KR101794343B1 - 석화 캘러스 배양물 제조방법, 석화 캘러스 배양물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

석화 캘러스 배양물 제조방법, 석화 캘러스 배양물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 석화 캘러스 배양물 제조방법, 석화 캘러스 배양물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법은 석화(Adenium obesum)로부터 캘러스를 유도하는 단계; 상기 석화 캘러스를 계대 배양하는 단계; 상기 계대 배양된 석화 캘러스를 일리시터(elicitor)를 포함하는 현탁 배지에 접종하는 단계; 및 상기 현탁 배지에 접종된 석화 캘러스를 현탁 배양하는 단계;를 포함한다.

Description

석화 캘러스 배양물 제조방법, 석화 캘러스 배양물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 {METHOD FOR CULTURE PRODUCT OF ADENIUM OBESUM CALLUS, CULTURE PRODUCT OF ADENIUM OBESUM CALLUS, AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 석화 캘러스 배양물 제조방법, 석화 캘러스 배양물, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
석화(사막의 장미, Adenium obesum)는 용담목 협죽도과에 속하는 식물로서 최초로 발견된 장소인 예멘의 “Aden(아덴)”에서 그 학명이 유래되었다. 비대하는 줄기를 가지며, 아라비아부터 동아프리카 전역에 넓게 자생한다. 석화는 사막이나 높은 산 등 수분이 적고 건조한 날씨의 지역에서 살아남기 위해서 땅 위의 줄기나 잎에 많은 양의 수분을 저장하고 있는 다육식물이기 때문에 피부에 수분을 공급하는 화장품의 원료로써 탁월한 효능 효과를 보일 것으로 사료된다.
현재까지 석화와 관련된 연구에서는 석화의 잎과 줄기 등 식물체에 포함된 성분인 강심 배당체(Cardiac glycosides), 및 프레그난(Pregnanes) 등이 항암효과를 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다. 또한 석화 줄기 껍질의 메탄올 추출물이 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)과 함께 박테리아에 대한 항생력을 가지는 연구 결과가 확인되었다. 그러나 식물 조직배양 기술을 이용하여 석화의 캘러스를 유도하고 배양하는 방법에 대한 연구나, 세포 유래 천연물질의 효능에 대한 연구는 미미한 실정이다. 또한 석화 캘러스의 이차대사산물에 대한 연구 역시 필요한 상황이다.
이차 대사산물이란, 식물의 생장 발육 및 생식과정과 같이 생존에 필요한 물질로써 직접적인 생리기능을 갖진 않지만 특정 식물에 한정되어 생성되는 부가적인 천연물질이다. 식물의 생활에 필수적인 당인산, 아미노산, 아미드, 뉴클레오티드, 핵산, 유기산 등과 같은 1차 대사산물과는 구분된다. 동물의 경우 운동성이 있어서 외부의 위협으로부터 벗어날 수 있는 반면에 운동성이 없는 식물은 자기방어 수단으로 독성 물질을 생성하여 해충이나 병원균으로부터 자신을 보호하고, 식물들 사이에서의 양분의 경합 또는 종의 번식을 위하여 곤충 등을 유인하는 수단으로 이차 대사산물을 생성한다. 이들 이차 대사산물은 대부분 생리활성물질로 작용하기 때문에 관심이 커지고 있다. (신고 식물조직배양 실험, 향문사)
이 중 플라보노이드(Flavonoid)는 식물의 노란색 색소성분의 총칭으로, 폴리페놀류도 그 안에 포함된다. 식물의 잎이나 줄기, 목부 등에 함유되어 있으며, 현재까지 4000 종류 이상이 발견되어 있다. 폴라보노이드의 대부분은 수용성의 배탕체로서 존재하고 있으며 화학구조 차이에 따라 플라보놀류, 이소플라본류, 카테킨류 등으로 분류된다. (건강, 영양 식품사전 858-864P)
한편, 폴리페놀(Polyphenol)은 복수의 수산기, 즉 -OH 가 결합한 벤젠 고리를 갖는 화합물의 총칭이다. 폴리페놀은 녹색식물이 광합성으로 생산해 내는 당분의 일부가 변화된 것으로, 많은 종류가 있다. 잘 알려진 것으로는 레드와인의 안토시아닌, 대두에 함유되어 있는 이소플라본, 차(茶)의 카테킨, 카레가루의 그루크민, 그리고 깨의 세사미놀 등이 있다. 폴리페놀은 활성산소에 의한 신체의 산화를 억제하는 작용을 뜻하는 강한 항산화물질이며 신체의 건강에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 이밖에도 간 기능의 향상, 피로회복, 항암작용, 동맥경화의 예방, 항균작용 등 여러 생리활성 물질로 작용을 한다.
이러한 이차대사산물의 생성 유도 및 촉진 시키는 방법은 캘러스 배양 시 여러 가지 종류의 자극을 식물에 가하거나, 일리시터(Elicitor)인 인공 화학물질을 첨가하거나 혹은 이차 대사산물의 전구체를 배지에 처리하여 배양하는 방법이 있다.
