酸蔗糖酯、补骨脂酚（4-[(1E,3S)-3-乙烯基-3,7-二甲基–1,6-辛二烯基]苯酚或单萜苯酚）、焦宁（购自Biotech Marine（France））、黍稷种子提取物、十八烯二酸、肉桂酸、阿魏酸、achromaxyl（芥末花提取物）、甲基烟酰胺、油溶性甘草提取物、叶酸、十一碳烯酸（即十一碳烯酸）、十一碳烯酸锌、硫胺素（维生素B1）及其盐酸盐、L-色氨酸、向日葵（朝阳花）和葡萄（葡萄）叶提取物、肌肽（即肌肽）、龙胆酸甲酯、1,2-己二醇和1,2-辛二醇（即以商品名Symdiol68由Symrise AG（Germany）出售的组合）、肌醇、十一碳烯酰基苯丙氨酸（例如以商品名Sepiwhite由Seppic（France）出售）、曲酸、去氧苯比妥化合物、水杨酸、和类视色素（包括视黄醇和丙酸视黄酯）。

在某些实施例中，附加的肤色调节剂选自维生素B3化合物、糖胺、去氧苯比妥化合物、水杨酸、1,3-二羟基-4-烷基苯如己基间苯二酚、以及类视色素。如本文所用，“维生素B₃化合物”是指具有下式的化合物：

其中R为-CONH₂（即烟酰胺）、-COOH（即烟酸）或-CH₂OH（即烟基醇）；它们的衍生物；以及任何上述物质的盐。如本文所用，“糖胺”包括上述物质的异构体和互变异构体以及它的盐（例如HCl盐）和它的衍生物。糖胺的例子包括葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、它们的异构体（例如立体异构体）和它们的盐（例如HCl盐）。如本文所用，“去氧苯比妥化合物”是指具有下式结构的化合物：

其中R¹和R²是任选的，或为有机酸（例如磺酸等）。在一个实施例中，去氧苯比妥化合物为二羟乙基磺酸己氧苯醚。

C.抗炎剂

色素沉着过度可由皮肤炎症引起。瞬时发炎事件引发色素沉着过度，并且更具体地讲引发发炎后色素沉着过度，包括但不限于粉刺损害、内生毛、擦伤、昆虫螫咬、表面活性剂损伤、过敏原和短期紫外线曝光。包括发炎后色素沉着过度在内的炎症引发的色素沉着过度可通过向本发明组合物中掺入抗炎剂来控制。当存在时，本发明组合物包含按所述组合物的重量计至多约20%、10%、5%、3%、或1%的抗炎剂。当存在时，本发明组合物包含按所述组合物的重量计至少约0.001%、0.01%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、或1%的抗炎剂。适宜的范围包括下限和上限的任何组合。适宜的抗炎剂包括但不限于非甾族抗炎剂（NSAIDS，包括但不限于布洛芬、萘普生、氟芬那酸、依托芬那酯、阿司匹林、甲芬那酸、甲氯芬那酸、吡罗昔康和联苯乙酸）、甘草酸（还被称为甘草素、甘草甜素和甘草皂甙）和盐如甘草酸二钾、甘草次酸、甘草提取物、红没药醇（例如α-红没药醇）、茜草提取物（从茜草属植物尤其是茜草中提取）、和乳香树脂（从没药属植物尤其是印度穆库尔没药中提取）、可乐果提取物、春黄菊、红三叶草提取物、和海鞭提取物（从柳珊瑚目植物中提取）、任何上述物质的衍生物、以及它们的混合物。

D.防晒活性物质

本主题发明的组合物可包含一种或多种防晒活性物质（或“防晒剂”）和/或紫外线吸收剂。本文中，“防晒活性物质”总体上包括防晒活性物质、防晒剂、和/或紫外线吸收剂。防晒活性物质包括防晒剂和物理防晒剂。防晒活性物质可以是有机的或无机的。适宜防晒活性物质的例子公开于Personal Care Product Council的“International CosmeticIngredient Dictionary and Handbook”第十三版“防晒剂”中。尤其适宜的防晒活性物质为对甲氧基肉桂酸2-乙基己酯（可以商品名PARSOL^TMMCX商购获得）、4,4'-叔丁基甲氧基联苯酰甲烷（可以商品名PARSOL^TM1789商购获得）、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、辛基二甲基对氨基苯甲酸、二倍酰三油酸酯、2,2-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮、4-(二(羟丙基))氨基苯甲酸乙酯、2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸2-乙基己酯、水杨酸2-乙基己酯、对氨基苯甲酸甘油酯、水杨酸3,3,5-三甲基环己酯、邻氨基苯甲酸薄荷酯、对二甲基氨基苯甲酸或氨基苯甲酸酯、对二甲基氨基苯甲酸2-乙基己酯、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸、2-(对二甲基氨基苯基)-5-磺酸苯并唑、氰双苯丙烯酸辛酯、氧化锌、亚苄基樟脑及其衍生物、二氧化钛、以及它们的混合物。

在一个实施例中，所述组合物可包含按所述组合物的重量计约1%至约20%，或约2%至约10%的防晒活性物质。确切的量将根据所选的防晒活性物质和所期望的防晒因子（SPF）而变化，这在本领域技术人员的理解范围内。

E.任选组分

本发明组合物可包含多种其它成分，前提条件是它们不会不可接受地改变本发明的有益效果。当存在时，本发明组合物可包含按所述组合物的重量计约0.0001%至约50%；约0.001%至约20%；或约0.01%至约10%的任选组分。本文所列的量仅用作指导，因为具体活性物质的效能确实显著不同，用于组合物中的任选组分的最佳量取决于所选的具体活性物质。因此，可用于本发明中的一些任选组分的量可在本文所列范围之外。

当掺入到所述组合物中时，任选组分应适用于和人类皮肤组织接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等等。本发明组合物可包含任选组分，如抗痤疮活性物质、脱屑活性物质、抗蜂窝炎剂、螯合剂、类黄酮、美黑活性物质、非维生素抗氧化剂和自由基清除剂、毛发生长调节剂、抗皱纹活性物质、抗萎缩活性物质、矿物、植物甾醇和/或植物激素、N-酰基氨基酸化合物、抗微生物或抗真菌活性物质、以及其它可用的护肤活性物质，其更详细地描述于美国专利申请公布No.US2006/0275237A1和US2004/0175347A1中。

Personal Care Product Council的“International Cosmetic IngredientDictionary and Handbook”第十三版描述了多种常用于护肤产业中的非限制性化妆品和药物成分，它们是适用于本发明组合物中的任选组分。这些成分类别的例子包括：研磨剂、吸收剂、美观组分如芳香剂、色素、染色剂/着色剂、精油、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂、基料、生物添加剂、缓冲剂、增量剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀虫剂、变性剂、药物收敛剂、润肤剂、外用止痛剂、成膜剂或成膜材料、遮光剂、pH调节剂、防腐剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤凉爽剂、皮肤保护剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素、以及它们的组合。

F.皮肤病学可接受的载体

本发明的组合物还可包含用于所述组合物的皮肤病学可接受的载体（其可称为“载体”）。如本文所用，短语“皮肤病学可接受的载体”是指所述载体适于局部施用于角质组织，具有良好的美观性能，与组合物中的活性物质相容，并且不引起任何不合理的安全或毒性问题。在一个实施例中，所述载体的含量按所述组合物的重量计为约50%至约99%，约60%至约98%，约70%至约98%，或约80%至约95%。

载体可呈多种形式。非限制性例子包括简单溶液（例如基于水、有机溶剂、或油的）、乳液、和固体形式（例如凝胶、条棒、可流动固体、或无定形物质）。在某些实施例中，所述皮肤病学可接受的载体为乳液形式。乳液一般可分类为具有连续水相（如，水包油和水包油包水）或连续油相（如，油包水和油包水包油）。本发明的油相可包含硅油，非硅氧烷类油诸如烃油、酯、醚等、以及它们的混合物。

所述含水相通常包含水。然而，在其它实施例中，水相可包含不是水的组分，包括但不限于水溶性保湿剂、调理剂、抗微生物剂、湿润剂和/或其它水溶性护肤活性物质。在一个实施例中，所述组合物中的非水组分包括湿润剂，诸如甘油和/或其它多羟基化合物。然而，应当认识到，所述组合物可以是基本上（即小于1%的水）或完全无水的。

