CN102149398A - 雪片莲属鳞茎提取物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及雪片莲属提取物，尤其涉及有效地抑制肌肉细胞或肌肉组织的收缩且有效地作为抗氧化剂的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，包含该提取物的组合物以及其用于抑制肌肉收缩尤其是皮肤肌肉收缩来有效治疗和预防皮肤的皱纹、细纹和氧化损害的用途。

Description

雪片莲属鳞茎提取物及其用途
发明领域
本发明涉及雪片莲属提取物(Leucojum extract)，尤其涉及有效抑制肌肉细胞或肌肉组织的收缩且作为抗氧化剂的雪片莲属鳞茎(Leucojum bulb)的含水的提取物，包含该提取物的组合物以及其作为肌肉松弛剂尤其是作为皮肤肌肉的松弛剂来有效治疗和预防皮肤的皱纹、细纹和氧化损害的用途。
发明背景
皮肤主要由表皮和真皮组成。在这些层之下是下皮，通常并不将下皮分类为皮肤层。下皮通常也被称为皮下脂肪层或皮下组织。最外面的表皮由分层的扁平上皮与下面的基底膜构成。该表皮不包含血管，且通过从真皮扩散供给营养。表皮主要包括角质形成细胞，且还存在黑素细胞和郎格汉斯细胞。此皮肤层在身体与外部环境之间起到屏障的作用，保持身体内的水分并防止有害的化学品和病原体渗透。
真皮位于表皮之下且包含许多结构，包括血管、神经、毛囊、平滑肌、腺和淋巴组织。真皮(dermis)(或真皮(corium))通常厚3-5mm且是人类皮肤的主要部分。真皮包括结缔组织的网络，主要是提供支撑的胶原原纤维和提供柔性的弹性组织。构成真皮的主要的细胞类型是成纤维细胞、脂肪细胞(脂肪储存)和巨噬细胞。下皮位于真皮之下。下皮的用途是将皮肤连接到下面的骨骼和肌肉以及为皮肤提供血管和神经。下皮由松弛的结缔组织和弹性蛋白构成。下皮主要由成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞组成，脂肪细胞在下皮的脂肪储存功能方面起着主要的作用。脂肪用作填充物质且作为身体与外部环境的隔离物。
由于若干种因素发生了面部老化，这些因素中有皮肤内的固有变化、重力影响、导致动态纹形成的面部肌肉活动、软组织损失或偏移、骨质疏松、组织弹性的丧失和暴露于苛刻的环境条件，尤其是日光或紫外线照射以及污染。当表皮开始变薄时，皮肤老化，这造成与真皮的接合处变平。随着人老化，胶原减少且胶原束(其产生皮肤膨压)变松并损失强度。当皮肤损失弹性时，其抗拉伸的能力变弱。加上重力、肌肉牵拉和组织变化，皮肤开始起皱纹。水分损失和细胞之间的键断裂也减弱了皮肤的屏障作用，这可能造成皮肤的孔径增大。
由于疾病、老化和外部侵袭而在身体细胞内产生了增加量的活性氧(ROS)。皮肤尤其易受活性氧的损害，这促使皮肤呈不期望的老相的外观。因此，抗氧化剂通常用于皮肤护理。
目前流行用肉毒杆菌毒素(也已知商品名，BOTOXAllergan，Irvine，Calif.)治疗皱纹和细纹，但其开始用于治疗痉挛。此毒素通过特别抑制神经细胞内的神经传递，尤其是抑制乙酰胆碱的释放来对肌肉痉挛状态起作用，由此造成收缩的肌肉松弛(如，美国专利第6,395,277号；第6,939,852号；和第7,384,918号)。当皮下注射肉毒杆菌毒素时，其还对眉间皱纹(眉毛之间的皱纹)起作用。然而，目前还不清楚与长期使用肉毒杆菌毒素和包含此物质的产品或治疗有关的最大程度的副作用，且在某些条件下的使用甚至可能造成死亡。毒素杆菌毒素治疗伴有许多副作用，包括短暂性疲劳、吞咽困难、颈部虚弱、声嘶和局部疼痛。此外，许多开始对肉毒杆菌毒素有反应的患者随后变得对该治疗无反应了。
已经提出使用呈印度金钮扣提取物(Acmella oleracea extract)形式的金钮扣醇作为皮下肌肉收缩，主要是面部皮下肌肉收缩的抑制剂，且因而被提出作为具有类似肉毒杆菌活性同时无毒性的抗皱产品(美国专利申请公布第2008/0069912号)。
雪片莲属植物，也称为“雪片”，是属于石蒜科的球根植物。目前被归为雪片莲属中的仅有的物种是雪片莲(Leucojum vernum)(春天雪片(Spring Snowflake))和夏雪片莲(Leucojum aestivum)(夏天雪片(Summer Snowflake))。
已知夏雪片莲的整株植物提取物包含活性成分雪花莲胺，其具有不同的活性。已经公开了用于从雪片莲属植物的包括鳞茎的不同部位的提取物纯化雪花莲胺的方法(例如，美国专利第6,573,376号和第6,617,452号；美国专利申请公布第2009/0216012号)。
美国专利第6,117,428号公开了用于保护叶子免于被反刍动物如鹿吃的反刍动物驱除剂组合物，该反刍动物驱除剂组合物包含石蒜科尤其是夏雪片莲中存在的化合物。
美国专利第6,159,476号公开了通过施用包括雪花莲胺的膳食补充剂或药草组合物，尤其是包括夏雪片莲的整株植物提取物的组合物来改善运动员的肌肉性能。
美国专利第7,029,708号公开了通过施用药草组合物，尤其是夏雪片莲的药草提取物来改善女性的与雌激素缺乏相关的神经变性和认知功能障碍，其中药草提取物的活性成分是雪花莲胺。
雪花莲胺还用于治疗神经系统的各种疾病，包括阿尔茨海默氏疾病(美国专利第5,958,903号)和帕金森疾病(美国专利第5,965,571号)。雪花莲胺的该作用归因于其作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性。
本发明的一些发明人先前公开了(美国专利申请公布第2006/0160702号)源于植物的抗增殖剂，其中该剂能够诱导植物器官处于休眠状态或使器官保持休眠状态。该发明还公开了包括抗增殖剂的组合物和所述组合物抑制植物或哺乳动物组织内不期望的或有害的细胞增殖的用途。显示了来自体眠的雪片莲属鳞茎的抗增殖性提取物以及其他的。
美国专利申请公布第2008/0254055号在许多其他活性成分的清单中指出了夏雪片莲的提取物作为皮肤护理活性成分，没有提供此提取物的活性和/或功效的任何描述。
有效增强肌肉松弛的天然植物提取物在化妆品和药物行业内是高度期望的。具体而言，需要有效作为皮肤肌肉和皮下肌肉的松弛剂来治疗和预防诸如皱纹和细纹的老化的和饱经风霜的皮肤的可见体征的无毒性物质。
发明概述
