KR102311078B1 - 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

작약(Paeonia lactiflora) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
이에 따라, 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다. 또한, 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다. 또한, 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.

Description

작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물 {COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLES CONTAINING CULTURE MEDIUM OF CALLUS FROM Paeonia lactiflora AS AN ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 작약으로부터 캘러스를 유도하고 분리한 다음, 그 캘러스를 배양하는데 사용한 배양액을 유효성분으로 함유하여 노화나 산화적 스트레스로 인하여 발생할 수 있는 피부의 주름을 개선할 수 있는 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 물리적, 화학적인 외부의 자극으로부터 1차적으로 체내를 보호하는 기능을 갖는다. 사람의 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하지방층으로 구성되어 있으며, 피부의 가장 기본적인 역할은 우리 몸으로부터 수분이 증발되는 것을 막아주며 외부로부터 유해성분이 침입하는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 피부는 항상 외부 자극으로부터 노출되어 있기 때문에 다양한 방어 능력을 가지고 있다. 또한, 피부는 아름다움을 나타내는 표정으로써 피부가 건강하고 깨끗함은 곧 사람의 아름다움과 연관되어 있다고 할 수 있다. 최근 들어, 여성 뿐 아니라 남성들도 피부 노화 등 여러 가지 피부 트러블들에 대한 관심이 많아지면서 이와 관련된 제품들이 많이 개발되고 있다.
피부에 존재하는 멜라닌(melanin)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 자외선 등 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 환경에 대한 세포의 생존력과 경쟁력을 높여주는 물질로 알려져 있다. 반면, 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨, 검버섯 등을 생성하고 피부노화를 촉진시키고 피부암 유발과도 관련이 있다고 보고되고 있다.
미용에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 미용의 중심에 있는 피부를 관리하기 위한 다양한 방법이 생겼는데, 특히 우리나라는 하얗고 깨끗한 피부에 대한 선호도가 높은 탓에 미백, 노화방지, 주름개선, 자외선 차단 등 다양한 기능성을 갖는 기능성 화장품에 대한 수요가 증가했다. 이러한 수요에 맞춰 여러 종류의 화장품들이 우후죽순으로 출시되었고, 높은 수준의 판매량을 기록하였다.
한편, 화장품 시장이 커짐에 따라, 경쟁이 과도해지고 가격경쟁력을 높이는 과정에서 화장품에 포함되는 물질이 유전자 변형 물질이거나, 환경호르몬을 포함하는 경우가 있어 오히려 피부나 건강상에 문제가 종종 발생했다. 이에 따라 장기적으로 인체에 유해하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 천연물질 추출물을 주성분으로 하는 기능성 화장품에 대한 기대가 높아지고 있다(특허문헌 1 참조).
다만 천연물로부터 직접 추출하여 이용되는 식물유래 유용성분들은 인체에 사용 시 안정성이 보장된다는 점에서 높은 이점이 있지만, 추출물의 수득율이 낮고, 계절, 장소, 기후 등 재배조건과 부위별 등의 다양한 환경적 요인에 따라 생산성과 효능의 차이가 날 수 있어 안정적인 원료 공급이 어렵다는 단점이 있다.
KR 10-1997-0005272 A1 (1997. 02. 19.)
본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 인체에 대한 안전성이 높은 식물로부터 추출된 물질을 이용하여 피부의 주름을 개선시킬 수 있으면서, 동시에 그 조성물의 일정한 공급과 품질을 함께 유지할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 작약의 세포조직으로부터 유래된 캘러스의 배양액을 이용하여 피부의 주름을 개선할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명에 따른 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 작약 유래 캘러스를 이용함에 따라 인체에 사용했을 경우 독성이 없어 높은 안전성을 담보할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 피부의 주름 형성에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 피부의 주름을 개선하는 효과가 우수하고, 이를 화장수, 수용성 리퀴드, 크림, 젤, 에센스, 에멀젼 등의 화장품에 적용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 작약 유래 캘러스의 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물은 식물을 채집하는 것이 아니라 식물세포 배양을 통해 원료를 취득하므로 원료의 생산성과 효능의 일정성을 유지할 수 있다.
