JP2013537196A - フィカス美容液画分を含有する化粧品組成物、及び過剰な色素沈着の発生を低減する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、新鮮なフィカス葉の新鮮なフィカス細胞汁から得られるフィカス美容液画分を含有する化粧品組成物を提供する。化粧品組成物は、また、美容的に許容されるキャリアも含有する。フィカス美容液画分は、組成物中に、所望の皮膚美白化を得るにあたり美容的に有効な量で存在する。

Description

本発明は、化粧品組成物を皮膚に局所適用することによって、皮膚を美白化する分野に関する。本発明は、更に、フィカス（Ficus）の美容液画分を含有する局所的皮膚美白化用組成物に関する。本発明は、メラニン合成の１つ以上の段階を阻害させるために、色素沈着が過剰な領域に化粧品組成物を局所適用することによって、皮膚の色素沈着を低減する方法にも関する。

ヒト皮膚は、３つの主要な層、すなわち表皮、真皮及び皮下脂肪層を含む。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層及び基底層の４つの層（上部から下部へ）を含む。角質層と顆粒層との間に、別個の５つめの層である透明層が存在する場合がある。基底層は、徐々に上方に移動して、他の表皮層を形成する細胞を生成する。これらの細胞は、上方に移動するにつれて、それらの中心核を損失し、皮膚タンパク質（ケラチン）及び脂肪（脂質）の生成を開始する。これらの細胞は、表皮の上部層内に存在する場合に角化細胞と識別される。メラニン産生細胞は、表皮の基底層内に位置する別のクラスの細胞である。メラニン産生細胞は、皮膚色素沈着の主な要因であるメラニンの産生を担っている。

メラニンは、酵素チロシナーゼと基質としてのＬ−チロシンとが関与するメラニン産生細胞内の複雑な反応セットにより基本的な濃度で産生される。チロシナーゼは、Ｌ−チロシンのＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換と、ＤＯＰＡのドーパキノンへの変換とを触媒する。ドーパキノンは、更なる変換を受けてメラニンを形成する。メラニンは、メラノソームとして知られている小器官内に凝集し、このメラノソームは、メラニン産生細胞の、樹状突起として知られる細長い線維に沿って角化細胞に輸送される。メラノソーム内で発現するおよそ１５００の遺伝子産物が存在するが、そのうちの６００は任意の所定の時間に発現し、そのうちの１００はメラノソームに固有のものであると考えられている。加えて、シグナル伝達、メラニン産生細胞内でのメラノソームの輸送、角化細胞へのメラノソームの輸送に関与する多数の調節因子が存在する。

メラニンの生成は、様々な外部及び内部事象により引き起こされる場合がある。例えば、メラニン産生細胞は皮膚が紫外線照射に付された際に余分なメラニンを生成する。次に、メラニンはメラノソーム（melanasome）を介して角化細胞に輸送され、角化細胞は次に皮膚に「黄褐色の」外観を残す。紫外線光が除去されると、メラニン産生細胞は、通常のメラニン産生の濃度に戻る。炎症は、ＩＬ−１、エンドセリン−１、及び／又は幹細胞因子等のメディエータによるメラニン産生細胞の直接的な刺激により、過剰な色素沈着を開始させ得る。損傷皮膚内で生成され、又は炎症細胞から副生物として放出される超酸化物及び一酸化窒素等の活性酸素種は、メラニン産生細胞の刺激因子であり得る。

時間が経過するにつれて、慢性的な紫外線暴露と、他の内因性及び外因性の加齢因子とが、角化細胞及び／又はメラニン産生細胞内で遺伝子発現の永久的な変化をもたらし、加齢に伴う色素沈着が生じ得る。メラニン合成に関連する幾種類かの遺伝子（例えば、チロシナーゼ、ＴＹＲＰ１）のｍＲＮＡ濃度は、化学線照射により生じる黒子（染み）を増大させるものと報告されている。色素沈着過剰には、表皮性エンドセリンカスケードの増強と、幹細胞因子の関与も存在し得る。これらの変化により、メラニンの過剰生成と、結果として色素沈着とが生じる場合があり、この沈着は、紫外線暴露等による侵襲が避けられる場合でさえも持続する。色素沈着以外にも、慢性的な紫外線暴露と他の内因性及び外因性加齢因子とは、皮膚色調においてより僅かな変化をもたらし得る。これらの変化は、度々、まだらな色調、又は斑点模様の外観として表現される。染みがある人は、認識される外見年齢が１０〜１２年上昇する場合があり、メラニン分布は色調に依存した年齢認知を推し進め得ることが、少なくとも１つの試験で示唆されている。したがって、染み等の、色素沈着の過剰な皮膚外見を改善し得る、治療組成物及び方法が望まれている。

ここ数年、消費者による、「天然」の化粧品の需要は増加している。その結果として、化粧品製造者らは、彼らの化粧品製剤の中により多くの植物由来原料を取り入れてきた。数百年又は時として数千年もの間、様々な評判のよい効能を目的として、様々な植物が用いられてきたが、最近になって初めて、植物の生理活性に関する基礎科学に基づいて新たな潜在的用途を検証すること、又は有効と言われている原料を臨床的に検証することが可能になってきた。近年の科学の進歩に伴い、現在では、研究者らは、最近まで民間伝承によってのみ支持されてきた、植物に関する新規な潜在的用途及び／又は有効性をより良く評価することができる。科学技術がまだ新しいこと、及び化粧品用生理活性剤として潜在的に利用し得る植物の数が非常に大きいことから、植物の大部分は、まだ十分には調査されていない。

植物から植物成分を抽出するために用いられる方法の多くには、植物組織に含有される対象とする生理活性成分及び／又は植物組織の組成にとって有害となる技術が包含される。したがって、従来の抽出方法では、多くの場合、植物細胞内に存在する広範囲の活性の全てを得ることができず、植物ベースの化粧品製剤に見込まれる潜在能力は完全には発揮されていない。加えて、従来の多くの抽出方法では、強い化学溶媒が利用される。それら化学溶媒は「天然素材」ではないため、消費者らは、このような溶媒を自身の皮膚に適用するのを避けたがる。更に、これらの溶媒ベースの加工では、適切に取り扱われなかった場合に並びに有害廃棄物として処理されなかった場合に環境を汚染する恐れのある、毒性の化学廃棄物が生成される。

しかし、原料が「天然素材」だからといって、それにより望ましくない成分が非含有であることの理由にはならず、このような原料が皮膚への使用に好ましいものであるものと保証される訳ではない。例えば、多くの植物は、フェオホルビド等の光線感作物質を含有し、及び／又は、タンパク質等のアレルゲンと関係する。フェオホルビド及び／又はタンパク質は、多くの一般的植物に天然に見出だされる濃度では、ほとんどの人々に関し懸念を生じるものではない。しかしながら、植物材料が、例えば、抽出によって高濃度に濃縮される場合、これらの材料は、発疹などの皮膚のかぶれ及びアレルギー反応を引き起こす濃度に達する恐れがある。しかし、これらの材料が天然の濃度で存在する場合でさえも、否定的な皮膚反応を起こしてしまう感受性の高い人々が尚数多く存在する。

更に、天然物に対する需要が増大するにつれて、地球の天然資源を保護することについての関心も増大している。消費者が所望する「天然」成分の多くは、消費者製品に使用するために採取する際に、生物資源を消耗させ及び／又は破壊することで得られる。このように、天然素材で、地球により優しい製品を消費者が要望することで、皮肉にも、まさに彼らが保護することを目標にしている生物資源が破壊される場合がある。

したがって、生理活性を有する天然の植物成分であって、それらの望ましい生理活性範囲を保持し、局所的な皮膚適用に適しており、かつ製造時に強い化学溶媒を使用されない成分が必要とされている。更に、そのような生理活性物質を含有する化粧品組成物であって、色素沈着の過剰な皮膚領域を減少させるのに有効である組成物が必要とされている。加えて、上記の生理活性材料であって、生態学的に健全で持続可能な方法で収穫し、かつ加工することのできる材料が必要とされている。

本発明のこれらの目的及び他の目的は、次の開示内容を考慮すれば明らかになるであろう。

本発明は、新鮮なフィカスの葉の細胞汁から得られるフィカス美容液画分を提供する。また、本発明は、フィカス美容液画分を含有する化粧品組成物も提供する。フィカス美容液画分は、該組成物中に、所望の皮膚美白結果を達成するための有効量で存在する。

本発明は、更に、メラニン合成における１つ以上の段階を阻害するために、色素沈着が過剰な領域に化粧品組成物を局所適用することによって、皮膚の過剰な色素沈着を低減させる方法に関する。

本発明は、添付図面と併せて以下の説明から、より良く理解されると考えられる。参照する図面は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
新鮮なフィカス葉から生理活性のある美容液画分を調製するためのプロセスの概略図。 フィカス美容液画分のＬＣ／ＵＶクロマトグラムと従来のフィカス抽出物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムを重ねあわせた図。従来の抽出物が、フィカス美容液画分には検出されない、後期溶出性の（より疎水性の）化合物をより高濃度で含有することを示している。 従来のフィカス抽出物の後期溶出性化合物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムと、それらの対応する抽出イオンクロマトグラムの図。それらの化合物がフェオホルビド、すなわち色素化合物であり、クロロフィルの分解産物であることを同定する。 フィカス美容液画分のＬＣ／ＵＶクロマトグラムと従来のフィカス抽出物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムを重ね合わされた図。従来のフィカス抽出物がフラボノール配糖体をより高濃度で含有することを示している。 従来のフィカス抽出物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムと、対応する抽出イオンクロマトグラムの抜粋をフィカス美容液画分のＬＣ／ＵＶクロマトグラムの上に重ね合わされた図。本フィカス美容液画分は、従来のフィカス抽出物と比べ、カテキン及び関連する縮合型タンニンを約１０倍含有していることを示している。 従来のフィカス抽出物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムと、対応する抽出イオンクロマトグラムの抜粋を、それぞれフィカス美容液画分のクロマトグラムと重ね合わせた図。カフェオイルキナ酸の３種類の異性体の濃度が、それら２種類のサンプルの間では実質的に相違しないようであることを示している。 従来のフィカス抽出物のＬＣ／ＭＳクロマトグラムの抜粋を、フィカス美容液画分のＬＣ／ＭＳクロマトグラムに重ね合わせた図。遊離のチロシン、フェニルアラニン及びトリプトファンの濃度が、フィカス美容液画分のものより高いことを示している。 経時促進試験により得た２枚のカラー写真。乾燥葉フィカスの抽出物の色安定性対ＦＳＦの色安定性を示している。異なる濃度のフィカス美容液画分と、異なる保存料とを含有する、２種類の異なる化粧品組成物。 図８の経時促進試験の較正プロット。 経時促進試験結果のカラー写真。０．５５％ ＦＳＦを含有する溶媒と、様々な濃度の保存料とを比較している。

特に指示のない限り、本明細書で使用される全ての百分率及び比率は、総組成物の重量を基準とし、かつ全ての測定は２５℃にて行われる。

本発明の組成物は、本明細書に記載の必須構成成分並びに任意成分を含み、それらから本質的になり、又はそれらからなることができる。本明細書で使用するとき、「から本質的になる」とは、組成物又は構成成分は追加成分を包含してもよいが、それら追加成分が特許請求される組成物又は方法の基本的及び新規な特徴を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。

組成物に関連して用いられる用語「適用する」又は「適用」は、表皮等のヒト皮膚の表面に本発明の組成物を適用すること又は塗布することを意味する。

本明細書で使用される用語「皮膚科学的に許容可能な」は、記載される組成物又は構成成分が、過度の毒性、不適応性、不安定性、アレルギー反応等がなく、ヒト皮膚組織と接触して使用するのに好適であることを意味する。

本明細書で使用される用語「安全かつ有効な量」は、有益な利益を有意に誘導するのに十分な化合物及び組成物の量を意味する。

本明細書で使用される用語「炎症後色素沈着過剰」は、一過性炎症事象に応答した、急性から慢性の色素沈着の増大を指す。炎症後色素沈着過剰は特に、暗色皮膚の対象によく見られる。炎症後色素沈着過剰は、典型的には、一過性炎症事象が消散した後、低下する。一過性炎症事象の例には、挫創病変、内方発育毛、引っ掻き傷、虫刺され、界面活性剤損傷、及び短時間の紫外線曝露が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「色素沈着」は、局部的かつ慢性の又は全身性のメラニン過剰生成により、隣接する皮膚よりも色素沈着の程度の大きい皮膚の限定的な領域を指す。色素沈着は、典型的には、直径約２ｍｍ〜約１０ｍｍであるが、より小さい又は大きい領域である可能性もある。色素沈着は、染み、日焼けによる染み（sun spot）、黒子（solar lentigo）、低メラニン性病変（hypo-melanotic lesion）、そばかす及び肝斑スポットのうちの１つ以上を含むことができる。

本明細書で使用される用語「染み」は、色素沈着が生じている領域を指し、該領域には、内因性又は外因性の加齢因子によりメラニンの局部的かつ慢性の過剰生成により、色素沈着が生じている。

本明細書で使用される用語「皮膚トーン剤」は、メラニン生成シグナル、メラニンの合成、メラニン産生細胞と角化細胞との間でのメラニンの全身輸送、及び／又はメラニン分解を調節する薬剤を指す。皮膚トーン剤は、美白剤又は色素沈着低下の美容薬剤として作用することにより、まだらな皮膚色調の外観を改善することができる。

本明細書で使用される用語「皮膚色調」は、一過性ではなく全身性のメラニン合成による、皮膚におけるメラニンの全体的な外観を指す。皮膚色調は一般に、皮膚の広い範囲にわたり特徴付けられる。範囲は、理想的には１００ｍｍ²であってもよいが、顔の皮膚の全体、又は任意の顔の皮膚表面等のより広い範囲が想定される。皮膚色調は、画像分析により測定することができる。例えば、全体的な明るさは、Ｌ^*ａ^*ｂ^*色空間内のＬ^*座標により測定することができる（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）。メラニンマッピング等の発色団マッピングとメラニン濃度とは、全体的な皮膚色調の指標として使用することができる。発色団マップデータから平均メラニンを計算することができる。加えて、皮膚色調均一性はメラニン均一性から測定することができ、メラニン均一性も発色団マップデータから計算することができる。好適な発色団マッピング法は、以下の実施例にて論じられる。

本明細書で使用される用語「顔の皮膚表面」は、額、眼窩周囲、頬、口周囲、頤及び鼻の皮膚表面のうちの１つ以上を指す。

本明細書で用いられる用語「従来の抽出物」とは、植物原料から化合物を溶媒抽出することによって生成される抽出物をいう。植物原料は、脱水された（即ち、乾燥された）及び／又は脱水されていない（例えば、新鮮な、若しくは、僅かに一部脱水された）植物原料であってもよい。

Ｉ．組成物
本発明は様々な組成物に関し、より詳細には、皮膚表面に塗布するための組成物に関する。組成物は、限定するものではないが、溶液、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル、化粧水、スティック、ペンシル、スプレー、エアゾール、軟膏、クレンジング洗剤液及びクレンジング棒状固形物（cleansing liquid washes and solid bars）、シャンプー及びヘアコンディショナー、ペースト、フォーム、パウダー、ムース、髭剃りクリーム、ティッシュ、細片（strip）、パッチ、電気駆動パッチ、創傷被覆材及び粘着性包帯、ヒドロゲル、フィルム形成製品、顔及び皮膚マスク（不溶性シートを有する及び有さない）、ファンデーション、アイライナー及びアイシャドウ等の化粧品等の、非常に様々な製品形態を有し得る。組成物の形態は、組成物中に存在する場合、選択された皮膚科学的に許容可能な特定のキャリアに従い得る。

本発明の組成物は、メラニンに関連する、皮膚の過剰な色素沈着を低減させるのに有用である。本明細書で用いられる「視認可能な程の皮膚の過剰な色素沈着を低減させる」には、皮膚の美白化を包含する。皮膚の美白化は、皮膚中の既存メラニンを減少させること、最小限に抑えること、及び／若しくは消失させること（治療）、並びに／又は、色素沈着が過剰な皮膚領域などの皮膚中でメラニンが生成されるのを遅らせること、最小限に抑えること、及び／若しくは防止すること（予防）を包含する。本明細書で用いられる「色素沈着が過剰な皮膚領域」は、メラニン含量の高い局所領域を意味し、しみ、肝斑、吹き出物、斑点、黒皮症、褐色斑、そばかす、炎症後色素沈着、又は日光誘発性の色素沈着が生じた領域を包含する。

