KR20200064384A - 약쑥을 함유한 항산화 및 항염증 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생약 성분인 약쑥 추출물을 유효 성분으로 한 항산화 및 항염증 화장료 조성물에 관한 것으로 DPPH 라디칼 소거능이 우수할 뿐만 아니라, NO 생성 억제 활성이 우수하여 항산화 및 항염증 효과가 탁월한 화장료 조성물이다.

Description

약쑥을 함유한 항산화 및 항염증 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION OF ANTIOXIDANT, ANTI-INFLAMMATORY CONTAINING ARTEMISIA PRINCEPS PAMPANINI}

본 발명은 항산화 및 항염증 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 천연물로부터 유래된 생약 성분인 약쑥 추출물을 유효성분으로 한 항산화 및 항염증 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하며, 내부의 수분 및 유용 성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽기능, 체온조절, 배설 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있는 중요한 기관이다. 이러한 피부의 기능 및 건강과 관련하여 특히 문제가 되는 것이 피부의 노화 및 염증반응이다.

피부의 노화는 지나친 산화의 결과인데, 이는 주로 활성산소에 기인한다. 자유라디칼을 가진 활성산소는 산소호흡을 하는 모든 호기성 생물체의 세포 내에서 호기성 에너지 대사과정 중 자연스럽게 발생하는 생화학적 메커니즘이며, 활성산소에 의한 세포의 상해를 근본적으로 방어할 수 있는 시스템도 구비하고 있다. 그러나 외부환경의 영향에 의해 자체 방어능력을 초월한 과다한 활성산소의 생성은 세포소기관의 산화를 촉진하고, DNA를 변형시켜 피부의 노화를 일으키게 된다. 피부가 자외선에 노출되면 강한 광에너지가 삼중항산소를 유해산소인 일중항산소로 전환시켜 세포를 빠르게 산화시키므로 피부의 급격한 노화를 일으키게 되는 것이다. (윤 선, 곽호경 등, 기능성 식품학, 라이프 사이언스, 2006, pp95-101)

또 다른 문제점인 염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기유발물질)에 감염되었을 때 나타난다. 피부내 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동 및 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열 및 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 피부의 상태가 정상인 경우, 염증 반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복 작용을 한다. 그러나 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증 반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 야기한다.

상기한 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히, 산화질소(nitric oxide: NO)를 발생시키는 효소인 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase: NOS)와 프로스타글란딘의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 상기 산화질소 합성효소나 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 시클로옥시게나제(cyclo-oxygenase: COX)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

최근 상기한 피부노화 및 염증에 효과가 있는 화장료 조성물에 관하여 천연물을 사용한 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행중이다. 등록특허 10-1477126는 정향, 백단향, 감송향, 침향, 귤홍, 회향, 곽향, 백복령, 백급, 백작약, 백과, 백삼, 백질려 및 백렴으로 구성된 천연 생약 성분인 칠향 팔백산을 함유한 미백, 항산화 및 항염 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한 공개특허 10-2018-0122529는 마늘, 생강, 파, 양파 및 미나리의 다섯 가지 조미채소를 발효시킨 항산화 화장료 조성물에 대하여 소개하고 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 천연물 이외에 항산화 및 항염증 효과가 있는 천연물질을 스크리닝하던 중 약쑥의 항산화 및 항염증 효과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

약쑥(Artemisia princeps pampanini)은 쌍덕잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀인 쑥의 별칭이며, 한방에서 약으로 쓰는 쑥을 뜻한다. 약쑥의 잎 및 어린줄기를 말려서 약재로 사용하는데 이를 애엽이라고 하며, 애엽은 지혈 및 진해거담 작용을 하고, 여성의 생리통, 생리불순 및 대하에 효과가 있으며, 습진과 피부가려움증을 개선하는 효과가 있다고 알려져 왔다. 약쑥의 일반성분은 수분 76%, 단백질 4.7%, 지방 1.9%, 조섬유 14.5%이고 특수 성분으로는 알칼로이드, 비타민, 무기질 등이 있으며 특히 필수지방산, 섬유소, 회분량이 많아 체중 조절 식품으로도 유익하다고 보고되었다.

그러나 아직까지 약쑥을 사용한 항산화제 및 항염증제에 대한 연구나 특허는 보고되거나 알려진 바 없다.

대한민국 등록특허공보 제10-1477126호 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0122529호

본 발명은, 약쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증 효과가 있는 화장료 조성물을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 삼는다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 약쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증 화장료 조성물을 과제 해결을 위한 수단으로 제공한다.

상기 화장료 조성물은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼의 소거능에 있어서 IC₅₀ 값이 0.253±0.014 mg/mL 인 것을 특징으로 하고, 0.13 mg/mL의 농도에서 iNOS의 mRNA 발현량이 0.06±0.00이고 COX-2의 mRNA 발현량이 0.25±0.03인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 폴리페놀, 폴라보노이드 함량이 풍부하고 DPPH 라디칼 소거능이 우수하여 탁월한 항산화 효과를 나타낸다. 뿐만 아니라 NO 생성 억제 활성이 우수하여 항염증 효과도 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 약쑥 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 약쑥 추출물의 세포독성 실험결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 약쑥 추출물의 NO 생성 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 약쑥 추출물의 iNOS, COX-2 단백질 발현 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 약쑥 추출물의 Real-time PCR을 이용한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸다.