选择适宜的载体以获得所需的产品形式。此外，组分（例如FSF、防晒活性物质、附加组分）的溶解度或可分散度可决定载体的形式和特征。在一个实施例中，优选水包油或油包水乳液。

乳液还可包含乳化剂。所述组合物可包含任何适宜百分比的乳化剂以充分乳化所述载体。适宜的重量范围包括按所述组合物的重量计约0.1%至约10%，或约0.2%至约5%的乳化剂。乳化剂可为非离子、阴离子或阳离子的。适宜的乳化剂公开于例如美国专利3,755,560、美国专利4,421,769、和McCutcheon的“Detergents and Emulsifiers”北美版第317-324页（1986）。取决于所需的产品形式，合适的乳液可具有范围很宽的粘度。

如本领域所熟知的，所述载体还可包含增稠剂以提供具有适宜粘度和流变特征的组合物。

G.示例性组合物

以下是本发明组合物的非限制性例子。实例的给出仅是为了举例说明之目的，不应被解释为是对本发明的限制，因为在不背离本发明的实质和范围的情况下，其许多改变是可能的，这会被本领域的普通技术人员所理解。在实例中，除非另外指明，所有浓度均按重量百分比列出，并且可排除次要材料，如稀释剂、填料等。因此，所列制剂包括所列组分和与该组分相关的任何微量物质。对本领域普通的技术人员来说显而易见的是，这些微量物质的选择将根据选择制备如本文所述发明的具体成分的物理和化学特性而不同。

所有实例均可用于处理或改善一个或多个色素沉着点的外观。本发明还可涉及一种方案，所述方案涉及用第一组合物（例如实例A或B）局部处理一个或多个色素沉着点，以及用第二组合物（例如实例C、D和E）更广泛或全面的处理面部皮肤，所述第二组合物可在局部处理之前或之后施用，以改善整个面部的肤色。

*1–由Integrated Botanical Technologies（New York）生产。

*2–Sepiwhite，购自SEPPIC（France）。

*3–Emulgade PL68/50，购自Cognis GmbH。

*4–Sepigel305，购自SEPPIC（France）。

*5–Dow Corning DC1503，购自Dow Corning，Inc.（Midland，MI）。

本发明组合物通常由常规方法制备，如本领域已知的制备局部用组合物的方法。上述方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至比较均一的状态，可使用或不使用加热、冷却、施加真空等。通常，通过首先将水相材料与脂肪相材料分开混合，然后视情况混合两相，获得所期望的连续相，制得乳液。优选制备所述组合物，以使活性物质的稳定性（物理稳定性、化学稳定性、光稳定性）和/或递送最优。这种最优化可包括合适的pH值（如，小于7）、排除可与活性物质复合并因而负面影响稳定性或递送的物质（如排除杂质铁）、使用预防复合物形成的方法（如合适的分散剂或双层包装）、使用合适的光稳定性方法（如加入防晒油/防晒霜、使用不透明的包装），等等。

本发明的组合物优选包含自或约0.01%至或约10%，更优选自或约0.05%至或约5%，最优选自或约0.1%至或约5%（例如2%）的无花果浆液组分。

H.亮肤方法

本发明的组合物可用于淡化哺乳动物皮肤（尤其是人类皮肤，更尤其是面部和手部皮肤）。所述组合物尤其可用于淡化皮肤色素沉着区域。

亮肤（包括色素沉着区域）方法涉及向皮肤局部施用安全且有效量的本发明组合物。在一个实施例中，本发明的化妆品组合物可包含0.01%至10%的无花果浆液组分。组合物的施用量、施用频率和使用周期将根据指定组合物中的无花果浆液组分和/或其它组分的含量以及所期望的淡化度而广泛变化，例如根据受试者具有的皮肤色素沉着程度和进一步的皮肤色素沉着速率而广泛变化。

在一个优选的实施例中，所述组合物长期涂敷于皮肤。“长期局部施用”是指在受试者的一生中，基本上长期持续局部施用组合物，优选至少约一个星期时间，更优选至少约一个月时间，甚至更优选至少约三个月时间，甚至更优选至少约六个月时间，还甚至更优选至少约一年时间。尽管有益效果在各最大使用期（例如二、五、十或二十年）后仍能获得，但是优选在受试者整个一生中都长期持续施用。在上述延续期间，通常依照每天约一次或两次的规律施用，然而，施用频率可以变化，例如约每周一次至最多约每天三次或更多次。

可采用本发明组合物的各种用量范围，以提供亮肤有益效果。每次施用所通常施加的本发明组合物的量为约0.1mg/cm²皮肤至约10mg/cm²皮肤。尤其可用的施用量为约2mg/cm²皮肤。

本文所用术语“局部应用”是指将本发明的组合物涂敷或分散于皮肤表面。本发明优选的组合物是旨在局部施用后与皮肤保持长时间（例如几小时）接触的那些形式，例如霜膏、乳液、保湿剂等典型用途。

优选通过局部施用皮肤乳液、霜膏、化妆品等形式的组合物实施亮肤方法，所述组合物旨在保留于皮肤上以获得美观、预防、治疗或其它有益效果。将所述组合物施用于皮肤后，其优选在皮肤上保留至少约15分钟时间，更优选至少约30分钟时间，甚至更优选至少约1小时时间，最优选地至少几小时时间，例如至多约12小时时间。

更一般地讲，本发明的组合物还可用于调节哺乳动物皮肤状况（尤其是人类皮肤，更尤其是面部和/或手部皮肤），包括皮肤老化迹象，以及与皮肤老化相关的皮肤可见和/或可触知的不连续状况。此类调节包括预防性和/或治疗性调节。调节皮肤状况涉及向皮肤局部施用安全且有效量的本发明组合物。组合物的施用量、施用频率和使用周期将根据指定组合物中的无花果浆液组分和/或其它组分的含量以及所期望的调节程度而广泛变化，例如根据受试者具有的皮肤老化程度和进一步皮肤老化的速率而广泛变化。

I.无花果浆液组分生物活性

本发明还涉及通过将所述化妆品组合物局部施用至色素沉着过度区域以破坏黑素生成（黑素合成）的一个或多个步骤，而减少皮肤色素沉着过度外观的方法。化妆品组合物实现酶抑制（胰蛋白酶抑制活性和/或酪氨酸酶抑制活性）、抗氧化剂活性（ORAC和DPPH）、和/或COX-2抑制，从而破坏黑素生成的一个或多个步骤。

制备生物活性植物化妆品组合物的方法优于当前方法，因为它得到获取植物细胞中包含的全部活性的植物提取物。如实例6中所示，本发明的无花果提取物具有比经由传统方法提取的无花果更高的生物活性。

在本发明的一个实施例中，淡化哺乳动物皮肤的方法包括局部施用包含有效量无花果浆液组分的化妆品组合物以抑制胰蛋白酶活性。

本发明的另一个实施例包括通过抑制哺乳动物皮肤中酪氨酸酶活性而淡化哺乳动物皮肤的方法，所述方法包括向哺乳动物局部施用包含有效量无花果浆液组分的化妆品组合物。

黑素形成正常的肤色，所述黑素为还确定毛发和眼睛颜色的天然色素。在皮肤中，酶酪氨酸酶是负责氨基酸酪氨酸转化成黑素的生物化学途径所必需的。当形成过多黑素并且在皮肤中形成沉积物时，发生色素沉着过度。产生色素的细胞称为黑素细胞。它们位于表皮底层。黑素细胞产生黑素体，其转移到其它表皮细胞上，并且向上前往皮肤顶层。黑素的合成仅发生于黑素体中。当产生过多的黑素时，形成沉积物，并且在皮肤中出现色素沉着过度。

酪氨酸酶是含铜单氧酶，其催化一元酚o-羟化至相应的儿茶酚（一元酚酶或甲酚酶活性），以及一元酚氧化成相应的o-醌（二元酚酶或儿茶酚酶活性）。酪氨酸酶的这些功能在黑素生成期间的黑素色素形成中起重要的作用。黑素产生是肤色的主要成因，并且在预防阳光引发的皮肤损伤方面起重要作用。然而，皮肤中黑素产物的异常积聚是色素沉着过度的成因，所述色素沉着过度包括黑斑、黄褐斑、雀斑、和老年斑，这可造成非期望的外观（Jeon等人，（2005），“Bull.Korean Chem.Soc”，第26卷：1135-1137）。