Ａ．フィカス美容液画分
イチジク属（fig genus）のフィカスは、多数の種からなり、世界中に存在する。フィカス・イチジク属（Ficus genus）は、イチジク種、サボテン科オプンティア属団扇サボテン（Ｌ．）ミル（prickly pear cactus Opuntia ficus-indica (L.) Mill）、サボテン科（Ｂａｒｂｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｉａｎ−ｆｉｇ Ｐｒｉｃｋｌｙ−Ｐｅａｒ（Ｏｐｕｎｔｉａ ｆｉｃｕｓ−ｉｎｄｉｃａ（Ｌ．）Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃａｃｔａｃｅａｅ）ｉｎ ｔｈｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｉｃｉｌｙ．Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ４６（１）：１０〜２０．１９９２．）と混同されるべきではない。有名なイチジク種としては、フィカス・カリカ（Ficus carica）（一般的なイチジク）、フィカス・レリジオサ（Ficus religiosa）（仏陀が「真理」を探り当てた際に、彼をかくまったインドボダイジュ）、フィカス・エラスチカＲｏｘｂ（Ficus elastica Roxb.）例えば、ホルネウム（exHorneum）（ゴムの木）、フィカス・バンヤンシス（Ficus behghalensis）（バンヤンノキ）及びフィカス・ラセモーサ（Ficus racemosa）（グロメラータ（glomerata）と同義、大きな房状の木）が挙げられる。

果物の一般的なカテゴリーの中で、イチジクは、特殊な「隠頭花序」構造を有する集合果の例である。これらは、小核果の集まりを有し、それら小核果は、果肉質の中空花床であり、それぞれ、小孔と称される頂部に小開口部を有する。複数個の小さい花が内壁上に密集しており、外部から見ることはできない。

古くから知られる人間の食物である、ベリンギン（Ficus spp.）（イチジク）は、長期摂取についても安全であるというプロファイルがある。イチジクの新鮮な又は乾燥果物、樹皮、葉、小枝、ラテックス、及び若枝は、歴史の中で様々な目的のために用いられてきた。これらの歴史的用途の一部のものとしては、傷口、潰瘍、がん増殖、腫瘍、膿瘍、痛風、慢性咳、肺疾患、慢性下痢、便秘、リウマチ、淋疾、痔疾、糖尿病、嘔吐、湿疹、ハンセン病、及びいぼ用途などが挙げられる。

本発明のフィカス美容液画分（以下、「ＦＳＦ」という）は、新鮮なフィカス葉の細胞汁から得られる。新鮮な葉から機械的に分離された細胞汁は、ｐＨ調整、集束マイクロ波照射、遠心分離、及び濾過滅菌を使用して画分され、フェオホルビドもタンパク質も含有しないフィカス美容液画分を得る。得られたフィカス美容液画分は、本質的にフィカス葉の細胞質からなる。特定の例では、フィカス細胞汁は、フィカス・ベンガレンシス（F. benghalensis）、フィカス・カリカ（F. carica）、フィカス・エラスチカ（F. elastica）、フィカス・ミクロカルパ（F. microcarpa）、フィカス・トリゴーナタ（F. trigonata）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるフィカス種から得られる。

本発明の組成物は、安全かつ有効な量のフィカス美容液画分を含有する。組成物は、ＦＳＦを該組成物の０．０１重量％〜５０重量％の量で、一態様では０．０５重量％〜２０重量％の量で、他の態様では０．２重量％〜１０重量％の量で含有する。更に他の態様において、組成物は、ＦＳＦを総組成物の１重量％〜５重量％、更に他の態様では、１重量％〜３重量％含有する。

本治験担当医師らは、哺乳動物の皮膚に局所適用したときに、色素が過剰に沈着している皮膚領域が美白化されるなど、本フィカス美容液画分が、従来のフィカス抽出物と比べてより優れた皮膚美白化効果を生じることを見出だした。本発明は、理論によって限定されるべきではないが、メラニン産生細胞内のメラニン生成経路を開始させることになる（例えば、ＵＶ又は日光への暴露によって生じることがある）、反応性酸素／酸素ラジカルによるメラニン産生細胞への刺激作用（酸化的ストレス）を防止するなど、メラニン生成（メラニン合成）に関与するプロセスを阻害することによって作用するものと考えられる。

フィカス美容液画分の調製
例えば、溶媒抽出による方法など、植物由来の諸化合物を分離するのに用いられる方法により、単離される化合物が決定されることになる。いずれかの特定の抽出技術により結果として得られる諸化合物の種類と数とは、「同類のものは同類のものを溶解する」という一般的原理に従って、抽出溶媒の選定によって決定されるところが大きい。例えば、極性化合物は、極性溶媒を用いることによって抽出されるが、非極性化合物は、非極性溶媒を用いることによって抽出される。このことによって、結果的に、存在するであろう全スペクトルの化合物から狭いスペクトル範囲の化合物のみが単離される。溶媒の極性と、典型的には、従来の溶媒抽出法を用いて単離された原料の種類との間の相互関係は、下図によって表される（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ＆ Ｒａｍａｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（１９９８））。

本発明のフィカス美容液画分は、溶媒抽出法によって調製されるのではなく、植物の残部から、植物の葉に見出だされる新鮮な細胞汁を分離することによって調製される。この細胞汁は、抽出工程にさらされないため、新鮮なフィカス葉に見出だされる全範囲の化合物を含有する。対照的に、抽出物は、特定の溶媒で分離し得る狭い範囲の化合物のみを含有する。したがって、結果として得られるフィカス美容液画分は、抽出物に比べて、遥かに広範囲の潜在的に活性な化合物を含有する。

更に、多くの抽出物は、新鮮な葉から調製されるのでなく、乾燥させた植物原料から調製され、このような植物原料は、脱水に起因して分解を受けている。脱水の間に細胞壁は傷つけられ、加水分解、酸化、重合、メイラード反応及び異性化等の作用によって、化合物の分解を生じる。したがって、乾燥葉を抽出した場合に得られる抽出物は、新鮮な植物には元来存在しなかった分解産物を含有することになり、それに加え、該抽出物は、特定の溶媒によって単離され得る範囲の化合物のみを含有する。したがって、結果として、乾燥葉の抽出物の組成は、フィカス美容液画分の組成と大いに異なる。

フィカス美容液画分組成物を調製する方法は、（ａ）清浄で新鮮でしおれていないフィカス葉からフィカス細胞汁を分離して、新鮮なフィカス細胞汁を得る工程であって、分離工程の前にも分離工程の間にも外因性の液体を添加しない工程と、（ｂ）上記の新鮮なフィカス細胞汁を濾過して、繊維を含有していない細胞汁を得る工程と、（ｃ）上記の繊維を含有していない細胞汁を分画して、フィカス美容液画分を得る工程とを含む。上記の分画工程は、（１）前記繊維を含有していない細胞汁からクロロフィルを除去して、上澄み液Ｉを得る工程と、（２）上記の上澄み液Ｉから色素及びタンパク質を除去して、フィカス美容液画分を生成する工程と、（３）上記のフィカス美容液画分に安定剤を添加する工程とを含む。

一部の態様では、安定剤は、酸化防止剤、キレート化剤、保存料、及びこれらの混合物からなる群から選択される。特定の態様において、安定剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、ペンチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群から選択される。

特定の態様において、上記の繊維を含有していない細胞汁からクロロフィルを除去する工程は、（ｉ）上記の繊維を含有していない細胞汁のｐＨを約３に調整して、繊維を含有しないｐＨ調整済み細胞汁を得る工程と、（ｉｉ）上記の繊維を含有しないｐＨ調整済み細胞汁を約１分間約９０℃に加熱する工程と、（ｉｉｉ）上記の繊維を含有しないｐＨ調整済み細胞汁を約３０℃に冷却する工程と、（ｉｖ）上記の繊維を含有しないｐＨ調整済み細胞汁を、沈殿物Ｉと上澄み液Ｉとに分離する工程と、を含む。

特定の態様において、上澄み液Ｉから色素及びタンパク質を除去する工程は、（ｉ）上澄み液ＩのｐＨを７．５に調整して、ｐＨ調整済み上澄み液Ｉを生成する工程と、（ｉｉ）ｐＨ調整済み上澄み液Ｉを沈殿物ＩＩと上澄み液ＩＩとに分離する工程と、（ｉｉｉ）上澄み液ＩＩのｐＨを３．６に調整して、ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩを生成する工程と、（ｉｖ）ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩを沈殿物ＩＩＩとフィカス美容液画分とに分離する工程と、を含む。

新鮮なフィカス葉を用いて、フィカス美容液画分を調製する。本明細書における調製方法は、フィカス葉に固有の生理活性成分の完全性を保持し、結果的に、より優れた活性を有するフィカス美容液画分を生じる。収穫及び運搬を行う間、水分損失及び生分解等の環境要因を最小限に抑えるために、葉の完全性を保持するよう注意が払われる。全ての工程をできるだけ短時間で完了させて、日光、高温、及び他の負の環境要因への新鮮な葉の暴露を最小限に抑える。

特定の態様において、フィカス葉は、フィカス・ベンガレンシス（F. benghalensis）、フィカス・カリカ（F. carica）、フィカス・エラスチカ（F. elastica）、フィカス・ミクロカルパ（F. microcarpa）、フィカス・トリゴーナタ（F. trigonata）、及びこれらの組み合わせからなるフィカス種の群から選択される。

手又は機械的切断等による収穫工程は、チョッピング、マッシング、クラッシング、若しくは葉に対する他のタイプの損傷を回避するか、又は最小限に抑える方法で行われる。収穫及び運搬は、水分の損失に起因するしおれを回避する方法で行うことが望ましい。一態様では、フィカス美容液画分を調製するのに用いられる新鮮なフィカス葉は、それらの当初の含水量の少なくとも９０％を含有し、他の態様では、収穫時に存在する当初の含水量の少なくとも９５％を含有し、他の態様では、少なくとも９８％を含有する。

フィカス植物は、一度に３０％までであれば植物の生存度に悪影響を及ぼさずに葉を収穫することができ、同一の植物から何度でも将来収穫することのできる葉が再生され得る。したがって、フィカス植物は元来の寿命にわたって成長し続けることができ、かつ周辺の生態系の一部となると同時に、生理活性のある化粧品成分を調製するための葉収穫物を繰り返し提供する。この収穫方法は、天然資源の持続可能性を促進するので、好ましい。

好ましくはないにしても、決して持続可能ではない収集方法、例えば、植物の大部分を除去し、再生のための生活性のある部分を残さない大規模な機械的収穫方法も用いることができる。しかし、このより攻撃的な収穫方法を採用する場合でも、収集された葉における微生物の増殖、水分損失、酸化の増大、重合、異性化、及び加水分解のプロセス（すなわち、好ましくない分解反応）などの損傷を引き起こし得るフィカス葉の損傷を最小限に抑える注意が払われる。例えば、本発明の１つの態様において、フィカス植物は、切断されて植物体としてそのまま手で収集される。もう１つの態様においては、収穫機器を用いて植物葉が切断される。

切断された植物原料を加工処理施設まで運搬する時間、並びに日光、高温及び他の負の環境要因へのそれらの葉の暴露を最小限に抑えて、上述のような好ましくない分解プロセスによる影響を予防することが望ましい。例えば、本発明の１つの態様において、植物の更なる処理を行うための運送時間は、切断時から３０分を超えない。他の態様では、植物を長距離輸送する場合、凍結ゲルパックを収容している発泡スチロール・クーラーの中にフィカス葉を直ちに入れるなどの切断後処置に処し、一晩かけて加工処理施設まで配達する間の新鮮さと天然含水量との保持を補助する。上述の結果を達成する他の切断後処置もまた、用いることができる。

次いで、加工処理前に、土壌粒子及び他の破片を除去するためフィカス葉は穏やかに洗浄する。１つの態様において、洗浄は、それらの葉から細胞汁の放出が開始されるのを防止するか、損傷が引き起こされるのを防止するか、又は価値ある成分が除去されるのを防止する条件下で、低圧洗浄により短時間で行われる。例えば、本発明の１つの態様において、フィカス葉の洗浄は、９８．１ｋＰａ（１ｋｇ／ｃｍ²）以下の水圧で５分以下で実行される。洗浄後の水には、いかなる緑色色素も黄色色素も含有されていないことが望ましい。すなわち、そのような色素が存在しなければ、採取後に生じた損傷はないものと判断される。次いで、できるだけ天然葉に近い乾物含量を保持するため、過剰な水は洗浄済みの葉から除去する。

次いで、洗浄済みの新鮮なフィカス葉は、機械的に分離し、主として細胞壁を含有する繊維に富む原料から、細胞汁を遊離する。細胞汁は、柔細胞の細胞内物質の大部分を含有する。重要なことであるが、分離プロセスの間、外因性の溶媒（例えば、水、ヘキサン、アセトン、エタノール）は全く添加されない。本明細書で用いられる「外因性の溶媒」は、元来植物原料中に存在しないが、植物原料から諸化合物を分離する（例えば、抽出する）目的で、植物原料と接触させて置かれるあらゆる溶媒を意味する。

洗浄済みの葉から細胞汁を放出させる工程は、粉砕、浸漬、及び加圧により、細胞に含まれる液体成分（すなわち、細胞汁）を得た後に、繊維に富む原料からそれを分離する工程を含む。１つの態様では、５ＨＰエンジンと一組のスクリーンとを備えたハンマーミル（ＶＳ ３５モデル，Ｖｉｎｃｅｎｔ社（Ｔａｍｐａ，ＦＬ）を用いて、最短時間で、生物資源の温度を有意に上昇させずに葉を粉砕して、適当に小さい寸法の葉組織粒子を生成する。この態様において、ハンマーミルは、１０秒以下の処理の間、最大寸法が２．０ｃｍ以下の浸軟された葉粒子を生成するように設定される。この際、浸軟された新鮮な葉の温度は、僅か２℃以下で上昇する。

粉砕され浸軟されたフィカス葉の暴露は最小限に抑えて、上述のような望ましくない分解反応の影響を防止する。フィカス葉は、温度の有意な上昇を生じさせることなく、短時間で加工処理する。フィカス葉は、粉砕及び浸軟処理後直ちに加圧し、浸軟された新鮮な葉から細胞汁を得る。１つの態様において、この工程は、圧縮空気によって支持されたコーンを備えた水平型連続スクリュープレス［コンパクトプレス機「ＣＰ−６」，ビンセント社，フロリダ州タンパ（Tampa）］を用いて実行する。この態様において、コーン上の圧力は１４７１．０ｋＰａ（１５ｋｇ／ｃｍ²）以上に維持され、スクリュー速度は１２ｒｐｍであり、また、細胞汁の温度上昇は５℃以下である。

この処理によって、繊維に富む原料及び細胞汁が生じる。残渣の小繊維粒子は、その後価値ある細胞汁を吸収し、かつ、装置のホースとポンプとを閉塞す恐れがあるため、細胞汁から除去する。例えば、これらの粒子は、濾過又は低速遠心分離によって除去することができる。１つの態様において、これらの粒子は、全自動排水装置を備えた連続流遠心分離機（１２−４１３Ｖモデル，ＡｍＬ工業社，ペンシルベニア州ハットボロ）を用いる清澄化によって除去される。２リットル／分の流量で、２，２５０ｇ以下の細胞汁の清澄化を行うための滞留時間は、１００秒以上である。この管理工程によって、繊維を含有していない細胞汁が生成される。小繊維粒子を含有する沈殿物を回収し、次いで、新鮮な葉を圧搾した後に生成された、残部の繊維に富む原料と組み合わせる。

この時点で、所望により、細胞汁は密閉型の非反応性容器内で凍結させ、後の加工処理に備え保存することができる。１つの態様では、細胞汁は、迅速に１５リットルの矩形のＨＰＤＥ容器に入れてしっかりと蓋をし、−３０℃で凍結させる。凍結させた固体状態の細胞汁は、更なる利用に備えこの低温で保存する。

凍結させた細胞汁は、次いで液体状態に戻すことができ、好ましくは、短時間（例えば、２分以下）での流体化により、かつ、流体化の間の細胞汁の温度上昇を最小限に（例えば、２０℃以下に）抑えて戻すことができる。短時間での流体化、及び温度上昇の少なさにより、細胞汁の変性と酸化損傷とが最小限に抑えられる。その結果、凍結前に測定された生理化学的及び生化学的特性と本質的に同一の特性を有する細胞汁が得られる。

細胞汁は、３種類の成分：（ｉ）膜結合葉緑体、ミトコンドリア、小胞体、細胞核、リソソーム、ペルオキシソーム、液胞、ゴルジ体、（ｉｉ）非膜結合リボソーム、微小管、及び（ｉｉｉ）上記の群に属しない成分、例えば、細胞質、を含有する。細胞小器官及びそれらの断片だけでなく、望ましくない色素及びタンパク質も細胞汁に存在するため、限定するものではないが、色、溶解性、透明性、安定性、及びインビトロ（in vitro）活性などといった性質が望ましく組み合わされた、パーソナルケア成分を生成するために、分画を行う必要がある。

細胞汁は、ｐＨ調整、集束マイクロ波照射、遠心分離、及び真空濾過を包含する様々な処理を用いて分画する。次いで、得られる単離済みフィカス美容液画分を保存料及び酸化防止剤で安定化させ、最終的なフィカス美容液画分を生成する。

細胞汁のｐＨは、３．０以上（ｐＨ調整１）に調整される。１つの態様では、５．０Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を滴加し、中性（７．０）付近の細胞汁のｐＨを３．０以上（ｐＨ調整１）に低下させる。

