KR101769461B1 - 땅콩새싹 추출물을 함유하는 미세먼지 또는 황사로부터 발생하는 피부손상 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 땅콩새싹 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부손상 개선, 피부자극 완화, 피부염증 완화, 피부노화 방지 및 피부 보습에 우수한 효과를 발휘한다.

Description

땅콩새싹 추출물을 함유하는 미세먼지 또는 황사로부터 발생하는 피부손상 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition with the extract of peanut sprout for the improvement of skin damage from fine dust and yellow sand}

본 발명은 땅콩새싹 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 땅콩새싹 머리 추출물을 함유함으로써, 미세먼지 또는 황사로부터 발생하는 피부손상을 개선시키는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투를 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선, 오염된 환경 등 외부로부터 받는 스트레스는 피부 자극을 유발하게 되고, 결국에는 피부 노화로 이어지게 된다.

이러한 외부 자극 중에서도 특히, 최근 중국의 산업화로 인해 발생하고 있는 중금속 등의 유해물질이 섞인 미세먼지, 황사, 스모그는 피부 노화 및 피부 트러블의 주요 원인으로 인식되고 있다.

중금속은 수은, 카드뮴, 납 및 구리 등과 같은 비중이 4 이상인 금속류를 말하며, 일반적으로 생체 내로 흡수되면 생체 내 물질과 결합하여 잘 분해되지 않는 유기복합체를 형성하기 때문에, 몸 밖으로 빨리 배출되지 않고, 간장, 신장 등의 장기나 뼈에 축적된다. 중금속에 장기간 노출될 경우 후지 마비, 이상운동, 운동실조, 피부의 색소침착 및 각질화, 발톱 또는 발굽 및 모발의 위축결손, 생식기능장애, 기형출산, 성장 저하 및 면역기능저하 등의 증상이 나타난다.

피부에서는, 유해 중금속 미세 분진들이 대기 중에서 화학반응을 일으켜 질소산화물(NO), 황산화물(SO) 등과 같은 유해물질을 추가로 생성해 피부의 염증성 물질인 사이토카인 등을 증가시키고, 아토피나 피부 트러블을 유발할 수 있다. 또한, 중금속이 피부의 보습과 밀접한 관계에 있는 히아루론산을 파괴한다는 것은 이미 알려져 있는 사실이다.

한편, 중금속 입자의 크기는 2 ㎛ 이하이기 때문에 일반먼지 (평균 크기가 20 ㎛ 이상)보다 훨씬 작다. 이러한 중금속을 포함하는 미세먼지는 크기가 작기 때문에 피부모공 깊숙이 쉽게 침투할 수 있는데, 침투된 미세먼지를 깨끗이 제거하지 못하면 피부에 염증 및 트러블을 일으키는 경우가 많다.

현재 체내 중금속 제거 방법은 'EDTA(ethylene diamine tetraacetate)' 및 'BAL(British Anti-Lewisite)'과 같은 착화합물 형성물질을 주사하여 체내에 축적되어 있는 중금속과 결합하게 함으로써, 중금속을 체외로 배출시키는 방법 또는 비타민 B1, 비타민 C 및 비타민 E를 복용하여 중금속의 체내 흡수를 막고, 배출시키는 방법 등이 있다. 하지만, 효과적이고 용이하게 중금속으로부터 피부를 보호하는 방법은 알려진 바가 없다.

한편, 2006년 예방의학회지에 보고된 "황사에 대한 수도권 거주 성인의 위해도 인식조사"에 따르면, 응답자의 40.2%가 황사에 의한 신체적 불편증상을 경험한 적이 있으며(남성 32.5%, 여성 47.1%), 여성응답자의 25.8%가 '가려움증 등의 피부증상'을 경험한 것으로 나타났다. 이 보고에 따르면 황사는 건강에 가장 유해한 환경문제의 하나로 인식되고 있으며, 피부질환과 관련성이 큰 것으로 보고 있다 (Im et al., Public perceptions of the risk of asian dust storms in seoul and its metropolitan area. J Prev Med Public Health 39(3):205-212, 2006).