本发明一般涉及抑制造成哺乳动物皮肤组织中色素沉着或皮肤着色的至少一种酶的活性。无花果浆液组分可抑制胰蛋白酶以及酪氨酸酶和其它酪氨酸酶类酶的活性。此外，本发明涉及实现与色素相关的抗氧化剂活性（ORAC和DPPH），包括过氧化物清除活性以及COX-2抑制。

源自浆液的化妆品组合物具有ICR50值介于约50至190μg干质/mL范围的过氧化物清除效能。如本专利申请中所用，术语“ICR50值”表示抑制50%细胞色素c还原所需的细胞浆液组分中所含干质的浓度。

可每日几次频繁地向哺乳动物施用所述化合物，或可较低频率的施用所述化合物，如每日一次、每周一次、两周一次、每月一次，或甚至更低频率，如每几月一次或甚至每年一次或更少。施用频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于以下多项因素，比如但不限于所治疗的疾病类型和严重性、动物的类型和年龄等。

J.任选组分

本发明组合物可包含多种既定产品类型中常用的其它成分，前提条件是，它们不会不可接受地改变本发明的有益效果。所述组合物可包含皮肤病学可接受的载体。

当掺入到组合物中时，任选组分应适用于和人类皮肤组织接触，在合理的判断范围内没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等等。“CTFA Cosmetic Ingredient Handbook”第二版（1992）描述了多种通常用于皮肤护理领域的适用于本发明组合物中的非限制性美容和药物成分。这些成分类别的例子包括：研磨剂、吸收剂、美容组分如芳香剂、颜料、染色剂/着色剂、精油、抗结块剂、消泡剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、增量剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀虫剂、变性剂、药物收敛剂、外用止痛剂、成膜剂或成膜物质（如用于辅助组合物成膜特性和亲和性的聚合物（如二十碳烯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物））、遮光剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂和增稠剂。

在一些实施例中，可能期望在组合物中包含第二肤色调节剂、第三肤色调节剂或第四肤色调节剂与FSF的组合。可包含第二肤色调节剂、第三肤色调节剂或第四肤色调节剂以进一步改善整体肤色。当存在时，本发明组合物优选包含按所述组合物的重量计约0.1%至约50%，更优选约0.2%至约20%，甚至更优选约1%至约10%的附加肤色调节剂。本文所列的量仅用作指导，因为具体活性物质的效能确实显著不同，附加肤色调节剂的最佳量取决于所选的具体活性物质。优选的肤色调节剂包括但不限于N-乙酰基葡糖胺、维生素B3、和十一碳烯酰基苯丙氨酸（例如以商品名Sepiwhite（Seppic，France）出售）。在一些实施例中，可使用一种组合物（例如表1中的组合物#1）作为一个或多个色素沉着点的局部处理物，同时在指定处理之前或之后向面部皮肤表面更全面地施用一种或多种其它组合物（例如表1中的组合物#2、#3和#4），以改善整个面部的肤色。

本发明的局部用组合物可以多种形式提供，包括但不限于乳液、乳剂、摩丝、浆液、喷剂、气溶胶、泡沫、条棒、笔剂、凝胶、霜膏和油膏剂。在一个实施例中，所述组合物为溶液形式，并且在另一个实施例中，所述组合物为乳液形式。

K.组合物的制备

本发明组合物通常由常规方法制备，如本领域已知的制备局部用组合物的方法。上述方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至比较均一的状态，可使用或不使用加热、冷却、施加真空等。优选制备所述组合物，以使活性物质的稳定性（物理稳定性、化学稳定性、光稳定性）和/或递送最优。这种最优化可包括合适的pH值（如，小于7）、排除可与活性物质复合并因而负面影响稳定性或递送的物质（如排除杂质铁）、使用预防复合物形成的方法（如合适的分散剂或双层包装）、使用合适的光稳定性方法（如加入防晒油/防晒霜、使用不透明的包装），等等。

L.治疗方法

在一个实施例中，使用者选择需治疗的色素沉着点，并且在至少约4周内，至少每天一次，并且更优选每天两次，将第一组合物施用至所述色素沉着点。在另一个实施例中，在至少约8周期间，将所述第一组合物施用至所选的色素沉着点。第一组合物可为任何形式。在一个实施例中，所述组合物为溶液形式，其由滴眼管局部施用至色素沉着点。可使用能够向色素沉着点局部施用第一组合物的其它施用装置。例如，可使用端部具有泡沫或棉花的施用装置将组合物施用至色素沉着点，所述施用装置可释放地容纳如本文所述溶液、乳液等第一组合物或其它形式的第一组合物。在另一个实施例中，将所述组合物施用至一个或多个色素沉着点，并且更一般地，同时施用至一个或多个面部皮肤表面（即在同一治疗治疗周期内）。

在某些情况下，治疗方法包括选择一个治疗周期内用第一组合物局部治疗的多个色素沉着点。如本文所用，治疗周期是指向旨在治疗的皮肤表面单次施用组合物。例如，以合理的短暂间歇向一个或多个色素沉着点单次施用第一组合物（例如在1至30分钟时间内）构成单次治疗周期。相比之下，每天两次向一个或多个色素沉着点单次施用第一组合物构成两个治疗周期，其中施用彼此间隔较长时间（例如间隔1至12小时）。

在一个实施例中，治疗方法包括第一组合物与第二组合物组合施用，所述第二组合物在所述第一组合物之前或之后施用，其中第二组合物更一般性地施用于一个或多个面部皮肤表面，以改善面部皮肤的整体色调外观。可将第二组合物施用至前额、口周、下颏、眶周、鼻部和面颊皮肤表面中的一个或多个上。在一个实施例中，在单次治疗周期中将第二组合物同时至少施用至面颊、前额、和下颏/口周皮肤表面。与色素沉着点的局部治疗相比，第二组合物施用的表面区域更大。

虽然本文所述方法设想用施用装置施用本发明的组合物，但是应当理解，施用装置不是必需的，并且本发明组合物可直接或使用手指（或以某些其它方式）施用。此外，虽然本发明的一个实施例设想向一个色素沉着点局部施用组合物，但是应当理解，更一般地将本发明组合物施用至一个或多个面部皮肤表面，以减少位于那些面部皮肤区域内的色素沉着点外观。

提供下列实例以说明本发明的多个实施例的某些特征和优点，并且不应被理解为限制它们的范围。

实例

现在参照下列实例描述本发明。这些实例仅因例证目的而提供，不应以任何方式理解为限于这些实例，而是应理解为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有的变型。

实例1

制备来源于新鲜孟加拉榕树叶的生物活性浆液组分。

图1为示意图，展示由新鲜无花果叶制备生物活性浆液组分的方法的一个实施例。

收集足量的新鲜孟加拉榕树叶，以获得约100kg干质。测得新鲜叶中的干质含量为32.01%，需要收获约312.4kg新鲜植物叶以获得100kg干质。小心地维持新鲜叶中的固有含水量，并且避免因水分损失而造成的萎蔫。以此方式实施收集，以避免所收集新鲜叶的任何损伤或使所述任何损伤最小化。在可能的最短期间内完成所有步骤，以使新鲜叶与阳光、高温以及其它不利环境因素的接触最小化。

然后在≤5分钟内以及≤1kg/cm²水压下洗涤所收集的叶，以从所述叶上去除污垢颗粒和其它碎屑，之后进一步处理。余下的水洗不包含任何绿色或褐色色素，表明叶片组织完整、水压适当以及耐洗涤。从洗过的叶上去除过量的水。然后将洗过的新鲜无花果叶机械分离，这有效地使包含大部分实质细胞的细胞内物质的无纤维细胞汁与主要包含细胞壁的富含纤维的物质分离。在分离过程之前或期间，不加入外来溶剂或水。

洗过的叶经历碾磨、浸泡、和挤压，以获得细胞内液体内容物（即细胞汁）并且使其与富含纤维的物质分离。使用具有5HP引擎和一组筛网的锤磨机（型号VS35，VincentCorporation，Tampa，FL）碾磨叶，以在最短时间内获得具有适宜小尺寸的叶组织颗粒，而不显著增加生物质温度。设置锤磨机以在≤10秒处理期间获得≤2.0厘米的最大浸透叶颗粒尺寸。新鲜浸透叶的温度仅增加≤2℃。