도 1은 작약 캘러스 배양액을 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포증식율 결과를 나타내는 그래프
도 2는 작약 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포증식율 결과를 나타내는 그래프
도 3은 작약 캘러스 배양액을 tBHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 세포생존율 결과를 나타내는 그래프
도 4는 작약 캘러스 배양액을 tBHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-1 활성 결과를 나타내는 그래프
도 5는 작약 캘러스 배양액을 tBHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Elastase억제활성 결과를 나타내는 그래프
도 6은 작약 캘러스 배양액을 tBHP가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Type I procollagen 활성 결과를 나타내는 그래프
도 7은 작약 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 MMP-1 활성 결과를 나타내는 그래프
도 8은 작약 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Elastase억제활성 결과를 나타내는 그래프
도 9는 작약 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 SOD 억제 불활성 결과를 나타내는 그래프
도 10은 작약 캘러스 배양액을 UVB가 처리된 HaCaT 세포에 처리한 뒤 Type I procollagen 활성 결과를 나타내는 그래프
도 11은 피부 측정 장치를 통해 시험참가자들의 눈가주름을 측정한 결과를 나타내는 그래프
도 12는 시험참가자들의 눈가주름 사진
도 13은 피부 측정 장치를 통해 시험참가자들의 팔자주름을 측정한 결과를 나타내는 그래프
도 14는 시험참가자들의 팔자주름 사진
도 15는 시험참가자들의 캘러스 배양액의 효능에 대한 설문 결과
도 16은 시험참가들의 캘러스의 배양액의 유용성에 대한 설문 결과
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1. 작약 식물체 절편 조직배양을 통한 캘러스 취득
작약의 뿌리, 자엽, 하배축 등 조직별 절편 시료를 배양하였다. 배양 개시 약 2주 후부터 절단면에서 팽창이 이루어지면서 황색의 캘러스가 형성되기 시작하였고, 배양 개시 약 4주 후에는 황색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 그 크기가 약 1 mm 정도에 이르렀다.
한편, 식물생장조절제가 작약의 조직별 절편 시료의 조직배양 체계 확립에 미치는 영향을 알아보기 위해 시료를 약 4주간 배양하였다. 배양한 작약 절편 시료로부터 캘러스 형성 효율을 조사한 결과, MS 기본배지에 1 mg/L 2,4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)를 첨가한 처리구에서 작약의 뿌리 절편으로부터 유래된 캘러스의 형성 효율이 가장 높았다. 배양한지 약 6주 후에는 동일 조성의 새로운 배지들로 계대 보존하였고, 4주 주기로 계대 보존을 반복하면서 작약 유래 캘러스의 인공세포주를 확보하였다.
실시예 2. 작약 유래 캘러스 현탁배양
1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지 20 ㎖를 250 ㎖ 크기의 삼각플라스크(erlenmeyer flask)에 넣고, 실시예 1에서 증식된 약 1 g의 작약 유래 캘러스를 배지에 옮겼다.
현탁배양은 gyratory shaker(100 rpm)에서 25 ℃ 온도로 암배양을 실시하였다. 약 2주간 배양한 다음 새로운 액체배지 20 ㎖를 추가하였다. 그로부터 약 4주간 더 배양한 다음, 작약 유래 캘러스의 현탁배양세포와 배양배지 5 ㎖을 20 ㎖의 새로운 액체배지가 있는 다른 삼각플라스크에 옮겨 계대배양을 실시하였다. 새로운 액체배지는 1 mg/L의 2,4-D가 첨가된 MS 액체배지다. 그리고 계대배양은 약 4주 간격으로 실시하였다.
이와 같은 현탁배양은 기내 대량생산을 위한 초기 단계로서 현탁배양 체계를 확립하기 위한 작업이다.
실험예 1. 세포증식(cell proliferation) 평가
아무것도 처리되지 않은 HaCat 세포, UVB가 처리된 HaCat 세포에 작약 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, 세포의 증식 수준을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가됨에 따라 세포증식 비율 역시 증가되는 것을 알 수 있다.
또한, 도 2에 도시된 바와같이 UBV가 처리된 경우, HaCat 세포의 세포증식율이 절반수준으로 감소하였는데, 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가됨에 따라 증가하였고, 특히 0.625㎕/㎖의 농도에서 정상수준으로 회복하는 것을 알 수 있다.
실험예 2. 세포생존율(cell viability) 평가
t-BHP(tert-Butyl hydroperoxide)가 처리된 HaCat 세포에 작약 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, 세포의 생존율을 평가하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 t-BHP가 처리되는 경우 세포생존율이 80% 수준으로 감소하는 것을 알 수 있고, 작약 캘러스 배양액을 처리한 경우 유의적으로 세포생존율이 회복되는지는 알 수 없었다.