임상적으로 황사바람이 직접 피부에 닿으면 알레르기 반응을 일으켜 접촉성 피부염이 발생하기 쉬우며, 건조하고 세찬 황사바람은 피부의 수분을 빼앗아가 피부건조증, 각질, 가려움증, 황사여드름 및 아토피 등을 유발한다고 알려져 있다. 그러나, 이에 대한 치료나 대비책은 명확하지 않다.

결론적으로, 중금속, 미세먼지, 황사 등과 같은 오염 물질들은 피부 내 스트레스를 야기하는데, 이러한 스트레스는 활성 산소에 의해 생성된다. 활성산소는 미토콘드리아 내 전자전달체 및 백혈구 세포의 활성화 등 정상적인 세포기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당하는 세포 내 신호전달 물질로 작용한다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된다 (Jeong E. J., et al., Natural Product Sciences 2008, 14, 156-160; Parfenova H., et al., Am J. Physiol. Cell. Physiol. 2006, 290, 1399-1410).

산화적 스트레스를 막아 줄 수 있는 항산화 물질에 대해서는 많은 연구가 진행되었고, 실제로 많은 항산화제가 개발되어 사용되고 있는데, 특히 비타민 C와 비타민 E는 널리 사용되고 있는 항산화제이다. 비타민 C는 수용성 항산화제이고, 비타민 E는 지용성 항산화제이다. 이들 항산화제들은 강력한 항산화 효과를 나타내지만, 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 따른다.

한편, 채소 중 새싹채소는 씨앗에서 싹이 나와 잎이 1~3개 정도의 발아한 지 1주일 남짓 된 어린채소를 말하는데, 크기는 일반채소에 비하여 작지만 다 자란 채소보다 많은 영양소를 함유하고 있는 것으로 보고되어 있다. 즉, 식물 종자에서 싹이 발아할 때 곰팡이, 박테리아 등 외부의 적으로부터 자신을 방어할 무기로써 여러 생리활성 물질을 생산하는데, 이들 물질들이 인체 내에서 다양한 기능성을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 무순은 발아과정 중 항산화 비타민, 식이섬유소 및 이소티오시아네이트류(isothiocyanates) 함량이 높아지고, 유채는 필수아미노산과 항산화 비타민 함량이 증가한다. 또한, 메밀은 발아과정 중 식이섬유소 및 루틴 같은 생리활성 물질들이 증가한다고 보고되어 있다.

한편, 땅콩은 콩과에 속하는 일년생의 초본식물로서 지방과 단백질을 많이 함유하고 있는 고열량 식품인데, 직접 식용으로 이용되거나 가공식품 등 다양한 분야에 이용되고 있다. 발아된 땅콩새싹은 기능성 성분이 풍부하고, 수분함량이 높으며, 식감이 우수하여 식품소재로서 이용범위가 넓은 장점을 지니고 있다. 하지만, 땅콩새싹에 관련된 연구는 아직 초기단계에 불과하며, 특히 피부와 관련된 연구는 아직 활발하게 수행되고 있지 않다.