本发明提供了有效抑制肌肉细胞的收缩，尤其是皮肤肌肉细胞和皮下肌肉细胞的收缩的植物源提取物。因而，这些提取物有效地治疗、减轻、缓解和/或消除皮肤老化的体征，尤其是皱纹和细纹，和/或改善皮肤的美观。
本发明部分基于下述出人意料的发现：石蒜科植物雪片莲属的鳞茎，尤其是夏雪片莲的鳞茎的含水的提取物有效地抑制或阻止了肌肉收缩。如上所述，目前已知雪片莲属提取物具有高含量的雪花莲胺，雪花莲胺是一种乙酰胆碱酯酶的抑制剂。没有背景技术公开或表明雪片莲属鳞茎的含水的提取物有效地抑制肌肉收缩，且因而有效地治疗和预防皱纹。出人意料地，不依赖鳞茎休眠期而获得了肌肉松弛活性。
本发明的提取物是基本上无细胞毒素的。因而，本发明的提取物可以替代，尤其是替代BOTOX
Figure BPA00001329776400041
因为，像BOTOX一样，该提取物显示出肌肉收缩抑制活性，但无肉毒杆菌毒性。
而且，本发明现在公开了此提取物有利于酶锰-超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达，其是在清除超氧自由基方面具有关键作用的抗氧化剂酶。由于本发明的提取物不仅是无细胞毒素的，而且他们还显示出抗氧化活性，且因而可以进一步保护皮肤避免老化，因此该提取物比先前已知的具有肌肉收缩抑制活性的化合物有优势。
因而，根据一个方面，本发明提供了一种用于抑制肌肉收缩或使皮肤组织松弛的方法，该方法包括将包括有效量的夏雪片莲鳞茎的含水的提取物的组合物施用至需要其的受试者。
根据某些实施方案，提取物是独立于鳞茎休眠状态获得的。
根据某些实施方案，以有效地缓解、减轻和/或消除皮肤皱纹、细纹、褶皱(crease)、皱眉纹或皮肤病学老化的其他体征、或皮肤光照(photoexposure of skin)中的至少一种的量施用含水的提取物。此量还有效地保护皮肤避免受到氧化损害。
根据某些实施方案，含水的提取物呈其液体形式。根据其他实施方案，提取物被干燥成粉末形式。
根据这些实施方案，当提取物呈液体形式时，组合物包括约0.01％到约99.9％(w/w)，通常约0.01％到约30％(w/w)，更通常约0.1％到约10％(w/w)的浓度的雪片莲属鳞茎提取物。当所述提取物呈干燥粉形式时，组合物包括约0.0001％到约0.99％(w/w)，通常约0.0001％到约0.3％(w/w)，更通常约0.01％到约0.1％(w/w)的干提取物。
应理解，正如本文中使用的，术语治疗(treating)和治疗(treatment)包括且包含减轻、缓解、改善、减缓和/或消除老化的皮肤病学效果和氧化损害，且特别是关于皮肤的皱纹、细纹、褶、皱褶(furrow)、褶皱以及类似的。本发明还包括治疗(如上定义的)在嘴的任一侧上延伸的“木偶”纹，以及前额上的纹和眉毛之间的垂直纹。
根据某些实施方案，施用至受试者的组合物是还包括化妆品上有效的稀释剂或载体的化妆品组合物。
根据另外的实施方案，组合物还包括用于化妆品和皮肤病学领域的添加剂，包括但不限于，脂肪、乳化剂和辅助乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、填料、亲水性和亲脂性滤料、染料、中和剂、渗透增强剂和聚合物。具体地，组合物还可以包括甘油、氯苯甘油醚、苯氧乙醇和山梨酸钾中的至少一种。这些不同添加剂的量是化妆品和皮肤病学制剂中通常使用的量，正如本领域的技术人员已知的。
根据另外的实施方案，组合物包括另外的活性成分，其选自由脱色剂、湿润剂、抗皮脂溢剂、抗痤疮剂、角质层分离剂和/或剥离溶解剂、抗刺激剂、安抚剂以及另外的抗老化活性成分如视黄醇和其他抗皱剂组成的组。
根据某些实施方案，局部施用组合物。可以使用任何局部制剂，正如本领域已知的，只要制剂保持提取物活性和无刺激性的特征。根据某些实施方案，以选自由水溶液、乳膏、洗液、包括油包水乳液或水包油乳液的乳液、多重乳液、有机硅乳液、微乳液或纳米乳液、凝胶、浆液和乳剂组成的组的形式施用组合物。
根据另外的实施方案，通过使用靶向递送系统来局部施用组合物，使得活性成分可以更容易地到达并影响如面或颈的施用区域的肌肉层，靶向递送系统如脂质体、微球、透皮贴剂、微注射和纳米注射、无针注射以及类似的。
根据另外的实施方案，可以通过直接应用来施用包括提取物的组合物以将活性剂沉积到需要肌肉松弛或去收缩的部位处，组合物包括脂质体制剂、微注射和纳米注射、无针注射或递送系统，直接应用包括皮下注射、皮内注射或通过离子电渗疗法。
根据某些实施方案，施用组合物达有效缓解、减轻和/或消除皱纹和/或细纹褶皱、皱眉纹或皮肤病学老化的其他体征、或皮肤光照的时段。根据典型的实施方案，施用组合物至少一天一次。根据其他典型的实施方案，施用组合物每天两次持续至少7天的时间，通常持续30天。
根据另一个方面，本发明提供了非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，其中该提取物有效地抑制肌肉细胞的收缩活性。
根据某些实施方案，本发明提供了呈液体形式的非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物。根据其他实施方案，提取物呈干粉末形式。
根据进一步的方面，本发明提供了包括作为活性成分的非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物的化妆品组合物，还包括化妆品上有效的稀释剂或载体。
根据还另外的实施方案，本发明的化妆品组合物用于治疗皮肤的皱纹和/或细纹和/或褶皱。
根据另外的实施方案，化妆品组合物用于治疗和/或预防氧化损害。
根据某些实施方案，当提取物呈液体形式时，化妆品组合物包括约0.01％到约99.9％(w/w)，通常约0.01％到约30％(w/w)，更通常约0.1％到约10％(w/w)的提取物。根据其他实施方案，当所述提取物呈干燥粉形式时，组合物包括约0.0001％到约0.99％(w/w)，通常约0.0001％到约0.3％(w/w)，更通常约0.01％到约0.1％(w/w)的提取物。
根据某些实施方案，本发明的组合物被配制用于局部应用。可以使用如本领域已知的和如上文描述的适于局部应用的任何制剂。
根据另外的实施方案，组合物被配制用于直接应用，直接应用包括皮下注射、皮内注射或通过离子电渗疗法。根据另外的实施方案，组合物被配制用于透皮应用。