立即使用配备由压缩空气承载的锥体的水平连续螺旋压榨机（Compact PressCP-6，Vincent Corporation，Tampa，FL），由新鲜浸透叶获得细胞汁。锥体上的压力保持在≥15g/cm²水平，并且螺杆转速为12rpm。在这些条件下，细胞汁的温度仅增加≤5℃。

该处理获得富含纤维的物质和细胞汁。采用具有全自动卸料单元的连续式离心机（型号12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA）净化，从细胞汁中进一步去除残余的小纤维颗粒。在2L/min流速下，≤2,250g的细胞汁净化保留时间≥100秒。上述方案获得无纤维的细胞汁。收集包含小纤维颗粒的沉淀，并且与新鲜叶压榨后产生的其余富含纤维的物质合并。

上述方法能够产生160.9kg具有9.29%干质含量的细胞汁，和151.5kg具有56.14%干质含量的富含纤维的物质。将细胞汁快速放置于密封的15升矩形HDPE容器中，并且在–30℃下冷冻。固态冷冻细胞汁保持在该低温下以供进一步利用。

细胞汁包含三种主要类型的组分：（i）膜结合的叶绿体、线粒体、内质网、胞核、溶酶体、过氧化物酶体、液泡、高尔基氏体；和（ii）非膜结合的核糖体、微管；以及（iii）与上述类别无关的组分如细胞质。由于细胞器和它们的片段以及非期望的色素和蛋白质存在于细胞汁中，因此需要将其分级获得具有所期望功能特性组合的个人护理成分，所述特性包括但不限于颜色、溶解度、透明性、稳定性和体外活性。为达到这些目标，采用多种处理将细胞汁分级，包括细胞汁液化、pH调节、聚焦微波辐射、离心分离、和真空过滤。然后用防腐剂和抗氧化剂稳定分离的细胞汁浆液组分。

使细胞汁的处理持续时间和强度最小化，以消除氧化应激、水解、变性、异构化、聚合以及其它非期望的过程。

在≤2分钟内，通过液化，使15升容器中的细胞汁完成自冷冻态至初始液态的转化。在该处理期间，细胞汁温度仅增加≤20℃。短持续时间的该处理能够使变性过程和氧化性损伤最小化。细胞汁冷冻和液化后，其物化和生化特性与从新鲜叶中分离细胞汁期间测得的相应特性相同。这些特性包括但不限于其干质含量、pH、电导率、氧化还原电位、渗透度、和IR光谱。

然后，采用滴定方法，使用5.0N盐酸（HCl）调节接近中性的细胞汁pH，以将细胞汁pH降至≥3.0（pH调节1）。调节过的细胞汁立即用频率2,450MHz的聚焦微波辐射处理。在该聚焦微波处理（FMP）期间，细胞汁温度短暂升至90℃，在该温度下保持1分钟，然后使细胞汁温度立即降至≤30℃。然后使用连续式离心机CEPA LE（Carl Padberg ZentrifugenbauGmbH，Germany），在15,000rpm和≥30秒保留时间下快速分离处理过的细胞汁。分离15.0kg处理过的细胞汁，产生1.37kg绿色糊状沉淀（“沉淀I”）和13.63kg具有6.75%干质含量的浅褐色稍乳浊的液态上层清液（“上层清液I”）。该上层清液I用于进一步分级。

表1表示经pH调节的细胞汁在FMP处理期间达到的最大温度（Tmax）对上层清液I中干质含量、其色度以及叶绿素a和叶绿素b的存在（通过分别测定662nm和642nm处的吸光度确定）的影响的数据。

表1.FMP Tmax对所选上层清液I参数的影响

表1数据表明，Tmax=90℃下获得的上层清液I具有较高的干质含量，并且不包含叶绿素。虽然Tmax=60℃下获得的上层清液I的格氏标度值较低，但是该制剂具有显著较低的干质含量，并且包含较高残量的叶绿素。除了该色素非期望地存在于化妆品成分中以外，叶绿素还可转化成被认为是毒性化合物的脱镁叶绿酸（Bergstrom，L.C.、Vucenik，I.、Hagen，I.K.、Chernomorsky S.A.、Poretz R.D.，“In-vitro photocytotoxicity oflysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladdercarcinoma cells.”–J.Photochem.Photobiol.，24,1,17–23,1994），并且是造成皮肤刺激的原因（Kato T.，Yamada K.，“Relationship between appearance ofphotosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder.”–J.FoodHyg.Soc.Japan，36,632–634,1995）。

根据上述原因，选择经pH调节的细胞汁的FMP Tmax=90℃，作为获得上层清液I的优选方案，然后进行目的为改善功能特性的进一步分级，所述功能特性包括但不限于个人护理成分的颜色、透明性和稳定性。应当指出的是，上层清液I具有所期望的体外活性，如（i）酶抑制活性，包括但限于酪氨酸酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、环加氧酶-2（COX-2）抑制活性，（ii）自由基清除活性，和（iii）抗氧化剂活性，包括但不限于氧自由基吸收能力。考虑到所有上述体外活性的至关重要性，它们不应受改善所期望个人护理成分功能特性所需的其它处理的影响。就组合物的改善而言，应进一步处理上层清液I以显著去除褐色素以及其它非期望的化合物，包括残余的蛋白质。

为达到该目的，使上层清液I经历进一步处理，包括pH调节和分离。采用滴定方法，使用50%氢氧化钠（NaOH）将细胞汁上层清液I的pH从～3.0增至～7.5（pH调节2），开始第一处理。应当指出的是，在pH=7.5以上，上层清液II丧失所期望的弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制活性。然后快速分离处理过的细胞汁。pH调节2获得颜色更深的物质和更高的乳浊度，使用连续式离心机CEPA LE（Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Germany），在15,000rpm和≥30秒保留时间下，其立即澄清。上述分离获得0.53kg褐色糊状沉淀（下文为沉淀II）和13.10kg具有6.59%干质含量的褐色稍乳浊的上层清液（下文为上层清液II）。

然后使用5.0N盐酸（HCl）对上层清液II进行滴定，以将pH值降至pH～3.6（pH调节3）。此类处理获得颜色更浅的滴定过的上层清液II，然而其乳浊度稍增加。通过具有0.2微米孔尺寸的膜进行灭菌过滤处理该物质。这获得浅色透明的新鲜无花果叶浆液组分。

浆液组分的色度值（格氏标度值=7.0）低于上层清液I的色度值（格氏标度值=8.5）。应当指出的是，浆液组分的格氏标度值总是低于不同FMP Tmax条件（表2）下获得的相应上层清液I的色度值。

表2.用于细胞汁处理的FMP Tmax对上层清液I和浆液组分色度（格氏标度）的影 响。

得自细胞汁的浆液组分在液化、pH调节（在3.0至7.0的pH范围内）、聚焦微波辐射（FMP Tmax=90℃下1分钟）、离心分离和灭菌过滤后，展示出所有所期望的酶抑制活性、自由基清除活性、和抗氧化剂活性。

就浆液组分中的残余蛋白质含量的测定而言，使用了凯氏定氮法可靠地检测浆液组分及其超滤液中的氮含量，所述浆液组分包含能够干扰色度测定的酚类化合物。使用不同的膜将浆液组分分成三种滤液，所述滤液分别具有≤15、≤10和≤5千道尔顿（kD）的分子量。涉及样品中氮含量的数据示于表3中。

表3.超滤条件对过滤浆液组分中氮含量的影响。

数据显示，即使通过低截留分子量膜超滤后，氮含量没有显著变化，表明浆液组分中几乎所有的氮是非蛋白质的，即浆液组分不包含蛋白质。

通过加入抗氧化剂、稳定剂、螯合剂和防腐剂，进一步稳定浆液组分。下面是用于稳定如本发明实例1中所述浆液组分的添加剂的组成：0.2%偏亚硫酸氢钠、0.1%山梨酸钾、0.1%苯甲酸钠、0.1%对羟基苯甲酸甲酯钠。培养混合物，直至实现溶解（≥30分钟）。然后将1.9%戊二醇加入到混合物中。