대한민국 등록특허 제10-0711007호(등록일자 2007. 04. 18)에는, 메밀 추출물을 함유하여 항산화능 및 피부 노화 방지 효과가 있고, 대기 중의 중금속 제거 능력 및 피부 주름개선 능력이 뛰어난 기능성 화장료 조성물에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1402289호(등록일자 2014. 05. 26)에는, 새싹땅콩 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 식품 조성물에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 미세먼지 또는 황사로부터 유래한 피부손상의 개선, 피부 자극 완화, 피부염증 완화, 피부노화 방지 및 피부 보습에 효과가 있는 천연물질을 함유한 화장료 조성물을 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부손상 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부자극 완화용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부염증 완화용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부손상, 피부자극, 피부염증 및 피부노화는 중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암아 발생한 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 보습은 중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암아 건조해진 피부에 대한 보습일 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 땅콩새싹 추출물은 땅콩새싹의 모든 부위를 사용해도 좋으나, 바람직하게는 땅콩새싹 머리의 추출물을 사용하는 것이 좋으며 이때, 땅콩새싹 머리는 '땅콩열매부터 새로 자라나는 떡잎'까지를 모두 포함할 수 있다. 땅콩새싹 머리의 추출물을 사용할 경우, 땅콩새싹의 다른 부위를 사용할 경우보다 피부 자극 완화, 피부염증 완화, 피부노화 방지 및 피부 보습 효과가 더 우수하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 땅콩새싹은 바람직하게 땅콩을 18~23℃에서 3~10일간 수경재배하여 수득한 땅콩새싹인 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 땅콩새싹 추출물은 일 예로, 용매추출(solvent extraction), 증류(hydrodistillation) 및 수증기 증류(steam distillation) 중 선택되는 하나의 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 이때, 상기 증류(hydrodistillation)는 대상 물질을 물에 침지하고, 이를 가열하여 휘발성 물질을 분리하는 증류법이다. 또한, 상기 수증기 증류(steam distillation)는 끓는점이 높고, 물에 거의 녹지 않는 유기화합물에 수증기를 불어넣어, 그 물질의 끓는점보다 낮은 온도에서 수증기와 함께 유출되어 나오는 물질의 증기를 냉각하여, 물과의 혼합물로서 응축시키고 그것을 분리시키는 증류법이다. 또한, 상기 용매추출의 용매는 일 예로, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올일 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 땅콩새싹 추출물은 바람직하게 화장료 조성물 대비 0.01~95중량% 포함되는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 화장료 조성물 대비 1~80중량% 포함되는 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 일 예로, 현탁액, 용액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 상기 페이스트 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 상기 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 상기 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 상기 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 상기 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 땅콩새싹 추출물을 함유함으로써 피부손상 개선, 피부자극 완화, 피부염증 완화, 피부노화 방지 및 피부 보습에 우수한 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명 땅콩새싹 추출물의 처리에 따른 SIRT3 mRNA의 발현량을 하우스키핑(Housekeeping) 유전자인 베타액틴(β-actin)의 발현량과 비교하여 보여준다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 제조예 1 내지 제조예 3: 땅콩새싹 추출물의 제조]

본 발명에 사용된 땅콩새싹은 제주 우도에서 재배된 땅콩을 20℃에서 9일 동안 발아시켜 실험에 사용하였다. 피부세포 배양을 위해 필요한 'DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)', 'FBS(fetal bovine serum)'은 'Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)'에서 구입하였다.

또한, 피부세포 보호 효과 실험에 사용된 'MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)', 'DMSO(dimethyl sulfoxide)'는 'Sigma chemical co.(st. Louis, MO, USA)'의 제품을 구입하여 사용하였으며, 그 외 하기 실험에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

본 발명의 땅콩새싹 추출물을 제조하기 위해, 먼저 부위별 추출물을 제조하였다. 땅콩새싹을 전체(whole), 머리(head) 및 줄기(stem) 부분으로 나누었다. 상기 각각의 부위별 시료 5 g에 메탄올 100 ml을 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출한 후, 여과지(Advantage, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 상기 여과된 추출액은 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압 농축하여 분말 형태의 추출물을 수득하였으며, 땅콩새싹의 부위별로 전체(whole) 추출물은 '제조예 1', 머리(head) 추출물은 '제조예 2', 줄기(stem) 추출물은 '제조예 3'이라 명명하여 하기 실험에서 사용하였다.

[ 실험예 1: 땅콩새싹 추출물의 세포독성 측정]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물의 세포독성 및 세포 생존율을 관찰하고자 MTT 분석법을 수행하였다. MTT 분석은 살아있는 세포의 수를 측정함으로써, 세포 증식이나 독성 측정에 많이 사용되는 실험방법이다.