실험예 3. 피부노화관련 단백질 발현 평가 1(t-BHP 처리)
t-BHP가 처리된 HaCat 세포에 작약 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, MMP-1, Elastase의 발현 억제여부 및 Type I procollagenase의 발현 촉진여부를 평가하였다.
그 결과, MMP-1의 경우 도 4에 도시된 바와 같이 t-BHP가 처리된 경우 MMP-1의 레벨이 현저하게 상승하였으나, 증가된 농도의 작약 캘러스 배양액을 처리할 수록 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 알 수 있으며, 특히 1.25㎕/㎖ 농도에서 감소폭이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다.
Elastase의 경우 도 5에 도시된 바와 같이 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가함에 따라 억제율이 상승하는 것을 알 수 있으며, 1.25㎕/㎖ 농도에서 억제 상승폭이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다.
Type I procollagenase의 경우 도 6에 도시된 바와 같이 2.5㎕/㎖ 농도에서부터 증가하는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 피부노화관련 단백질 발현 평가 2(UVB 처리)
UVB가 처리된 HaCat 세포에 작약 캘러스 배양액을 농도별로 처리한 다음, MMP-1, Elastase, SOD의 발현 억제여부 및 Type I procollagenase의 발현 촉진여부를 평가하였다.
그 결과, MMP-1의 경우 도 7에 도시된 바와 같이 UVB가 처리된 경우 MMP-1의 레벨이 현저하게 상승하였으나, 증가된 농도의 작약 캘러스 배양액을 처리할 수록 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 알 수 있으며, 특히 4㎕/㎖ 농도에서 감소폭이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다.
Elastase의 경우 도 8에 도시된 바와 같이 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가함에 따라 억제율이 상승하는 것을 알 수 있으며, 2㎕/㎖ 농도에서 억제 상승폭이 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다.
SOD의 경우 도 9에 도시된 바와 같이 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가함에 따라 억제율이 감소되는 것을 알 수 있다.
Type I procollagen의 경우 도 10에 도시된 바와 같이 작약 캘러스 배양액의 농도가 증가함에 따라 그 농도가 증가되는 것을 알 수 있다.
실험예 5. 인체적용시험
1. 시험대상시료
시험군은 중량비 기준으로 아데노신 0.04%, 작약캘러스배양액 96.98%으로 구성되는 혼합물을 시험군으로 사용하였고, 아데노신 0.04%, 정제수 96.98%로 구성되는 혼합물을 대조군으로 사용하였다.
2. 시험 대상자
30세~60세의 여성 20명 이상을 대상으로 피험자의 선정기준에 부합하고 제외기준에 부합하지 않는 피험자를 선정하였다. 선정된 피험자를 대상으로 시험의 목적과 방법 그리고, 기대 효능과 이상반응을 설명하여 참여의사를 보이는 자는 시험 참가 동의서를 작성하고 시험에 참여하도록 하였다.
2-1. 선정기준
① 30~60 세의 성인 여성으로 눈가주름 및 팔자주름을 가진 자
② 피부질환을 포함하는 급, 만성 신체 질환이 없는 건강한 자
③ 시험의 목적, 내용 등에 대해 충분히 설명을 듣고 자발적으로 시험 동의서에 서명한 지원자
④ 시험 기간 동안 추적 관찰이 가능한 자
2-2. 제외기준
① 임신, 수유 중이거나 임신 가능성이 있는 여성
② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1개월 이상 사용하는 경우
③ 동일한 시험에 참가한 뒤 1개월이 경과되지 않는 경우
④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우
⑤ 시험부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상소견이 있는 경우
⑥ 시험시작 3개월 이내에 시험부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우
⑦ 시험부위에 시술(피부 박피술, 보톡스, 기타 피부관리 등)을 받거나 6개월 이내 계획한 경우
⑧ 만성 소모성 질환이 있는 경우(천식, 당뇨, 고혈압 등)
⑨ 아토피 피부염을 가지는 경우
⑩ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우
2-3. 준수사항 및 제한사항
① 시험 제품 도포 후 외출 시 선크림을 반드시 사용하고 가벼운 화장은 허용하였다.
② 시험제품 외에 유사한 효능을 가진 기능성 화장품 혹은 의약품과의 혼용은 금하였다.
③ 피험자는 시험기간 동안 시험제품 이외의 사용하는 기초제품은 변경하지 않았다.
④ 시험제품은 고온 내지 저온의 장소 및 일광이 닿는 곳은 피하여 유, 소아의 손에 닿지 않는 곳에 보관하도록 하였다.