虽然本发明的组合物和方法主要设计用于治疗面部皮肤，但是他们还适用于治疗(如上所定义的)身体的许多区域的皮肤的皮肤病学病症，包括但不限于，颈、臂、手、腿、膝盖以及类似区域。
根据某些实施方案，本发明的组合物和方法可以通过治疗皮肤病学老化来改善皮肤的美观，治疗包括预防、缓解和/或减轻，皮肤病学老化包括年代老化、光老化或荷尔蒙老化。该改善优选源于局部应用包含本文所述的夏雪片莲提取物的产品或制剂之后的结果。
从下面的描述和附图，本发明的其他目的、特征和优势将变得明显。
附图简述
图1显示了1.5％的夏雪片莲提取物在肌肉-神经共培养物中对肌肉收缩的影响。
图2和图3分别显示了在用产品“T”(包括2％夏雪片莲提取物的组合物)治疗后的第8号和第4号受试者的皮肤表面的2维图像。图2A-3A：在治疗前(第0天)。图2B-3B：治疗后(第28天)。
图4显示了在用产品“T”(包括2％夏雪片莲提取物的组合物)治疗后的第8号受试者的皮肤的3维图像的示例。图4A：在治疗前(第0天)。图4B：治疗后(第28天)。
图5显示了与对照(仅含安慰剂的组合物)相比，产品“T”(包括2％夏雪片莲提取物的组合物)对微起伏皱褶和中等深度的皱纹的总体影响。
发明详述
本发明提供了包括雪片莲属鳞茎的含水的提取物的组合物，提取物显示出有效地抑制肌肉收缩和有效地作为抗氧化剂。本发明现在表明，所述提取物通过它们对肌肉收缩的抑制作用和它们的抗氧化活性来有效地治疗，包括预防、减轻、缓解和/或消除，皮肤的皮肤病学老化的体征，皮肤病学老化的体征包括皱纹、细纹和皮肤病学老化的其他体征(即，内在老化)或皮肤的日光照射(即，外在老化)。
本发明的提取物调节肌肉收缩，以便松弛皮肤或皮下肌肉和/或神经组织中的肌肉纤维，这减少了皱纹以及细纹、褶、皱褶以及类似的。通过松弛或预防诸如面部或手、足等的区域内的皮肤或皮下的肌肉细胞的收缩或过度收缩，雪片莲属提取物和包含其的组合物可以有效地使那些区域内的皮肤形貌平滑，在那些区域内肌肉收缩参与形成皱纹或类似物。因而，由于肌肉和肌肉细胞收缩性与皱纹、细纹等的形成有关，所以通过本发明的组合物对皮肤或皮下的肌肉组织的收缩性的松弛或去收缩可以起到使收缩的肌肉组织放松或松弛且减缓、减轻、缓解、抑制或根除皱纹和细纹的作用。提取物的抗氧化特性还有助于消除老化的可见的皮肤病学效果。
根据一个方面，本发明提供了一种用于抑制肌肉收缩或使皮肤组织松弛的方法，该方法包括将包括有效量的夏雪片莲鳞茎的含水的提取物的组合物施用至需要其的受试者。
根据某些实施方案，鳞茎可以处于休眠状态或非休眠状态。
本发明的夏雪片莲鳞茎提取物以作为肌肉收缩活性的抑制剂为特征。此效果是高度出乎意料的，因为先前描述的夏雪片莲的整株植物提取物显示出增大了肌肉质量，且因而增强了肌肉纤维收缩的有效性(如，美国专利第6,159,476号)。应注意，本发明的雪片莲属鳞茎提取物被局部施用，而在使用雪片莲属提取物的目前已知的方法中，提取物被口服施用。
正如本文中使用的，术语“局部施用(topical administration)”或“局部施用(administered topically)”是指将雪片莲属提取物或包括其的组合物应用至身体的局部区域或身体部位的表面。因而，这些术语包括局部施用至皮肤的表面以及使用靶向递送系统局部施用至靶肌肉层，靶向递送系统包括但不限于，脂质体、微球、透皮贴剂、微注射和纳米注射以及无针注射。全身施用途径诸如口服和静脉内施用途径被排除在本发明的范围之外。
出人意料地，由休眠的或非休眠的夏雪片莲鳞茎获得的提取物之间的肌肉收缩抑制活性不存在明显的差异，这表明此活性与本发明的一些发明人先前公开的由休眠的鳞茎获得的提取物的抗增殖活性无关。
此外，本发明的粗雪片莲属提取物被发现基本上无雪花莲胺。
根据某些实施方案，本发明的方法和组合物用于治疗面部皮肤。根据其他实施方案，身体的多个区域的皮肤可以被有效地治疗，包括颈、臂、腿、手、足、躯干(胸)、背以及类似区域。
本发明的组合物和方法通过治疗下述中的至少一种而改善了皮肤的美观：皮肤病学老化尤其是年代老化、光老化或荷尔蒙老化的体征，或外在老化的体征，诸如日光照射。具体地，皮肤美观的改善包括下述中的至少一种：使面部细纹看起来不那么明显；使面部细纹和/或皱纹感觉饱满；改善眶下细纹和/或眶周细纹的外观；改善鱼尾纹的外观；减轻和/或消除皱纹的出现，尤其是面颊、前额上(如，眼睛之间的垂直皱纹、眼睛上方的水平皱纹)和/或嘴周围(如，木偶纹)的面部皱纹以及深的皱纹、褶或褶皱；减轻和/或消除细纹和/或深纹、褶和褶皱；以及使皮肤平滑，例如至皱纹/细纹被减少的程度。
根据某些实施方案，本发明的提取物由雪片莲属的鳞茎产生。根据本发明的某些方面，从夏雪片莲鳞茎进行提取，独立于鳞茎休眠状态。冲洗鳞茎并对其进行剥皮，在纯水中粉碎剥了皮的鳞茎，直到形成均匀的浆液。将活性成分提取到水溶液中，同时搅拌浆液，且然后通过倾析从浆液中去除粗固体。通过将悬浮液加热至70℃-130℃之间的温度并然后离心来去除细固体和蛋白。在水和/或甘油中根据干重稀释所获得的提取物，并过滤。
根据某些实施方案，提取物的干重在约7mg/g至约15mg/g的范围内。
收缩的肌肉细胞或组织与皱纹、细纹等的形成有关。收缩的肌肉的松弛或去收缩起到使皮肤的形貌或微起伏平滑的作用，由此对由皮肤内的收缩的肌肉组织导致的皱纹和细纹形成的缓解、减轻和/或根除产生影响。
本发明的组合物可以以本领域技术人员已知的任何化妆品上和/或皮肤病学上合适的形式被配制。根据某些实施方案，制剂可以呈洗液、凝胶或乳膏的形式、呈软膏或油基质的形式，以及呈可喷射的液体形式。用于本发明组合物的其他合适的化妆品产品形式包括，如乳液、摩丝、唇膏、唇彩、洗液、面膜、软膏、润发膏、溶液、浆液或喷剂。在一些实施方案中，组合物被结合到或混合到透皮贴剂或诸如微注射和纳米注射以及无针注射的其他递送系统中。
除了作为活性剂的雪片莲属鳞茎提取物外，正如本文描述的，本发明的组合物还可以包含合适的药学上或化妆品上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，包括有利于活性化合物处理成可以在药学上或化妆品上使用的制剂的助剂。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿的药物科学)(Mack Publishing Co.；Easton，Pa)的最新版中提供了有关配制和施用技术的进一步的细节。本发明的包含雪片莲属鳞茎提取物的组合物可以按照本领域已知的方式制成，如通过常规的混合、溶解、粒化、制糖衣(dragee-making)、水磨、乳化、胶囊化、包封或冻干工艺。