浆液组分包含约6.38%干质，并且其得自新鲜无花果叶的收率为约36%。得自100kg初始新鲜无花果叶干质的浆液组分干质产量为约7.2kg。

浆液组分的所选特性及其体外活性示于表4和表5中。

表4.得自孟加拉榕树的浆液组分的所选特性。

*)报告加入稳定剂前产品的干质（%）。

表5.基于干质百分比计算的浆液组分所选体外活性

活性	结果
		酪氨酸酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.362
弹性蛋白酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.067
		胰蛋白酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.342
环加氧酶-2抑制活性（IC50，mg/mL）	5.40
		自由基清除活性（1/X）*	2.57
氧自由基吸收能力（1/Y）**	0.98

*)X–完全清除1单位干重DPPH的单位干重测试制品数

**)Y–产生的抗氧化剂效应与1单位干重(R)-Trolox甲基醚等效的单位干重测试制品数

实例2

得自孟加拉榕树细胞汁的浆液组分特征和体外活性的比较

收集不同地点的新鲜无花果叶，并且如实例1中所述压榨成细胞汁。将该细胞汁冷冻并且储存于–30℃下的密封的15升矩形HDPE容器中。采用如实例1中所述相同的方法，将一个或多个容器依次处理成浆液组分。

示于表6和表7中的数据表明浆液组分的所选特性和体外活性的变化，所述浆液得自相同冷冻细胞汁源的不同时间多个分级组分以及得自不同冷冻细胞汁源的分级组分。

表6.得自孟加拉榕树细胞汁的浆液组分所选特性

*)报告加入稳定剂前产品的干质（%）。

**)可根据不同设定下的光谱分析确定一些样品中的肩峰

表7.基于干质百分比计算的浆液组分所选体外活性。

活性	结果
		酪氨酸酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.133–0.437
弹性蛋白酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.067–0.103
		胰蛋白酶抑制活性（IC50，mg/mL）	0.342–1.003

实例3

制备孟加拉榕树干叶的水提取物

用GM200Grindomix切碎机（Retsch，Germany）磨碎50g风干孟加拉榕树叶（收集自实例1中所用相同批次叶），以获得尺寸为<300微米的颗粒。碾磨包括在2,500rpm下20秒，然后在2,500rpm下10秒，接着在10,000rpm下10秒。采用OMNI可编程数字匀浆仪（OMNIInternational，Kennesaw，GA），使用去离子水匀化磨碎的叶。将35g磨碎的叶与490g水混合，并且放置于匀浆仪平台上的冰浴中。用20mm匀浆仪分散头，以15,000rpm的速率实施匀化15分钟。然后在Initiator2微波聚焦处理器（Biotage AB，Uppsala，Sweden）中，使匀浆经历90℃下微波处理1分钟。接着使微波处理过的物质在3,200g下离心30分钟。然后将上层清液真空过滤通过三层Whatman No:2滤纸，并且用盐酸（HCl）将滤液滴定至pH4.0。使滴定过的物质在3,200g下离心30分钟，然后将上层清液通过0.2微米灭菌过滤器真空过滤。将稳定剂加入到样品中：0.2%偏亚硫酸氢钠、0.1%山梨酸钾、0.1%柠檬酸、0.1%苯甲酸钠。培养混合物，直至实现完全溶解（≥30分钟）。将所得干叶水提取物放置于玻璃样品瓶中，并且在室温下储存于黑暗中。干燥无花果叶水提取物的所选特性和体外活性示于表8中。

表8.干燥孟加拉榕树叶水提取物的所选特性和体外活性。

*)基于干质百分比计算呈现的体外活性。

**)X–完全清除1单位干重DPPH的单位干重测试制品数。

***)Y–产生的抗氧化剂效应与1单位干重(R)-Trolox甲基醚等效的单位干重测试制品数。

在广泛的测试浓度范围内，干燥无花果叶的水提取物不显示弹性蛋白酶、胰蛋白酶和环加氧酶-2抑制活性。得自同批孟加拉榕树叶的水提取物和浆液组分的所选特性和体外活性的比较示于表9中。

表9.得自同批孟加拉榕树叶的水提取物和浆液组分的所选特性和体外活性*的比 较。

*)基于干质百分比计算呈现的体外活性。

**)X–完全清除1单位干重DPPH的单位干重测试制品数。

***)Y–产生的抗氧化剂效应与1单位干重(R)-Trolox甲基醚等效的单位干重测试制品数。

实例4

得自不同无花果物种和地点的浆液组分的特性和体外活性

除了在印度和佛罗里达州（USA）收集的孟加拉榕树新鲜叶以外，使用下列无花果物种的新鲜叶分级以获得浆液组分：无花果、印度榕、细叶榕和佟氏榕。除了生长于波多黎各的佟氏榕以外，这些无花果物种生长于美国佛罗里达州。

经由实例1中所述的方法，获得浆液组分。将所有这些组分相对于它们的收率、所选的物化特性和体外活性进行比较（表10、表11和表12）。

表10.新鲜无花果叶的分级产物比较。

上表数据表明，在不同的无花果物种中，新鲜叶中的干质含量、细胞汁产量和浆液组分产量以及它们的干质含量、颜色和pH显著地不同。生长于印度和佛罗里达州的两种孟加拉榕树之间的对应差异表达小于不同无花果物种之间的差异。

涉及得自不同无花果物种的浆液组分的所选物化特性（表11）和体外活性（表12）的比较的额外数据支持该结论。

表11.得自不同无花果物种的浆液组分比较。

表12.得自不同无花果物种的无花果浆液组分的所选体外活性*。

*)基于干质百分比计算呈现的活性。

**)X–完全清除1单位干重DPPH的单位干重测试制品数。

***)Y–产生的抗氧化剂效应与1单位干重(R)-Trolox甲基醚等效的单位干重测试制品数。

实例5

传统无花果提取物与无花果浆液组分（孟加拉榕树）的LC/UV/MS色谱图比较

通过240-500nm的紫外线检测，并且通过C18柱上LC分离后正离子（m/z150-1150）和负离子（m/z100-1100）模式的电喷质谱方法，检测无花果提取物和FSF的组分。由于四极MS上所用的高扫描速度，在质谱色谱图中仅观测到主要组分和/或具有高电离效率的组分。由TOF/MS分析得自无花果浆液组分的无花果提取物，并且结构归属基于该确切质量和内源裂解数据。

如图2中所示，传统无花果提取物包含更晚洗脱（更疏水）的在FSF中未检出的化合物。如图3中所示，一类后洗脱化合物显示为脱镁叶绿酸，其为叶绿素降解产物。图4表明传统提取物包含较高量的可能为黄酮醇糖苷的物质。如图5中所证实的，FSF具有较高含量（约10倍）的儿茶素和相关的缩合丹宁。然而，如图6中所示，两个样品之间的三种咖啡酰奎尼酸异构体的含量未显示显著的不同。图7表明，FSF包含较高含量的游离酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

方法：

无花果浆液组分样本制备：

如实例1制备FSF。用90:10的水：DMSO将FSF样本稀释50倍（20uL样本+100uL DMSO+880uL水），并且依照下列条件，由LC/UV/MS分析。最终样本中的大致固含量为～1.26mg/mL。

传统样本制备：

称量10.64mg样本至4mL玻璃样品瓶中。将1.064mL的DMSO加入到样品瓶中并且超声处理30分钟，并且偶尔涡旋混合。将100uL该样本加入到4mL玻璃样品瓶中，并且用900uL水稀释。最终样本中的大致固含量为～1mg/mL。

HPLC条件：

HPLC：Waters Acquity UPLC二元溶剂管理器 S/N M05UPB601M

Waters Acquity UPLC样本管理器 S/N M05UPS632M

Waters Acquity UPLC PDA检测器 S/N M05UPD879N

MS: Waters Micromass Quattro Premier MS S/N VAA-219

LC柱：Waters Acquity UPLC BEH C18,1.7mm，2.1×100mm，部件号#

186002352，批号#0150371861

移动相：A：具有0.1%甲酸的水

B：具有0.1%甲酸的乙腈

分离： 梯度（见表）

时间（分钟）	流量	%A	%B	曲线
					初始	0.40mL/min	95.0	5.0
0.5	0.40mL/min	95.0	5.0	6
					6.5	0.40mL/min	70	30	6
13.5	0.40mL/min	0.0	100.0	6
					17.5	0.40mL/min	0.0	100.0	6
18.0	0.40mL/min	95.0	5.0	6
					19.0	0.40mL/min	95.0	95.0	6