이하 도면과 실시예를 바탕으로 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 본 발명과 관련하여 특허청구의 범위는 원칙적으로 발명의 상세한 설명과 비교하여 그 기술내용을 동일하게 기재한 경우로 해석되어야 하고, 특별한 사정이 없는 한 축소해석되어서는 아니된다.

본 발명의 약쑥 추출물은 약쑥을 세척하여 분말화한 후, 추출용매에 넣고 교반시킨다음 여과하여 상등액을 농축시켜 제조한다.

상기 추출용매는 물, 헥산, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 추출방법으로는 진탕 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출 용매를 약쑥 분말 중량대비 에 20 내지 50배의 용매를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출온도는 상온 내지 100℃인 바람직하게는 30℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 농축은 진공 감압농축기를 이용하는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정하지 않는다.

실시예 1: 약쑥 추출물의 제조

약쑥(Artemisia princeps pampanini)은 전북 남원시의 재배농가로부터 구입한 약쑥을 증류수에 세척한 후, 분말화하였다. 약쑥 분말 100 g에 75% 에탄올 2 L를 가하고 실온에서 24시간 교반한 후, 감압여과하여 상등액을 감압 농축하였다.

농축물은 동결건조 분말화하여 -80℃에 보관하면서 기능성 평가 시료로 사용하였다.

실시예 2: 약쑥 추출물을 이용한 화장료 조성물의 제조

본 실시예에 따른 조성물은 하기 실험예의 실험 결과에 근거하여, 약쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증 화장료 조성물이다.

상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카,알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 중에서 선택된 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

실험예 1. 항산화 활성 평가

1) 총 페놀 함량 분석

폴린-데니스(Folin-Denis)법을 일부 변형하여 폴리페놀 화합물 함량을 측정하였다. 상기 실시예 1의 방법에 의하여 제조된 약쑥 추출물 0.1 mL에 증류수 6 mL를 가하고 폴린-시오칼토 페놀 시약(folin-ciocalteu's phenol reagent) 0.5 mL를 차례로 가하여 교반한 후, 탄산나트륨(Na₂CO₃₎ 포화용액을 1.5 mL 가하여 충분히 교반하고 실온에서 1시간 방치한 뒤 765 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준물질로 갈산(gallic acid)을 농도별(6.25~100 mg/mL)로 처리하여 얻은 표준검량곡선으로부터 시료 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 산출한다.

그 결과 약쑥에 함유된 총페놀 함량은 60.10±2.02 mg GAE/g이었다. 이를 표 1을 통해 나타내었다.

2) 총 플라보노이드 함량 분석

약쑥 추출물 0.5 mL에 에탄올 1.5 mL, 10% 질산알루미늄 용액 0.1 mL, 1 M 초산칼륨용액 0.1 mL, 증류수 2.8 mL를 가하여 충분히 교반하였다. 각 농도별 표준물질 및 시료의 공시험은 10% 질산알루미늄 용액 대신 증류수 0.1 mL을 가한다. 실온에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 케르세틴(quercetin) 6.25~100 mg/mL을 사용하였다.

그 결과 약쑥에 함유된 총플라보노이드 함량은 16.58±0.44 mg QUE/g임이 확인되었다. 이를 표 1을 통해 나타내었다.

총 페놀 및 총 플라보노이드 함량

소재	총 페놀 (mg GAE*/g)	총 플라보노이드 (mg QUE**/g)
시료	60.10±2.02	16.58±0.44

3) DPPH 라디칼 소거능 평가

Abe 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 농도별 약쑥 추출물 50 μL에 에탄올 100 μL를 혼합한 후, 0.2 mM DPPH 용액 50 μL를 첨가하였다. 실온의 암소에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

그 결과를 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 약쑥 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 활성을 나타나내었는데, DPPH 라디칼이 50% 소거되는 농도인 IC₅₀ 값은 0.253±0.014 mg/mL 임이 확인되었다. 이를 표 2를 통해 나타내었다.

약쑥 추출물의 IC₅₀ value

시료	IC50 value (mg/mL)
약쑥	0.253±0.014
Ascorbic acid (Positive control)	0.017±0.001

실험예 2. 항염증 활성 평가

1) 세포 독성 평가

RAW264.7 대식세포를 10% FBS, 1% 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 2x10⁵ cells/mL로 seeding 후 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂₎ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 실시예 1의 방법에 의하여 제조된 약쑥 추출물을 0.008, 0.016, 0.033, 0.065, 0.13 mg/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 더 배양한 후, 배지를 제거하고 MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 (100μg/mL)을 1mL 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2시간 배양하였다. 마지막으로 배지를 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1mL를 넣은 뒤, 상등액은 570 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 세포의 생존율을 아래의 식에 의하여 계산하여 그 결과를 도 2를 통해 도시하였다.