⑤ 피험자는 시험기간 동안 일상 생활에서 보다 많은 수준의 태양광선에의 노출을 피하도록 하였다. 예를 들면 옥외 수영, 스키, 등산 등의 야외 활동을 시험 기간 동안 자제하도록 하였다.
⑥ 피험자는 시험기간 동안 제품의 사용방법과 제한사항을 성실히 이행하며 검사 일정을 준수하도록 하였다.
⑦ 피험자는 시험 기간 중 피험자에게 발생하는 모든 증상을 상세하고 빠짐없이 시험자에게 보고하도록 하였다.
⑧ 피험자는 방문(측정)시에는 색조 화장은 하지 않고 방문하도록 하였다
⑨ 피험자는 방문 시마다 제품사용확인서와 사용중인 시험제품을 시험자에게 제출하도록 하였다.
2-4. 시험중단 및 탈락기준
① 갑작스런 사고, 질환의 병발, 임신 등으로 피험자가 임상시험 동의서를 자발적으로 철회한 경우
② 시험 중 시험물질에 의한 이상반응이 심각한 경우
③ 시험제품을 총 사용횟수의 10% 이상 또는 연속 3일 이상 사용하지 않았거나 프로토콜에 따른 준수사항을 따르지 않은 경우
④ 추적관찰 실패 등 기타 시험자의 판단에 의해 시험수행에 지장이 있다고 생각되는 경우
2-5. 피험자 수에 대한 근거
피험자 수는 시험계획서에 준하여 20명 이상을 선정하여 시험을 시행하였다.
3. 시험 방법
평가는 제품 사용 전과 사용 4주 및 8주 후 시점에서 눈가주름 및 팔자주름 측정, 피험자에 의한 설문평가 및 시험자의 관찰과 문진을 통해 피부 안전성을 평가하였다.
모든 피험자는 방문 시마다 시험부위를 세정한 다음에 항온항습실(22±2℃, 50±5%)에 입실하였으며 20분 동안 안정을 취한 후 시험에 참여하였다.
3-1. 눈가주름 측정
눈가주름은 3차원 피부 측정 장치인 PRIMOS® premium (GFMesstechnik GmbH, Germany)을 이용하여 측정하였다. 이 기기는 Digital Micro mirror Devices (DMD)기술을 이용하여 디지털 stripe 투사를 응용한 비접촉식 기기이다. 각 평가시점마다 촬영된 영상이미지는 매칭(matching) 기능을 이용하여 동일한 부위의 변화를 비교, 측정이 가능하다.
본 시험에서는 제품 사용 전, 사용 4주 및 8주 후 시점에서 눈가 부위를 측정하고 주름파라미터(1, Average depth of wrinkles; 2, Mean depth biggest wrinkle; 3, Max.depth biggest wrinkle; 4, Total wrinkle area; 5, Total wrinkle volume; 6, Total form factor wrinkles; 7, Total lengh of wrinkles; 8, Ra; 9, Ry)를 분석하였다
3-2. 팔자주름 측정
팔자주름은 3차원 피부 측정 장치인 PRIMOS® lite (GFMesstechnik GmbH, Germany)을 이용하여 측정하였다. 이 기기는 Digital Micro mirror Devices (DMD)기술을 이용하여 디지털 stripe 투사를 응용한 비접촉식 기기이다. 각 평가시점마다 촬영된 영상이미지는 매칭(matching) 기능을 이용하여 동일한 부위의 변화를 비교, 측정이 가능하다.
본 시험에서는 제품 사용 전, 사용 4주 및 8주 후 시점에서 팔자주름을 측정하고 주름 파라미터(1, Average depth of wrinkles; 2, Mean depth biggest wrinkle; 3, Max.depth biggest wrinkle; 4, Total wrinkle area; 5, Total wrinkle volume; 6, Total form factor wrinkles; 7, Total lengh of wrinkles; 8, Ra; 9, Ry)를 분석하였다.
3-3. 사진촬영
각 평가 시점에서 안면 피부 촬영장치(VISIA® CR, Canfield, USA)를 이용하여 안면을 촬영하였다.
3-4. 설문평가
제품의 효능에 관한 설문은 제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서 피험자로 하여금 5점 척도(1, 매우 그렇지 않다; 2, 그렇지 않다; 3, 변화 없음; 4, 그렇다; 5, 매우 그렇다)로 설문을 작성하도록 하였다. 또한 제품 사용성에 관한 설문은 제품 사용 8주 후 시점에서 5단계 척도(1, 매우 좋지 않다; 2, 좋지 않은 편이다; 3, 보통이다; 4, 좋은 편이다; 5, 매우 좋다)로 실시하여, 긍정적인 답변(4, 5)을 분석하였다.