본 발명의 목적은 세포독성이 없으며, 인체에 무해한 석화 캘러스 배양물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피부보습 및 항산화 효과가 우수한 석화 캘러스 배양물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항염 및 피부주름 개선 효과가 우수한 석화 캘러스 배양물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법에 의해 제조된 석화 캘러스 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 석화 캘러스 배양물 제조방법에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법은 석화(Adenium obesum)로부터 캘러스를 유도하는 단계; 상기 석화 캘러스를 계대 배양하는 단계; 상기 계대 배양된 석화 캘러스를 일리시터(elicitor)를 포함하는 현탁 배지에 접종하는 단계; 및 상기 현탁 배지에 접종된 석화 캘러스를 현탁 배양하는 단계;를 포함한다.
한 구체예에서 상기 캘러스 유도는, 석화 잎을 생장조절제를 포함하는 캘러스 유도용 배지에 치상한 다음, 배양하여 캘러스를 유도하는 것이며, 상기 생장조절제는 나프탈렌 아세트산(Naphthalene Acetic Acid, NAA), 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산), 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid, IAA), 인돌뷰트릭산(Indolebutric acid, IBA), 벤질아데닌(Benzyl adenine), 키네틴(kinetin), 및 제아틴(zeatin) 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 구체예에서 상기 일리시터는 코코넛 워터(coconut water) 및 이스트 추출물(yeast extract) 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법에 의해 제조되는 석화 캘러스 배양물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은, 플라보노이드계 화합물을 0.09~0.19 mg/mL 포함하고, 페놀성 화합물을 0.09~0.20 mg/mL 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~50 중량% 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 석화 캘러스 배양물 제조방법을 적용시, 세포독성이 없으며, 인체에 무해하면서, 이차대사산물의 생성효율이 우수하여, 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법으로 제조된 석화 캘러스 배양물을 화장료 조성물에 적용시, 인체 피부보습, 항산화 효과, 항염 효과 및 피부주름 개선효과가 우수할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예, 및 본 발명에 대한 비교예의 세포독성 활성도를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예, 및 본 발명에 대한 비교예의 자유 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예, 및 본 발명에 대한 비교예의 NO 생성 억제능을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예, 및 본 발명에 대한 비교예의 Elastase 저해활성능을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예, 및 본 발명에 대한 비교예의 히알루론산 합성 단백질 활성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로써 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 발명을 설명하는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
석화 캘러스 배양물 제조방법
본 발명의 하나의 관점은 본 발명은 석화 캘러스 배양물 제조방법에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법은 (a) 석화 캘러스 유도단계; (b) 계대 배양단계; (c) 현탁 배지 접종단계; 및 (d) 현탁 배양단계;를 포함한다. 좀 더 구체적으로 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법은 석화(Adenium obesum)로부터 캘러스를 유도하는 단계; 상기 석화 캘러스를 계대 배양하는 단계; 상기 계대 배양된 석화 캘러스를 일리시터(elicitor)를 포함하는 현탁 배지에 접종하는 단계; 및 상기 현탁 배지에 접종된 석화 캘러스를 현탁 배양하는 단계;를 포함한다.
이하, 본 발명에 따른 석화 캘러스 배양물 제조방법을 단게별로 상세히 설명하도록 한다.
(a) 석화 캘러스 유도단계
상기 단계는 석화(Adenium obesum)로부터 캘러스(callus)를 유도하는 단계이다. 한 구체예에서 상기 캘러스 유도는 석화의 잎을, 생장조절제를 포함하는 캘러스 유도용 배지에 치상한 다음, 배양하여 캘러스를 유도할 수 있다.
상기 캘러스 유도용 배지는 통상적인 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 높은 농도의 암모늄(Ammonium), 질산염(Nitrate), 및 칼륨(Potassium) 등이 포함된 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지를 사용할 수 있다. 다른 예를 들면, 상기 MS 배지보다 암모늄성 질소의 비율이 낮은 B5(Gamborg et al., 1968) 배지, MS 배지와 비슷하고, 일부 유기물 조성 차이를 갖는 LS(Linsmaier and McCown, 1980) 배지, 저농도의 염을 포함하는 White(White, 1963) 배지, 및 SH(Schenk and Hildebrandt, 1972) 배지 중에서 하나 이상의 배지를 사용할 수 있다. 상기 캘러스 유도용 배지를 사용시, 조직 배양 효율이 우수하여, 캘러스 유도 효과가 우수할 수 있다.
상기 생장조절제는 식물의 특정 생장반응을 조절하는 물질로서, 미량의 농도로 식물의 잎, 줄기 및 뿌리 등의 분화에 관여하며 세포의 생장에 영향을 미치는 필수적인 요소이다. 본 발명의 한 구체예에서 상기 생장조절제는 옥신(Auxin)계 및 사이토키닌(Cytokinin)계 생장조절제 등을 사용할 수 있다. 예를 들면 상기 옥신계 생장조절제로는 나프탈렌 아세트산(Naphthalene Acetic Acid, NAA), 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산), 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid, IAA), 및 인돌뷰트릭산(Indolebutric acid, IBA) 중에서 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 사이토키닌계 생장조절제로는 벤질아데닌(Benzyl adenin, BA), 키네틴(kinetin, (6-furfuryl-amino purin)), 및 제아틴(zeatin, 6-(4-hydroxy-3-methyltrans-2-butenylamino) purine) 중에서 하나 이상을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 생장조절제로 나프탈렌 아세트산 및 벤질아데닌을 포함할 수 있다.
한 구체예에서 상기 캘러스 유도용 배지의 pH는 5~6일 수 있다. 상기 조건에서 조직 배양 효율 및 캘러스 유도 효과가 우수할 수 있다. 예를 들면 pH 5.5~5.8일 수 있다.