次いで、ｐＨ調整した細胞汁から、クロロフィルを除去する。化粧品の成分中にこの色素が存在することは望ましくないのに加えて、クロロフィルは、毒性化合物であると考えられるフェオホルビドに変化する恐れがあり（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｌ．Ｃ．，Ｖｕｃｅｎｉｋ，Ｉ．，Ｈａｇｅｎ，Ｉ．Ｋ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ Ｓ．Ａ．，Ｐｏｒｅｔｚ Ｒ．Ｄ．Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｔｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ａ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．−Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，２４，１，１７〜２３，１９９４）、かつ皮膚炎の原因となる（Ｋａｔｏ Ｔ．，Ｙａｍａｄａ Ｋ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｏｗｄｅｒ．−Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｈｙｇ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，３６，６３２〜６３４，１９９５）。

１つの態様において、クロロフィルの除去は、ｐＨ調整済み細胞汁を加熱し、次いで冷却し、続いて、上澄み液から沈殿物を分離することによって実行される。特定の態様において、ｐＨ調整済み細胞汁は、集束マイクロ波照射によって２，４５０ＭＨｚの周波数で迅速に処理する。この集束マイクロ波照射処理（ＦＭＰ）の間、細胞汁の温度を瞬時に９０℃に上昇させ、この温度を１分間維持し、次いで、細胞汁の温度を瞬時に３０℃以下に低下させる。次いで、連続流遠心分離機ＣＥＰＡ ＬＥ（Ｃａｒｌ Ｐａｄｂｅｒｇ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ社，ドイツ）を用いて１５，０００ｒｐｍ、３０秒以上の滞留時間で処理済み細胞汁を迅速に分離する。処理済み細胞汁を分離することによって、緑色のペースト沈殿物（「沈殿物Ｉ」）と、淡褐色の僅かに乳白光を発する上澄み液（「上澄み液Ｉ」）とが生成される。この上澄み液Ｉを、更に分画する。

上澄み液Ｉを更に処理して、茶色の色素と、残渣のタンパク質を含む他の望ましくない化合物とを除去する。この処理には、ｐＨ調整と分離とが含まれる。上澄み液ＩのｐＨは、ｐＨが約７．５に上昇するように調整する（ｐＨ調整２）。ｐＨ調整２は、１つの態様においては、５０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を滴加し、細胞汁の上澄み液ＩのｐＨを約３．０〜約７．５に上昇させることにより行う。ｐＨ調整２の結果、暗色の物質が生じ、分離によって清澄化されることになる乳白光色が顕色されるようになる。１つの態様では、清澄化は、連続流遠心分離機ＣＥＰＡ ＬＥ（Ｃａｒｌ Ｐａｄｂｅｒｇ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ社，ドイツ）を用いて、１５，０００ｒｐｍかつ３０秒以上の滞留時間で実行される。この分離の結果、茶色のペースト沈殿物（沈殿物ＩＩ）と、茶色の僅かに乳白色を発する上澄み液（上澄み液ＩＩ）とが生じる。

次いで、上澄み液ＩＩを、ｐＨ調整（ｐＨ調整３）し、次いで、濾過する。上澄み液ＩＩのｐＨを調整し、ｐＨ約３．６に低下させる（ｐＨ調整３）。１つの態様では、上澄み液ＩＩは、５．０Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を滴加して、ｐＨ約３．６に低下させる（ｐＨ調整３）。このような処理によって、ｐＨ調整した上澄み液ＩＩの乳白光は僅かに濃くなるが、上澄み液ＩＩの色はより明るくなる。ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩは、孔径０．２μｍの膜により濾過滅菌処理する。得られる濾過液は、明るい色の透明なフィカス美容液画分（ＦＳＦ）である。ＦＳＦは、フィカス葉の細胞質から本質的になる。

美容液画分は、酸化防止剤、安定剤、キレート化剤、及び保存料を添加することで更に安定化させることができる。１つの態様では、フィカス美容液画分には次の添加剤：０．２％メタ重亜硫酸ナトリウム、０．１％ソルビン酸カリウム、０．１％安息香酸ナトリウム、及び０．１％メチルパラベンナトリウムが添加される。この態様では、この混合物は、それらの添加剤が完全に可溶化されるまで（３０分以上）保温される。次いで、この混合物には１．９％ペンチレングリコールを添加した。

ＦＳＦの特性
得られるＦＳＦは、化粧品成分としての使用に望ましい特性を示す。これらの特性には、安定性、水溶性、フェオホルビド及びタンパク質等の望ましくない物質が存在しないこと、より明るい色、より大きい固形分含量、及びフェニルアラニン等の望ましい化合物がより高濃度で存在すること、が包含される。

これらの方法によってＦＳＦから生成される化粧品成分は、室温で少なくとも６ヶ月の間安定であることが、安定性試験により示される。本明細書で用いられる「安定である」は、暗所乾燥領域にＳＴＰ［標準の温度及び圧力：２５℃、１０１．３ｋＰａ（１気圧）］で保管した場合に、特定の期間にわたって組成物の物理的及び化学的特性が有意に変化しないことを意味する。これらの特性には、色及び化学組成が包含される。幾つかの態様においては、ＦＳＦ及びそれを含有する組成物は、少なくとも６ヶ月の間安定であり、他の態様においては、少なくとも１２ヶ月の間安定であり、また、更に他の態様においては、少なくとも２４ヶ月の間安定である。特定の態様では、それら組成物は、６〜２４ヶ月の間、１２〜２４ヶ月の間、又は６〜１２ヶ月の間安定である。

水溶性
本発明の諸ＦＳＦは、更に、水溶性である。本明細書で用いられる「水溶性である」は、それらＦＳＦが、いかなる割合ででも（ＳＴＰ下で）水と混和することを意味する。ＦＳＦは水溶性であるため、フィカスを含有する組成物の配合柔軟性がより高くなる。例えば、水性の製剤は、感触がベタベタせず、望ましい展延性をもち、触感が軽やかであり、及び皮膚表面からの除去（例えば、洗浄すること）が容易であるために、消費者によってしばしば所望される。

しかし、従来の溶媒を用いて抽出されてきた非水溶性フィカス抽出物は、相分離、沈降、結晶化、及び水性組成物中です活性濃度の非均一性等の配合困難性を呈することがある。非水溶性の活性物質にまつわる配合の問題を克服するため、エマルション（それらエマルションは、典型的には、油性及び／又は油性の感触のする物質を組成物の中に導入する）のようなより複雑な製剤が、典型的には用いられる。これにより、組成物は、脂肪性でベタベタし、重く、かつ／又は粘着性の皮膚感触を有し、皮膚表面から容易には除去されず、より高コストのかつ／又は製造方法の複雑なものになる。多くの事例において、これらの製剤は、また、皮膚への活性剤の送達を妨害することもある。

しかし、ＦＳＦは、十分に水溶性であるので、従来の非水溶性フィカス抽出物にまつわる上記の諸問題を生じさせずに、水性製剤の中に組み入れることができる。このことによって、配合の柔軟性はより大きくなり、したがって、消費者が所望するより優れた特性を有するフィカス組成物を送達することが可能となる。

更に、ＦＳＦは十分に水溶性であるので、十分には水溶性ではない溶媒抽出物に比べて、生体での利用効率がより高くなる。このことによって、ＦＳＦの活性成分がより効果的に皮膚に送達されることになる。

加えて、従来の溶媒抽出物の潜在的生理活性の多くは、それら溶媒抽出物が水に不溶性であることに起因して、活性を測定できない。例えば、現在の試験法では、溶媒抽出物が水溶性ではないため、溶媒抽出物のＩＣ₅₀値を測定することはできない。

安全性／アレルゲン性
ＦＳＦは、また、フェオホルビド、タンパク質、及びフィカスなどの植物中に一般に見出だされる諸物質を実質的に含有していない。これらの物質は、敏感な人に毒性及び／又はアレルギー反応等の安全上の懸念を与えることが知られている。植物に通常見出だされる濃度では、これらの物質は、典型的には、懸念を引き起こすものではない。しかし、例えば、加工処理によって、植物原料が濃縮されるとき、相対的に濃度が劇的に増大して、安全上の懸念を生じる場合がある。いたがって、これらの物質を含有しない組成物は、非常に好ましい。

フェオホルビドは、クロロフィルの分解産物である色素化合物である。これらの色素は、生成物の変色を引き起こすことに加えて、生体毒素であるだけでなく皮膚光線感作物質であるとしても知られている。（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｌ．Ｃ．，Ｖｕｃｅｎｉｋ，Ｉ．，Ｈａｇｅｎ，Ｉ．Ｋ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ Ｓ．Ａ．，Ｐｏｒｅｔｚ Ｒ．Ｄ．Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｔｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ａ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．−Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，２４，１，１７〜２３，１９９４）；（Ｋａｔｏ Ｔ．，Ｙａｍａｄａ Ｋ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｏｗｄｅｒ．−Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｈｙｇ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，３６，６３２〜６３４，１９９５）。

図２に示されるように、従来のフィカス抽出物（実施例３）は、ＦＳＦ（実施例１）中に検出されない後期溶出性の（すなわち、より疎水性の）化合物を含有する。図３に示されるように、従来のフィカス抽出物の後期溶出性化合物のＬＣ／ＵＶクロマトグラムとそれらの対応する抽出イオンクロマトグラムとによって、これらの化合物はフェオホルビドであると同定された。（実施例５を参照のこと）

タンパク質（フィカス等の植物由来のタンパク質を包含する）は、敏感な人にタンパク質接触性皮膚炎を引き起こす場合がある。敏感な人々は、原因となるタンパク質と接触した直後に、皮膚上に、多くの場合、かゆみ、火傷、及び／又は刺すような痛みをを伴う、急性じんましん又は水疱疹等の症状に悩まされる場合がある（Ｖ．Ｊａｎｓｓｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：ｍｙｔｈ ｏｒ ｒｅａｌｉｔｙ？」，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １９９５；１３２：１〜６）。したがって、スキンケア物質が含有しているタンパク質ができるだけ僅かであることは非常に望ましい。

ケルダール法を用いて、ＦＳＦの総タンパク質含量の検査を行った（実施例１、表３）。ＦＳＦにタンパク質は検出されなかった。本明細書で用いられる「タンパク質を実質的に含有しない」は、ケルダール法を用い測定した場合に、総タンパク質含量が１％未満（０％〜１％）であることを意味する。幾つかの態様において、タンパク質含量はＦＳＦの０％〜１％であり、他の態様では、０％〜０．５％であり、他の態様では、０％〜０．２５％である。

色／色の安定性
ＦＳＦは、従来のフィカス抽出物に比べ、より明るい色を有する。ＦＳＦは、８未満の、幾つかの態様では、７．５未満のガードナーカラー値を有する。特定の態様では、５〜８の、他の態様では、６〜８の、他の態様では、６．５〜８のガードナーカラー値を有する。図８は、１４日間の経時促進試験におけるＦＳＦの色差と乾燥フィカス葉抽出物の色差との比較を示す。図１０は、様々な濃度の安定剤／保存料を添加した溶媒に含有させた場合の０．５５％ ＦＳＦの色差を示す。図９は、図８の経時促進試験の分析用に作図された検量線図である。

本研究者らは、従来の抽出物中に存在するもののＦＳＦ中には存在せず、及び／又は遥かに低い濃度で存在し、これらの色及び色安定性の差異に関係するものと見られる成分を、従来の抽出物において数種類同定した。例えば、図４は、従来の抽出物が、恐らくフラボノール配糖体と思われる物質をより高濃度で含有することを示す。フラボノール配糖体は、タンニン（これは、ＦＳＦにも従来の抽出物にも見出だされる）と結合して、ポリマー色素を形成し得る。したがって、従来の抽出物において、フラボノール配糖体の濃度が高くなるほど、それに伴いより高濃度の色素化合物が生成されるようになる。更に、フラボノイド及びタンニンのポリフェノール構造によって、それらは酸化、熱及び光等の要因に対して非常に敏感になる。これにより、従来の抽出物において色素の濃度が時間と共に増大する原因となっている可能性がある。

固形分含量
固形分は、ＦＳＦ又は抽出物の生理活性部分を含有する。したがて、固形分含量が高くなるほど、植物の活性も高くなる。ＦＳＦは、従来の水溶性フィカス抽出物と比べて、より高い固形分含量を有する。ＦＳＦは、ＦＳＦの５重量％超の固形分（乾物）含量を有し、特定の態様では、５重量％〜２０重量％、又は５重量％〜１０重量％の固形分含量を有する。

ＦＳＦの生理活性
ＦＳＦは、皮膚中の色素沈着を制限するものと認識されている少なくとも４種類の異なる作用機構を示す。これらの機構は、チロシナーゼ阻害、トリプシン阻害、ＣＯＸ−２阻害、及び酸化防止活性である。１つの態様では、ＦＳＦは、次の色素沈着低減活性：チロシナーゼ阻害ＩＣ５０（％ＤＭ）０．００３〜０．０６；トリプシン阻害ＩＣ５０（％ＤＭ）０．０２〜０．５；ＣＯＸ−２阻害ＩＣ５０（％ＤＭ）０．０２〜１；ＤＰＰＨ分析によって測定される酸化防止剤の過酸化物排除能力（１／ｘ ＤＭ）１〜１５、及び／若しくはＯＲＡＣ分析によって測定される酸化防止剤過酸化物排除能力（１／ｘ ＤＭ）０．２〜５の、少なくとも１つを有し、他の態様では少なくとも２つを有し、又は少なくとも３つを有する。本明細書で用いられる「ＤＭ」は、乾物（「固形分」）であり、「ＯＲＡＣ」は、酸素ラジカル吸収能であり、また、「ＤＰＰＨ」は、フリーラジカル排除能力の測定である。

更に、実施例６のＢ１６メラニン抑制分析によって実証されるように、ＦＳＦは、従来のフィカス乾燥葉の溶媒抽出物に比べて、メラニン生成を抑制する上でより効果的である。例えば、ＦＳＦは、０．０１の濃度で、結果的に従来の抽出物（２３％のメラニン抑制）に比べて、メラニン合成抑制の程度が２倍を超えた（４８．１％のメラニン抑制）。

したがって、本発明は、皮膚におけるメラニン生成を調節する（すなわち、メラニン抑制）方法を提供する。皮膚におけるメラニン濃縮を包含する様々な形態の過剰な色素沈着（例えば、そばかす、染み、肝斑、斑点、斑状色素沈着等）は、表皮に存在するメラニン産生細胞及びケラチン産生細胞の変化によって生じるものと考えられている。メラニン産生細胞は、表皮の基底に位置しているが、加齢に伴い、正常な調節プロセスを損なわれ、過剰に色素を生じるようになる。この過剰な生成により、表皮内部のケラチン産生細胞の中にメラニンの濃密な核周辺塊が形成され、結果的に過度に色素沈着した領域が生じることになる。

過度に色素沈着した皮膚に対する従来の治療法は、メラニン合成を抑制するある種の皮膚美白剤を適用することを含む。当該技術において提案されてきたこれらの物質の作用機構は、チロシナーゼ阻害、及び／又はメラニン合成における他の工程の抑制である。チロシナーゼは、表皮メラニン細胞のメラノソーム内部に存在し、チロシンからのメラニン生成に関与する工程におて触媒として作用する（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ａ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｖ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．８７３〜９０３，Ｎ．Ｙ．１９９１を参照されたい）。チロシナーゼは、チロシンのヒドロキシル化と、ＤＯＰＡのＤＯＰＡキニーネへの酸化を触媒する。したがって、チロシナーゼの活性部位に阻害物質が結合すれば、結果的に、メラニン生成が減少する。概して、Ｐｒｏｔａ，Ｇ．Ｍｅｌａｎｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９２）を参照されたい。

メラニン生成の非酵素段階には、酸化プロセスが包含される。ＤＯＰＡキノンのメラニンへの転換は、非酵素的な又は自発的な化学反応であって、それらの反応の幾種類かは、活性酸素種（ＲＯＳ）又は酸素ラジカルを含む化学反応によって生じる。メラニン産生細胞に、例えば反応性酸素／酸素ラジカル種による刺激（例えば、その刺激は、ＵＶ又は日光への暴露によって生じることがある）などで酸化的ストレスが加わると、それによりメラニン産生細胞内でメラニン生成経路が開始されることになる。これらのプロセスを妨害し、皮膚美白化効果の実現を助けるために様々な酸化防止剤／ラジカル捕捉剤が使用されてきた。

アラキドン酸由来の代謝産物は、とりわけ、ＵＶ、スモッグ、及びそれらに類する他の刺激物等の外界からの刺激に反応して、皮膚において強力な炎症伝達物質として作用するものとして知られている。この経路において、膜リン脂質は、ホスホリパーゼＡ２によってアラキドン酸（ＡＡ）に転換される。一度形成されると、ＡＡは、競合する２種類の生物学的経路：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）経路か又は５−リポキシゲナーゼ経路のいずれかによって利用される。ＣＯＸ炎症性経路において最も関連性のある酵素は、ＣＯＸ−２であり、これは、ＰＧＥ２等のプロスタグランジンに迅速に転換される一過性分子であるＰＧＨ２への、アラキドン酸の転換を触媒する。プロスタグランジンは、刺激部位で炎症反応の発現に関与する局所メッセンジャーとして作用するオートクリン又はパラクリン分子である。