3-5. 안전성 평가
제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서 문진과 시험자의 관찰을 통해 주관적 피부 자극감과 객관적 피부 자극을 평가하였다.
4. 통계 분석
모든 데이터는 SPSS Package Program (IBM, USA)을 이용하여 통계적 유의성을 검증하였고, 정규성은 Shapiro-Wilks test 및 첨도(kurtosis)와 왜도(skewness)를 통해 검증하였고(첨도와 왜도의 경우 ±2 이내일 경우 정규성으로 인정), 사전 동질성은 paired t-test를 통해 검증하였다. 시점별 전후 변화를 확인하기 위해 모수일 경우에는 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을 적용하였고, 비모수일 경우에는 Wilcoxon signed rank test (Bonferroni correction)를 적용하였다. 군간비교는 시점별 전후 변화를 확인하기 위해 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을 적용하였다.
모든 데이터의 통계학적 유의수준은 p 값이 0.05 미만으로 설정하였고, 증감률은 아래의 수학식 1에 따라 계산하였다.
Figure 112020028145118-pat00001
5. 시험 결과
5-1. 피험자 정보
본 시험은 제외기준 및 선정기준에 준하는 41세~55세(평균 연령 47.74±4.18세)의 여성 피험자 23명이 참여하여 시험 종료 시까지 전 과정을 성실히 수행하였다. 피험자의 정보는 설문에 의해 조사 되었으며, 분석 결과는 표 1과 같다.
Item Classification Frequency(N) Percentage(%)
피부타입 건성 11 47.83
증성 8 34.78
지성 1 4.35
건지성 3 13.04
문제성피부 0 0.00
수분 촉촉 0 0.00
보통 14 60.87
부족 9 39.13
유분 번들거림 2 8.70
보통 14 60.87
부족 7 30.43
표면상태 부드러움 3 13.04
보통 15 65.22
거침 5 21.74
피부 두께 얇은 편 6 26.09
보통 17 73.91
두꺼운 편 0 0.00
자외선 노출시간 1시간 이내 8 34.78
1~3시간 12 52.17
3시간 이상 3 13.04
수면시간 5시간 이하 1 4.35
5~8시간 21 91.30
8시간 이상 1 4.35
흡연 유무 안핌 23 100.00
10개피 이내 0 0.00
10개피 이상 0 0.00
자극 감수성 예 0 0.00
아니오 23 100.00
따가움 감수성 예 1 4.35
아니오 22 95.65
이상반응 경험 예 0 0.00
아니오 23 100.00
5-2. 눈가주름 분석
분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 시험군의 경우 ‘Average depth of wrinkles’, ‘Mean depth biggest wrinkle’, ‘Max. depth biggest wrinkle’, ‘Total wrinkle volume’ 및 ‘Ra’파라미터가 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Ry’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 4.74% ~ 15.38%였다. 대조군의 경우 ‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 감소율은 5.96%였다(표 2, 도 11, 2 참고).