상기 캘러스 유도용 배지는 겔라이트(gelrite) 및 수크로오스를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 겔라이트는 배양배지의 고형화를 목적으로 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 석화잎을 0.4% 겔라이트(gelrite), 2% 수크로오스(sucrose), 생장조절제로 나프탈렌 아세트산 1~2mg/L 및 벤질아데닌 0.5~1.5mg/L를 포함하는 MS 고체배지에 접하게 치상하여 캘러스를 유도할 수 있다. 상기 범위로 포함시 조직 배양 효율이 우수하여, 캘러스 유도 효과가 우수할 수 있다.
한 구체예에서 상기 배지에 치상된 석화잎을, 23~27℃ 및 암조건에서 4~6주 동안 배양시 석화 캘러스가 유도될 수 있다.
(b) 계대배양단계
상기 단계는 상기 석화 캘러스를 계대 배양하여, 상기 석화 캘러스를 분열 및 증식 하는 단계이다. 한 구체예에서 상기 계대 배양은, 상기 석화 캘러스를 2주 간격으로 4회 이상 계대배양하여 세포를 증식시킨 후, 8주 후 부터는 4주 간격으로 배양할 수 있다.
(c) 현탁배지 접종단계
상기 단계는 상기 계대 배양된 석화 캘러스를 일리시터(elicitor)를 포함하는 현탁 배지에 접종하는 단계이다. 예를 들면 생장조절제 및 수크로오스를 포함하는 현탁배지에 접종한 다음, 현탁배양할 수 있다. 한 구체예에서 상기 현탁배지는, 상기 캘러스 유도용 배지와 동일한 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지, B5(Gamborg et al., 1968) 배지, LS(Linsmaier and McCown, 1980) 배지, White(White, 1963) 배지, 및 SH(Schenk and Hildebrandt, 1972) 배지 중에서 하나 이상의 배지를 사용할 수 있다. 한 구체예에서 상기 현탁 배지는, 액체 형태로 사용할 수 있다.
한 구체예에서 상기 생장조절제는 전술한 것과 동일한 성분을 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 석화 캘러스를 2% 수크로오스(sucrose), 나프탈렌 아세트산(Naphthalatene Acetic Acid, NAA) 1~2mg/L 및 벤질아데닌(Benzyl adenine) 0.5~1.5mg/L를 포함하는 MS 액체배지에 접종하여 현탁배양할 수 있다.
상기 일리시터(elicitor)는 일리시테이션(elicitation)을 유발시키는 물질로서, 식물의 세포가 여러 가지 종류의 스트레스를 받을 때, 이에 대응하는 이차 대사산물의 생산량이 촉진되는 것을 의미한다.
상기 일리시터는 코코넛 워터(coconut water) 및 이스트 추출물(yeast extract) 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 종류의 일리시터를 적용시, 상기 석화잎의 이차대사산물의 생성이 촉진되어, 상기 석화 캘러스의 플라보노이드(Flavonoids) 및 폴리페놀성 화합물(Polyphenolic Compound)의 생성량이 증가할 수 있다. 한 구체예에서 상기 일리시터는 상기 현탁배지 전체중량에 대하여, 5~20 중량% 포함될 수 있다. 상기 범위로 포함시, 이차대사산물의 생성 효율이 우수할 수 있다.
(d) 현탁배양 단계
상기 단계는 상기 현탁 배지에 접종된 석화 캘러스를 현탁 배양(Suspension culture)하는 단계이다. 한 구체예에서 상기 현탁배지에 접종된 석화 캘러스를, 현탁 배양하여 석화 캘러스 배양물을 제조할 수 있다.
한 구체예에서 상기 현탁배지의 pH는 5~6일 수 있다. 상기 조건에서 조직 배양 효율 및 캘러스 유도 효과가 우수할 수 있다. 예를 들면 pH 5.5~5.8일 수 있다.
상기 현탁배양은 4~6주 동안 실시될 수 있다. 한 구체예에서 상기 현탁배지에 상기 석화잎 석화 캘러스를 접종하고, 10℃~20℃의 온도 및 광도 15~30μmol·photons/㎡/s 하의 조명하에서 10~20 시간 광처리 및 5~15 시간 암처리로 광주기를 조절하면서 1~2 주 동안 1차 현탁 배양 뒤, 상기와 동일한 온도 및 pH 조건을 유지하면서, 추가적으로 상기 현탁배지를 1차 증량하여 1~2주 동안 2차 현탁 배양하고, 그리고 상기와 동일 온도 및 pH 조건을 유지하면서 추가적으로 상기 현탁배지를 2차 증량하여 1~2주 동안 3차 현탁 배양할 수 있다.
석화 캘러스 배양물
본 발명의 다른 관점은 상기 석화 캘러스 배양물 제조방법에 의해 제조된 석화 캘러스 배양물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은 플라보노이드 및 페놀성 화합물을 포함할 수 있다.
한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은, 플라보노이드계 화합물을 0.09~0.19 mg/mL 포함하고, 페놀성 화합물을 0.09~0.20 mg/mL 포함한다. 상기 범위에서 본 발명의 항염, 피부보습, 피부주름개선 및 항산화 효과가 우수할 수 있다.
본 발명에서 상기 플라보노이드계 화합물은 플라보놀(flavonols), 플라본(flavones), 카테킨(catechin), 및 이소플라본(iso-flavones) 중에서 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 플라보노이드계 화합물을 포함시 항염 및 항산화 효과가 우수할 수 있다.