실험을 위해, 먼저 인간섬유아세포 세포계(human fibroblasts cell line, ATCC, CRL-2310)을 1×10⁵ cells/ml의 세포수로 10% FBS-DMEM 배지에 현탁시켜 24-웰 배양플레이트에 접종하여 부착시켰다. 접종 24시간 후, 혈청이 없는 배지로 교체하고, 제조예 1~3의 땅콩새싹 추출물을 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 500 ㎍/ml의 각 농도별로 첨가한 후, 1일 동안 37℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

배양이 끝난 후, 상등액을 제거하고, 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200 ㎕씩 가하여 세척하고, MTT 용액을 웰 당 1.0 ml씩 가하였다. 4시간 후에 MTT를 제거하고, DMSO를 웰 당 1.0 ml씩 가한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험의 대조군으로는 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 제외된 추출용매만을 사용하였으며, 세포 생존률은 하기 수학식 1에 따라 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.

	세포 생존율 (%)
	10 ㎍/ml	50 ㎍/ml	100 ㎍/ml	500 ㎍/ml
대조군	100	104.5	102.9	104.8
전체(whole) 추출물	101	103.2	102.4	103.5
머리(head) 추출물	102.8	105.1	104.3	101.4
줄기(stem) 추출물	103.5	101.8	103.2	102.6

실험결과, 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 모든 처리 농도에서 세포독성을 보이지 않는 것으로 확인할 수 있었다 (표 1).

[ 실험예 2: 중금속에 대한 땅콩새싹 추출물의 세포 보호 효과]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물을 사용하여 젖산 탈수소 효소 방출 분석(lactate dehydrogenase release assay, LDH release assay)을 수행하고자 하였다.

젖산 탈수소 효소 방출 분석은 세포 괴사율을 측정할 수 있는 비색적(colorimetric) 방법으로, 세포배양시 괴사된 세포는 젖산 탈수소 효소(LDH)를 배지로 방출하는데, 방출된 젖산 탈수소 효소(LDH)에 무색의 테트라졸리움염(colorless tetrazolium salt)을 넣으면 환원된 형태의 유색 포르마잔(colored formazan)을 형성한다. 이때, 젖산 탈수소 효소 방출 분석 키트(LDH release assay kit)를 사용하여 젖산 탈수소 효소(LDH) 방출을 측정하였다.

먼저, 세포주를 1×10⁵ cells/ml로 맞춘 후, 100 ㎕씩 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주하여, CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 땅콩새싹 추출물을 50 ㎍/ml의 농도로 세포주에 처리하여 30분 동안 배양하고, 다시 20 mM 중금속을 종류별로(카드뮴, 납, 비소, 알루미늄) 각각 추가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 배양액을 새로운 96-웰 플레이트에 50 ㎕ 분주하고, 젖산 탈수소 효소 시약(LDH reagent) 50 ㎕를 첨가하여 반응시킨 후, 1 N HCl을 100 ㎕ 첨가하여 반응을 중지시켰다. 한편, 살아남은 세포의 젖산 탈수소 효소(LDH) 측정을 위해 남은 배양액을 제거하고, 0.5 % 'Triton X-100' 용액을 50 ㎕ 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 섞고, 같은 방법으로 젖산 탈수소 효소 시약(LDH reagent)을 첨가하여 반응시켰다. 반응 후, 반응 정지액을 넣고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

젖산 탈수소 효소(LDH)에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 젖산 탈수소 효소(LDH)에 대한 배양액으로부터 유리된 젖산 탈수소 효소(LDH)의 값으로 계산하여 무처리 군과 비교한 값을 나타내었다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	LDH(lactate dehydrogenase) release (%)
	카드뮴	납	비소	알루미늄
대조군	85.7	67.4	80.1	65.7
전체(whole) 추출물	42.2	53.7	65.8	41.5
머리(head) 추출물	31.2	35.4	41.3	31.8
줄기(stem) 추출물	54.1	62.3	74.5	59.6

실험결과, 중금속만 처리한 대조군에 비해, 본 발명의 땅콩새싹 추출물을 처리하는 경우, 젖산 탈수소 효소(LDH)의 방출이 감소하였고, 땅콩새싹 머리 추출물의 경우 가장 좋은 효과를 나타내었다.