根据某些实施方案，本发明的组合物还包括一种或多种化妆品上相容的或药学上可接受的添加剂以及其他植物性药材，所述添加剂包括但不限于脂肪、乳化剂和辅助乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝剂、着色剂、芳香剂、软化剂、湿润剂、防腐剂、维生素、螯合剂、增稠剂、填料、溶剂、亲水性和亲脂性滤料、染料、中和剂、渗透增强剂聚合物以及类似物，其他植物性药材诸如芦荟、春黄菊以及类似物。
根据某些实施方案，脂肪选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：矿物油、动物源的油(羊毛脂)、合成油(肉豆蔻酸异丙酯、辛基十二烷基、异硬脂酸异硬脂醇酯、油酸癸酯或棕榈酸异丙酯)、硅油(环甲硅油或二甲硅油)和氟化油。可以使用脂肪醇、脂肪酸、蜡和胶(主要是硅橡胶)和弹性体作为脂肪。
根据其他实施方案，乳化剂和辅助乳化剂可以选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、PEG脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、烷基硫酸酯、烷基醚硫酸酯、烷基磷酸酯、烷基多葡糖苷和二甲硅油共聚多元醇。
根据另外的实施方案，亲水性胶凝剂选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：羧基乙烯基聚合物(卡波姆)、丙烯酸聚合物诸如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖诸如黄原胶、瓜尔胶、天然的胶诸如纤维素胶和衍生物、粘土和2-丙烯酰氨基-2-甲基丙酸共聚物。亲脂性胶凝剂选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：改性粘土诸如有机皂土、脂肪酸金属盐、疏水性二氧化硅和乙基纤维素。填料可以选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：滑石、高岭土、云母、绢云母、碳酸镁、硅酸铝和有机粉末，诸如尼龙。染料可以选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：亲脂性染料、亲水性染料、颜料和通常用于化妆品组合物或皮肤病学组合物的珍珠母以及它们的混合物。中和剂选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：苏打、三乙醇胺、氨甲基丙醇和氢氧化钾。渗透增强剂可以选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：醇和二醇(乙醇和丙二醇)、乙氧基乙二醇、醇和脂肪酸(油酸)、脂肪酸酯和二甲基异山梨醇。
与化妆品组合物和皮肤病学组合物相容的防腐剂是本领域众所周知的。根据某些实施方案，防腐剂选自由苯甲酸、其盐和酯；山梨酸和其盐；对羟基苯甲酸酯类和它们的盐；三氯生；咪唑烷基脲；苯氧乙醇；DMDM乙内酰脲；重氮烷基脲和氯苯甘油醚组成的组。
根据某些实施方案，滤料是通常使用的UVA滤料和UVB滤料，它们选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：有机滤料：二苯甲酮-3、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、氰双苯丙烯酸辛酯、甲氧基肉桂酸辛酯、4-甲基苄亚基樟脑、水杨酸辛酯、对苯二亚甲基二樟脑磺酸和甲酚曲唑三硅氧烷；非有机滤料：氧化钛和氧化锌。
根据某些实施方案，溶剂选自由下述物质组成的组，但不限于这些物质：水、乙醇、甘油、丙二醇、丁二醇和山梨糖醇。根据典型的实施方案，溶剂是水和/或甘油。
根据某些典型的实施方案，组合物被局部施用。
本发明的组合物还可以被配制成脂质体，脂质体可以包括其他添加剂或物质，和/或可以被改性以便在施用之后更专门到达或保持在某一部位。脂质体和包括脂质体的递送系统和运载体在本领域是众所周知的。简言之，脂质体是包封显著部分的水溶液的单层或多层的脂囊泡。脂质体的囊状微储器可以包含被悬浮在乳液内的多种水溶性物质(如以下综述的：G.Gregorius(编辑)，1991，Liposome Technology(脂质体技术)，第I、II、III卷，CRC Press，Boca Raton，Fla.；Davis S.S.和Walker I.M.，1987，Methods in Enzymology(酶学方法)，149：51-64；Mayhew E.等人，1987，Methods in Enzymology(酶学方法)，149：64-77；和Shafer-Korting M.等人，1989，J.Am.Acad.Dermatol.，21：1271-1275)。已经描述了脂质体的制备以及脂质体在生物系统中的多种用途(如，在美国专利第4,708,861号、第4,224,179号和第4,235,871号中)。因此，这样的脂质体可以被配制成如本文描述的皮肤病学组合物或化妆品组合物中的任一种。另外或可选择地，本发明的组合物可以被胶囊化，尤其是通过微胶囊化和纳米胶囊化。
包含雪片莲属鳞茎提取物的组合物可以被配制并使用各种可利用的递送系统被递送至皮肤和肌肉，递送系统诸如微注射和纳米注射、无针注射、透皮递送和有助于使活性成分到达它们的作用点的通道系统。
可选择地，包含雪片莲属鳞茎提取物的组合物可以被皮下(s.c.)或皮内(i.d.)注射到需要的部位，即，具有皱纹、细纹等的皮肤部位。