본 발명에서 상기 페놀성 화합물은 탄닌(Tannin), 나린긴(Naringin), 및 레스베라트롤(Resveratrol) 중에서 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 페놀성 화합물(phenolic Compound)을 포함시 항산화 활성효과가 우수하며, 피부 보습 작용을 나타낼 수 있다.
기존 연구 결과에 따르면 석화의 줄기 및 뿌리의 수액은 피부에 대해 독성을 보이므로 화장품 원료로써 이용이 어려울 수 있다. 반면, 본 발명은 석화의 잎 절편체를 이용하여 캘러스를 유도하기 위해 최적 배양 조건 배지를 연구하였고, 일리시터(Elicitor) 처리하여 상기 석화 캘러스 배양물의 이차대사물질 생성을 촉진하고, 피부미용 활성을 증가 시킬 수 있다.
석화 캘러스 추출물
또한, 본 발명에서는 석화 캘러스로부터 추출물을 제조할 수 있다. 석화 캘러스 추출물은 상기 유도된 캘러스를 유기용매 추출 혹은 열수추출 방법으로 추출한 것일 수 있다.
상기 유기용매 추출은 상기 석화 캘러스와 유기용매 혼합물의 비율이 1:1~10 범위 내에서 추출될 수 있으며, 상기 조건에서 석화 캘러스에 포함된 유용성분을 손상 없이 용이하게 추출할 수 있다.
상기 유기용매추출에서 사용될 수 있는 유기용매로는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 및 헥산 등이 있으며, 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 석화 캘러스에 포함된 유용성분은 유기용매에 3~7일정도 추출하여 분획(分劃)한 다음 감압농축 한 후 동결 건조하여 추출물을 얻을 수 있다. 또한 30℃~80℃의 온수로 상기 석화 캘러스에 포함된 유용성분을 용출시키는 방법을 사용할 수 있다. 3~12시간 정도 열수 추출하고 필요에 따라 음파처리(Sonication)을 실시할 수도 있다. 상기 열수추출물을 분획(分劃)한 다음 감압농축 한 후 동결 건조하여 추출물을 얻을 수 있다.
석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물
본 발명의 또 다른 관점은 상기 석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물은 세포독성이 없으며, 인체에 무해하면서 피부 보습, 항염, 피부 주름개선 및 항산화 효과가 우수할 수 있다.
한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은 감압·농축과정을 거쳐 동결건조 후, 분말 상태로 화장료 조성물에 포함 될 수 있다.
한 구체예에서 상기 석화 캘러스 배양물은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~50 중량% 포함될 수 있다. 상기 범위로 포함시 제형안정성이 우수하고, 세포독성이 없으며, 인체에 무해하면서 피부 보습, 항염, 피부 주름개선 및 항산화 효과가 우수할 수 있다. 예를 들면 0.5~30 중량% 포함될 수 있다.
석화 캘러스 추출물 또는 석화 캘러스 배양물은 화장료 조성물의 원료로써 통상적으로 첨가되는 다양한 성분들과 함께 특정 제형으로 제조될 수 있다. 구체에에서 화장료 조성물에 첨가되는 원료들은 용매, 용해제, 보습제, 겔화제, 점증제, 연화제, 안정화제, 유화제, 계면활성화제, pH조절제, 항산화제, 발포제, 방부제, 살균제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 향료, 오일, 염료 등 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 물질을 포함하여 여러 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함될 수 있는 용매 또는 용해제는 물, 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌, 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 또는 지방산 에스테르 등을 사용할 수 있다.
상기 보습제는 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 및 소듐하이알루로네이트 등을 사용할 수 있다.
상기 겔화제는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트 및 실리카 등을 사용할 수 있고, 상기 점증제는 잔탄검, 카보머, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스 등의 수용성 고분자 화합물을 사용할 수 있다.
상기 계면활성제는 스테아릭애씨드, 라우릭애씨드, 암모늄라우릴술포석시네이트, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌지방산에스테르 등을 사용할 수 있다. 또한 알킬트리메칠암모늄클로라이드, 아민염 등과 같은 양이온성 계면활성제등을 사용할 수 있다.
상기 pH 조절제는 구연산, 시트르산, 수산화나트륨, 트리에탄올아민, 구연산나트륨, 인산 및 인산나트륨 등을 사용할 수 있다.
상기 방부제는 벤조산, 페녹시에탄올, 파라옥시안식향산에스테르 및 메칠클로로이소치아졸리논의 혼합물 등을 사용할 수 있으며, 산화방지제는 아스코르빈산을 사용할 수 있다.
상기 가용화제로는 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올 및 캐스터오일 등이 될 수 있으며, 상기 향료로는 본 발명의 화장료 조성물 분야에 사용되는 통상적으로 사용되는 오일을 사용할 수 있다.
본 발명에서 이러한 화장료 조성물로 제조될 수 있는 제형들은 로션, 크림, 겔, 용액, 유탁액, 페이스트, 파우더, 팩, 비누 및 오일 등으로 다양하며 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예 1: 석화 캘러스 배양물 제조
석화( Adenium obesum ) 캘러스 유도
석화잎 조직을 살균하기 위해 잎에 묻은 흙을 흐르는 물에 세척한 후 70% 에탄올에서 1분간 1차 살균하였다. 멸균한 증류수에서 3회 정도 세척한 뒤 1% NaOCl에서 20분간 2차 살균하였다.