フィカス美容液画分が皮膚に吸収されることによって、ＣＯＸ−２が阻害され、アラキドン酸由来の代謝産物のプロスタグランジンへの転換が防止される。正味の影響は、基底状態及び誘導時の両方でプロスタグランジンのプールが減少するというものである。プロスタグランジンの濃度が減少することで、炎症反応が直接減少するだけでなく、結果として下流の全てのメッセンジャー活性も減少することになる。これらのメッセンジャー活性のうちの２つとしては、メラニン産生細胞におけるメラニン合成の活性と、線維芽細胞におけるコラーゲン産生の阻害とが包含される。

プロスタグランジンは、メラニン生成に関与する酵素であるチロシナーゼの量を増大させることによってメラニン産生細胞を刺激することが公知である。メラニン産生細胞が刺激され、メラニンが過剰に産生されると、皮膚領域の黒ずみとして観察される過剰な色素沈着が生じることになる。したがって、炎症後色素沈着と称される、炎症によって引き起こされる変色は、プロスタグランジンがメラニン産生細胞を直接刺激することによって生じる。フィカス美容液画分によるＣＯＸ２の阻害によりプロスタグランジン生成が減少することで、結果的に、メラニンの産生は低下し、皮膚の色調はより均一になる。

プロスタグランジンＰＧＥ₂は、ヒト皮膚線維芽細胞、ラットメサンギウム細胞、及び肝星細胞を包含する様々な細胞におけるＩ型及び／又はＩＩＩ型コラーゲンの合成を減少させるにあたって有意な効果をもつものと示されている［参考］。Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚真皮を構成するコラーゲンの主要な形態であるため、このような効果は、炎症に応答したＰＧＥ₂の濃度上昇により、コラーゲン合成が抑制されることを立証する。ＡＡ及びＰＧＥ₂は、コラーゲン合成に対する抑制効果を有することが示されている。ω−３脂肪酸のＥＰＡ及びＤＨＡを包含する、天然由来のＣＯＸ−２阻害剤を添加した場合には、ＰＧＥ₂によって生じるコラーゲン合成の抑制が相殺され、コラーゲン合成の純増加が導かれた。したがって、フィカス美容液画分は、恐らく、ＣＯＸ２を阻害することによって、コラーゲンの合成を抑制するプロスタグランジンの産生量を低減させ、肌のきめを改善すると思われる。

フィカス美容液画分は、皮膚に局所適用した場合に、哺乳動物の色素沈着の過剰な皮膚領域を美白化するなど、意外にも従来のフィカス抽出物と比べより優れた皮膚美白化効果を達成することが判明している。更に、分析試験によって、本発明のフィカス美容液画分は、多様な作用機構によってメラニン合成を崩壊させ、酵素経路と非酵素経路との両方に影響を及ぼすことが示された。ＦＳＦは、従来のフィカス抽出物と比べて、酵素阻害活性、フリーラジカル捕捉活性、酸化防止活性、及びメラニン合成抑制活性の１つ又は組み合わせなどといった生理活性が強化されている。酵素阻害活性は、チロシナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、及びシクロオキシゲナーゼ−２（「ＣＯＸ−２」）阻害活性の１つ又はこれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。酸化防止活性は、酸素ラジカル吸収能力を包含するが、これに限定されない。

更に、本治験担当医師らは、例えば、従来のフィカス抽出物は、過剰な色素沈着に対し利点を提供し得るものの、これら従来の抽出物はあまり効果的ではなく、並びにあまり好ましくなくひいては化粧品組成物に用いるのにあまり望ましくない特性を有することも示した。

図５に示されるように、ＦＳＦは、より高濃度（約１０倍）のカテキンと、その縮合型のタンニンとを含有する。カテキン等の縮合型タンニン（プロアントシアニジン）は、フラバノールの類である。プロアントシアニジンは、本質的に、カテキン等のフラボノイドのポリマー鎖である。タンニンは、人体において、生物学的酸化防止剤（フリーラジカル補足剤）として機能すると考えられており、並びに老化などによって引き起こされる酸化損傷などに有効であると広く考えられている。更に、酸化防止剤は、喫煙及び汚染のような内部及び環境ストレスの影響を予防する助けとなり得るだけでなく、健康体の代謝過程を支持する助けともなり得る。（Ｋｅｈｒｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，２３，２１）。図７も、必須アミノ酸である遊離チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンを、ＦＳＦが高濃度で含有していたことを示す。しかし、検出された３種類のカフェオイルキナ酸異性体の濃度は、図６に示す２種類のサンプル間で実質的に差異があるようには見えなかった。

Ｂ．皮膚トーン剤
幾つかの態様において、組成物中には、ＦＳＦと組み合わせて皮膚トーン剤を含有させることが望ましいことがある。皮膚トーン剤は、全体的な皮膚色調を更に改善するよう含められてもよい。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約５０重量％、４０重量％、３０重量％、２０重量％、１０重量％、５重量％又は３重量％迄の皮膚トーン剤を含有する。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の少なくとも約０．００１重量％、０．０１重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％又は１重量％の皮膚トーン剤を含有する。好適な範囲は、組成物の約０．１重量％〜約５０重量％、約０．２重量％〜約２０重量％、又は約１重量％〜約１０重量％の皮膚トーン剤の好適な範囲を含む、下限及び上限の任意の組み合わせを含む。皮膚トーン剤の効力はかなり多様であるため、皮膚トーン剤の最適な量は選択される特定の活性物質によって異なり、本明細書に列挙した量は、規準としてのみ使用されるべきである。

好適な皮膚トーン剤には、糖アミン、ビタミンＢ３化合物、アルブチン、デオキシアルブチン、ヘキシルレゾルシノール等の１，３−ジヒドロキシ−４−アルキルベンゼン、ジラウリン酸スクロース、バクコイル（bakuchoil）（４−［（１Ｅ，３Ｓ）−３−エテニル−３，７−ジメチル−１，６オクタジエニル］フェノール又はモノテルペン（monterpene）フェノール）、ピレノイン（pyrenoine）（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｍａｒｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能）、キビ（panicum miliaceum）種子抽出物、アーラトン（arlatone）二酸、ケイ皮酸、フェルラ酸、アクロマキシル（achromaxyl）、メチルニコチンアミド、油可溶性甘草抽出物、葉酸、ウンデシレン酸（即ち、ウンデセン酸）、ウンデシレン酸亜鉛、チアミン（ビタミンＢ１）及びその塩酸塩、Ｌ−トリプトファン、ヒマワリ（helianthus annuus）（サンフラワー）及びブドウ（vitis vinifera）（グレープ）葉抽出物、カルノシン（即ち、ドラゴシン）、ゲンチシン酸メチル、１，２−ヘキサンジオール及び１，２−オクタンジオール（即ち、Ｓｙｍｒｉｓｅ ＡＧ，ＧｅｒｍａｎｙによりＳｙｍｄｉｏｌ ６８として販売されている組み合わせ）、イノシトール、デシレノイルフェニルアラニン（decylenoylphenylalanine）（例えば、Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅにより商標名Ｓｅｐｉｗｈｉｔｅで販売）、コウジ酸（koijic acid）、ヘキサミジン化合物、サリチル酸、並びにプロピオン酸レチノール及びプロピオン酸レチニルを含むレチノイドが挙げられるが、これらに限定されない。

所定の態様において、追加の皮膚トーン剤はビタミンＢ３化合物、糖アミン、ヘキサミジン化合物、サリチル酸、ヘキシルレゾルシノール等の１，３−ジヒドロキシ−４−アルキルベンゼン、及びレチノイドからなる群から選択される。本明細書で使用するとき、「ビタミンＢ₃化合物」は、次式を有する化合物を意味する。

式中、Ｒは、−ＣＯＮＨ₂（すなわち、ナイアシンアミド）、−ＣＯＯＨ（すなわち、ニコチン酸）又は−ＣＨ₂ＯＨ（すなわち、ニコチニルアルコール）；これらの誘導体；及び前述のいずれかの塩である。本明細書で使用するとき、「糖アミン」には、その異性体及び互変異性体、並びにその塩（例えば、ＨＣｌ塩）及びその誘導体が含まれる。糖アミンの例としては、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、これらの異性体（例えば、立体異性体）、及びこれらの塩（例えば、ＨＣｌ塩）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「ヘキサミジン化合物」とは、次式を有する化合物を意味する：

式中、Ｒ¹及びＲ²は任意であるか、又は有機酸（例えば、スルホン酸など）である。一態様において、ヘキサミジン化合物はジイセチオン酸ヘキサミジンである。

Ｃ．抗炎症剤
色素沈着過剰は、皮膚炎症から生じ得る。色素沈着過剰、より詳細には炎症後色素沈着過剰を引き起こす一過性炎症事象としては、挫創病変、内方発育毛、引っ掻き傷、虫刺され、界面活性剤損傷、アレルゲン、及び短時間の紫外線暴露が挙げられるが、これらに限定されない。炎症後色素沈着過剰を含む、炎症誘導による色素沈着過剰は、本発明の組成物中に抗炎症剤を組み込むことにより対処することができる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約２０重量％、１０重量％、５重量％、３重量％又は１重量％迄の抗炎症剤を含有する。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の少なくとも約０．００１重量％、０．０１重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．５重量％又は１重量％の抗炎症剤を含有する。好適な範囲は、下限と上限との任意の組み合わせを含む。好適な抗炎症剤には、非ステロイド系の抗炎症剤（イブプロフェン、ナプロキセン、フルフェナム酸、エトフェナマート、アスピリン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、ピロキシカム及びフェルビナクが挙げられるが、これらに限定されないＮＳＡＩＤＳ）、グリシルリジン酸（グリシルリジン、グリシルリキシン酸（glycyrrhixinic acid）及びグリシルレチン酸グリコシドとしても知られている）及びグリシルリジン酸二カリウム等の塩、グリシルレテン酸（glycyrrhetenic acid）、甘草抽出物、ビサボロール（例えば、αビサボロール）、マンジスタ（キイチゴ属の植物、特にクルマバアカネ（Rubia cordifolia）から抽出される）、及びガッグル（guggal）（コミフォラ属の植物、特にコミフォラムクリ（Commiphora mukul）から抽出される）、コーラノキ抽出物、カミツレ、ムラサキツメクサ抽出物、及びムチサンゴ（sea whip）抽出物（ヤギ目の植物からの抽出物）、上記のいずれかの誘導体、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。

Ｄ．日焼け防止活性物質
本発明の組成物は、１つ以上の日焼け止め活性物質（日焼け止め剤）及び／又は紫外線吸収剤を含んでよい。本明細書において、「日焼け防止活性物質」は、集合的に、日焼け防止活性物質、日焼け止め剤、及び／又は紫外線吸収剤を包含する。日焼け止め活性物質には、日焼け止め剤と物理的日焼け防止剤の双方が含まれる。日焼け止め活性物質は、有機又は無機であってよい。好適な日焼け止め活性物質の例は、「日焼け止め剤」としてＰｅｒｓｏｎａｌ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｕｎｃｉｌ’ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。特に好適な日焼け止め活性物質は、２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート（ＰＡＲＳＯＬ（商標）ＭＣＸとして市販）、４，４’−ｔ−ブチルメトキシジベンゾイルメタン（ＰＡＲＳＯＬ（商標）１７８９として市販）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、オクチルジメチル−ｐ−アミノ安息香酸、ジガロイルトリオレエート、２，２−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、エチル−４−（ビス（ヒドロキシプロピル））アミノベンゾエート、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、２−エチルヘキシルサリチレート、グリセリル−ｐ−アミノベンゾエート、３，３，５−トリ−メチルシクロヘキシルサリチレート、アントラニル酸メチル、ｐ−ジメチル−アミノ安息香酸又はアミノベンゾエート、２−エチルヘキシル−ｐ−ジメチルアミノベンゾエート、２−フェニルベンゾイミダゾール−５−スルホン酸、２−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−５−スルホンベンゾオキサゾイン酸、オクトクリレン、酸化亜鉛、ベンジリデンカンファー及びその誘導体、二酸化チタン、並びにこれらの混合物である。

一態様において、組成物は、組成物の約１重量％〜約２０重量％、代替的に約２重量％〜約１０重量％の日焼け止め活性物質を含有してもよい。正確な量は、選択された日焼け止め活性物質と、当業者の知識の範囲内である所望の太陽光線保護指数（ＳＰＦ）に応じて変動するであろう。

Ｅ．任意成分
本発明の組成物は、本発明の利益を受け入れ難いほど変更しなければ、様々な他の成分を含有することができる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約５０重量％、約０．００１重量％〜約２０重量％、又は代替的に約０．０１重量％〜約１０重量％の任意構成成分を含有することができる。本明細書に列挙した量は規準としてのみ使用されるべきであり、組成物中に使用される任意構成成分の最適な量は、それらの効力がかなり多様であるため、選択される特定の活性物質に依存するであろう。したがって、本発明において有用ないくつかの任意構成成分の量は、本明細書に列挙した範囲外であり得る。

組成物中に組み込まれる場合、任意成分は、過度の毒性、不適応性、不安定性、アレルギー反応等を示すことなく、ヒト皮膚組織に接触させて用いるのに好適でなければならない。本発明の組成物は、抗挫創活性物質、落屑活性物質、抗セルライト剤、キレート剤、フラボノイド、日焼け活性物質、非ビタミン酸化防止剤及びラジカルスカベンジャー、育毛調整剤、しわ防止活性物質、抗皮膚萎縮防止活性物質、鉱物、フィトステロール及び／又は植物ホルモン、Ｎ−アシルアミノ酸化合物、抗菌活性物質又は抗真菌活性物質、並びに他の有用なスキンケア活性物質等の任意構成成分を含有してもよく、これらは、米国特許出願公開第２００６／０２７５２３７（Ａ１）号及び同第２００４／０１７５３４７（Ａ１）号に更に詳細に記載されている。

Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｕｎｃｉｌ’ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎには、皮膚ケア産業において通常使用されている非常に様々な非限定的な美容及び医薬成分が記載される。それらは本発明の組成物中で使用するのに好適な任意構成成分である。これらの成分クラスの例としては、研磨材、吸収剤、芳香剤等の美容構成成分、色素、顔料／着色剤、精油、アンチケーキング剤、消泡剤、抗菌剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝剤、充填剤、キレート化剤、化学的添加剤、着色剤、美容収斂剤、美容殺生物剤、変性剤、薬物収斂剤、皮膚軟化剤、外用鎮痛剤、フィルム形成剤又は材料、乳白剤、ｐＨ調整剤、保存料、噴霧剤、還元剤、捕捉剤、皮膚冷却剤、皮膚保護剤、増粘剤粘度調節剤、ビタミン及びそれらの組み合わせが挙げられる。

Ｆ．皮膚科学的に許容可能なキャリア
本発明の組成物は、組成物用の皮膚科学的に許容可能なキャリア（「キャリア」と称してもよい）も含有し得る。本明細書で使用するとき、「皮膚科学的に許容可能なキャリア」という語句は、キャリアがケラチン組織への局所塗布に好適であり、良好な審美特性を有し、組成物中の活性物質と適合性があり、安全性又は毒性についていかなる不当な問題も起こさないことを意味する。一態様において、キャリアは、組成物の約５０重量％〜約９９重量％、約６０重量％〜約９８重量％、約７０重量％〜約９８重量％、又は代替的に約８０重量％〜約９５重量％の濃度で存在する。

キャリアは多様な形態をとりうる。非限定例には、単純な溶液（例えば、水性、有機溶媒又は油ベースの）、乳濁液、及び固体形態（例えば、ゲル、スティック、流動性固体、又は無定形材料）が挙げられる。特定の態様において、皮膚科学的に許容可能なキャリアは、エマルションの形状である。エマルションは、一般に、連続水相（例えば水中油型及び水中油中水型）、又は連続油相（例えば油中水型及び油中水中油型）を有するものとして分類され得る。本発明の油相には、シリコーンオイル、非シリコーンオイル（炭化水素油、エステル類、エーテル類など）、及びこれらの混合物が含まれうる。

水相は典型的に、水を含む。しかしながら、別の態様では、水相は、水溶性保湿剤、コンディショニング剤、抗菌剤、湿潤剤、及び／又は他の水溶性スキンケア活性物質が挙げられるが、これらに限定されない水以外の構成成分を含み得る。一態様では、組成物の非水構成成分は、グリセリン及び／又は他のポリオール等の湿潤剤を含む。しかしながら、組成物は、実質的に（即ち、１％未満の水）又は完全に無水であってもよいことを理解するべきである。

所望の製品形態を得るために、好適なキャリアが選択される。更に、それら成分（例えば、ＦＳＦ、日焼け止め活性の追加成分）の溶解性又は分散性は、キャリアの形態と特徴とを決定することがある。一態様では、水中油又は油中水型の乳濁液が好ましい。

乳濁液は、更に乳化剤を含み得る。組成物は、キャリアを十分乳状にする任意の好適な百分率の乳化剤を含有してもよい。好適な重量範囲は、組成物の、約０．１重量％〜約１０重量％又は約０．２重量％〜約５重量％の乳化剤を含む。乳化剤は、非イオン性、アニオン性、又はカチオン性であり得る。好適な乳化剤は、例えば、米国特許第３，７５５，５６０号、同第４，４２１，７６９号、及びＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ，Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ３１７〜３２４（１９８６）に開示されている。好適なエマルションは、所望の製品形態に応じて、幅広い粘度を有し得る。