Item Group Time point N Mean 1 SD p -value 2 Change from baseline(%)
Average
depth of
wrinkles		 Test Baseline 23 43.10 7.11 - -
4 weeks 23 40.74 6.81 0.004* 5.48▼
8 weeks 23 39.82 6.29 0.000* 7.61▼
Control Baseline 23 41.83 8.31 - -
4 weeks 23 41.36 8.17 1.296w 1.12▼
8 weeeks 23 40.20 7.73 0.084w 3.90▼
Mean depth biggest wriknkle Test Baseline 23 62.95 12.70 - -
4 weeks 23 56.18 11.32 0.000* 10.75▼
8 weeks 23 54.82 11.19 0.000* 12.92▼
Control Baseline 23 60.09 16.57 - -
4 weeks 23 59.82 15.61 0.892 0.45▼
8 weeks 23 56.51 14.16 0.028* 5.96▼
Max. depth biggest wriknkle Test Baseline 23 175.45 49.76 - -
4 weeks 23 160.80 58.33 0.041* 8.35▼
8 weeks 23 148.47 37.43 0.001* 15.38▼
Control Baseline 23 165.50 44.98 - -
4 weeks 23 171.28 47.48 0.481 3.49△
8 weeks 23 164.87 53.28 0.942 0.38▼
Total
wrinkle area		 Test Baseline 23 41.63 9.17 - -
4 weeks 23 41.60 9.07 0.536 0.07▼
8 weeks 23 41.88 9.13 0.345 0.60△
Control Baseline 23 42.66 9.05 - -
4 weeks 23 42.65 9.07 1.782 0.02▼
8 weeks 23 42.64 9.05 1.546 0.05▼
Total wrinkle volume Test Baseline 23 1.78 0.45 - -
4 weeks 23 1.68 0.39 0.002* 5.62▼
8 weeks 23 1.66 0.41 0.001* 6.74▼
Control Baseline 23 1.78 0.33 - -
4 weeks 23 1.71 0.32 0.314w 3.93▼
8 weeks 23 1.68 0.34 0.102w 5.62▼
Total form factor wrinkles Test Baseline 23 1.04 0.05 - -
4 weeks 23 1.06 0.07 0.103 1.92△
8 weeks 23 1.05 0.05 0.162 0.96△
Control Baseline 23 1.03 0.05 - -
4 weeks 23 1.03 0.05 1.000 0.00(-)
8 weeks 23 1.04 0.05 0.426 0.97△
Total length of wrinkles Test Baseline 23 101.48 28.46 - -
4 weeks 23 101.30 27.51 0.926 0.18▼
8 weeks 23 102.35 28.22 0.635 0.86△
Control Baseline 23 108.04 28.40 - -
4 weeks 23 105.35 30.25 0.203 2.49▼
8 weeks 23 105.13 29.32 0.170 2.69▼
Ra Test Baseline 23 22.13 3.59 - -
4 weeks 23 21.08 3.41 0.007* 4.74▼
8 weeks 23 20.78 3.18 0.001* 6.10▼
Control Baseline 23 21.57 3.71 - -
4 weeks 23 21.47 3.87 1.670w 0.46▼
8 weeks 23 20.89 3.63 0.092w 3.15▼
Ry Test Baseline 23 340.18 71.84 - -
4 weeks 23 325.23 79.57 0.071 4.39▼
8 weeks 23 299.51 52.95 0.001* 11.96▼
Control Baseline 23 337.51 68.59 - -
4 weeks 23 331.63 60.17 0.570 1.74▼
8 weeks 23 319.45 71.96 0.158 5.35▼
1 Decrement of the mean value represents improvement of crow’s feet (▼).
2 Significantly different at *p<0.05 compared with baseline
W Wilcoxon signed rank test (Bonferroni correction)
군간 비교 시,‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Max. depth biggest wrinkle’ 파라미터가 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05, 표 3, 도 11, 2 참고).
Group Item p -value
4 weeks 8 weeks
Test
vs.
Control		 Average depth of wrinkles 0.217 0.826
Mean depth biggest wrinkle 0.002* 0.040*
Max. depth biggest wrinkle 0.077 0.006*
Total wrinkle area 0.781 0.307
Total wrinkle volum 0.392 0.625
Total form factor wrinkles 0.213 1.000
Total length of wrinkles 0.292 0.100
Ra 0.064 0.166
Ry 0.417 0.145
* Significantly different at p<0.05 compared with control group
5-3. 팔자주름 분석
분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 시험군의 경우 ‘Average depth of wrinkles’, ‘Mean depth biggest wrinkle’ 및 ‘Ra’ 파라미터가 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Max. depth biggest wrinkle’ 및 ‘Total form factor wrinkles’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 7.04%~11.73%였다. 대조군의 경우 ‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 감소율은 6.37%였다(표 4, 도 13, 4 참고).