살균된 석화잎 조직을 0.5㎠ 크기로 자른 뒤 캘러스 유도용 배지 위에 치상하였다. 상기 캘러스 유도용 배지는 0.4% 겔라이트(gelrite), 2% 수크로오스(sucrose), 생장조절제로 나프탈렌 아세트산 1~2mg/L 및 벤질아데닌 0.5~1.5mg/L를 포함하는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 고체 배지를 사용하였으며, pH는 5.50~5.58 범위로 제조하였다. 그 다음에, 25℃ 및 암조건에서 4~6주 동안 배양하여 석화 캘러스를 유도하였다.
석화 캘러스 유도단계
상기 유도된 석화 캘러스를 2주 간격으로 4회 이상 계대배양하여 석화 캘러스 세포를 분열 및 증식시킨 후 8주 후 부터는 4주 간격으로 계대배양하였다.
현탁배지 접종 및 현탁 배양단계
소독된 500 mL 유리 삼각 플라스크에 상기 계대 배양된 석화 캘러스 4g을 액체 현탁 배지(2% 수크로오스(sucrose), 생장조절제로 나프탈렌 아세트산(Naphthalene Acetic Acid, NAA) 1~2mg/L 및 벤질아데닌(Benzyl Adenine) 0.5~1.5mg/L를 포함하는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지 250mL에 접종하고, 일리시터로 코코넛 워터(coconut water) 25mL를 첨가하였다.
그 다음에, 소독된 알루미늄 호일로 밀봉한 후 교반기에서 120rpm의 속도로 교반해주었다. 현탁배양을 위해 배양실 온도를 15℃로 조정하였고, 24μmol·photons/㎡/s 하의 조명하에서 14시간 광처리, 10시간 암처리로 광주기를 조절하여 1~2주 동안 1차 배양하였다. 그 다음에, 동일한 배양 조건에서 상기 현탁 배지 250mL를 1차 증량하여 1~2주 동안 2차 배양하였고, 그 다음에 동일한 배양 조건에서 상기 현탁 배지 300mL를 2차 증량하여, 1~2주 동안 3차 배양하여, 총 4~6주간 현탁 배양하여 석화 캘러스 배양물을 제조하였다.
실시예 2
일리시터로서 이스트 추출물(yeast extract) 25mL를 적용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 석화 캘러스 배양물을 제조하였다.
비교예 1
일리시터를 적용하지 않은 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 석화 캘러스 배양물을 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예 1에서 유도된 석화 캘러스와 70% 에틸알코올의 비율을 1:1~10 범위 내로 혼합하여 3~7일 동안 추출하여 추출물을 제조하였다. 그 다음에 상기 추출물을 분획(分劃)한 다음, 감압농축 한 후 동결 건조를 실시하여 석화캘러스 추출물을 수득하였다.
실험예 1: 세포독성 활성 실험
WST(Water Soluble Tetrazolium salt) 분석법은 세포의 증식능력이나 세포생존능력을 측정하는 방법으로 세포 내의 Mitochondrial dehydrogenase 활성을 측정한다. WST는 수용성의 Tetrazolium Salt(WST-1)로서 살아있는 세포와 반응하여 발색물질인 오렌지색 수용성의 Formazan을 생성한다. 이 Formazan의 흡광도를 측정하여 시료에 대한 세포 독성을 확인하였다. 본 발명의 배양물이 염증 악화 등과 같은 자극 없이 면역 활성 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위해 대식세포(RAW 264.7)에 대한 독성을 측정하였다.
대식세포를 96well 플레이트에 1×104 cells/well씩 분주하였으며, 정확하게 동일한 양을 분주하기 위해 Hemacytometer를 사용하였다. 24시간 동안 배양한 대식세포에 상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2를 각 well에 0.15(v/v)%씩 넣고 DMEM 배지 100㎕에서 37℃, 5% CO2 Incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 DMEM 배지와 WST solution(EZ-cytox)을 9~10:1의 비율로 혼합한 뒤, 3 시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 반응시키고, 430nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 활성도(Cell Viability)는 하기 식 1에 따라 계산하였다.
[식 1]
세포 독성 활성도(Cell Viability) = (시료 처리군의 흡광도/시료 무처리(대조군)군의 흡광도) X 100
상기 식 1에 의해 계산된 실시예 1~2, 비교예 1~2의 세포 활성도(%)를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
구분 세포독성 활성도(%)
대조군 (100㎍/ml) 100
실시예 1 (100㎍/ml) 105.8
실시예 2 (100㎍/ml) 111.2
비교예 1 (100㎍/ml) 109.5
비교예 2 (100㎍/ml) 105.1
도 1은 상기 실시예 1~2, 및 비교예 1~2의 세포독성 활성도를 비교한 그래프이다. 상기 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1~2는 대조군과 유사한 세포 활성도를 나타내며 세포 독성을 보이지 않음을 알 수 있었다.