进样体积：7.5uL部分定量环进样-针溢出

柱温=25℃

PDA240-500nm，20点/秒，过滤器时间常数0.2秒，暴露时间=自动，分辨率1.2nm

MS条件：

	电喷（+）	电喷（-）
			毛细管（kV）	3.0	3.0
锥孔（V）	30	40
			提取器（V）	2	3
RF透镜（V）	0.2	1.0
			源温度	120℃	120℃
解溶剂温度	350℃	350℃
			锥孔气体流量	50L/h	50L/h
解溶剂气体流量	900L/h	800L/h
			扫描质量范围	150-1150	100-1100
扫描持续时间	0.300秒	0.300秒
			中间扫描延迟	0.025秒	0.025秒

实例6

黑素合成

在测定中使用B16-F1小鼠黑素瘤细胞系。B16-F1细胞得自American TissueCulture Collection（Virginia，USA）。测定中使用的细胞培养基包含500mL Dulbecco改性Eagle介质（DMEM）、50mL胎牛血清（FBS）、和5mL青霉素-链霉素液体。在该介质中培养并且生长至大于90%铺满率的B16-F1细胞合成黑素。尽管不旨在被任何理论束缚，但还是推测黑素合成是由培养基和/或生长至高铺满率导致的应激而引发的。DMEM和FBS可得自AmericanTissue Culture Collection，并且青霉素-链霉素液体可得自Invitrogen，Inc.（California，USA）。测定中所用的设备包括CO2培养箱，如Therma Scientific（Massachusets，USA）的Forma系列3110型；血球计如Hauser Scientific（Pennsylvania，USA）的Bright Line型号；以及紫外-可见光谱孔板读取器如得自Molecular Devices（California，USA）的SpectraMax250。测定步骤包括：

第0天-细胞生长：将细胞培养基温热至37℃，并且将29mL放置于T-150烧瓶中。将约1×106的B16-F1一代小鼠细胞加入到T-150烧瓶中，并且在37℃、5%CO2、90%相对湿度下培养3天，直至～80%铺满率；

第3天-开始96孔板法：在第3天，使得自T-150烧瓶的细胞胰蛋白酶化，并且使用血球计测定细胞浓度。开始96孔板法，每孔具有2,500细胞的100uL细胞培养基溶液。将所述板在37℃、5%CO2、90%相对湿度下培养2天，直至至少20%至40%铺满率；

第5天-从板中去除细胞培养基，并且用新鲜培养基替换（每孔100uL）。加入1uL稀释于[水或DSMO]溶剂中的[受试化合物]。测定多个稀释比率，以生成剂量反应曲线，其中优选用每个稀释比率处理三个孔。对照物包括具有细胞培养基、B16-F1细胞、和溶剂的孔（对照物#1）；包含细胞培养基和溶剂的孔（对照物#2）；以及需要对照[受试化合物]背景颜色时任选的包含细胞培养基、溶剂和[受试化合物]的孔（对照物#3）；

第7天-测定黑素产生：细胞应具有大于～90%的铺满率。如果没有，不采用该数据点。向每个孔中加入100uL0.75%的氢氧化钠溶液。使用紫外-可见孔板读取器，在410nm下读取96孔板，以光学测定用[受试化合物]处理过的孔与没有用[受试化合物]处理过的对照孔之间产生的黑素量。其中产生黑素的孔呈现褐色。其中几乎没有产生黑素的孔呈现清澈至浅紫色。由下文公式计算黑素合成抑制百分比：

100-[OD410受试化合物–OD410对照物#2]×100

_________________________

(OD410对照物#1–OD410对照物#2)

其中OD410为由紫外-可见光谱孔板读取器测得的410nm处的光密度。

当使用对照物#3时，黑素合成抑制百分比的公式为：

100-[OD410受试化合物–OD410对照物#3]×100

________________________

(OD410对照物#1–OD410对照物#2)

一般来讲，使用上述测定法，与对照物细胞相比，FSF处理过的B16-F1细胞中的黑素合成被抑制，如下表13a和13b中所示。

表13a–FSF B16数据

表13b–无花果干叶溶剂提取物

干叶溶剂提取物	抑制%
		稀释	无花果R
0.01	23
		0.005	8
0.0025	1
		0.00125	-8
0.000625	-3
		0.0003125	-2
0.00015625	2
		0.000078125	2

虽然考虑可变因素如黑素产生复杂性和在皮肤中的转移以及受试化合物的皮肤渗透能力，与人类面部色素沉着点相对应的体内测试结果不具有肯定性，但是该测定法确实展示了物质如FSF潜在影响酪氨酸酶活性的能力。

实例7

酪氨酸酶抑制

酪氨酸酶是黑素生物合成中重要的酶。该测定法能够鉴定可影响蘑菇酪氨酸酶将L-酪氨酸转变成L-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）的能力的试剂。

试剂和供应商

酪氨酸酶：蘑菇酪氨酸酶，购自Sigma-Aldrich（Missouri，USA）；

酶基质：L-酪氨酸，购自Sigma-Aldrich（Missouri，USA）；

缓冲液：磷酸盐缓冲的盐溶液（PBS），购自Invitrogen（California，USA）；

阳性对照物：4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（熊果苷），购自Sigma-Aldrich（Missouri，USA）；

二甲基亚砜（DSMO），购自Sigma-Aldrich（Missouri，USA）；

1172Microtest^TM非组织培养物处理的透明平底96孔板；

潜在的酪氨酸酶抑制剂；

孔板读取器：Spectra MAX Plus，购自Molecular Devices（California，USA）；

数据采集和分析软件：SoftMax Pro，购自Molecular Devices（California，USA）

工作溶液浓度 测定的最终浓度

酪氨酸酶： 26单位/mL 13单位/mL

L-酪氨酸基质： 1mM 0.5mM

熊果苷阳性对照物： 20mM 200um

测定方案

制备试剂和阳性对照物

如下制备1mM的酶底物工作液：将.01812g的L-酪氨酸加入到100mL的1X PBS中。超声处理直至L-酪氨酸溶解。按需要涡旋。不使用时贮存于4℃下。

如下制备0.2M熊果苷阳性对照物原液：将.0544g熊果苷加入到1mL的DMSO中。涡旋并且超声处理1分钟，直至熊果苷溶解。通过将100uL该溶液加入到900uL的DMSO中，将其稀释1:10，获得20mM的熊果苷工作液。贮存于室温下直至使用。

潜在的酪氨酸酶抑制剂应配制于DMSO中。测定中的受试化合物最终体积为2μl，因此通常配制5-40mM（100X）的工作液，这在测试中获得50–400μM的最终浓度。

用冷的1XPBS，重构1000U/mL的酪氨酸酶。以1mL等分试样在–20℃下避光贮存该原液，直至需要。如下制备26U/mL的酶工作液：将1ml解冻的原液（1000U/mL）加入到37.5冷的1X PBS缓冲液中。这足以用于四个96孔板。避光并且保持于冰中，直至用于测定中。

实施测定

将200uL的1X PBS缓冲液加入到每个测试板上的三个相同孔中，用作合适的空白。

将2uL的DMSO加入到三个相同孔中，用作载体对照物。

将2uL的熊果苷加入到三个相同孔中，用作阳性对照物。

将2uL的潜在酪氨酸酶抑制剂加入到三个相同孔中。

将98uL的酪氨酸酶工作液加入到除空白以外的每个孔中。通过上&下移液两次或短暂涡旋，使化合物与酶混合。

加入100uL/孔的L-酪氨酸底物。

选择SpectraMax250孔板读取器上的动力学设置，并且每1分钟记录475nm处的吸光度读数，记录1小时。

采用数据采集软件，计算对照物和受试化合物的比降。

由下式计算酪氨酸酶抑制百分比：

(平均载体对照物比降–平均样品比降)×100

___________________________________

平均载体对照物比降

一般来讲，采用上述测定法，FSF如下表14所示抑制酪氨酸酶活性。

表14

浓度（w/v%）	酪氨酸酶抑制
		1%	60%
0.5%	64%
		0.25%	73%
0.125%	77%

虽然考虑可变因素如黑素产生复杂性和在皮肤中的转移以及受试化合物的皮肤渗透能力，与人类面部色素沉着点相对应的体内测试结果不具有肯定性，但是该测定法确实展示了物质如FSF潜在影响酪氨酸酶活性的能力。