세포 생존율 계산식

Cell viability (% control)	=	실험군의 흡광도값	×	100
		대조군의 흡광도값

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 약쑥 추출물의 농도가 0.13 mg/mL 이하에서는 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

2) 일산화질소(nitric Oxide, NO) 활성 저해 평가

RAW264.7 대식세포를 24well plate의 각 well에 2x10⁵ cells/mL로 seeding 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 1에 의하여 제조된 약쑥 추출물(0.008, 0.016, 0.033, 0.065, 0.13 mg/mL)과 LPS 100 ng/mL를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포 배양 상등액 100μL를 취해 NO 측정키트(detection kit)를 이용하여 540nm에서 흡광도 값을 측정함으로써 NO의 생성량을 확인하여 그 결과를 도 3을 통해 도시하였다.

도 3에 도시된 바와 같이 본 발명의 약쑥 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO 생성 억제 활성은 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 약쑥 추출물을 0.13 mg/mL 처리시 생성된 NO는 9.11±0.81 μM로 대조군(48.85±2.01 μM)에 비해 80% 이상 감소됨을 확인하였다. 또한 양성대조군인 아스피린(aspirin) 1 mM (0.18 mg/mL)과 거의 유사한 0.13 mg/mL에서의 NO 생성량을 비교해 보았을 때, 약 76%의 저해 활성(37.46±0.55 μM →9.11±0.81 μM)을 나타냄을 확인할 수 있었다.

3) iNOS, COX-2 단백질 발현 확인

RAW264.7 대식세포를 100 mm dish에 2x10⁵ cells/mL로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 1에 의하여 제조된 약쑥 추출물(0.008, 0.016, 0.033, 0.065, 0.13 mg/mL)과 LPS 100ng/mL를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 제거한 후, cell harvest하고 lysis buffer로 용해하여 BCA법으로 단백질을 정량하였다. 추출된 단백질은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)로 전기영동하고 PVDF 멤브레인에 옮겨 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 차폐(blocking)한 후, 각각의 단백질에 대한 1차 항체(antibody)와 5% 탈지유에 넣어 4℃에서 오버나이트(overnight) 반응하였다. 이어서 TBS-T (Tris buffered saline + Tween-20)로 세척한 후 5% 탈지유와 2차 항체를 넣어 3시간 동안 반응시킨다. 반응액은 TBS-T로 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 발색하여 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 4를 통해 도시하였다.

도 4에 도시된 바와 같이 본 발명의 약쑥 추출물의 농도가 증가함에 따라 iNOS, COX-2 단백질의 발현정도가 감소하였다.

4) 실시간(Real-time) PCR (iNOS, COX-2 확인)

RAW264.7 대식세포를 100 mm dish에 2x10⁵ cells/mL로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다. 약쑥 추출물(0.008, 0.016, 0.033, 0.065, 0.13 mg/mL)과 LPS 100 ng/mL를 처리하고 24시간 동안 배양한다. 배양한 세포를 수확(harvest)한 후 RNA 추출 kit를 사용하여 RNA를 분리 후 분광광도계(spectrophotometer)로 RNA를 정량한다. 정량한 RNA를 cDNA kit를 사용하여 cDNA를 합성한 후, 합성된 cDNA를 프라이머로 PCR 반응시킨다. 샘플은 SYBR Green 형광인자를 이용하여 Real-time PCR로 분석하며, β-액틴(actin)을 대조구로 사용하였다.

그 결과 도 5에 도시된 바와 같이 본 발명의 약쑥 추출물의 농도가 증가함에 따라 iNOS, COX-2의 mRNA 발현량이 감소하였다. iNOS의 mRNA 발현량은 0.06±0.00, COX-2의 mRNA 발현량은 0.25±0.03로 확인되었다.

실험예의 결과를 종합해본 결과, 본 발명의 약쑥 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않으며, 약쑥 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO 생성, iNOS 및 COX-2 단백질 발현, iNOS 및 COX-2 mRNA 발현을 억제하고 있음이 확인되었다. 이를 통해 본 발명의 약쑥 추출물은 항산화 및 항염증에 탁월한 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로 화장품에 적용 가능하고, 적절한 담체나 약물전달을 위한 매개체가 개발된다면 의약품, 건강 기능성 식품으로도 제조 가능하다.

Claims (3)

1. 약쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항염증 화장료 조성물
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 DPPH 라디칼의 소거능에 있어서 IC₅₀ 값이 0.253±0.014 mg/mL 인 것을 특징으로 한 항산화 및 항염증 화장료 조성물
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 0.13 mg/mL의 농도에서 iNOS의 mRNA 발현량이 0.06±0.00이고 COX-2의 mRNA 발현량이 0.25±0.03인 것을 특징으로 한 항산화 및 항염증 화장료 조성물

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