실험예 2: 항산화 실험
호흡을 통해 체내에 들어간 산소 중 산화과정에 이용되면서 프리라디칼을 갖는 구조를 활성산소라 칭하며, 이는 산화력이 큰 물질이다. 동식물의 체내 세포들의 대사과정에서 생성되거나 스트레스, 광자극, 세균 침투에 의해서도 발생되며, 과량의 활성산소가 체내에 존재함에 따라 정상 세포까지 공격할 경우 신체 노화와 각종 질병의 주범이 된다. 또한, 외부 자극에 예민한 면역 반응을 유도하는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명의 항염증 조성물이 항산화능을 나타냄에 따라 염증 완화 효과를 나타내는지 확인하기 위해 DPPH의 자유라디칼 소거능 실험을 진행하였다.
1mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 프리라디칼을 생성한다. 에탄올 0.20 ㎕과 100μM DPPH 200㎕에 실시예 1~2 및 비교예 1~2를, 각각 1㎕씩 첨가하였다. 10초간 강하게 교반하고, 약 5℃에서 30분간 보관한 다음, 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 비타민 C인 Ascorbic Acid를 양성 대조군으로 사용하여 흡광도를 측정하였고, 항산화효과는 하기 수식 2에 따라 계산하여 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
[식 2]
자유라디칼 소거능(%): (100-(시료처리군의 흡광도/시료 무처리(대조군)군의 흡광도)) X 100
구분 DPPH 자유라디칼소거능(%)
양성 대조군 (100㎍/ml) 65.6
실시예 1 (100㎍/ml) 62.3
실시예 2 (100㎍/ml) 59.5
비교예 1 (100㎍/ml) 48.7
비교예 2 (100㎍/ml) 37.8
도 2는 상기 실시예 1~2, 및 비교예 1~2의 자유 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다. 상기 표 2 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예 1~2는 비교예 1~2에 비해 우수한 항산화능을 나타냄을 알 수 있었다.
시험예 3: Nitric oxide (NO) 생성 실험
상기 제조된 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 항염증 활성도를 측정하기 위해서 염증 유도반응에 의해 생성되는 Nitric oxide(NO)의 농도를 측정하는 실험을 실시하였다. 염증유발 물질인 LPS(Lipopolysaccharide)로 자극시키면 활성화된 Pathway를 통해 NOS(NO 합성효소)가 NO를 생성한다. 생성된 NO는 세포배양액에 중에 NO2-의 형태로 존재하며 함량은 NO kit (Nitric oxide detection kit, iNtRON 21021, Korea)를 이용하여 측정하였다.
실시예 1~2 및 비교예 1~2를 각각 용매로 용해시킨 후 약 4%농도로 희석하였다. 이를 LPS (sigma, St. Louis, MOLogan, UT, USA) 1.5㎍/mL와 세포 RAW 264.7 에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 중 200 ㎕를 취한 후, NO kit의 N1 buffer 100 ㎕를 첨가하여 15분 방치하고, 이어 N2 buffer 100 ㎕를 첨가하여 15분간 방치 후, 530nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2-는 Nitrite를 표준용액으로 하여 측정하였다. 항염 효과가 있는 것으로 알려진 Dexamethasone을 양성대조군으로 설정하여 실시예 1~2 및 비교예 1~2를 각각 처리한 후 NO2- 생성 농도를 비교하여 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
구분 NO 생성농도(μM)
양성 대조군 (100㎍/ml) 1.0
실시예 1 (100㎍/ml) 2.2
실시예 2 (100㎍/ml) 2.6
비교예 1 (100㎍/ml) 3.9
비교예 2 (100㎍/ml) 5.2
도 3은 상기 실시예 1~2, 및 비교예 1~2의 NO 생성 억제능을 비교한 그래프이다. 상기 표 3 및 도 3을 참조하면, 실시예 1~2는 비교예 1~2보다 NO 생성 감소 효과가 상대적으로 우수한 것을 알 수 있었다.
실험예 4: Elastase 저해 활성 실험
Elastase 저해 활성 테스트는 엘라스틴(Elastin)을 분해하여 피부 주름 형성에 관여하는 Elastase의 저해 활성을 확인하는 실험을 통해 피부 주름 억제 효과를 확인 할 수 있다. 0.2M 인산나트륨 완충용액을 이용하여 실시예 1~2 및 비교예 1~2를 2%로 희석하여 시료를 각각 제조하였다. 상기 제조한 시료 40㎕에 1mM 농도의 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide를 첨가하였다. 효소인 0.4U Elastase를 20㎕ 첨가하여 25℃에서 7분 동안 반응한 후 분광분석기를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐 합성을 저해하여 피부노화에 관여하는 MMP-1 효소의 발현을 억제하는 물질로 알려진 올레아놀릭산(oleanolic acid)을 양성대조군으로 사용하였다. Elastase 저해 활성 정도는 식 3을 이용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
[식 3]
Elastase 저해 활성(%) = 100-(시료 처리군의 흡광도/시료 무처리군의 흡광도 X 100)
구분 Elastase 저해 활성 (%)
양성 대조군 (100㎍/ml) 50.2
실시예 1 (100㎍/ml) 52.5
실시예 2 (100㎍/ml) 51.6
비교예 1 (100㎍/ml) 49.3
비교예 2 (100㎍/ml) 48.4
도 4는 상기 실시예 1~2, 및 비교예 1~2의 Elastase 저해활성능을 비교한 그래프이다. 상기 표 4 및 도 4를 참조하면, 실시예 1~2는 비교예 1~2, 및 양성대조군(oleanolic acid)보다 향상된 Elastase 저해활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 5: 히알루론산 합성 단백질 활성 실험
히알루론산 합성 단백질 활성 테스트를 통해서 본 발명의 석화 캘러스 배양물 처리한 Hyaluronan synthase 2 단백질의 발현량을 확인하여, 보습 활성을 측정하였다. HAS-2 촉진 물질을 석화캘러스로부터 확인하고자, 상기 실시예 1~2 및 비교예 1을 처리하였을 때 HAS-2 mRNA 발현량 변화를 통해 히알루론산의 생성이 증가되는지를 확인하였다. 사람 피부 섬유아세포 4×105개를 6-well plate에 분주하여 24 시간 동안 배양한 후에 No-PGR 배지로 교환하여 또 다시 24 시간 동안 배양하였고, 여기에 0~200 ㎍/mL 농도의 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 시료가 포함되도록 하였다. 이렇게 처리한 세포들에서 RNeasy mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 정량하여 1 ㎍의 RNA를 GeneAmp RNA PCR kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 역전사(reverse transcription)하였다. 합성한 cDNA는 HAS-2 및 GAPDH 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 통해 증폭시켰다. PCR 증폭 산물은 1.5% 아가로스 젤에 전기영동하고 이를 Fluoro-S Multimager(Biorad, USA)를 이용하여 분석하였다.