상기 결과에 따라, 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 중금속에 의해 유도된 피부세포의 손상(사멸)을 강력하게 억제할 수 있는 것으로 확인할 수 있었다 (표 2).

[ 실험예 3: 중금속에 대한 땅콩새싹 추출물의 히아루론산 보호 효과]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 제조예 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물이 피부 보습에 관여하는 히아루론산을 중금속으로부터 보호할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

철분(19ppm)과 땅콩새싹 전체, 머리, 줄기 추출물 50㎍/ml 및 'EDTA-2NA' 5 mM 를 각각 반응시켰다. 히아루론산의 분해 방지 효과는 히아루론산의 점도 측정을 통해서 확인하고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때, 히알루론산이 중금속으로 인해 분해되면 용액의 점도가 감소되므로 점도가 낮을수록 히알루론산이 많이 분해되었음을 의미한다.

	점도(cps)
히아루론산	1630
히아루론산 + 철	1227
전체(whole) 추출물 + 히아루론산 + 철	1465
머리(head) 추출물 + 히아루론산 + 철	1593
줄기(stem) 추출물+ 히아루론산 + 철	1404

실험결과, 본 발명의 땅콩새싹 추출물을 함유하는 경우, 히아루론산만의 점도와 유사하며, 그 중에서도 땅콩새싹 머리 추출물은 히아루론산만을 함유하는 시료와 가장 근접한 점도를 나타내었다.

상기 결과에 따라, 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 히아루론산 분해 방지 효과를 가지고 있는 것으로 확인할 수 있었다 (표 3).

[ 실험예 4: 황사에 대한 땅콩새싹 추출물의 피부 세포 보호효과]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 제조예 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물이 피부 세포를 황사로부터 보호할 수 있는지 확인하고자 하였다.

사람 유래의 섬유아세포를 96 웰 평판 배양기에 각 웰 당 1×10⁵ cells/ml 농도로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 중금속 및 미세먼지를 함유하는 황사 0.01% 와 땅콩새싹 전체 추출물 50 ㎍/ml을 동시에, 황사 0.01% 와 땅콩새싹 머리 추출물 50 ㎍/ml을 동시에, 황사 0.01% 와 땅콩새싹 줄기 추출물 50 ㎍/ml을 동시에 처리하고, 대조군에는 황사(0.01%)를 단독 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다.

배양 후, MTT 시약(Sigma)을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고, 1 N 'NaOH/이소프로판올용액'을 첨가하여 20분간 교반하였다. 그 후, 흡광 광도계로 565 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 섬유아세포의 생존율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.

	세포 생존율(%)
대조군(황사 단독 처리)	28.5
전체(whole)추출물 + 황사	71.3
머리(head) 추출물 + 황사	83.2
줄기(stem) 추출물+ 황사	64.6

실험결과, 본 발명의 땅콩새싹 추출물은 황사를 단독으로 처리한 대조군과 비교하여, 황사에 의해서 유발되는 세포 사멸을 억제시켜 섬유아세포의 생존율을 더 높이는 것으로 확인할 수 있었다 (표 4).

[ 실험예 5: 땅콩새싹 추출물의 ' PGE ₂ , IL - 1β , IL -6, TNF -α, IP -10, MCP -1, RANTES 및 VEGF' 발현 억제 효과 확인]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 제조예 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물이 염증 매개 물질인 'PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF'의 발현 억제에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.