本领域的技术人员能够确定采用本发明方法而使用的组合物的有效剂量或有效量以及应用方案。有效剂量是指活性成分的量，即根据本发明确定的含水的雪片莲属鳞茎提取物的量，其，如治疗、预防、缓解、减轻或消除皱纹、细纹、褶皱以及类似物的量。提取物剂量将由执业者根据与需要治疗的个体有关的某些因素决定，这些因素包括个体的特定需要的严重度、个体的总体健康、个体的年龄、重量和性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和治疗耐受性/治疗响应。作为一般准则，长效的化妆品组合物可以每天、每2天到每4天、每周施用一次或每两周施用一次，这取决于特定制剂的半衰期和清除率。可以采用本领域的技术人员众所周知的用于优化的标准的经验惯例来调节这些剂量水平的变化。文献中提供了特定剂量和递送方法的准则且本领域的执业者通常可利用它们。举个例子，当提取物呈其干形式时，雪片莲属鳞茎提取物以基于组合物的总重量的约0.0001wt％到约0.3wt％的量存在于组合物中，而当提取物呈其液体形式时，雪片莲属鳞茎提取物以基于组合物的总重量的约0.01wt％到约30wt％的量存在于组合物中。根据典型的实施方案，每天施用组合物一次。根据其他典型的实施方案，每天施用组合物两次。根据还另外典型的实施方案，在约7天至约30天的时段期间施用组合物。
有利地，本发明的雪片莲属提取物现在已经显示出具有抗氧化活性，这是因为其对本文下面描述的MnSOD表达的影响。尽管这样，本发明的组合物还可以包括另外的活性成分，另外的活性成分包括另外的抗氧化剂。另外的活性成分包括但不限于，脱色剂、湿润剂、抗皮脂溢剂、抗痤疮剂、角质层分离剂和/或剥离溶解剂、抗刺激剂、安抚剂以及另外的抗老化活性成分，诸如视黄醇和其他抗皱剂。
根据另一个方面，本发明提供了非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，其中提取物抑制肌肉细胞的收缩活性。
根据某些实施方案，本发明提供了非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，该提取物呈液体形式。根据其他实施方案，提取物呈干粉末的形式。
根据另一个方面，本发明提供了抗老化化妆品组合物，该化妆品组合物包括作为活性成分的非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，还包括化妆品上有效的稀释剂或载体。
根据还另外的实施方案，本发明的抗老化化妆品组合物用于治疗皮肤的皱纹和/或细纹。
根据某些实施方案，当提取物呈液体形式时，化妆品组合物包括约0.01％到约99.9％(w/w)，通常约0.01％到约30％(w/w)，更通常约0.1％到约10％(w/w)的提取物。根据其他实施方案，当所述提取物呈干燥粉形式时，组合物包括约0.0001％到约0.99％(w/w)，通常约0.0001％到约0.3％(w/w)，更通常约0.01％到约0.1％(w/w)的提取物。
根据某些实施方案，本发明的组合物被配制用于局部施用或用于皮下或皮内施用或通过离子电渗疗法施用。可以使用本领域已知的和上文描述的适于局部应用的任何制剂。
提出下面的实施例是为了更充分地阐释本发明的一些实施方案。然而，这些实施方案绝不应该被解释为限制本发明的宽范围。本领域的技术人员可以易于设想本文所公开的原理的许多变化和修改而并不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1：夏雪片莲鳞茎提取物的生产
冲洗夏雪片莲鳞茎并对其进行剥皮。然后在纯水中粉碎剥了皮的鳞茎，直到形成均匀的浆液。借助螺旋搅拌在15℃-45℃的温度范围下进行提取15-60分钟。通过倾析进行粗固体的去除。按照下述方式从浆液中进行细固体的去除：
·在70℃-130℃之间的温度范围内加热浆液；
·倾析液相提取物至新的清洁的容器；
·通过流速在3-10Kg/分钟之间的范围的盘式离心机离心所获得的液体。
在水或/和甘油中稀释提取物以获得7.0mg/g到15.0mg/g的干重。将最终的溶液通过一个接一个地放置的1μm、0.45μm和0.2μm的过滤器(Suprolife过滤器，Pall)过滤。
最终的提取物具有约4.50到约6.50的pH。提取物的颜色是浅黄色到黄褐色的，且其在水中具有无限制的溶解度。在该提取物中未检测到雪花莲胺，且检测阈值低于4p.p.m。
实施例2：评价夏雪片莲鳞茎提取物对肌肉收缩的影响
按照上文所述获得的夏雪片莲鳞茎提取物使用在本研究中。目的是评估此提取物对肌肉收缩频率的影响。
神经-肌肉共培养物模型是一种适于研究物质对肌肉收缩频率的影响的模型。在将被检验的物质应用至共培养物之前和之后，在给定时间期间对肌肉收缩次数进行计数。该物质存在下的收缩次数由与最初的收缩次数相比的百分数来表示。如果在包含神经-肌肉共培养物的3孔中的至少两孔中观察到肌肉收缩频率的显著减少或阻断，则确定了对肌肉收缩的抑制效果。
材料和方法
细胞培养物的制备
在24孔培养板中接种人类肌肉细胞。在整个培养期间，在37℃下，5％CO2中温育细胞。
在培养5天后，从大鼠胚胎中分离出脊髓，并切割为小部分(外植块)。将每培养孔(culture well)中一个外植块置于肌肉细胞中，且两种细胞类型均在24孔板中培养21天。
在培养期间，肌肉细胞结合并形成肌肉纤维。存在于脊髓中的运动神经元发出神经突(nervous extension)，该神经突接触肌肉纤维。形成神经-肌肉接点且出现肌肉收缩。
在共培养21天后，模型成熟且发挥作用。肌肉纤维自发地受神经支配并以固定的方式收缩。用倒置显微镜观察这些收缩并计数。
测试提取物的制备
在培养基中制备测试提取物的储备溶液。将此溶液应用至神经-肌肉培养物。
测试了1.5％的夏雪片莲提取物。
培养基单独起到阴性对照的作用。
阳性对照是卡立普多，一种以可逆方式阻断肌肉收缩的药物。在DMSO中制备1M的卡立普多储备溶液。以1/200将此溶液稀释到培养基(最终浓度为5×10-3M)中。每次处理采用三个培养孔(对照/测试提取物)。
试验过程
在培养第21天开始试验。
用显微镜观察每个孔内的细胞。显微镜配备有由LUCIA软件操控的自动样品升降台(motorized stage)。显微镜还结合了照相机并连接至计算机以允许记录视频序列(video sequence)。
对每一个选择的培养孔来说，参照显示出规律收缩的肌肉纤维。使用LUCIA软件登记此纤维的XY数据。在30秒期间对此纤维的收缩频率进行手动计数，且记录视频序列(T0)。对所有孔实施相同的操作。
将测试提取物和参照应用至神经-肌肉培养物，且试验系统在37℃下，5％CO2中培养。