キャリアは、当業者に周知であるように増粘剤を更に含有して、好適な粘度及び流動学的特性を有する組成物を提供してもよい。

Ｇ．典型的な組成物
以下は、本発明の組成物の非限定的な実施例である。これらの実施例は単に説明のために示すものであり、本発明を限定するものと解釈すべきでなく、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの改変が可能であり、当業者にはこれらのことが理解されよう。実施例においては、特に指定のない限り、全ての濃度が重量％として列挙されており、希釈剤、充填剤などの微量物質は除外し得る。そのため、列挙した配合は、列挙した成分及びこのような成分に関連するいかなる微量物質をも含む。当業者にとって明白なように、このような微量物質の選択は、本明細書に記載したように本発明を作るために選択した特定成分の物理的及び化学的特質によって変わることになる。

全ての実施例は、１つ以上の色素沈着部位の外観を処置又は改善するのに使用され得る。本発明は、更に、第１の組成物（例えば、実施例Ａ又はＢ）によって１つ以上の色素沈着部位を局部的に処置し、第２の組成物（例えば、実施例Ｃ、Ｄ及びＥ）によってより広い又は全般的な顔の皮膚を処置することを含む治療計画に関してもよく、第２の組成物は、局部的な処置の前又は後に塗布されて、顔全体の皮膚色調を改善し得る。

^*１−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により生成。
^*２−ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能なＳｅｐｉｗｈｉｔｅ。
^*３−Ｃｏｇｎｉｓ ＧｍｂＨから入手可能なＥｍｕｌｇａｄｅ ＰＬ ６８／５０。
^*４−ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能なＳｅｐｉｇｅｌ ３０５。
^*５−Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩから入手可能なＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ＤＣ１５０３。

本発明の組成物は、一般に、局所塗布組成物を製造する技術分野において既知であるような従来の方法によって調製される。このような方法は、通常、加熱、冷却、真空の適用などを用いて又は用いずに、成分を１つ以上の工程で混合して比較的均一な状態にするものである。一般に、乳濁液は、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後２相を適宜組み合わせて、所望の連続層を得ることにより調製される。組成物は、好ましくは、安定性（物理的安定性、化学的安定性、光安定性）、及び／又は活性物質の送達を最適化するように調製される。この最適化には、適切なｐＨ（例えば７未満）、活性剤と錯体になり、ひいては安定性又は分配にマイナスの影響を与え得る物質の排除（例えば汚染鉄の排除）、錯体形成を防止する手法（例えば適切な分散剤又は二重区画包装）の使用、適切な光安定性の手法（例えば日焼け止め剤／日焼け防止剤の組み込み、不透明包装の使用）の使用などが含まれてもよい。

本発明の組成物は、好ましくはフィカス美容液画分を約０．０１％〜約１０％、より好ましくはフィカス美容液画分を約０．０５％〜約５％、最も好ましくは約０．１％〜約５％、例えば２％、含有する。

Ｈ．皮膚美白化の方法
本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚（特にヒト皮膚、更には顔面皮膚及び手皮膚）を美白化するのに有用である。それら組成物は、とりわけ、色素沈着の過剰な皮膚領域を美白化するのに有用である。

皮膚（色素沈着の過剰な領域を含む）を美白化する方法には、本発明の組成物の安全かつ有効な量を皮膚に局所適用することが含まれる。１つの態様において、本発明の化粧品組成物は、フィカス美容液画分を０．０１％〜１０％含有する。適用される組成物の量、適用の頻度、及び使用の期間は、提供される組成物のフィカス美容液画分及び／又は他の諸成分の濃度と、所望される美白化の程度、例えば、対象者の皮膚に存在する色素沈着の程度と、皮膚への更なる色素沈着の速度とに応じて大きく異なる。

好ましい態様において、組成物は、長期にわたって皮膚に適用される。「長期的な局所適用」は、被験者の生涯の間の長期間にわたって、好ましくは少なくとも約１週間の期間の間、より好ましくは少なくとも約１ヶ月の期間の間、更により好ましくは少なくとも約３ヶ月の間、更により好ましくは少なくとも約６ヶ月の間、なお更により好ましくは少なくとも約１年の間、組成物を実質的に連続的に局所適用することを意味する。効果は、様々な最大使用期間（例えば、２年、５年、１０年、又は２０年）の後得られるが、長期適用は、被験者の生涯を通して継続することが好ましい。典型的には、適用は、そのような長期間にわたって、１日に約１回又は２回程度であるが、適用頻度は、例えば、約１回／週〜約３回／日、又はそれ以上と様々であってよい。

本発明の組成物を様々な用量で使用して、皮膚美白化効果を提供することができる。典型的に１回の適用当りに適用される、本発明の組成物の量は、約０．１ｍｇ／ｃｍ２（皮膚）〜約１０ｍｇ／ｃｍ２（皮膚）である。とりわけ有用な適用量は、約２ｍｇ／ｃｍ２（皮膚）である。

本明細書で用いられる用語「局所適用」は、本発明の組成物を皮膚表面に適用又は薄く塗布することを意味する。本発明の好ましい組成物は、局所適用、例えば、クリーム、ローション、保湿剤、又は同種のものの典型的な使用後、長期間にわたって（例えば、数時間にわたって）皮膚と接触した状態で残されるように意図された形態のものである。

皮膚を美白化する方法は、好ましくは、皮膚用のローション、クリーム、化粧品、又は同類のものの形態の組成物であって、ある審美的利益、予防のための利益、治療上の利益、又は他の利益のために皮膚上にとどめることを意図される組成物を局所適用することによって行われる。皮膚に組成物を適用した後、該組成物は、好ましくは少なくとも約１５分間、より好ましくは少なくとも約３０分間、更により好ましくは少なくとも約１時間、最も好ましくは少なくとも数時間、例えば、約１２時間以下で皮膚上に残される。

また、本発明の組成物は、より一般的には、皮膚老化の徴候、並びに、皮膚老化に関連する視認可能でかつ／又は触知可能な皮膚の不連続さなどといった、哺乳動物の皮膚（とりわけ、ヒト皮膚、更には顔面皮膚及び／又は手皮膚）の状態を制御するのに有用である。そのような制御には、予防的制御及び／又は治療的制御が包含される。皮膚の状態を制御することには、本発明の組成物の安全かつ有効な量を、皮膚に局所適用することが含まれる。適用される組成物の量、適用の頻度、及び使用の期間は、提供される組成物のフィカス美容液画分及び／又は他の諸成分の濃度と、所望される制御の程度、例えば、対象者の皮膚に存在する加齢の程度と、皮膚の更なる加齢の速度とに応じて大きく異なる。

Ｉ．フィカス美容液画分の生理活性
本発明は、メラニン合成（メラニン合成）における１つ以上の段階を阻害するために、色素沈着の過剰な領域に本化粧品組成物を局所適用することによって、皮膚の色素沈着が過剰な外観を低減する方法にも関する。本化粧品組成物は、酵素阻害（トリプシン阻害活性及び／若しくはチロシナーゼ阻害活性）、酸化防止活性（ＯＲＡＣ及びＤＰＰＨ）、並びに／又はＣＯＸ−２阻害をもたらし、それによって、メラニン合成における１つ以上の段階を阻害する。

生理活性をもつ植物性の化粧品組成物を調製する方法は、該方法により、植物細胞に含まれる全範囲の活性物質を含有する植物抽出物が生成されるという点で、現在利用できる方法より優れて好都合である。実施例６に示されるように、本発明のフィカス美容液画分は、従来の方法によって抽出されたフィカス抽出物に比べて、遥かに高い生理活性を有する。

本発明の１つの態様において、哺乳動物の皮膚を美白化する方法は、トリプシン活性を阻害するのに有効な量のフィカス美容液画分を含有する化粧品組成物を、局所投与することを含む。

本発明のもう１つの態様は、哺乳動物の皮膚においてチロシナーゼ活性を阻害することによって、哺乳動物の皮膚を美白化する方法であって、有効量のフィカス美容液画分を含有する化粧品組成物を哺乳動物に局所投与することを含む方法を含む。

正常な皮膚の色は、髪及び目の色をも決定する天然色素のメラニンによって形成される。皮膚において、酵素チロシナーゼは、アミノ酸のチロシンのメラニンへの転換に関与する生化学的経路に不可欠である。過剰な色素沈着は、メラニンが過剰に生成されて、皮膚中で堆積物を形成することで生じる。色素を作る細胞は、メラニン産生細胞と称される。それら細胞は、表皮の基底層に位置している。メラニン産生細胞は、メラノソームを産生する。メラノソームは、表皮の他の細胞の上に移行し、皮膚の最上層にたどり着く。メラニンの合成は、専らメラノソームにおいてのみ生じる。メラニンが過剰に生成されると、堆積物が形成されて、皮膚に色素沈着過剰が生じる。

チロシナーゼは、モノフェノールの対応するカテコールへのｏ−ヒドロキシル化（モノフェノラーゼ活性又はクレゾラーゼ活性）と、モノフェノールの対応するｏ−キノンへの酸化（ジフェノラーゼ活性又はカテコラーゼ活性）とに触媒作用を及ぼす銅含有モノオキシゲナーゼである。チロシナーゼのこれらの機能は、メラニン合成時のメラニン色素の生成に重要な役割を果たす。メラニン産生は、主に皮膚の色味に関与し、日光により誘導される皮膚損傷の防止に重要な役割を果たす。しかし、メラニン生成物の異常蓄積は、望ましくない審美的外観を引き起こす、メラニン沈着、肝斑、そばかす、老人性黒子などの色素沈着過剰に関与する（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｖｏｌ．２６：１１３５〜１１３７）。

本発明は、概して、哺乳動物の皮膚組織内で皮膚の色素沈着又は着色に関与する少なくとも１種類の酵素活性を阻害することに関する。フィカス美容液画分は、トリプシンだけでなくチロシナーゼ及び他のチロシナーゼ様酵素の活性を阻害することができる。更に、本発明は、超酸化物捕捉活性だけでなくＣＯＸ−２阻害活性をも包含する、色素に関連する酸化防止活性（ＯＲＡＣ及びＤＰＰＨ）をもたらすことに関する。

美容液由来の化粧品組成物は、ＩＣＲ５０値が約５０〜１９０μｇ（乾物）／ｍＬである超酸化物捕捉効能を有する。本明細書で用いられる用語「ＩＣＲ５０値」は、チトクロームｃの還元を５０％抑制するにあたり細胞美容液画分に含有させる必要のある乾物濃度を表わす。

本化合物は、１日に数回の頻度で哺乳動物に投与することができるか、又は、１回／日、１回／週、２週間おきに１回、１回／月のような、より少ない頻度で、又は数ヶ月に１回、若しくは１年未満に１回のような、更により少ない頻度で投与することができる。投薬の頻度は、当業者によって容易に判断され、限定するものではないが、例えば、処置されている疾患の種類及び重症度、動物の種類及び年齢等の幾種類もの要因によって異なる。

Ｊ．任意成分
本発明の組成物は、所与の製品の種類に従来用いられる他の様々な成分を、それらが本発明の効果を容認し難いほど変更しないという条件で含有してもよい。本組成物には、皮膚科学的に許容されるキャリアを含有させることができる。

組成物中に組み込まれる場合、任意の構成成分は、正常な判断の範囲内で、過度の毒性、不適応性、不安定性、アレルギー反応等を示すことなく、ヒト皮膚組織に接触させて用いるのに好適でなければならない。ＣＴＦＡ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９２）には、スキンケア工業で一般に用いられる、種々様々な非限定的な化粧品及び医薬品の成分であって、本発明の組成物に用いるのに適する成分が記述されている。これらの成分の部類の例としては、研磨剤、吸着剤、香料などの審美的構成成分、顔料、色素／着色剤、精油、皮膚感覚剤、消泡剤、結合剤、生物学的添加物、緩衝剤、充填剤、キレート化剤、化学添加物、着色剤、化粧用収れん剤、化粧用殺生剤、変性剤、薬用収れん剤、外用鎮痛剤、例えば、組成物の被膜形成特性及び実体性を補助するためのポリマーなどの被膜形成剤又は物質（例えば、エイコセンとビニルピロリドンのコポリマー）、不透明化剤、ｐＨ調整剤、噴射剤、還元剤、封鎖剤、及び増粘剤が挙げられる。

幾つかの態様において、本組成物には、ＦＳＦと組み合わせて、第２、第３又は第４の皮膚トーン剤を含有させることが望ましい場合がある。第２、第３又は第４の皮膚トーン剤は、全般的な皮膚トーンを更に改善するために含有させてもよい。本発明の組成物は、追加の皮膚トーン剤を、存在する場合、好ましくは、本組成物の約０．１重量％〜約５０重量％、より好ましくは約０．２重量％〜約２０重量％、更により好ましくは約１重量％〜約１０重量％含有する。追加の皮膚トーン剤の効力はかなり多様であるため、皮膚トーン剤の最適な量は選択される特定の活性物質によって異なり、本明細書に列挙した量は、規準としてのみ使用されるべきである。好ましい皮膚トーン剤には、Ｎ−アセチルグルコサミン、ビタミンＢ３、及びウンデシレノイルフェニルアラニン（undecylenoylphenylalanine）（例えば、商品名Ｓｅｐｉｗｈｉｔｅ，Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅで販売されているもの）が包含されるが、それらに限定されない。幾つかの態様において、色素沈着過剰な１つ以上の箇所を局所処置するために、１種類の組成物（例えば、表１の組成物＃１）を用い、なおかつ専門治療の前又は後に１種類以上の他の組成物（例えば、表１の組成物＃２、＃３及び＃４）を顔面皮膚の表面により広範に適用して、顔面中の皮膚トーンを改善することができる。

本発明の局所組成物は、様々な形態で提供することができる。それら形態は、ローション、乳液、ムース、美容液、スプレー、エアゾール、フォーム、スティック、ペンシル、ゲル、クリーム、及び軟膏を包含するが、これらに限定されない。一態様では、本組成物は溶液の形態であり、もう１つの態様においては、本組成物はローションの形態である。

Ｋ．組成物の調製
本発明の組成物は、一般に、局所塗布組成物を製造する技術分野において既知であるような従来の方法によって調製される。このような方法は、通常、加熱、冷却、真空の適用などを用いて又は用いずに、成分を１つ以上の工程で混合して比較的均一な状態にするものである。組成物は、好ましくは、安定性（物理的安定性、化学的安定性、光安定性）、及び／又は活性物質の送達を最適化するように調製される。この最適化には、適切なｐＨ（例えば７未満）、活性剤と錯体になり、ひいては安定性又は分配にマイナスの影響を与え得る物質の排除（例えば汚染鉄の排除）、錯体形成を防止する手法（例えば適切な分散剤又は二重区画包装）の使用、適切な光安定性の手法（例えば日焼け止め剤／日焼け防止剤の組み込み、不透明包装の使用）の使用などが含まれてもよい。

Ｌ．処置方法
１つの態様において、使用者は、処置するにあたり色素沈着の過剰な箇所を選択し、次いで、第１の組成物を、１日に少なくとも１回、より好ましくは１日に２回、少なくとも約４週間の間、その色素沈着の過剰な箇所に適用する。もう１つの態様において、第１の組成物は、選択された色素沈着の過剰な箇所に少なくとも約８週間にわたって適用される。第１の組成物は、いかなる形態であってもよい。１つの態様において、本組成物は、色素沈着の過剰な箇所に目薬の容器を用い局所的に適用される溶液の形態である。色素沈着の過剰な箇所に第１の組成物を局所適用することのできる他の塗布器を用いてもよい。例えば、フォームアプリケータ又は綿棒であって、溶液、ローション、又は本明細書に記述される他の形態のような第１の組成物を放出可能なように保持するものを用いて、色素沈着の過剰な箇所に本組成物を適用することができる。もう１つの態様において、本組成物は、１箇所以上の色素沈着の過剰な部位に、より一般的には１箇所以上の顔面皮膚の表面に同時に（すなわち、同一の治療周期内で）適用される。

幾つかの事例において、本処置方法は、１つの治療周期において、第１の組成物によって局所的治療を行うにあたり色素沈着の過剰な箇所を複数選定する段階を含む。本明細書で用いられる治療周期とは、意図される皮膚表面に組成物を単独適用することを言う。例えば、色素沈着の過剰な１箇所以上の部位に、適度に短い連続期間で（例えば、１〜３０分間にわたって）第１の組成物を単独適用した場合、これにより１周期分の治療周期が構成される。対照的に、色素沈着の過剰な１箇所以上の部位に、１日に２回、第１の組成物を単独適用する場合、これは治療周期を２周期分構成することになる。この際、これら適用は、より長時間にわたって互いに分離される（例えば、１〜１２時間分離される）。

１つの態様において、本処置方法は、第１の組成物を、第１の組成物の前又は後に適用される第２の組成物と組み合わせて適用する工程であって、第２の組成物を、より一般的には、顔面皮膚表面の１箇所以上に適用して、顔面皮膚の全体的な外観のトーンを改善する工程を含む。第２の組成物は、前頭、口周、顎、眼窩周囲、鼻、及びほおの皮膚表面の１箇所以上に適用することができる。１つの態様において、１回の治療周期中に、第２の組成物を少なくともほお、前頭、及び／又は顎／口周の皮膚表面に適用する。第２の組成物が適用される表面領域は、色素沈着の過剰な箇所を局所処置する領域と比べてより広くなる。