발현량의 변화는 All trans-Retinal을 대조군으로 비교하여 도 5 에 나타내었다. 도 5는 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 히알루론산 합성 단백질 활성 테스트 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 5를 참조하면, 실시예 1~2는 비교예 1~2보다 Hyaluronan synthase 2 단백질의 생성량이 많았고, 보습인자인 히알루론산의 생성에 관여하는 단백질의 생성량 결과에 따라 보습효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.
실험예 6: 석화캘러스의 생리활성물질 함량측정
상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 석화캘러스 배양물의 활성도 및 효과가 어떠한 성분에 의한 것인지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 석화캘러스 배양물의 생리활성물질(플라보노이드(Flavonoids) 및 총 페놀성 화합물(Polyphenolic Compound))의 함량 변화를 측정하였다. 실험의 음성 대조군으로는 세포를 배양하지 않은 빈 배지를 설정하였다. 상기 플라보노이드 및 총 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위하여 Folin & Ciocalteu‘s Phenol Reagent를 사용하였으며, 표준물질로 Naringin(EtOH soluble), (+)-catechin hydrate, diethyleneglycol 및 2% Na2CO3를 이용하였다.
실험예 6-1: 플라보노이드계 화합물 함량측정
상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 석화캘러스 배양물에 포함된 플라보노이드계 화합물(플라보놀(flavonols), 플라본(flavones), 카테킨(catechin), 및 이소플라본(iso-flavones) 중에서 하나 이상)의 총 함량은 David 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 나린긴(Naringin)을 0.002~0.2 mg/mL의 범위 내의 농도로 제조하여 표준 시약으로 이용하였고, 각 시료에 디에틸렌글리콜(Diethyleneglycol)과 1N NaOH를 첨가하여 0.002~0.2mg/mL의 범위 내의 농도로 제조하여 실험군으로 이용하였다. 표준물질 및 시료 모두 UV-spectrophotometer를 이용하여 420nm에서 측정하였고, 표준 곡선을 작성 하였다. 상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 동결건조물 100mg을 취한 후, 50% MeOH 8mL을 첨가하였다. 상기 혼합액을 초음파추출기로 1시간 추출한 후 50% MeOH에 나타내었다.
구분 파장(nm) 투과율 흡광도 농도(mg/ml)
naringin 0.002(mg/ml) 420 97.39 0.011 0.002
naringin 0.02(mg/ml) 420 79.73 0.098 0.023
naringin 0.2(mg/ml) 420 16.76 0.776 0.199
실시예 1 420 22.15 0.664 0.179
실시예 2 420 27.23 0.579 0.161
비교예 1 420 48.66 0.405 0.081
비교예 2 420 48.72 0.416 0.084
Blank 420 100.04 0.000 0.000
상기 표 5를 참조하면, 항산화효과, 항염효과가 우수한 실시예 1~2은 비교예 1~2에 비하여 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 알 수 있었다.
실험예 6-2: 페놀성 화합물 함량측정
상시 실시예 1~2 및 비교예 1~2의 석화 캘러스 배양물의 페놀성 화합물(상기 페놀성 화합물은 탄닌(Tannin), 나린긴(Naringin), 및 레스베라트롤(Resveratrol) 중에서 하나 이상)의 총 함량 측정을 위하여 (+)-Catechin hydrate를 0.002~0.2 mg/mL의 범위내의 농도로 제조하여 표준 시약으로 이용하였고, 각 시료에 2% Na2CO3와 50% folin 시약을 첨가하여 0.002~0.2 mg/mL의 범위내의 농도로 제조하여 실험군으로 이용하였다. 표준물질과 시료 모두 UV-spectrophotometer를 이용하여 750nm 파장에서 측정하였고, 표준 곡선을 작성하였다. 상기 실시예 1~2 및 비교예 1을 동결건조 시킨 후 100mg을 취한 후, 50% MeOH 8mL 첨가하였다. 상기 혼합액을 초음파추출기로 1시간 동안 추출한 후 50% MeOH를 사용하여 10mL로 정용하였다. 이 추출물을 0.20㎛ Syringe filter를 사용하여 여과시킨 후 검액으로 사용하였다. 검액 100㎕를 2% Na2CO3 2ml과 혼합한 후 용액에 50% folin 시약 100㎕를 첨가하고 약 20~25℃에서 30분 반응시킨다. UV-spectrophotometer를 사용하여 파장 750nm에서 함량을 측정하였으며 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
구분 파장(nm) 투과율 흡광도 농도(mg/ml)
catechin 0.002(mg/ml) 750 95.82 0.019 0.003
catechin 0.02(mg/ml) 750 80.13 0.096 0.023
catechin 0.2(mg/ml) 750 14.29 0.645 0.200
실시예 1 750 25.65 0.496 0.166
실시예 2 750 37.43 0.309 0.149
비교예 1 750 60.66 0.177 0.067
비교예 2 750 60.61 0.191 0.078
Blank 750 99.98 0.000 0.000
상기 표 6을 참조하면, 상기 항산화효과 및 항염효과가 우수한 실시예 1~2는 비교예 1~2에 비하여 총 페놀성 화합물 함량이 높은 것을 알 수 있었다.