实例8

色素沉着点减少和黑素均匀度的体内测试

采用轮循、载体控制的、面部分区设计，对270名受试者实施包括1周标准化期在内的9周体内研究。根据入选/排除标准，筛选出270位受试者，所述入选/排除标准包括下列：

入选

在面部两侧的脸颊和/或眶周区域周围具有色素沉着点。

具有至少1个8-10mm直径的色素沉着点，4个4-6mm的点或10个2-3mm直径的点（晒斑、雀斑或黄褐斑），或在他们面部每一侧的脸颊区域具有等同的点面积。

愿意通过使用所提供的防紫外乳液以及物理性紫外线阻隔物如有檐帽避免日光照射，以避免面部晒斑、晒黑或风害。

排除

已被诊断为具有过敏症、湿疹、牛皮癣或其它慢性皮肤疾病。

具有明显的面部皮肤疾病迹象（例如多于5个丘疹，红色起皮皮肤区域，表皮纤细血管等）。

面部具有显著的变色或疤痕区域。

面部具有多于3个凸出的痣（<3mm）。

招募两百七十位受试者进行研究。在研究期间排除约60位受试者。每位受试者接受两种编号的测试制剂，每半边脸每日施用两次。拍摄基线（0周）以及处理4周和8周后的面部处理位点的图像，并且分析皮肤颜色以及斑点尺寸和颜色的变化。产品制剂包括载体对照物、载体+0.55%FSF、和载体+5%维生素B3化合物（烟酰胺）。

采用非接触性分光光度皮内分析（SiaScopy，Astron Clinica，UK）收集并且分析受试者图像。所述方法使用数字照相机（例如Fuji S2数码SLR）作为品牌光度计和闪光光源（例如Sigma Super闪光光源），以获得面部发色团信息。将正交极化滤光器放置在相机和光源前，以消除镜面反射。

真黑素（黑素）和氧化血红素浓度和分布的发色团作图产生这些发色团中每一个的灰度浓度图谱。可使用图像分析软件如Optimas6.5选择每个发色团图谱中的受关注区域，由此计算平均灰度值和斑点面积份额。斑点面积份额是指受关注总区域百分比形式的黑素斑点占据的总面积。一类发色团作图的描述可见于EP1,810,614以及“TheDistribution of Melanin in Skin Determined In Vivo”（British Journal ofDermatology，2007，第620-628页）中。

4周后FSF表现最佳，显著（p<=0.10）减少了色素沉着点，优于对照物和5%维生素B3组合物。8周后，维生素B3组合物表现最佳，然而FSF组合物在减少色素沉着点方面也显著优于对照物。表15总结了图像分析数据，其中SAF为平均斑点面积份额，并且ΔSAF为自基线（0周）起斑点面积份额的平均变化。

表15

所用缩写：SAF=斑点面积份额；sig=显著（p<0.1）；dir=定向（0.1<p<0.2）趋势=（0.2<p<0.3）ns=不显著（p>0.3）。

FSF在SAF方面显著优于载体，并且在黑素均匀度方面定向优于载体。

分析方法

使用下列分析方法测定实例中报告的各种物理和化学特性。

测定干质的方法

通过比较液体样品重量与液体组分蒸发后的干燥残余物重量，测定干质含量（百分比）。在所述方法中，使用一次性铝称量皿、得自Ohaus Corporation（Pine Brook，NewJersey）的Ohaus Explorer E00640天平、和得自VWR（West Chester，Pennsylvania）的ShelLab1400E型烘箱。在设置为105℃的烘箱中将样品干燥12小时。从包含皮重的液体样品重量中减去皮重，获得“湿”重。从干燥后的包含皮重的相同样品重量中减去皮重，获得“干”重。然后干质含量等于“干”重除以“湿”重乘以100%。

测定色度的方法

使用Lovibond Comparator3000（Tintometer Limited of Salisbury，UK）比色计，按照比色计操作手册的标准步骤，通过比较透明玻璃管中测试制品的颜色与比色计两个比色盘中的标准色片，测定色度（0至18的格氏标度）。

测定渗透度的方法

通过测定与纯溶剂凝固点相比溶液凝固点的下降，测定渗透度。在得自AdvancedInstruments，Inc.（Norwood，MA）的Advanced3250型单样品渗压计上，根据仪器操作手册中的标准步骤，实施测定。

测定折射率的方法

在得自Reichert Analytical Instruments（Depew，NY）的具有附连外部温控循环器的Arias500折射计上，根据仪器操作手册中标准步骤，测定折射率。

测定紫外光谱参数的方法

由得自Biochrom Ltd.（Cambridge，United Kingdom）的具有流体夹套池夹持器和附连外部温控循环器的Ultrospec4300pro紫外/可见分光光度计，测定UV吸收光谱中的波峰、波谷和拐点。对用去离子水稀释的样品，使用具有1cm光径长度的石英比色杯。仪器控制和数据分析由得自Biochrom Ltd.的Wavescan application of SWIFT II的软件提供。

测定弹性蛋白酶抑制活性的方法

由动力学比色测定来确定弹性蛋白酶抑制活性，所述比色测定能够用于得自Corning Incorporated（Corning，NY）的96孔微量滴定板（Corning3641）与得自BioTekInstruments，Inc.（Winooski，VT）的Synergy2微板读数器。由黄色显影指示裂解底物的酶活性，所述黄色显影由410nm波长处的吸光度增加测得。N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-pNA底物（EPCFH237）和弹性蛋白酶（EPC SE563）得自EPC（Elastin Products Company，Inc.，Owensville，MO）。每个孔的反应体积为200微升，弹性蛋白酶的浓度等于0.87单位/毫升，并且底物等于363μM。该方法根据Elastin Products Company，Inc.的ResearchBiochemicals Catalogue（2004,92页）第84页的标题为“Assay with N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA（EPC No.FH237）as substrate”的方法。

测定环加氧酶-2抑制活性的方法

由Cayman Chemicals COX抑制剂筛选ELISA试剂盒560131，测定环加氧酶-2（COX-2）抑制活性。

测定抗氧化剂活性的方法

由ORAC测试，采用可见于（www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf）的BioTek的“Performing Oxygen Radical Absorbance Capacity(ORAC)Assayswith Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader”应用注解中描述的方法的改型，与得自BioTek Instruments，Inc.（Winooski，VT）的Synergy2微板读数器一起使用，测定抗氧化剂活性。在该测试中，AAPH（2,2'-偶氮双2-氨基丙烷）产生反应性氧物质，其破坏荧光探针（荧光素钠）。抗氧化剂如(R)-Trolox甲基醚阻止或减缓该损伤，并且它们的效应可通过荧光测量量化。采用设至485nm的激发波长和设至528nm的发射波长，200微升的反应体积，55mM的AAPH浓度，1.33μM的荧光素钠浓度，和80μM和2μM之间的(R)-Trolox甲基醚浓度范围，读取荧光读数。荧光素钠（Fluka46960）、AAPH（Sigma440914）和(R)-Trolox甲基醚（Fluka93509）得自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。AUC（曲线下面积）值计算为比例（孔的当前荧光读数除以所述孔的第一荧光读数）之和。从(R)-Trolox甲基醚的孔与测试制品的孔的AUC中减去去离子水的孔的平均AUC值，获得与抗氧化剂的荧光保持相对应的AUC。以孔的抗氧化剂相关AUC函数形式产生校准曲线，表明(R)-Trolox甲基醚重量当量ORAC活性。然后计算测试制品的ORAC活性作为测试制品单位重量，所述单位重量为与1单位重量(R)-Trolox甲基醚所产生的抗氧化剂功效等量的重量。