在温育2小时、6小时和24小时后，再次在30秒期间对收缩频率进行计数且也对每一次计数记录视频序列。
结果说明
对每一个培养孔来说，在被检验的提取物存在下计数的肌肉收缩次数由与应用提取物之前计数的收缩次数(T0)相比的百分数来表示。
当收缩频率与T0相比在80％-120％的范围内时，肌肉收缩频率的调节并不认为是明显的。此范围是基于下述事实：在此时间期间，肌肉收缩频率可以略微变化，不依赖于所应用的条件。
低于80％和超过120％的频率度量被认为与T0明显不同。
结果表示如下：
·肌肉收缩频率无显著变化：收缩百分数在80％到120％之间，由(＝)表示
·肌肉收缩频率显著降低：收缩百分数＜80％，由(-)表示
·肌肉收缩频率的阻断：收缩百分数＝0％，由(0)表示
·肌肉收缩频率显著增大：收缩百分数＞120％，由(+)表示。
只有当在3个培养孔中的至少两个中(即，3根肌肉纤维中的2根)获得了相同的结果时，才评价产品效果。下面表1-2和图1概述了所获得的结果。
结果
表1：对照
Figure BPA00001329776400171
当培养基单独应用至测试孔(阴性对照)时，在应用2小时后，未观察到肌肉收缩频率的显著变化。在培养6小时和24小时后，观察到一些变化。
在培养2小时、6小时和24小时后，卡立普多(阳性对照)产生对肌肉收缩的完全阻断。在冲洗掉之后，观察到肌肉收缩的恢复，这表明卡立普多的影响是可逆的。
虽然在6小时和24小时时，观察到阴性对照的一些收缩频率变化，但是试验过程被证实为，被检验的产品引起对收缩的完全阻断(参见下文)，而不仅是减少。
表2：夏雪片莲提取物
Figure BPA00001329776400181
结论
在上述试验条件中，在应用2、6和24小时后，1.5％夏雪片莲提取物阻断肌肉收缩频率。
在冲洗掉(温育时间25小时)之后，仍阻断肌肉收缩，这表明1.5％的雪片莲属提取物的影响是不可逆的。
实施例3：夏雪片莲鳞茎提取物对面部皱纹的评价
在组合物中2％浓度的按照上文所述获得的夏雪片莲鳞茎提取物使用在本研究中，组合物包括下述成分：棕榈酰钾；水解的小麦蛋白；硬脂酸甘油酯；棕榈醇；异十六烷；辛酸/癸酸甘油三酯；PPG-15硬脂醚；丙二醇；黄原胶；硅酸镁铝；脱氢乙酸；苯甲酸；山梨酸；苄醇；夏雪片莲鳞茎提取物2％。不含夏雪片莲鳞茎提取物的相同的组合物用作对照。
此研究的目的是评估和阐释与对照相比，在使用28天后，包括提取物的组合物对人类受试者的抗皱效果。此研究是双盲的和个体内研究，即每个受试者是她自己的对照。
研究原理
皱纹测量
在应用产品(测试和对照)之前和之后，从所研究的皮肤区域采集聚合物硅氧烷皮肤的印迹。随后，使用Skin Image Analyser
Figure BPA00001329776400182
(S.I.A)研究皮肤的印迹。
简要地说，斜侧照明(35°)在复制品前面上产生阴影，且用连接至计算机的数码相机对阴影进行拍照。这产生数字化图像，其中分析了灰色阴影的表征皮肤表面起伏的若干参数。研究了每一个印迹的1cm2面积。
使用QUANTIRIDES
Figure BPA00001329776400191
-MONADERM软件，所研究的参数是皮肤微起伏皱褶的数目和中等皱纹的数目。还观察了皱纹深度。
微起伏皱褶具有低于55μm的深度。中等皱纹皱褶具有55μm到110μm之间的深度。检测了具有0.03mm2的最小表面的所有皱褶。
3D图示
使用Primos
Figure BPA00001329776400192
3D Compact(Phaseshift Rapid In vivo Measurement of Skin，GFMesstechnik GmbH，德国)研究了受试者的按照上述获得的聚合物硅氧烷皮肤的印迹(Silfo
Figure BPA00001329776400193
)(其呈现最佳的视觉效果)。
此技术借助干涉条纹投影从图像计算相位图像，允许确定每一个点的高度。该软件允许获得2D和3D测量。自动重新定位系统允许精确地重新确认测量的区域。该系统如下：
Figure BPA00001329776400194
受试者选择
此研究的受试者的最少数目是20。入选标准如下：健康的受试者，已经获得她的知情书面同意；合作的受试者，明白控制的必要性和时长，因此能够预料到对由临床试验中心建立的协议的完全遵守；女性；年龄在18岁以及18岁以上；具有中等的鱼尾纹皱纹。
排除标准如下：怀孕的或哺育的女性或打算在研究期间怀孕的女性；研究区域上存在皮肤病状(湿疹等)；在测量区域上使用作用于皮肤起伏的任何产品(抗皱霜)或在开始研究之前停止使用这样的产品不到1个月的受试者；进行了填料注射和/或眼睑提升的受试者；在开始研究之前改变、开始或停止她的口服避孕或任何荷尔蒙治疗不到1.5个月的受试者；在前两周期间使用了易于干扰研究产品的皮肤可接受性评价的局部或全身治疗的受试者；被研究人员认为未遵守协议的受试者；以及在研究前一个月内经受了过度的日光或UV光线照射的受试者。
在研究期间批准常用的清洁产品使用在面部上(除了待在实验室外)。在研究期间不批准使用非研究产品的皮肤药物产品或化妆品产品应用到面部。也不批准在研究期间过度受到日光或UV光线照射。
试验时间表
第0天(D 0 ，研究开始之前的那天)
·受试者进入实验室，从前一天晚上起没有应用任何产品到面部。
·她们阅读一式两份的信息表(产品使用说明书和与研究有关的限制条款)和知情同意书，在其上签名并注明日期。进行知情同意讨论的人也在这些文件上签名和注明日期。受试者获得副本。
·负责研究的技术人员核实入选标准和不入选标准。
·界定了面部上的两个区域：一个区域用测试产品处理，而另一个区域用对照处理(下文分别描述为产品“T”和“K”)。
·采集两个研究区域的皮肤印迹。
·将带说明书的研究产品给予受试者以便在每一个所界定的一半脸上每天应用产品两次。
第28天(D 28 )
·受试者回到实验室；在前一天晚上最后一次应用产品。
·采集两个研究区域的皮肤印迹。
由于受试者在家里应用测试产品，因此在此研究期间未进行依从控制(compliance control)。
研究产品
该产品被编码为1：产品“T”：包括2％的上述夏雪片莲鳞茎提取物的组合物；和2：产品“K”，只有组合物。两种化合物都是白色乳液。