Item Group Time point N Mean 1 SD p -value 2 Change from baseline(%)
Average
depth of
wrinkles		 Test Baseline 23 102.01 28.40 - -
4 weeks 23 93.07 28.98 0.004* 8.76▼
8 weeks 23 90.57 22.34 0.002* 11.21▼
Control Baseline 23 102.15 31.14 - -
4 weeks 23 96.77 30.22 0.070w 5.27▼
8 weeeks 23 96.18 28.23 0.058w 5.84▼
Mean depth biggest wriknkle Test Baseline 23 110.37 29.73 - -
4 weeks 23 102.17 31.07 0.013* 7.43▼
8 weeks 23 97.83 24.44 0.002* 11.36▼
Control Baseline 23 109.93 33.83 - -
4 weeks 23 106.53 33.22 0.496w 3.09▼
8 weeks 23 102.93 29.17 0.026*w 6.37▼
Max. depth biggest wriknkle Test Baseline 23 256.74 63.07 - -
4 weeks 23 242.50 68.65 0.155 5.55▼
8 weeks 23 226.63 52.58 0.006* 11.73▼
Control Baseline 23 250.43 71.60 - -
4 weeks 23 245.86 63.72 0.497 1.82▼
8 weeks 23 239.46 68.87 0.066 4.38▼
Total wrinkle area Test Baseline 23 34.54 10.73 - -
4 weeks 23 35.13 10.99 0.349 1.71△
8 weeks 23 35.99 11.02 0.119 4.20△
Control Baseline 23 31.62 9.84 - -
4 weeks 23 32.36 10.65 0.290 2.34△
8 weeks 23 33.70 11.08 0.058 6.58△
Total wrinkle volume Test Baseline 23 3.39 1.15 - -
4 weeks 23 3.14 1.18 0.112 7.37▼
8 weeks 23 3.20 1.16 0.161 5.60▼
Control Baseline 23 3.23 1.38 - -
4 weeks 23 3.08 1.26 0.194 4.64▼
8 weeks 23 3.21 1.37 0.908 0.62▼
Total form factor wrinkles Test Baseline 23 1.42 0.28 - -
4 weeks 23 1.35 0.24 0.143 4.93▼
8 weeks 23 1.32 0.21 0.025* 7.04▼
Control Baseline 23 1.36 0.23 - -
4 weeks 23 1.39 0.27 0.389 2.21△
8 weeks 23 1.47 0.32 0.028* 8.09△
Total length of wrinkles Test Baseline 23 50.57 18.91 - -
4 weeks 23 52.65 20.67 0.065 4.11△
8 weeks 23 53.26 20.59 0.063 5.32△
Control Baseline 23 47.26 20.71 - -
4 weeks 23 47.57 17.88 0.769 0.66△
8 weeks 23 49.39 19.39 0.055 4.51△
Ra Test Baseline 23 43.43 9.58 - -
4 weeks 23 40.21 9.59 0.013* 7.41▼
8 weeks 23 39.94 7.30 0.007* 8.04▼
Control Baseline 23 43.40 11.91 - -
4 weeks 23 41.38 11.09 0.079 4.65▼
8 weeks 23 42.10 11.91 0.355 3.00▼
Ry Test Baseline 23 454.46 87.43 - -
4 weeks 23 432.15 89.21 0.133 4.91▼
8 weeks 23 428.04 71.58 0.063 5.81▼
Control Baseline 23 479.22 115.15 - -
4 weeks 23 456.04 119.90 0.126 4.84▼
8 weeks 23 461.03 111.37 0.143 3.80▼
1 Decrement of the mean value represents improvement of nasolabial fold (▼).
2 Significantly different at *p<0.05 compared with baseline
W Wilcoxon signed rank test (Bonferroni correction)
군간 비교 시,‘Max. depth biggest wrinkle’ 및 ‘Total form factor wrinkles’ 파라미터가 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05, 표 5, 도 13, 4 참고).
Group Item p -value
4 weeks 8 weeks
Test
vs.
Control		 Average depth of wrinkles 0.217 0.826
Mean depth biggest wrinkle 0.002* 0.040*
Max. depth biggest wrinkle 0.077 0.006*
Total wrinkle area 0.781 0.307
Total wrinkle volum 0.392 0.625
Total form factor wrinkles 0.213 1.000
Total length of wrinkles 0.292 0.100
Ra 0.064 0.166
Ry 0.417 0.145
* Significantly different at p<0.05 compared with control group
5-4. 설문평가 분석
(1) 효능에 관한 설문평가
효능에 관한 설문평가 결과, 시험군의 경우 제품 사용 4주 후 시점에서 ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 부드러워짐’, ‘피부결 매끄러워짐’ 및 ‘전반적인 피부상태 개선’ 항목에 대하여 피험자의 약 61% ~ 87%가, 대조군의 경우 ‘피부결 매끄러워짐’ 항목에 대하여 피험자의 약 57%가 긍정적으로 응답하였으며, 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군 및 대조군 모두 ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 부드러워짐’, ‘피부결 매끄러워짐’ 및 ‘전반적인 피부 상태 개선’ 항목에 대하여 피험자의 약 52%~87%가 긍정적으로 응답하였다(표 6, 도 15 참고).