测定清除活性的方法

由动力学比色测定来确定自由基清除活性即DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基）自由基清除活性，所述比色测定能够用于得自SUN-SRi（Rockwood，TN）的玻璃包覆的聚丙烯96孔微量滴定板（目录号400062）与得自BioTek Instruments，Inc.（Winooski，VT）的Synergy2微板读数器。测定515nm波长处的吸光度。每个微板孔的反应体积为200微升，DPPH的初始浓度等于114μM。使用L-抗坏血酸作为阳性对照物。DPPH（Sigma D9132）和USP L-抗坏血酸（Sigma A-2218）得自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。计算反应的化学计量，并且表示为需要淬灭1单位重量DPPH的测试制品的单位重量。该方法根据W.Brand-Williams等人的公布于1995年LWT-Food Science and Technology第28卷第1期第25-30页中的文章“Use of afree radical method to evaluate antioxidant activity”中所述的方法。

采用温度表达谱的稳定性快速测试方法

1.开启12个加热器并且在指定温度下加热，并且开启冷藏机并且在指定温度下保持至少4小时，然后进行实验。除了放置于加热器中的12个样品以外，还使一个样品置于室温下，并且另一个冷藏，以提供共14个不同的温度。所述温度为5、室温（～23℃）、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72和75℃。加热器配备经切割以匹配20ml样品瓶的铝嵌入块；这些嵌入块安装于加热器热的袋状嵌段的内部。每个加热器应具有独立的温度控制器和温度传感器，并且提供0.1℃调节精度的反应嵌块温度控制。

2.填充14个样品瓶，使顶部空间尽可能的小。只要均是相同的尺寸，样品瓶尺寸可在自动进样器样品瓶至闪烁计数样品瓶的尺寸范围内变动。考虑该实例的目的，使用20mL样品瓶。

3.为每个样品瓶制作具有记录参考和温度的标签。最好制作尽可能小和窄的标签。如果用彩色照片评定颜色，制作额外一个没有温度的标签，以标示样品瓶。

4.将每个标签粘附于对应的样品瓶上，不阻碍观察样品瓶内的产品。这通常通过将标签胶带粘于封盖上来完成，形成从上向下阅读的长直标签。将标签放置在与样品瓶上具有任何标记的面相对的封盖面上，使得在拍摄照片时，能够展示标签与样品瓶中样品的最佳视图。

5.如果评定颜色，用数字照相机拍摄样品的初始照片。使样品排成一行，从左至右，从最低温至最高温，使得能够在样品瓶中清楚地看见样品（转动样品瓶，使得样品瓶上的任何标签或印刷不阻挡视图）。展示额外的标签，使得它易于从图像中读出。为一致起见，在实验室工作台上对样品瓶和相机位置做标记，从而它的几何形状可在以后重现。建议关闭闪光。

6.对这些类型的样品，以下列方式拍摄照片：

a.透明的溶液：背靠白色背景，使用闪光灯并且无台灯

b.不透明样品：背靠黑色背景，关闭闪光灯并且使用台灯

7.如果进行化学分析，对每个样品瓶取样以供初始读数。

8.将样品放置于加热器以及冷藏机中，记录日期和时间。

9.在所选时间点（默认采用3、7和14天），将样品从加热器和冷藏机中取出，并且使其达到室温至少30分钟。

10.如果评定颜色，依照步骤4中作出的样品瓶和相机位置的标记，拍摄新照片。在每个时间点重复该步骤。

11.如果进行化学分析，则在该点对每个样品瓶取样。对每个时间点进行重复。

12.为评定颜色，选取最好地区分不同产品的时间点，并且将标记每种样品的照片剪切和粘帖在一起。按照稳定性表，可在图像上画出表示等效室温下6个月和1年时间的线。找出给定时间点下与表上6个月和2年相对应的加速温度，并且这确定在哪些样品瓶之间画线。（例如参见图10）

13.为进行化学分析，将浓度对每个时间点的温度作图。在数据间画出光滑的线，并且记录达到不可接受阈值时的温度。将该温度关联稳定性表中的时间，获得等效室温。如果用Lab色度计测定色度并且将色差而不是浓度作图，则该技术可应用于色度分析。

14.稳定性表假定25kcal/mole的活化能。大多数水解和类似的反应大约具有该能量或更高。如果能量更高，则产品更加稳定，并且所述表预计的室温稳定性小于其实际（过于保守的估计）。有时能量低于该值。为此，如果进行化学分析，建议采用上文产生的数据，并且采用Arrhenius曲线图计算反应能，以确认假设正确。

15.附录：从照片上提取Lab颜色：

i.将所有照片转移至CD上。采用配备色度测量软件如Optimas以及任何所需周边设备的计算机，测定每个样品的平均Lab色度。

ii.从最左边的5C样品开始，并且从右上方移动，下滑至左下方，选取样品瓶区域以将色度取平均。设定5C样品为标准参照物（开始时仅对5C样品进行该步骤）。

iii.记录每个温度样品的L、a、b、Std Dev和dEcmc值。记录每张照片的白点（应为255,255,255）。

本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。

具体实施方式中引用的所用文献的相关部分以引用方式并入本文；任何文献的引用均不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。当本文献中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义冲突时，以赋予本文献中那个术语的含义或定义为准。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，但是对那些本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的实质和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (19)

1.一种适于淡化哺乳动物皮肤区域的化妆品组合物，包含：

有效量的来源于新鲜无花果叶汁的无花果浆液组分；和

皮肤病学可接受的载体，

其中所述无花果浆液组分由以下方法制得，包括：

a.从干净、新鲜、未萎蔫的无花果叶中分离出无花果细胞汁，获得新鲜的无花果细胞汁，其中在所述分离之前或期间不加入外来液体；

b.将所述新鲜无花果细胞汁过滤以获得不含纤维的细胞汁；

c.将所述不含纤维的细胞汁分级以获得无花果浆液组分，其中所述分级包括：

(1)从所述不含纤维的细胞汁中去除叶绿素以获得上层清液I；

(2)从上层清液I中去除色素和蛋白质以形成无花果浆液组分；

(3)将稳定剂加入到所述无花果浆液组分中。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述从上层清液I中去除色素和蛋白质包括：

i.将上层清液I的pH调节至约7.5以形成经pH调节的上层清液I；

ii.使经pH调节的上层清液I分离成沉淀II和上层清液II；

iii.将上层清液II的pH调节至约3.6以形成经pH调节的上层清液II；

iv.使经pH调节的上层清液II分离成沉淀III和无花果浆液组分。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述稳定剂选自抗氧化剂、螯合剂、防腐剂、以及它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述稳定剂选自偏亚硫酸氢钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯钠、戊二醇、以及它们的混合物。

5.根据权利要求2、3或4所述的组合物，其中所述组合物在室温下在至少6个月内是稳定的。

6.根据权利要求2、3或4所述的组合物，其中所述组合物在室温下在至少12个月内是稳定的。

7.根据权利要求2、3或4所述的组合物，其中所述组合物在室温下在至少24个月内是稳定的。

8.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果叶选自下列无花果物种：孟加拉榕树、无花果、印度榕、细叶榕、佟氏榕、以及它们的组合。

9.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果浆液组分基本上不含脱镁叶绿酸。

10.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果浆液组分基本上不含脱镁叶绿酸，并且其中按照凯氏定氮法所测量，所述无花果浆液组分基本上不含蛋白质。

11.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果浆液组分是水溶性的。

12.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果浆液组分具有小于8的格氏色度值。

13.根据前述权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述无花果浆液组分具有小于7.5的格氏色度值。

14.一种非治疗目的的减轻皮肤色素沉着过度外观的方法，包括将前述权利要求中任一项所述的化妆品组合物局部施用于期望淡化的色素沉着皮肤区域。

15.根据权利要求14所述的方法，其中施用有效量的所述化妆品组合物以破坏黑素生成的一个或多个步骤。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中施用有效量的所述化妆品组合物以抑制黑素生成酶活性。

17.根据权利要求14或15所述的方法，其中施用有效量的所述化妆品组合物以抑制黑素生成酶活性，其中所述酶活性为胰蛋白酶活性、酪氨酸酶活性、或它们二者。

18.根据权利要求14或15所述的方法，其中施用有效量的所述化妆品组合物以抑制COX-2活性。

19.根据权利要求14或15所述的方法，其中施用有效量的所述化妆品组合物以提高抗氧化剂活性、自由基清除活性、或它们二者。