사람 각질형성세포를 6-웰 플레이트에 1×10⁵ cells/ml 세포의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이후, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 인터페론-γ(IFN-γ)를 상기 웰에 첨가하여, 24시간 동안 자극을 준 후, 상기 제조예 1 내지 제조예 3에서 수득한 땅콩새싹 추출물을 50 ㎍/ml 농도로 처리하여, 48시간 동안 반응시켰다. 이후 배양액을 수거하여 ELISA 분석을 수행하였다. 'PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF' 측정은 알앤디 시스템(R&D system)사의 ELISA 키트를 사용하였으며, 판매회사의 매뉴얼대로 실험하였다. 측정 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

시 료		PGE2 pg/ml	IL-1β pg/ml	IL-6 pg/ml	TNF-α pg/ml	IP-10 pg/ml	MCP-1 pg/ml	RANTES pg/ml	VEGF pg/ml
대조군		569	3	5	83.1	30	10.2	5	20.4
LPS+IFN-γ		2756	18.3	7539	3589	69935	2892	2802	74
땅콩새싹 추출물	전체	1053	17.5	7012	2256	11981	2289	1236	57.3
	머리	476	7.1	835	417	58	16	45	8.6
	줄기	1885	14.8	1738	1364	98873	1796	1387	42.1

실험결과, 염증 매개 물질인 'PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF'의 생성량이 본 발명의 땅콩새싹 추출물의 첨가로 인해 현저하게 감소한 것으로 나타나, 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 상기 염증 매개 물질들의 억제에 효과를 가지는 것으로 확인할 수 있었다. 특히, VEGF의 경우에는 대조군보다도 낮은 생성량을 보여 VEGF를 완벽하게 억제시키는 것을 확인할 수 있었다 (표 5).

이상의 결과로부터, 본 발명의 땅콩새싹 추출물은 중금속 및 미세먼지를 포함하는 황사로 인해 발생할 수 있는 피부 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 피부 염증 및 트러블 방지 효과가 있는 것으로 확인할 수 있었다.

[ 실험예 6: 피부노화에 대한 효과 확인]

본 실험예에서는 상기 제조예 1 내지 제조예 3에서 수득한 땅콩새싹 전체, 머리, 줄기 추출물의 피부노화에 대한 효과를 알아보고자 하였다.

피부 세포 보호 및 재생에 있어 중요한 역할을 하는 'G6DPH' 활성 및 'DNA' 함량을 측정하였으며, 그 실험은 하기와 같이 수행하였다.

인간의 섬유아세포(human fibroblasts cell line; ATCC, CRL-2310)에 대한 'G6PDH' 활성을 아다치(adachi)방법 {Advan. Biol. Skin., 8, 223-240(1967)}에 의해 측정하였고, DNA 함량을 버튼(Burton) {J. Biol. Chem., 62, 315-322(1956)} 방법에 의해 측정하였다.

실험 결과를 하기 표 6에 나타내었는데, 3회 측정의 결과를 시료를 함유하지 않은 대조군에 대한 '상대적인 %'로 나타내었다.

시료	농도 (ug/ml)	DNA 함량		G6PDH 활성
		3일 후	6일 후	3일 후	6일 후
대조군	50	100	100	100	100
전체(whole)추출물	50	116	138	125	158
머리(head) 추출물	50	122	143	136	157
줄기(stem) 추출물	50	110	126	113	149

실험결과, 본 발명의 땅콩새싹 추출물은 대조군(control)과 비교하여 볼 때, G6DPH 활성 및 DNA 함량이 모두 증가된 것으로 확인할 수 있었다 (표 6).

따라서, 본 발명의 땅콩새싹 추출물은 중금속 및 미세먼지를 포함하는 황사로 인해 발생할 수 있는 산화적 스트레스로부터 세포를 보호 및 재생시키는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있었다.

[ 실험예 7: SIRT3 유전자 발현량 측정]

본 실험예에서는 SIRT3 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해 RT-PCR 법을 사용하였다. 이때, 시르투인(sirtuins)의 한 종류인 SIRT3는 고령의 'blood stem cells'을 스트레스로부터 해방시켜 주고, 새로운 혈구를 생성시켜주는 것으로 알려져 있는 유전자이다.