Item After 4 weeks After 8 weeks
Test Control Test Control
N % N % N % N %
피부 촉촉해짐 14 60.87 10 43.48 19 82.61 12 52.17
피부 부드러워짐 19 82.61 11 47.83 19 82.61 16 69.57
눈가주름 감소 6 26.09 6 26.09 9 39.13 4 17.39
팔자주름 감소 4 17.39 3 13.04 7 30.43 4 17.39
피부결 매끄러워짐 20 86.96 13 56.52 20 86.96 17 73.91
전반적인 피부 상태 개선 16 69.57 10 43.48 18 78.26 15 65.22
1N: The number of positive answers (4, agree; ~ 5, strongly agree)
2%: The number of positive answers / Total number of subjects (23) × 100
(2) 사용성에 관한 설문평가
사용성에 관한 설문평가 결과, 시험제품의 경우 ‘발림성’, ‘흡수력’ 및 ‘만족도’ 항목에서 피험자의 약 57%~83%가, 대조제품의 경우 ‘색’, ‘발림성’, ‘흡수력’ 및 ‘만족도’ 항목에서 피험자의 약 52% ~ 74%가 긍정적으로 응답하였다(표 7, 도 16 참고).
Item Test Control
Frequency(N) 1 Percentage(%) Frequency(N) Percentage(%) 2
색 11 47.83 12 52.17
향 3 13.04 11 47.83
발림성 15 65.22 13 56.52
흡수력 19 82.61 17 73.91
만족도 13 56.52 14 60.87
5-5. 안정성 평가
본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 이상반응은 관찰되지 않았다.
위 시험결과에 대하여 종합하여 설명한다.
(1) 눈가주름 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 시험군의 경우 ‘Average depth of wrinkles’, ‘Mean depth biggest wrinkle’, ‘Max. depth biggest wrinkle’, ‘Total wrinkle volume’ 및 ‘Ra’ 파라미터가 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Ry’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 4.74%~15.38%였다. 대조군의 경우 ‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 감소율은 5.96%였다.
군간 비교 시, ‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Max. depth biggest wrinkle’ 파라미터가 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05).
(2) 팔자주름 분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 시험군의 경우 ‘Average depth of wrinkles’, ‘Mean depth biggest wrinkle’ 및 ‘Ra’ 파라미터가 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Max. depth biggest wrinkle’ 및 ‘Total form factor wrinkles’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였고(p<0.05), 감소율은 7.04%~11.73%였다. 대조군의 경우 ‘Mean depth biggest wrinkle’ 파라미터가 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 감소율은 6.37%였다.
군간 비교 시,‘Max.depth biggest wrinkle’ 및 ‘Total form factor wrinkles’ 파라미터가 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05).
(3) 효능에 관한 설문평가 결과, 시험군의 경우 제품 사용 4주 후 시점에서 ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 부드러워짐’, ‘피부결 매끄러워짐’ 및 ‘전반적인 피부상태 개선’ 항목에 대하여 피험자의 약 61%~87%가, 대조군의 경우 ‘피부결 매끄러워짐’ 항목에 대하여 피험자의 약 57%가 긍정적으로 응답하였으며, 제품 사용 8주 후 시점에서 시험군 및 대조군 모두 ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 부드러워짐’, ‘피부결 매끄러워짐’ 및 ‘전반적인 피부 상태 개선’ 항목에 대하여 피험자의 약 52%~87%가 긍정적으로 응답하였다.
(4) 사용성에 관한 설문평가 결과, 시험제품의 경우 ‘발림성’, ‘흡수력’ 및 ‘만족도’ 항목에서 피험자의 약 57%~83%가, 대조제품의 경우 ‘색’, ‘발림성’, ‘흡수력’ 및 ‘만족도’ 항목에서 피험자의 약 52%~74%가 긍정적으로 응답하였다.
(5) 본 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.

Claims (4)

  1. 작약(Paeonia lactiflora) 뿌리 조직의 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하고, 배지는 MS액체배지에 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid가 첨가된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 작약(Paeonia lactiflora) 유래 캘러스(callus) 배양액을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법으로서,
    작약 뿌리 조직을 배지에서 배양하는 단계;
    상기 배양된 작약 뿌리 조직에서 형성되는 캘러스를 분리하는 단계;
    상기 분리된 캘러스를 새로운 배지에 옮긴 뒤 배양하는 단계; 및
    상기 캘러스를 배양한 뒤 새로운 배지에 계대배양하는 작업을 반복하는 단계;를 포함하고,
    상기 배지들은 MS액체배지에 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid가 첨가된 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
  4. 삭제
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