本明細書に記述されている幾つかの方法は、本発明の組成物をアプリケータを用いて適用することを意図しているが、アプリケータは必須ではなく、本発明の組成物は、直接又は使用者の指を用い（又は何らかの他の方法で）適用することができることが認識されるであろう。更に、本発明の１つの態様は、色素沈着の過剰な箇所に組成物を局所適用することを意図しているが、本発明の組成物は、より一般的には、顔面皮膚表面の１箇所以上に適用して、これらの顔面皮膚領域内での色素沈着の過剰な箇所の発生を低減させ得ることが認識されるであろう。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態の特定の特徴及び有利点を説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

次に、本発明は、次の諸実施例に関連して記述される。これらの実施例は、説明を目的としてのみ提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含するものと解釈されるべきである。

（実施例１）
フィカス・ベンガレンシスの新鮮な葉から得られる生理活性をもつ美容液画分の調製。
図１は、新鮮なフィカス葉から生理活性をもつ美容液画分を調製するためのプロセスの１つの態様を示す概略図である。

十分な量の新鮮なフィカス・ベンガレンシスの葉を収集して、約１００ｋｇの乾物を生じた。乾物の程度を測定したところ、新鮮な葉の３２．０１％に乾燥していた。すなわち１００ｋｇの乾物を得るためには、約３１２．４ｋｇの新鮮な植物葉を収穫する必要があった。新鮮な葉の元々の含水量を保存するため、かつ、水分損失に起因するしおれを回避するために、注意を払った。その収集は、収集される新鮮な葉に対するいかなる損傷をも回避するか又は最小限に抑えるようなやり方で行った。全ての工程をできるだけ短時間で完了させて、日光、高温、及び他の負の環境要因への新鮮な葉の暴露を最小限に抑えた。

収集された葉は、次いで、更なる処理加工を行う前に、５分以下の間、９８．１ｋＰａ（１ｋｇ／ｃｍ²）以下の水圧で洗浄して、土壌粒子及び他の破片を除去した。洗浄後の水には、いかなる緑色色素も茶色色素も含有されなかったため、葉組織の保全性、水圧及び洗浄時間が適切であったことが示された。過剰な水は、洗浄済みの葉から除去した。次いで、洗浄済みの新鮮なフィカス葉を機械的に分離し、主に細胞壁を含有する、繊維に富む物質から、柔細胞の細胞内物質の大部分を含有しかつ繊維を含有していない細胞汁を効果的に分離した。分離工程前あるいは分離工程中に、外因性の溶媒又は水は全く添加しなかった。

洗浄済みの葉から細胞汁を放出させる工程は、粉砕、浸漬、及び加圧により、細胞に含まれる液体成分（すなわち、細胞汁）を得た後に、繊維に富む原料からそれを分離する工程を含む。５ＨＰエンジンと一組のスクリーンとを備えたハンマーミル（ＶＳ ３５モデル，Ｖｉｎｃｅｎｔ社（Ｔａｍｐａ，ＦＬ）を用いて、最短時間で、生物資源の温度を有意に上昇させずに葉を粉砕して、適当に小さい寸法の葉組織粒子を生成する。ハンマーミルは、１０秒以下の加工処理で、最大寸法２．０ｃｍ以下の浸軟された葉粒子が生成されるよう設定した。浸軟された新鮮な葉の温度は、僅か２℃以下だけ上昇した。

圧縮空気によって支持されるコーンを装備した水平型連続スクリュープレス（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｒｅｓｓ ＣＰ−６，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，（Ｔａｍｐａ，ＦＬ））を直接用いて、浸軟された新鮮な葉から細胞汁を得た。コーン上の圧力は、１４７１．０ｋＰａ（１５ｇ／ｃｍ²）以上の濃度に維持され、スクリュー速度は１２ｒｐｍであった。これらの条件で、細胞汁の温度は、僅か５℃以下上昇した。

この処理によって、繊維に富む物質と細胞汁とが生成された。残りの小さい繊維粒子は、全自動放出装置を搭載した連続流遠心分離機（１２−４１３Ｖモデル，ＡＭＬ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社，（Ｈａｔｂｏｒｏ，ＰＡ））を用い清澄化し、細胞汁から更に除去した。２リットル／分の流量で、２，２５０ｇ以下の細胞汁の清澄化を行うための滞留時間は、１００秒以上である。上記の管理工程によって、繊維を含有していない細胞汁を生成した。小繊維粒子を含有する沈殿物を回収し、次いで、新鮮な葉を圧搾した後に生成された、残部の繊維に富む原料と組み合わせる。

上述の方法によって、乾物含量が９．２９％の細胞汁１６０．９ｋｇと、乾物含量が５６．１４％の繊維に富む物質１５１．５ｋｇとを生成することができた。細胞汁は、迅速に１５リットルの矩形のＨＰＤＥ容器に入れてしっかりと蓋をし、−３０℃で凍結させた。凍結させた固体状態の細胞汁は、更なる利用に備えこの低温で保存した。

細胞汁は、３種類の成分：（ｉ）膜結合葉緑体、ミトコンドリア、小胞体、細胞核、リソソーム、ペルオキシソーム、液胞、ゴルジ体、（ｉｉ）非膜結合リボソーム、微小管、及び（ｉｉｉ）上記の群に属しない成分、例えば、細胞質、を含有する。細胞小器官及びそれらの断片だけでなく、望ましくない色素及びタンパク質も細胞汁に存在するため、限定するものではないが、色、溶解性、透明性、安定性、及びインビトロ活性などといった性質が望ましく組み合わされた、パーソナルケア成分を生成するために、分画を行う必要があった。これらの目的を達成するために、細胞汁は、細胞汁の流動化、ｐＨ調整、集束マイクロ波照射、遠心分離、及び真空濾過などの、様々な処理を行い分画した。単離された細胞汁の美容液画分を、次いで、保存料及び酸化防止剤を用いて安定化させた。

酸化ストレス、加水分解、変性、異性化、重合、及び他の望ましくない影響を避けるため、細胞汁処理の期間及び程度は最小限に抑えた。

凍結状態の細胞汁は、１５リットル容器中で、２分以内で流動化させ、最初の液体状態へと転換させた。この処理の間、細胞汁の温度は、僅か２０℃以下上昇した。この処理が短時間であったため、変性プロセスと酸化的損傷との両方を最小限に抑えることができた。細胞汁を凍結させ流動化させた後の該細胞汁の物理化学的及び生化学的特性は、新鮮な葉から細胞汁を分離する間に測定された、細胞汁の対応する特性と同一であった。これらの特性には、限定するものではないが、細胞汁の乾物含量、ｐＨ、導電性、酸化還元電位、オスモル濃度、及び赤外線スペクトルなどが包含される。

次いで、５．０Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を用い、中性付近の細胞汁のｐＨを３．０を下回らないように低下させた（ｐＨ調整１）。ｐＨ調整済み細胞汁を、集束マイクロ波照射によって２，４５０ＭＨｚの周波数で迅速に処理する。この集束マイクロ波処理（ＦＭＰ）の間、細胞汁の温度は、瞬間的に９０℃まで上昇し、この温度に１分間保持され、次いで、直ちに３０℃以下に低下させられた。次いで、連続流遠心分離機ＣＥＰＡ ＬＥ（Ｃａｒｌ Ｐａｄｂｅｒｇ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ社，ドイツ）を用いて１５，０００ｒｐｍ、３０秒以上の滞留時間で処理済み細胞汁を迅速に分離する。１５．０ｋｇの処理済み細胞汁を分離して、１．３７ｋｇの緑色のペースト状沈殿物（「沈殿物１」）と、１３．６３ｋｇの、薄茶色で僅かに乳白光を発し乾物含量が６．７５％の液体状上澄み液（「上澄み液Ｉ」）と生成した。この上澄み液Ｉを、更に分画した。

表１は、ｐＨ調整済み細胞汁のＦＭＰ処理の間に生じる最大温度（Ｔｍａｘ）が、上澄み液Ｉ中の乾物含量と、その色と、クロロフィルａ及びクロロフィルｂ（それぞれ、６６２ｎｍ及び６４２ｎｍでの光吸収を測定することによって決定される）の存在とに及ぼす影響に関するデータを示す。

表１のデータは、Ｔｍａｘ＝９０℃で得られた上澄み液Ｉの乾物含量がより高く、かつクロロフィルを含有しないことを示している。Ｔｍａｘ＝６０℃の後に得られた上澄み液Ｉのガードナースケール値はより低くなるが、この調合液の乾物含量は有意により低くなり、かつクロロフィルの残存量はより高くなる。望ましくないことに化粧品成分中にこの色素が存在することに加えて、クロロフィルは、毒性化合物であると考えられているフェオホルビドに変化する恐れがあり（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｌ．Ｃ．，Ｖｕｃｅｎｉｋ，Ｉ．，Ｈａｇｅｎ，Ｉ．Ｋ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ Ｓ．Ａ．，Ｐｏｒｅｔｚ Ｒ．Ｄ．Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｔｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ａ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．−Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，２４，１，１７〜２３，１９９４）、かつ皮膚炎の原因となる（Ｋａｔｏ Ｔ．，Ｙａｍａｄａ Ｋ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｏｗｄｅｒ．−Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｈｙｇ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ，３６，６３２〜６３４，１９９５）。

上記理由に基づき、上澄み液Ｉを得るにあたり、好ましい条件として、ｐＨ調整済み細胞汁のＦＭＰ処理時のＴｍａｘは９０℃に設定し、得られた上澄み液Ｉを、限定するものではないがパーソナルケア成分の色み、透明度及び安定性などの性質を改善するために更に分画した。上澄み液Ｉは、（ｉ）チロシナーゼ、エラスターゼ、トリプシン、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害活性を包含するが、これらに限定されない酵素阻害活性、（ｉｉ）フリーラジカル捕捉活性、並びに（ｉｉｉ）酸素ラジカル吸収能力を包含するが、これらに限定されない酸化防止活性等の、望ましいインビトロ活性を有していたことに注目すべきである。上記のインビトロ活性の全てが決定的に重要な意味を持つことを考慮すれば、それらインビトロ活性には、望ましいパーソナルケア成分の機能特性を改善するのに必要な更なる処理によって、影響が生じないことが望ましい。本組成物を改善するという観点から、上澄み液Ｉを更に処理して、茶色の色素と、残渣のタンパク質を包含する他の望ましくない化合物とを有意に除去することが望ましい。

この目的を達成するため、上澄み液Ｉに、ｐＨ調整及び分離を含む更なる処理を行った。第１の処理は、５０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を滴加し、細胞汁の上澄み液ＩのｐＨを、約３．０〜７．５に上昇させて行った（ｐＨ調整２）。ｐＨが７．５を超えると、上澄み液ＩＩは望ましいエラスターゼ及びトリプシンの阻害活性を失うことに注目すべきである。ｐＨ調整２により、より色が黒ずみ、乳白光が呈された。この乳白光は、連続流れ遠心分離機ＣＥＰＡ ＬＥ（Ｃａｒｌ Ｐａｄｂｅｒｇ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ，（Ｇｅｒｍａｎｙ））を用い１５，０００ｒｐｍ及び滞留時間３０秒以上で直ちに清澄化された。上記の分離によって、茶色のペースト状沈殿物（以後、沈殿物ＩＩ）０．５３ｋｇと、茶色で僅かに乳白色を呈する乾物含量６．５９％の上澄み液（以後、上澄み液ＩＩ）１３．１０ｋｇとを生成した。

次いで、上澄み液ＩＩに５．０Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を滴加して、ｐＨを約３．６に低下させる（ｐＨ調整３）。このような処理によって、乳白色は僅かに増加したものの、ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩの色はより明るくなった。この物質に、０．２μｍの孔径を有する膜を用い濾過滅菌を行った。この処理により、結果的に、新鮮なフィカス葉の、淡色の透明な美容液画分が得られた。

美容液画分の色値（ガードナースケール値＝７．０）は、上澄み液Ｉの色値（ガードナースケール値＝８．５）より低かった。美容液画分のガードナースケール色値は、様々なＦＭＰ Ｔｍａｘ条件（表２）で得られた対応する上澄み液Ｉに比べて、常により低いことに注目すべきである。

細胞汁の流動化、ｐＨ調整（ｐＨ ３．０〜７．０の範囲内に調整）、集束マイクロ波照射（ＦＭＰ Ｔｍａｘ＝９０℃で１分間）、遠心分離、及び濾過滅菌を行った後に細胞汁から得られた美容液画分は、酵素阻害活性、フリーラジカル捕捉活性、及び酸化防止活性の全ての点で望ましいことが実証された。

比色分析に干渉し得るフェノール類を含有する美容液画分中の、残留タンパク質含量の測定に関してはケルダール法を用い、美容液画分中の及びその限外ろ液中の窒素含量を確実に検出した。異なる膜を用いて、美容液画分を、それぞれ１５キロダルトン（ｋＤ）以下、１０ｋＤ以下及び５ｋＤ以下の分子量を有する３種の濾液に分離した。表３に、サンプル中の窒素含量に関するデータを示す。

データから、低分子量化合物を除去する膜で限外濾過した後でも窒素含量が有意に変化しなかったことが示され、美容液画分中に含まれる窒素原子のうち、実質的に全てのものがタンパク質由来のものではないこと、すなわち、美容液画分はタンパク質を含有していないことが示唆される。

美容液画分は、酸化防止剤、安定化剤、キレート化剤、及び保存料を添加して更に安定化させた。以下は、実施例１に記述される美容液画分を安定させるために使用した添加剤の組成である：メタ重亜硫酸ナトリウム０．２％、ソルビン酸カリウム０．１％、安息香酸ナトリウム０．１％、メチルパラベンナトリウム０．１％。混合物は、完全に溶解するまでインキュベートした（３０分以上）。次いで、この混合物には１．９％ペンチレングリコールを添加した。

美容液画分は乾物を約６．３８％含有しており、新鮮なフィカス葉からの収率は約３６％であった。初期の新鮮なフィカス葉の乾物１００ｋｇから得られた美容液画分の乾物の収量は、約７．２ｋｇであった。

美容液画分に関し選択した特性と、そのインビトロ活性とを、表４及び表５に示す。

^*）乾物（％）は、安定剤を添加する前の生成物に関し記録された値である。

^*）Ｘ−乾燥重量で１単位のＤＰＰＨを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
^**）Ｙ−乾燥重量で１単位の（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。

（実施例２）
フィカス・ベンガレンシスの細胞汁から得られた美容液画分の特性及びインビトロ活性の比較
新鮮なフィカス葉を様々な場所で収集し、次いで、実施例１に記述されるように細胞汁に加工処理した。この細胞汁を凍結させ、次いで、１５リットルの矩形ＨＰＤＥ容器内に−３０℃で保管した。実施例１に記述されるのと同一の手順を用いて、同時に１個以上の容器の凍結細胞汁を美容液画分に加工処理した。

表６及び表７に示すデータは、その時々において同一の凍結細胞汁から得られた複数の画分、並びに異なる凍結細胞汁から得られた美容液画分のもつ、特性及びインビトロ活性の変動を示す。

^*）乾物（％）は、安定剤を添加する前の生成物に関し記録された値である。
^**）ショルダーは、様々な設定でのスペクトル分析に基づき幾つかのサンプルにおいて検出することができる。

（実施例３）
乾燥したフィカス・ベンガレンシス葉の水抽出物の調製
空気乾燥したフィカス・ベンガレンシス葉（実施例１で用いられたバッチと同一バッチの葉から収集された）５０ｇを、ＧＭ２００ Ｇｒｉｎｄｏｍｉｘ ｋｎｉｆｅ ｍｉｌｌ（Ｒｅｔｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で粉砕して、３００μｍ未満の粒径を有する粒子を得た。粉砕工程は、２，５００ｒｐｍで２０秒、次いで、２，５００ｒｐｍで１０秒、次いで、１０，０００ｒｐｍで１０秒から構成した。粉砕した葉を、ＯＭＮＩ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｋｅｎｎｅｓａｗ，ＧＡ））により脱イオン水と均質化させた。粉砕した葉３５ｇを水４９０ｇと混合し、次いで、ホモジナイザー・プラットホーム上の氷浴に入れた。２０ｍｍホモジナイザー・ジェネレイターを用いて、１５，０００ｒｐｍで１５分間均質化させた。次いで、イニシエータ２集束マイクロ波プロセッサー（Ｂｉｏｔａｇｅ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））により、ホモジネートを９０℃で１分間マイクロ波処理した。マイクロ波処理した原料を、次いで３，２００ｇで３０分間遠心処理した。次いで、上澄み液は、真空下で３層のＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ：２ペーパーにより濾過し、次いで、塩酸（ＨＣｌ）を滴加してｐＨ ４．０に調整した。ｐＨ調整したろ液を、３，２００ｇで３０分間、遠心処理し、次いで、上澄み液を、真空下で０．２μｍ滅菌フィルターにより濾過した。サンプルに、安定剤：メタ重亜硫酸ナトリウム０．２％、ソルビン酸カリウム０．１％、クエン酸０．１％、安息香酸ナトリウム０．１％を添加した。混合物は、完全に溶解するまでインキュベートした（３０分以上）。得られた乾燥葉の水抽出物は、バイアル瓶に入れ、次いで、暗所で室温で保存した。乾燥させたフィカス葉の水抽出物の、特性とインビトロ活性とを表８に示す。