섬유아세포(Fibroblast) 세포주로부터 'mRNA'의 획득은 트리졸 시약(TRIzol reagent) (Invitrogen, USA) 및 상기 시약 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 구체적으로는 60 mm 배양접시 (Nunc, Denmark)에 1×10⁶ cells/dish의 세포를 준비한 뒤, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다.

상기 24시간 배양한 세포 배양액에 제조예 2의 땅콩새싹 머리 추출물을 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml을 각각 처리하고, 양성 대조군으로는 레스베라트롤 10 μM을 처리한 후, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 음성 대조군으로는 세포배양액에 무처리한 것을 사용하였다.

24시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하고, 트리졸 시약(TRIzol reagent) 1 mL를 가하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포를 각각 1.5 mL 튜브로 옮긴 후, 클로로포름(Chloroform) 0.2 mL를 첨가하고, 실온에서 5분 방치한 후, 15,000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하였다.

원심분리 수행 후, 세포를 파괴시킨 혼합액의 상등액을 새 1.5 mL 튜브로 옮기고, 아이소프로판올(Isopropanol)을 0.6 mL 첨가하여 인버팅(inverting) 한 후, 실온에서 10분간 방치하였다.

그 후, 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여, mRNA를 수득하였다. 상기 튜브에서 아이소프로판올(Isopropanol)을 제거하고, 75% 에탄올 1 mL를 첨가하여 인버팅(inverting)한 후, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 에탄올을 제거하고, 정제된 정제 mRNA를 수득하였다. 정제 mRNA가 완전히 건조되면 DEPC-DW를 첨가하여 mRNA를 획득하였다. 상기에서 사용한 DEPC-DW는 3차 정제수 1 L에 DEPC(Diethyl pyrocarbonate) 1 mL를 첨가하고 121℃에서 25분간 멸균하여 제조한 것으로, RNase가 비활성화된 증류수(DW)이다.

SIRT3 mRNA 농도에 미치는 영향을 RT-PCR(Reverse trascription PCR)을 수행하여 확인하였다. RT-PCR(Reverse trascription PCR)을 수행하여 얻어진 mRNA의 상대적인 농도는 하우스키핑(Housekeeping) 유전자인 베타액틴(β-actin) 유전자의 mRNA 농도와 비교하여 표현하였다.

RT-PCR은 'Superscript Ⅱ' 키트 (Invitrogen, USA) 및 상기 키트 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였으며, 'GENE CYCLER' (Bio-Rad, USA) PCR 기기를 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로는 상기 수득한 mRNA 1 ㎍, '2X reaction buffer' 12.5 ㎕, '10 pmole primer' (Bioneer, Korea) 각각 3 ㎕씩, 'RT/PlatiumTaq Mix' 1 ㎕를 넣은 후, 최종 부피가 25 ㎕가 되도록 'RNase-free DW'를 넣어 제조하였다.

SIRT3 유전자의 발현량을 확인하기 위해 사용한 프라이머 쌍에 대해서는 하기 표 7에서 나타내었다. 하기 표 7에는 하우스키핑 유전자 중 하나인 베타액틴(β-actin)을 확인할 수 있는 프라이머도 기재하였다.

구분		염기서열
SIRT3	정방향 (Forward, 19 mer)	5'-GTGGTTGATTTCCCCATGG-3'
	역방향 (Reverse, 19 mer)	5'-ACAAGGTCCCGCATCTCTT-3'
비교예 1 (β-actin)	정방향 (Forward, 21 mer)	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'
	역방향 (Reverse, 21 mer)	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'

한편, PCR 반응은 표 8에 기재된 조건으로 수행되었다.