在开始研究之前，将产品保存在室温下的专用空调室内。将此室锁住并控制出入。
在28天期间，每天应用产品2次(早晨和晚上)，一种产品应用到每个一半脸上。在通常的使用条件下应用乳液。按照下面表3所述的随机选择应用区域。
表3：面部应用区域的随机选择
Figure BPA00001329776400211
二十二位(22)受试者开始研究。一位受试者未能到达第28天，且因而对21位受试者进行第二次测量。21位受试者遵守研究方案。参与者的平均年龄是60岁，且最小42岁，最大64岁。
数据分析
计算公式
根据下面的公式计算不同研究参数的以任何单位表示的变化(Δ)和以平均百分数表示的变化(Δ％)：
且：
ZPdt-1：在由产品1(T)处理的区域上获得的值；
ZPdt-2：在由产品2(K)处理的区域上获得的值；
t0：产品应用之前；
ti：应用之后的每一次测量时间。
注释：
变化百分数(Δ％)由产品1处理的区域的变化(ZPdt-1ti-ZPdt-1t0)与产品2处理的区域的变化(ZPdt-2ti-ZPdt-2t0)相比或与处理前的状态相比的百分数：
(ZPdt-1ti-ZPdt-1t0)-(ZPdt-2ti-ZPdt-2t0)或(ZPdtti-ZPdtt0)
这些变化在初始值ZPdtt0(处理前)时被加权，由t0到ti之间可能的误差来校正，不依赖于治疗。此误差在产品2处理的区域(ZPdt-2ti-ZPdt-2t0)上估计，或在t0时的处理区域上估计，这给出了分母：
Pdt-1Zt0+(ZPdt-2ti-ZPdt-2t0)或ZPdtt0
因此，此表达(Δ％)给出了由产品1(T)处理的每一个区域与初始条件相比的由百分数表示的变化，考虑了对于由产品2(K)处理的区域所观察的波动(不依赖于治疗)。
对每一个研究参数来说，提供了在应用之前(第0天)和完成治疗之后(第28天)由产品T处理的区域获得的值(表5-6)和由产品K处理的区域获得的值(表7-8)。
这些表还显示了描述性统计：平均值、中位值、最小值、最大值、平均标准误差(SEM)和这些值的95％的置信区间(CI 95％)。
统计方法
统计分析确定了由每一种研究产品处理的皮肤区域获得的变化的显著性。
用成对的t检验来分析数据。此方法测试了成对数据之间的样本差的平均值是否显著不同于假设平均值，零假设下为0(H0)。
可选择的假设(H1)是平均差大于或小于0(双尾检验)。在进行测试之前，选择5％的I型误差(这对应于拒绝真正的零假设的风险)。
如果p≤0.05，则H0被拒绝。在处理前与处理后之间或测试产品之间存在显著性差异。
如果p≥0.05，则H0被接受，平均值不是不同于0。数据并未显示出在处理前与处理后之间或测试产品之间存在显著性差异。所使用的软件是EXCEL 9.0版本2003。
结果
抗皱效果
研究参数是：
·微起伏皱褶的数目。
·中等皱纹的数目。
表4提供了微起伏皱褶的数目且表5提供了中等皱纹的数目，这些数目是在处理之前和处理之后，对个体受试者的来自由产品“T”(包括2％的夏雪片莲提取物的组合物)处理的皮肤区域的聚合物硅氧烷皮肤的印迹测得的。
表4：由产品“T”处理的皮肤区域的微起伏皱褶
Figure BPA00001329776400241
表5：由产品“T”处理的皮肤区域的中等皱纹的测量结果
Figure BPA00001329776400242
表6-7呈现了在处理之前和处理之后，对个体受试者的来自由产品“K”(对照组合物)处理的皮肤区域的聚合物硅氧烷皮肤的印迹测得的相同参数。
表6：由产品“K”处理的皮肤区域的微起伏皱褶
Figure BPA00001329776400261
表7：由产品“K”处理的皮肤区域的中等皱纹的测量结果
Figure BPA00001329776400262
Figure BPA00001329776400271
下面的表8和图5概述了在应用产品28天后，从所有受试者获得的皮肤起伏参数的平均变化。
表8：在使用每一种研究产品28天之后，与初始状态相比的皮肤起伏 参数的变化
结论：
在每天2次，使用28天后：
·产品“T”，包括2％的夏雪片莲提取物的组合物导致微起伏皱褶数目的显著降低(30％的平均值)。在86％的受试者中观察到降低。而且，还测量了中等皱纹数目的极限显著降低(limit significant decrease)(-14％的平均值)。在62％的受试者中观察到此参数的降低。
所有这些变化表征了包括本发明的夏雪片莲提取物的组合物(产品“T”)的平滑效果和抗皱效果的趋势。对照组合物(产品“K”)并没有改变皮肤起伏参数。
产品“T”与产品“K”之间的比较突出了微起伏皱褶数目的显著性差异。在此参数上，产品“T”比产品“K”显示出更好的功效。
图2和图3表示由产品“T”(包括2％的夏雪片莲提取物的组合物，图2A和图3A)或产品“K”(对照，图2B和图3B)处理的皮肤区域的2D视觉测量的实例(分别是第8号和第4号受试者)。图4A表示由产品“T”处理的(图4A)或产品“K”处理的(图4B)的第8号受试者的皮肤区域获得的3D视觉测量。观察到皱纹深度的可见的减小。
实施例4：夏雪片莲鳞茎提取物对角质形成细胞中MnSOD表达的影响
按照上文所述获得的夏雪片莲鳞茎提取物先前证明了刺激MnSOD基因的表达。本研究的目的是检验基因表达的刺激是否与蛋白水平的升高有关。由流式细胞术评估了蛋白表达。
材料和方法
生物模型
细胞类型：  正常的人类表皮角质形成细胞(NHEK)
第3次传代时使用的K074
培养条件：  37℃，5％CO2
培养基：    由表皮生长因子(EGF)0.25ng/ml补充的角质形成
细胞-SFM(Invitrogen 17005-034)-垂体提取物
(PE)25μg/ml(Invitrogen 3700015)庆大霉素25
μg/ml(Sigma G1397)
测定培养基：由庆大霉素25μg/ml(Sigma G1397)补充的角质形
成细胞-SFM(Invitrogen 17005-034)
培养和处理
在培养基中培养角质形成细胞。在亚融合(sub-confluence)时，去除培养基并用包含被检验的提取物或不包含被检验的提取物(对照)的测定培养基替换，且温育细胞72小时。以n＝3进行所有的处理。
流式细胞术分析-荧光活化细胞分选(FACS)
在温育结束时，通过用胰蛋白酶进行的酶促处理使细胞与它们的载体脱离。