^*）記載のインビトロ活性は、乾物割合基準で計算された。
^**）Ｘ−乾燥重量で１単位のＤＰＰＨを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
^***）Ｙ−乾燥重量で１単位の（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。

乾燥させたフィカス葉の水抽出物は、試験した広範囲の濃度において、エラスターゼ、トリプシン、及びシクロオキシゲナーゼ−２の阻害活性を示さなかった。フィカス・ベンガレンシス葉の同一バッチから得られた水抽出物及び美容液画分の特性とインビトロ活性との比較を表９に示す。

^*）記載のインビトロ活性は、乾物割合基準で計算された。
^**）Ｘ−乾燥重量で１単位のＤＰＰＨを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
^***）Ｙ−乾燥重量で１単位の（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。

（実施例４）
様々なフィカス種及び場所から得られた美容液画分の特性並びにインビトロ活性
インド及びフロリダ（ＵＳＡ）で収集されたフィカス・ベンガレンシスの新鮮な葉に加えて、次のフィカス種の新鮮な葉を分画し、美容液画分を得た：フィカス・カリカ（Ficus carica）、フィカス・エラスチカ（Ficus elastica）、フィカス・ミクロカルパ（Ficus microcarpa）、及びフィカス・トリゴーナタ（Ficus trigonata）。プエルトリコで生育したフィカス・トリゴーナタを除き、これらのフィカス種はフロリダ（ＵＳＡ）で生育した。

美容液画分は、実施例１に記述される手順で得た。これらの画分は全て、それらの収率、物理化学特性、及びインビトロ活性について比較した（表１０、表１１、及び表１２）。

上記のデータは、様々なフィカス種の間で、新鮮な葉の乾物含量、細胞汁の収率、及び美容液画分の収率だけでなく、それらの乾物含量、色及びｐＨも有意に変化したことを示す。インド及びフロリダで育った２種類のフィカス・ベンガレンシスの間の対応する差異は、異なるフィカス種間の差異に比べて、より小さいものであった。

この結論は、異なるフィカス種から得られた美容液画分の物理化学的特性（表１１）及びインビトロ活性（表１２）の比較に関連する追加のデータによって支持される。

^*）記載の活性は、乾物割合基準で計算された。
^**）Ｘ−乾燥重量で１単位のＤＰＰＨを完全に捕捉するための、乾燥重量の試験物品の単位数。
^***）Ｙ−乾燥重量で１単位のト（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルがもつ効果と同等の酸化防止効果を生成するための、乾燥重量の試験物品の単位数。

（実施例５）
従来のフィカス抽出物対フィカス美容液画分（フィカス・ベンガレンシス）のＬＣ／ＵＶ／ＭＳクロマトグラムの比較
フィカス抽出物及びＦＳＦの成分を、２４０〜５００ｎｍでのＵＶ検出と、Ｃ１８カラムでのＬＣ分離後の、陽イオン（ｍ／ｚ １５０〜１１５０）モード及び陰イオン（ｍ／ｚ １００〜１１００）モードの両方のモードでのエレクトロスプレー質量分析とによって検出した。四極子ＭＳで利用されるスパン速度が高速であることから、主成分、及び／又は高イオン化効率を有する成分のみが、マスクロマトグラムで観察された。フィカス美容液画分から得たフィカス抽出物をＴＯＦ／ＭＳによって分析し、次いで、この抽出物の質量とインソース・フラグメンテーションのデータとに基づいて構造配置を行った。

図２に示されるように、従来のフィカス抽出物は、ＦＳＦ中には検出されないより後期溶離性の（より疎水性の）化合物を含有する。図３に示されるように、後期溶離性化合物のうち１つの群は、クロロフィル分解産物であるフェオホルビドであるものと考えられる。図４は、従来の抽出物が、恐らくフラボノール配糖体と思われる物質をより高濃度で含有することを示す。図５に示されるように、ＦＳＦは、より高濃度（約１０倍）のカテキンと、その縮合型のタンニンとを含有する。しかし、検出された３種類のカフェオイルキナ酸異性体の濃度は、図６に示す２種類のサンプル間で実質的に差異があるようには見えなかった。図７は、ＦＳＦが、遊離チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンを高濃度で含有していたことを示す。

方法：
フィカス美容液画分サンプルの調製：
ＦＳＦを、実施例１のように調製した。ＦＳＦサンプルは、９０：１０の水：ＤＭＳＯで５０倍に希釈し（２０μＬサンプル＋１００μＬ ＤＭＳＯ＋８８０μＬ水）、次いで、以下の条件に従って、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳによって分析した。最終サンプル中のおおよその固形分は約１．２６ｍｇ／ｍＬであった。

従来のサンプルの調製：
サンプル１０．６４ｍｇを秤量して、４ｍＬガラスバイアル瓶に入れた。そのバイアル瓶に、ＤＭＳＯ １．０６４ｍＬを添加し、３０分間音波処理を行い、次いで、時々、ボルテックスして混合した。このサンプル１００μＬを、４ｍＬのガラスバイアル瓶に添加し、次いで、９００μＬの水で希釈する。最終サンプル中のおおよその固形分約１ｍｇ／ｍＬ。

ＬＣカラム：ウォーターズ・アクティＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８，１．７ｍｍ，２．１×１００ｍｍ，製品番号１８６００２３５２，ｌｏｔ ＃ ０１５０３７１８６１

２０ポイント／秒、濾過時間０．２秒でＰＤＡ ２４０〜５００ｎｍ、暴露時間＝自動、解像度１．２ｎｍ

（実施例６）
メラニン合成
Ｂ１６−Ｆ１マウス黒色腫細胞株をアッセイに使用する。Ｂ１６−Ｆ１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから得られる。アッセイに使用する細胞培養液には、５００ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、５０ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び５ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン液を含有させる。この培地で培養し、集密度９０％まで増殖させたＢ１６−Ｆ１細胞は、メラニンを合成する。任意の理論により束縛されるものではないが、メラニン合成は、培養液により及び／又は高培養密度まで増殖させることより誘導されるストレスにより刺激されるものと仮定される。ＤＭＥＭ及びＦＢＳはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手でき、ペニシリン−ストレプトマイシン液はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手できる。分析に使用した装置としては、Ｆｏｒｍａシリーズのモデル３１１０（Ｔｈｅｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｓ，ＵＳＡ））などのＣＯ２定温器；Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅモデル（Ｈａｕｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ））などの血球計算板；及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））などの紫外線可視光スペクトルプレートリーダーが挙げられる。アッセイは、次の工程を包含する。

０日目−細胞増殖。細胞培養液を３７℃に加温し、２９ｍＬをＴ−１５０フラスコに入れる。継代数１のＢ１６−Ｆ１のマウス細胞約１×１０６個をＴ−１５０フラスコに加え、３７℃で３日間、５％ ＣＯ２、９０％の相対湿度で、集密度が約８０％になるまで培養する。

３日目−９６ウェルプレートでの培養の開始。３日目にＴ−１５０フラスコの細胞をトリプシン処理し、血球計数器を使用して細胞密度を測定する。９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１００μＬの細胞培養液を入れ、２，５００個の細胞を用い培養を開始する。集密度が少なくとも２０％〜４０％になるまで、３７℃、５％ ＣＯ２、９０％相対湿度で２日間、プレートをインキュベートする。

５日目−プレートから細胞培養培地を除去し、新鮮な培養培地（１００μＬ／ウェル）で置き換える。［水又はＤＳＭＯ］溶媒で希釈した［試験化合物］１μＬを添加する。複数の希釈比を試験して用量応答曲線を生成してもよく、好ましくは３つのウェルを各希釈比で処理する。対照は、細胞培養培地、Ｂ１６−Ｆ１細胞と、溶媒（対照＃１）とを含むウェル；細胞培養培地と溶媒とを含むウェル（対照＃２）；並びに、細胞培養培地と、溶媒と、［試験化合物］のバックグラウンド色を制御する必要がある場合には［試験化合物］とを含む任意的なウェル（対照＃３）とから構成される。

７日目−メラニン生成を測定する：細胞は集密度が約９０％超の状態であるべきである。そうでない場合、このデータ点は使用しない。各ウェルに１００μＬの０．７５％水酸化ナトリウム溶液を加える。ＵＶ−Ｖｉｓプレートリーダーを使用して、９６ウェルプレートを４１０ｎｍにて読み取り、［試験化合物］で処理されたウェルと、処理されなかった対照ウェルとの間で、生成されたメラニンの量を光学的に測定する。メラニンが生成されたウェルは、茶色がかって見える。メラニンが殆ど生成されなかったウェルは、透明から薄紫色に見える。メラニン合成阻害率（％）は、次式により計算する。

ＯＤ４１０は、４１０ｎｍでＵＶ可視光スペクトルプレートリーダーによって測定される光学密度である。

対照＃３が使用される際、メラニン合成阻害率（％）の式は、

概して上記に概略される分析法を用いた場合に、ＦＳＦで処理されたＢ１６−Ｆ１細胞におけるメラニン合成は、以下の表１３ａ及び１３ｂに示されるように、対照細胞と比べて阻害された。

皮膚内部でのメラニン生成及び移動の複雑さ、並びに試験化合物の皮膚浸透能力などの変数を考慮すれば、ヒト顔の色素沈着の過剰な箇所に対して必ずしもインビボでの結果が得られるとは言えないが、この分析により、ＦＳＦ等の材料はチロシナーゼ活性に対し影響を及ぼし得ることが実証される。

（実施例７）
チロシナーゼ阻害
チロシナーゼは、メラニン生合成において重要な酵素である。この分析によって、マッシュルーム・チロシナーゼ酵素のもつ、Ｌ−チロシンをＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）に転化する能力を妨げることのできる薬剤を同定することができる。

試薬及び供給品
チロシナーゼ酵素：マッシュルーム・チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より入手可能）
酵素基質：Ｌ−チロシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より入手可能）
緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より入手可能）
陽性対照：４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（アルブチン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より入手可能）
ジメチルスルホキシド（ＤＳＭＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）より入手可能）
Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）１１７２ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）（非組織培養処理された、透明な平底の９６ウェルプレート）
潜在的チロシナーゼ阻害物質
ウェルプレートリーダー：Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により入手可能）
データ収集及び解析のソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により入手可能）

分析のプロトコル
試薬及び陽性対照の調製
１Ｘ ＰＢＳ １００ｍＬにＬ−チロシン０．０１８１２ｇを添加し、１ｍＭの酵素基質の希釈標準液を調製する。Ｌ−チロシンが溶解するまで、音波処理する。必要に応じてボルテックスする。使用しないとき、４℃で保存する。

１ｍＬのＤＭＳＯにアルブチン０．０５４４ｇを添加して、０．２Ｍの原液を調製する。アルブチンが溶解するまで、１分間ボルテックスし、音波処理する。この溶液１００μＬを、９００μＬのＤＭＳＯに添加して１：１０希釈し、２０ｍＭアルブチンの希釈標準液を得る。使用時まで室温で保管する。

潜在的チロシナーゼ阻害剤は、ＤＭＳＯで調製すべきである。分析時の試験化合物の最終容量は、２μＬであるため、希釈標準液は、典型的には、５〜４０ｍＭ（１００Ｘ）で作成され、分析時の最終濃度は５０〜４００μＭになる。

１Ｘ冷ＰＢＳを用いて、１０００Ｕ／ｍＬでチロシナーゼ酵素を再構成する。この原液は、１ｍＬアリコートとして使用時まで−２０℃にて遮光保存する。解凍した１ｍＬの原液（１０００Ｕ／ｍＬ）を３７．５の１Ｘ冷ＰＢＳ緩衝液に添加し、２６Ｕ／ｍＬの酵素希釈標準液を調製する。これは、４枚の９６−ウェルプレートで分析を行うのに十分な量である。分析時まで遮光し、氷中で保存する。

分析の実施
適切なブランクとして、各試験プレートには１Ｘ ＰＢＳ緩衝液を２００μＬずつ３ウェルに添加する。

溶媒対照として、３ウェルにＤＭＳＯを２μＬずつ添加する。

陽性対照として、３ウェルにアルブチンを２μＬずつ添加する。

３ウェルに潜在的チロシナーゼ阻害剤を２μＬずつ添加する。

ブランク以外のウェルにチロシナーゼ酵素希釈標準液を９８μＬずつ添加する。ピペッティングにより溶液を２回上下操作するか、又は手短にボルテックスするかして酵素と化合物を混合する。

Ｌ−チロシン基質を１００μＬ／ウェル添加する。

ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ２５０ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒに動的設定（kinetic setting）を選択し、次いで、１時間の間１分毎に４７５ｎｍで吸収読み取り値を記録する。

データ回収ソフトウェアを用いて、対照と試験化合物に関し勾配を計算する。

チロシナーゼ阻害の割合は、次式によって計算する：

一般的に、上記に概略される分析法を用いた場合に、ＦＳＦは以下の表１４に示されるようにチロシナーゼ活性を阻害する。

皮膚内部でのメラニン生成及び移動の複雑さ、並びに試験化合物の皮膚浸透能力などの変数を考慮すれば、ヒト顔の色素沈着の過剰な箇所に対して必ずしもインビボでの結果が得られるとは言えないが、この分析により、ＦＳＦ等の材料はチロシナーゼ活性に対し影響を及ぼし得ることが実証される。

（実施例８）
色素沈着の減少及びメラニン均一性に関するインビボでの試験
２７０人の被験者に対し、顔面の領域を分割し、１週間の標準化期間を含む、ラウンドロビン式の９週間のインビトロ試験を対溶媒対照群で実施した。２７０名の被験者を、以下を含む包含／除外基準に従ってスクリーニングした。

包含
顔の両側の頬の周辺及び／又は眼窩周囲の範囲に、色素沈着を有する。

顔の各側の頬領域内に、直径８〜１０ｍｍの色素沈着領域を少なくとも１箇所、直径４〜６ｍｍの色素沈着領域を４箇所又は直径２〜３ｍｍの色素沈着領域を１０箇所（日焼けによる染み、そばかす、又は肝斑）、又は等価な色素沈着領域を有する。

供給されたＵＶローション、及び、例えば帽子等の物理的ＵＶ遮断を用いることにより太陽暴露を控えて、顔の日焼け、黄褐色化、又は風焼けを避けることに協力的である。

除外
アトピー、湿疹、乾癬、又は他の慢性皮膚疾患を有すると診断されている。

顔の皮膚疾患（例えば、５つを越える面皰、紅色粃糠疹（red scaling）領域、表面細血管（superficial thin blood vessel）等を有する）の明かな徴候を有する。

顔面の有意な領域に変色又は瘢痕が認められる。

顔に目立ったほくろ（３ｍｍ未満）を３個以上有する。

２７０名の被験者が試験に組み込まれた。およそ６０名の被験者が、試験過程で脱落した。各々の被験者は、暗号化された被験薬を２種類受け取り、それぞれを１日２回顔面の半分に適用した。顔面の被験薬を塗布した部位の画像を、ベースライン（０週）、及び処置後４週間及び８週間で撮影し、皮膚の色、色素沈着領域の大きさ及び色の変化を分析した。生成物製剤には、溶媒対照、溶媒＋０．５５％ ＦＳＦ、及び溶媒＋５％ビタミンＢ３化合物（ナイアシンアミド）が包含された。

非接触式の皮内分光分析装置（spectrophotometric intracutaneous analysis）（ＳｉａＳｃｏｐｙ（Ａｓｔｒｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａ，ＵＫ））により被験者の画像を収集し分析した。分析では、デジタルカメラ（例えば、Ｆｕｊｉ Ｓ２ ｄｉｇｉｔａｌ ＳＬＲ）をブランド分光計とし、かつフラッシュ光源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｓｕｐｅｒ ｆｌａｓｈ ｌｉｇｈｔ ｓｏｕｒｃｅ）を用い、顔面の発色団の情報を回収した。カメラの前に、交叉偏光フィルターと、鏡面反射を除去するための光源とを置いた。

ユーメラニン（メラニン）及びオキシヘモグロビンの濃度と分布とから発色団マップを作成し、これらの発色団の各々のグレースケール濃度マップを作成する。Ｏｐｔｉｍａｓ ６．５等の画像分析ソフトウェアを用い、各発色団マップ内に、平均グレースケール値と色素沈着面積比とが計算される対象領域を選択することができる。色素沈着面積比とは、対象とする全領域内にメラニン沈着領域が占める割合を指す。１つのタイプの発色団マッピングの記述は、欧州特許第１，８１０，６１４号及びＢｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００７年，６２０〜６２８頁）の「Ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｌａｎｉｎ ｉｎ Ｓｋｉｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」に見出だすことができる。