	SIRT3		비교예 1 (β-actin)
단계 (step)	온도	반응시간	온도	반응시간
Denaturation	94℃	35 sec	94℃	1 min
Annealing	57℃	25 sec	62℃	1 min
Extension	72℃	25 sec	72℃	1 min
Cycle	Go to denaturation step	40 cycle	Go to denaturation step	25 cycle

실험결과, 땅콩새싹 추출물은 대조군인 레스베라트롤을 처리한 것과 유사하게, 섬유아세포(Fibroblast) 세포주에서 SIRT3 mRNA의 발현양을 증가시켰다 (도 1). 도 1은 본 발명 땅콩새싹 추출물의 처리에 따른 SIRT3 mRNA의 발현량을 하우스키핑(Housekeeping) 유전자인 베타액틴(β-actin)의 발현량과 비교하여 보여준다.

이상의 결과로부터 본 발명의 땅콩새싹 추출물이 피부노화방지에 효과가 있는 것으로 확인할 수 있었다.

[ 실시예 1: 화장료 조성물(크림)의 제조]

본 실시예에서는 하기 표 9의 성분을 혼합하여 상기 제조예 2의 땅콩새싹 머리 추출물을 함유하는 화장료 조성물(크림)을 제조하고자 하였다.

번호	원료	실시예 1 (중량%)	비교예 2 (중량%)
1	땅콩새싹 머리 추출물 (제조예 2)	5.0	-
2	밀납	5.0	5.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
5	유동 파라핀	10.0	10.0
6	스쿠알란	10.0	5.0
7	소르비탄 스테아레이트	1.0	5.0
8	글리세릴 스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0	5.0
9	친유성 모노스테아린산 글리세린	0.5	0.5
10	스테아린산	1.5	1.5
11	부틸렌글리콜	5.0	3.0
12	프로필렌글리콜	5.0	3.0
13	트리에탄올아민	0.2	0.2
14	방부제	미량	미량
15	색소	미량	미량
16	향료	미량	미량
17	정제수	잔량	잔량
합계		100	100

[ 실험예 8: 피부 손상 회복 효과]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 화장료 조성물(크림)의 피부 손상 회복 효과를 알아보고자 하였다.

20명의 여성을 각각 10명씩 2조로 나눠서 테이프 스트리핑을 통해서 피부에 자극을 유발시켰다. 이후, 상기 실시예 1 및 비교예 2를 각각 매일 오전과 오후 2회에 걸쳐 도포하도록 하고 피부 손상의 회복 정도를 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다.

시험 물질	피부 손상 회복 시간
실시예 1	2.3일
비교예 2	6일

실험결과, 땅콩새싹 머리 추출물을 함유하는 화장품 조성물(크림)은 비교예 2보다 피부 손상을 회복하는 시간이 짧은 것으로 확인되었다 (표 10).

따라서, 본 발명의 땅콩새싹 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 손상을 빠르게 회복시켜 주는 것으로 확인할 수 있었다.

Claims (14)

1. 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암은 피부 손상을 개선하는 것을 특징으로 하는 피부손상 개선용 화장료 조성물.
   
2. 삭제
3. 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암은 피부 자극을 완화하는 것을 특징으로 하는 피부자극 완화용 화장료 조성물.
   
4. 삭제
5. 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암은 피부 염증을 완화하는 것을 특징으로 하는 피부염증 완화용 화장료 조성물.
   
6. 삭제
7. 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암은 산화적 스트레스로부터 세포를 보호 및 재생시키는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물.
   
8. 삭제
9. 땅콩새싹 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   중금속을 함유하고 있는 미세먼지 또는 황사로 말미암아 건조해진 피부를 보습하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
   
10. 삭제
11. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제9항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 땅콩새싹 추출물은,
    땅콩새싹 머리의 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
12. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제9항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 땅콩새싹은,
    땅콩을 18~23℃에서 3~10일간 수경재배하여 수득한 땅콩새싹인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
13. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제9항 중 선택되는 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 땅콩새싹 추출물은,
    용매추출(solvent extraction), 증류(hydrodistillation) 및 수증기 증류(steam distillation) 중 선택되는 하나의 방법을 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 용매추출의 용매는,
    탄소수 1 내지 4의 저급알코올인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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