제조예 : 석화 캘러스 배양물을 함유하는 화장료의 제조
(1) 크림 제조: 상기 석화 캘러스 배양물을 함유하는 화장료를 제조하기 위해 하기 표 7에 기재된 원료들을 사용하여 통상적인 방법으로 크림을 제조하였다. 상기 실시예 1의 배양물 100 중량부를, 70%(v/v) 에탄올 수용액 1000 중량부에 첨가하고 5일~7일 동안 상온에서 숙성한 다음, Filter하여 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 회전진공 농축장치(rotary vacuum evaporator)(Eyela, 일본)를 사용하여 감압 및 농축하여 추출물을 수득하여 준비하였다.
성분명 함량 (중량 %)
정제수 65.29
카르복시메틸셀룰로스 15.0
글리세릴스테아레이트 2.0
스쿠알렌 5.0
스테아릭애씨드 3.0
1,3-부틸렌글라이콜 2.0
글리세린 1.0
세테아릴알코올 1.0
비즈왁스 0.6
구연산 0.1
방부제 0.01
실시예 1 석화 캘러스 배양물 5.0
합계 100
(2) 페이셜 스킨 제조: 상기 실시예 1의 석화 캘러스 배양물을 함유하는 페이셜 스킨 제형의 화장품을 제조하기 위해, 하기 표 8에 기재된 원료들을 사용하여 통상적인 방법으로 페이셜 스킨을 제조하였다.
성분명 함량(중량 %)
2NA-EDTA 0.03
카보머 0.5
베타인 2.0
PEG-60하이드로제네이티드캐스터오일 0.5
부틸렌글라이콜 5.0
방부제 0.1
실시예 1 석화 캘러스 배양물 5.0
향료 0.1
정제수 86.77
합계 100
(3) 페이셜 로션 제조: 상기 실시예 1의 석화 캘러스 배양물을 함유하는 페이셜 로션 제형의 화장품을 제조하기 위해, 하기 표 9에 기재된 원료들을 사용하여 통상적인 방법으로 페이셜 로션을 제조하였다.
성분명 함량(중량 %)
글리세린 5.0
카보머 0.5
스테아릴알코올 2.0
하이드로제네이티드폴리(C6-14올레핀) 3.0
폴리소르베이트 1.0
디메치콘 0.3
방부제 0.1
2NA-EDTA 0.03
실시예 1 석화 캘러스 배양물 5.0
향료 0.1
정제수 88.47
합계 100
(4) 페이셜 에센스 제조: 상기 실시예 1의 석화 캘러스 배양물을 함유하는 페이셜 에센스 제형의 화장품을 제조하기 위해, 하기 표 10에 기재된 원료들을 사용하여 통상적인 방법으로 페이셜 에센스를 제조하였다.
단위: 중량% 함량(중량%)
글리세린 9.0
카보머 0.5
부틸렌글라이콜 10
PEG-60하이드로제네이티드캐스터오일 1.0
폴리소르베이트 0.5
방부제 0.1
2NA-EDTA 0.03
실시예 1 석화 캘러스 배양물 5.0
향료 0.1
정제수 82.77
합 계 100
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (6)

  1. 석화(Adenium obesum)로부터 캘러스를 유도하는 단계;
    상기 석화 캘러스를 계대 배양하는 단계;
    상기 계대 배양된 석화 캘러스를 코코넛 워터(coconut water)를 포함하는 현탁 배지에 접종하는 단계; 및
    상기 현탁 배지에 접종된 석화 캘러스를 현탁 배양하는 단계;를 포함하며,
    상기 캘러스 유도는, 석화 잎을 나프탈렌 아세트산 1~2mg/L 및 벤질아데닌 0.5~1.5mg/L를 포함하는 캘러스 유도용 배지에 치상한 다음, 배양하여 캘러스를 유도하는 것을 특징으로 하는 석화 캘러스 배양물 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 석화 캘러스 배양물 제조방법에 의해 제조되며,
    플라보노이드계 화합물을 0.09~0.19 mg/mL 포함하고, 페놀성 화합물을 0.09~0.20 mg/mL 포함하는 것을 특징으로 하는 석화 캘러스 배양물.
  5. 제4항의 석화 캘러스 배양물을 포함하는 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 석화 캘러스 배양물은 상기 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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Shukla, S. International Journal of Tropical Agriculture, April-June 2015, vol.33, no.2 (Part III) pp.1369-1372 ref.12 (2015.6.15. 공개)

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