４週間後には、ＦＳＦが最良の結果を示し、対照及び５％ビタミンＢ３組成物に比べて、色素沈着領域を有意に（ｐ＜＝０．１０）減少させた。８週間後には、ビタミンＢ３組成物が最良の結果を示したものの、ＦＳＦ組成物も、色素沈着領域を有意に減少させるという点で対照よりも良好な結果を示した。表１５は、画像分析データの要約である。ＳＡＦは、平均色素沈着面積であり、Δ ＳＡＦは、ベースライン（０週）と比べ色素沈着面積に生じた変化の平均である。

用いられる略語：ＳＡＦ＝色素沈着面積比；ｓｉｇ＝有意である（ｐ＜０．１）；ｄｉｒ＝指向性がある（０．１＜ｐ＜０．２）；傾向がある＝（０．２＜ｐ＜０．３）；ｎｓ＝有意でない（ｐ＞０．３）。

ＦＳＦは、ＳＡＦに関し溶媒よりも有意に優れており、かつメラニン均一性に関し溶媒よりも指向性がある。

分析方法
次の分析法を用いて、諸実施例に記載の様々な物理特性及び化学特性を決定した。

乾物濃度の測定方法
液体サンプルの重量を、液体成分を蒸発させた後の乾燥残渣の重量と比較して乾物濃度（％）を測定した。手順において、使い捨てのアルミニウム秤量皿、Ｏｈａｕｓ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｅ００６４０天秤（Ｏｈａｕｓ社（Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）より入手）、及びＳｈｅｌ Ｌａｂモデル１４００Ｅオーブン（ＶＷＲ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）より入手）を用いた。１０５℃に設定したオーブンでサンプルを１２時間乾燥させた。液体サンプルを収容している容器の重量から容器重量を減じて、「湿潤」重量を得た。乾燥後の同一サンプルを収容している容器の重量から容器重量を減じて、「乾燥」重量を得た。すなわち、乾物濃度は、「乾燥」重量を「湿潤」重量で割り、１００％をかけた値に相当する。

色の測定方法
色（０〜１８のガードナースケール）は、Ｌｏｖｉｂｏｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ ３０００装置（Ｔｉｎｔｏｍｅｔｅｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ））を用い、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、透明のガラス管に入れた試験物品の色を、装置の２個のホイール中に設置した着色ガラス基準と比較することによって測定した。

オスモル濃度の測定方法
オスモル濃度は、溶液の凝固点降下を測定し、純溶媒の凝固点と比較することによって決定した。この測定は、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、Ａｄｖａｎｃｅｄモデル３２５０ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓａｍｐｌｅ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ））で実施した。

屈折率の測定方法
屈折率は、取扱説明書に記載の通り、装置のための標準手順に従って、外部温度制御サーキュレータを取り付けたＡｒｉａｓ ５００屈折計（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ））で測定した。

ＵＶスペクトルパラメータの測定方法
ＵＶ吸収スペクトルにおけるピーク、谷、及び変曲点を、セルホルダーに流体ジャケットを備え、外部温度制御サーキュレータが装備されたＵｌｔｒｏｓｐｅｃ ４３００ ｐｒｏ ＵＶ／可視分光光度計（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｅｇ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））により測定した。脱イオン水で希釈したサンプルの測定には、光学距離が１ｃｍの石英キュベットを用いた。測定器制御及びデータ解析は、ＳＷＩＦＴ ＩＩソフトウェア・スイート（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）のウェブスキャン・アプリケーションにより行った。

エラスターゼ阻害活性の測定方法
エラスターゼ阻害活性は、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））及びＳｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ））に用いるのに適した動的比色解析法により測定した。基質開裂時の酵素活性は、黄色の呈色により示され、波長４１０ｎｍでの吸光度の増大として測定された。Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ基質（ＥＰＣ ＦＨ２３７）及びエラスターゼ（ＥＰＣ ＳＥ５６３）は、ＥＰＣ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ））から入手した。各々のウェル中の反応容積は、２００μＬであり、エラスターゼ濃度は０．８７Ｕ／ｍＬであり、基質は３６３μＭであった。本手順は、Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（２００４年，全９２頁）の第８４頁の表題「Ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｎ−ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐＮＡ（ＥＰＣ Ｎｏ．ＦＨ２３７）ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」の方法を改変させたものであった。

シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性の測定方法
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害活性は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＣＯＸインヒビタースクリーニング用ＥＬＩＳＡ分析キット５６０１３１によって測定された。

酸化防止活性の測定方法
酸化防止活性は、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレート・リーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ））を用い、ＢｉｏＴｅｋから入手可能な「Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ）Ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ」（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄｏｃｓ／ＯＲＡＣ＿Ａｓｓａｙ＿Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ＿Ｎｏｔｅ．ｐｄｆ）に記載の使用方法に改変を加えたＯＲＡＣ試験により測定した。この分析において、ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス２−アミノ−プロパン）は、蛍光プローブ（フルオレセインナトリウム）を損傷させる活性酸素種を生じる。（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルなどの酸化防止剤は、この損傷を防止するか又は減速させる。これらの効果は、蛍光発光を測定することによって定量化することができる。励起波長は４８５ｎｍに設定し、かつ蛍光波長は５２８ｎｍに設定し、反応溶液量は２００μＬ、ＡＡＰＨ濃度は５５ｍＭ、フルオレセインナトリウム濃度は１．３３μＭ、及び（Ｒ）−トロロックスメチルエーテル濃度範囲は８０μＭ〜２μＭで蛍光を読み取った。フルオレセインナトリウム（Ｆｌｕｋａ ４６９６０）、ＡＡＰＨ（Ｓｉｇｍａ ４４０９１４）及び（Ｒ）−トロロックスメチルエーテル（Ｆｌｕｋａ ９３５０９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ＡＵＣ（曲線下面積）値は、比率（ウェルの現在の蛍光読取り値をウェルの最初の蛍光読取り値で除したもの）の合計として計算した。（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルを入れたウェルのＡＵＣ値と、試験化合物を入れたウェルのＡＵＣ値から、脱イオン水を入れたウェルの平均ＡＵＣ値を減じて、酸化防止剤による蛍光発光の保護量に相当するＡＵＣを得た。検量線は、（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルの重量当量のＯＲＡＣ活性を示し、ウェルの酸化防止に関係するＡＵＣ関数として作成した。次に、１単位重量の（Ｒ）−トロロックスメチルエーテルにより得られる酸化防止効果と同等の酸化防止効果を得るのに必要とされる単位重量として、試験化合物のＯＲＡＣ活性を算出した。

捕捉活性の測定方法
ガラスコーティングされたポリプロピレン９６ウェルマイクロタイタープレート（カタログ番号４００ ０６２）（ＳＵＮ−ＳＲｉ（Ｒｏｃｋｗｏｏｄ，ＴＮ））、及びＳｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ））を用い、フリーラジカル捕捉活性、すなわち、ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）のフリーラジカル捕捉活性を、速度論的比色分析法に改変を加え測定した。吸収波長は、５１５ｎｍで測定した。各々のマイクロプレートウェル中の反応溶液量は２００μＬであり、ＤＰＰＨの初期濃度は１１４μＭであった。陽性対照としてＬ−アスコルビン酸を用いた。ＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｄ９１３２）及びＵＳＰ Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ−２２１８）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。反応の化学量論を計算し、１単位重量のＤＰＰＨをクエンチするのに必要とされる被験化合物の単位重量として表した。この方法では、Ｗ．Ｂｒａｎｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＬＷＴ−Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８，Ｉｓｓｕｅ １，１９９５，ｐｐ ２５〜３０中の記事「Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ」に記載の手順を改変した。

温度プロファイリングを用いて、迅速に安定性試験を行うための手順
１．１２個の加熱ブロックを作動させ指定温度に加熱し、並びに冷蔵庫を作動させ、実験を行う前少なくとも４時間の間、指定温度で保持する。加熱ブロックに配置した１２個のサンプルに加えて、１個のサンプルを室温で残し、また、もう１個は冷凍して、全部で１４種の異なる温度を与える。それら温度は、５℃、室温（約２３℃）、３２℃、３６℃、４０℃、４４℃、４８℃、５２℃、５６℃、６０℃、６４℃、６８℃、７２℃及び７５℃である。加熱ブロックは、２０ｍＬバイアル瓶に適合するように圧延されたアルミニウム製インサートブロックを備えている。これらのインサートブロックは、加熱ブロックの加熱されたポケットブロックの内側で適合する。各々の加熱ブロックは、独立した温度調節器と温度センサーとを有し、かつ、反応ブロックの温度は０．１℃の変動範囲で制御されることが望ましい。
２．ヘッドスペースをできるだけ少なくして１４個のバイアル瓶を充填する。バイアル瓶は、全て同一寸法であるならば、オートサンプラーバイアル瓶からシンチレーション用バイアル瓶までの様々な寸法であってよい。本実施例の目的のためには、２０ｍＬバイアル瓶を用いた。
３．ノートの参照番号及び温度を記したラベルを各バイアル瓶用に作成する。できるだけ小さくかつ狭いラベルを作ることが最善である。カラー写真で色を評価する場合には、バイアル瓶には温度を記さずに、特大のラベルを１枚作成する。
４．バイアル瓶中の生成物を観察する際に邪魔にならないように、ラベルを各々対応するバイアル瓶に貼り付ける。通常、ラベルをふたにテープで留めて、端から端までを読み取る細長い垂直タブとすることで、ラベルが観察の邪魔にならないようにする。写真を撮る際には、バイアル瓶中のサンプルが良好に観察できるよう、このラベルは、バイアル瓶上の何らかの印とは反対側に移動させて表示させることができる。
５．色を評価する場合には、デジタルカメラでサンプルの初期写真を撮る。左端には最低温度で処理するサンプルを置き、処理温度が昇順になるようサンプルを右側に一列に並べる。この際、バイアル瓶中のサンプルが明瞭に見えるように配置する（バイアル瓶上のいかなるラベルも印刷物も視界を遮らないようバイアル瓶の向きを変える）。画像中で容易に読み取れるように特大のラベルを表示させる。一貫性を保つため、バイアル瓶とカメラとの位置が分かるように実験台の上に印を付け、後でそれらの相対位置を再現できるようにする。フラッシュはオフにすることが推奨される。
６．次のような種類のサンプルに関しては、以下の方法で写真を撮る：
ａ．透明な溶液：白色の背景に向かって撮影する。フラッシュを用い、卓上スタンドは用いない。
ｂ．不透明なサンプル：黒色の背景に向かって撮影する。フラッシュはオフにし、卓上スタンドを用いる。
７．化学分析を行う場合、初期値の読み取りのために各々のバイアル瓶をサンプリングする。
８．加熱ブロック及び冷蔵庫の中にサンプルを配置し、日付と時間とを記録する。
９．予め設定した時点で（初期設定で、３、７及び１４日を用いる）加熱ブロック及び冷凍庫からサンプルを取り出し、少なくとも３０分間室温に戻す。
１０．色を評価する場合、ステップ４でバイアル瓶とカメラとの位置を知るために作成したマークを用いて、新たな画像を撮影する。各々の時点で、この操作を繰り返す。
１１．化学分析を行う場合、この時点で各々のバイアル瓶をサンプリングする。各々の時点で、この操作を繰り返す。
１２．色を評価するため、結果間の差異を最も良好に識別できる時点の画像を選択する。安定性の表を用いて、６ヶ月及び１年室温処理した場合と等価な時間経過を表わす線を、画像上に引くことができる。その表で、任意の時点で６ヶ月及び２年に対応する促進温度を見出だし、次いで、この温度により、どのバイアル瓶間に線を引くべきかを判断する。（例えば、図１０を参照されたい。）
１３．化学分析のために、各々の時点に関し温度に対し濃度をプロットする。データ間に平滑な線を引き、許容できない閾値に及ぶ温度を記録する。安定性の表において、時間に対してこの温度を参照し、相当する室温を得る。色がＬａｂ色度計で測定される場合、この手法は色分析に応用することができ、濃度に代えて色差がプロットされる。
１４．安定性の表は、２５ｋｃａｌ／モルの活性化エネルギーを前提としている。大抵の加水分解及び類似の反応は、ほぼこのエネルギー付近であり、又はより高い。エネルギーがより高い場合、生成物はより安定であり、その表は、室温での安定性が、実際のものより小さい（過小評価）と予測する。時々、エネルギーはこれより低い。そのため、化学分析を行う場合には、上記で得られたデータを用い、アレニウスプロットにより反応エネルギーを計算して、前提が正しいことを確認することが推奨される。
１５．追加：写真からのＬａｂカラーの抽出：
ｉ．全ての写真をＣＤに移す。Ｏｐｔｉｍａｓ等の色測定ソフトウェア、及び必要なあらゆる周辺機器を搭載したコンピュータを用いて、各々のサンプルの平均Ｌａｂカラーを測定する。
ｉｉ．左端の５Ｃサンプルから始め、次いで、右上から移動し、次いで、左隅へ引き下げて、平均化された色を有するようにバイアル瓶の領域を選定する。５Ｃサンプルを標準的基準として設定する（この設定は開始時にのみ５ Ｃサンプルを用いて実施する）。
ｉｉｉ．各々の温度サンプルのために、Ｌ、ａ、ｂ、標準偏差、及びｄＥｃｍｃ値を記録する。各々の写真に関し白色点（各成分が２５５、２５５、２５５である点）を記録する。

本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきでない。むしろ、特に断らないかぎり、そのようなそれぞれの寸法は、記載された値及びその値周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。

本発明の「発明を実施するための形態」で引用した全ての文献は、関連部分において本明細書に援用するが、いずれの文献の引用もそうした文献が本発明に対する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本書における用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献における同一の用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本書においてその用語に与えられた意味又は定義が適用されるものとする。

以上、本発明の特定の態様を例示、記載したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び改変を行い得る点は、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲に含まれるそのような全ての変更及び改変を添付の「特許請求の範囲」において網羅するものとする。

Claims (15)

1. 哺乳動物の皮膚の領域を美白化するのに適した化粧品組成物であって、
   新鮮なフィカス葉汁から得られる有効量のフィカス美容液画分と、
   皮膚科学的に許容可能なキャリアと、を含む、組成物。
2. 前記フィカス美容液画分が、次の工程、
   ａ．清浄で新鮮でしおれていないフィカス葉からフィカス細胞汁を分離して、新鮮なフィカス細胞汁を得る工程であって、前記分離工程の前にも前記分離工程の間にも外因性の液体を添加しない、工程と、
   ｂ．前記新鮮なフィカス細胞汁を濾過して、繊維を含有していない細胞汁を得る工程と、
   ｃ．前記繊維を含有していない細胞汁を分画して、フィカス美容液画分を得る工程であって、前記分画工程が、
   （１）前記繊維を含有していない細胞汁からクロロフィルを除去して、上澄み液Ｉを得る工程と、
   （２）前記上澄み液Ｉから色素及びタンパク質を除去して、フィカス美容液画分を生成する工程と、
   （３）前記フィカス美容液画分に安定剤を添加する工程と、を含む、フィカス美容液画分を得る工程と、
   を含む方法によって製造される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記上澄み液Ｉから色素及びタンパク質を除去する工程が、
   ｉ．上澄み液ＩのｐＨを約７．５に調整して、ｐＨ調整済み上澄み液Ｉを生成する工程と、
   ｉｉ．ｐＨ調整済み上澄み液Ｉを、沈殿物ＩＩと上澄み液ＩＩとに分離する工程と、
   ｉｉｉ．上澄み液ＩＩのｐＨを約３．６に調整して、ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩを生成する工程と、
   ｉｖ．ｐＨ調整済み上澄み液ＩＩを、沈殿物ＩＩＩとフィカス美容液画分とに分離する工程と、を含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記安定剤が、酸化防止剤、キレート化剤、保存料、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記安定剤が、メタ重亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、ペンチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記組成物が、室温で、少なくとも６ヶ月、好ましくは少なくとも１２ヶ月、より好ましくは少なくとも２４ヶ月の間安定である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記フィカス葉が、フィカス・ベンガレンシス（F. benghalensis）、フィカス・カリカ（F. carica）、フィカス・エラスチカ（F. elastica）、フィカス・ミクロカルパ（F. microcarpa）、フィカス・トリゴーナタ（F. trigonata）、及びこれらの組合せからなるフィカス種群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記フィカス美容液画分が、フェオホルビド（pheophorbides）を実質的に含有せず、好ましくは、前記フィカス美容液画分が、ケルダール法で測定されるタンパク質を実質的に含有しない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記フィカス美容液画分が水溶性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記フィカス美容液画分が、８未満の、好ましくは７．５未満のガードナーカラー値を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 皮膚の色素沈着過剰の発生を低減する方法であって、美白化が所望される、色素が過剰に沈着している皮膚領域に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化粧品組成物を局所適用することを含む、方法。
12. 前記化粧品組成物が、メラニン形成（メラニン合成）における１つ以上の段階を阻害するのに有効な量で適用される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記化粧品組成物が、メラニンを形成する酵素活性を阻害するのに有効な量で適用され、好ましくは、前記酵素活性が、トリプシン活性、チロシナーゼ活性若しくはこれらの両方の活性である、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記化粧品組成物が、ＣＯＸ−２活性を抑制するのに有効な量で適用される、請求項１１又は１２に記載の方法。
15. 前記化粧品組成物が、酸化防止活性、フリーラジカル捕捉活性若しくはこれらの両方の活性を増大させるのに有効な量で適用される、請求項１１又は１２に記載の方法。

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