在广泛洗涤后，将细胞固定在缓冲液中，且然后用在透化缓冲液中制备的抗-MnSOD抗体(TEBU SOD-110C)标记。温育1小时并洗涤后，在透化缓冲液中制备的荧光轭合物抗兔免疫球蛋白(GAR-Alexa 488，Invitrogen A11008)的存在下，温育细胞。
在相同的条件下，还进行了仅采用第二抗体的对照，以证实免疫标记的特异性。
在温育1小时并洗涤后，通过由FACSArray系统软件(Becton-Dickinson)驱动的FACSArrayTM细胞计进行的流式细胞术来测量10,000个单个细胞(无细胞种群选择)的荧光参数。
数据管理
用Microsoft Excel
Figure BPA00001329776400291
软件分析原始数据。
通过学生t检验进行组间比较。如果n≥5，则可以解释统计分析。对n＜5来说，统计值可以认为是提供信息的，但不是定量的。此报告中使用的公式是：
平均标准误差：SEM＝Sd/√n
平均标准误差(SEM)是样品平均值可能离真正的总体平均值有多远的量度。SEM以标准误差(sd)除以样本量的平方根来计算。
结果
如下面的表9所示，以0.15％进行测试的本发明的夏雪片莲提取物略微增强了MnSOD蛋白表达，这与基因表达的增强相关。在0.075％和0.3％的浓度时，未能检测到该化合物对MnSOD蛋白表达的影响。
表9：夏雪片莲提取物对角质形成细胞中的MnSOD表达的影响
Figure BPA00001329776400301
(1)：统计显著性的阈值
ns：＞0.05，不显著
*：0.01到0.05，显著
结论
夏雪片莲鳞茎提取物略微增强了角质形成细胞中抗氧化酶MnSOD的表达。在0.15％浓度的提取物时，此影响是显著的(p＜0.05)且能够与由此提取物引起的基因表达的增强相关。
实施例5：夏雪片莲鳞茎提取物的毒性测定
下面检验了按照上文描述获得的夏雪片莲鳞茎提取物用于化妆品应用的安全性：
刺激性
通过“HET-CAM”测试检验了刺激性。测试原理是基于在将产品应用到温育10天后的胚胎鸡卵的绒毛尿囊膜之后的前5分钟期间可能出现的可能的刺激性(充血、出血和血凝固/血栓形成)的视觉观察。根据它们的初现(apparition)(而不是它们的强度)登记所观察到的现象。(操作模式ATS M1918LAC，根据1996年11月29日的顺序，重新开始“Journal Officiel”的官方方法)。发现此提取物是无刺激性的，在HET-CAM测试中获得“0”分。
细胞毒性
通过中性红(NR)细胞毒性程序来测量细胞毒性。此程序是基于活细胞吸收并结合中性红(一种超致命染料)的能力的细胞成活率/生存力化学敏感性测定。NR是一种通过非离子扩散而易于穿透细胞膜，并在溶酶体内积聚于细胞内的弱阳离子染料，其中NR结合溶酶体基质内的阴离子部位。细胞表面或敏感的溶酶体膜的变化导致溶酶体脆性以及逐渐变得不可逆的其他变化。由异生素的作用产生的这样的变化导致NR吸收和结合的降低。因而，可以区分活细胞、损伤的细胞或死亡的细胞。该测试通过与提取物接触设定时间段的兔的角膜成纤维细胞来进行(Official Journal of the French Republic，1999年12月27日)。
提取物被界定为具有可忽略不计的细胞毒性，因为50％稀释的提取物时，细胞死亡率的百分数低于20％。
皮肤耐受性
通过基本上如在Dermatotoxicology Methods：The laboratory worker′s VADEMECUM(皮肤毒理学方法：实验室工作人员的袖珍指南)；N.Marzulli-H.Maibach编辑，Taylor & Francis，1998中描述的闭塞性单贴片试验方法(occlusive single patch test method)来检验刺激性。在应用到皮肤，在贴片下48小时后，提取物被发现是无刺激性的。
前述的具体实施方案的描述将非常充分地揭示本发明的一般性质，因此其他人通过运用目前的知识，无需过度试验且并不偏离总构思就可以易于修改和/或改动这样的具体的实施方案以用于多种应用中，且因此，这样的改动和修改应该且期望被包括在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应理解，本文采用的短语或术语是基于描述的目的，而不是限制的目的。用于实现各种所公开的功能的方式、材料和步骤可以采取多种可选择的形式而并不偏离本发明。

Claims (28)

1.一种用于抑制肌肉收缩或使皮肤组织松弛的方法，所述方法包括将包括有效量的夏雪片莲鳞茎的含水的提取物的组合物施用至需要其的受试者。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物是不依赖鳞茎休眠期获得的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述含水的提取物的量在缓解、减轻和/或消除皮肤皱纹、皮肤细纹和皮肤褶皱中的至少一种中是有效的。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述量还有效地保护所述皮肤避免受到氧化损害。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物被局部施用。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述组合物被施用至皮肤上。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述组合物是经由皮下、皮内或透皮递送被施用的。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述组合物被施用至选自面部、颈、臂、腿和膝盖的区域。
9.如权利要求3或4中任一项所述的方法，其中当所述提取物呈液体形式时，所述提取物的量相比于所述组合物的总重量为约0.01％到约99.9％(w/w)。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述提取物的量为约0.01％到约30％(w/w)。
11.如权利要求3或4中任一项所述的方法，其中当所述提取物呈干形式时，所述提取物的量相比于所述组合物的总重量为约0.0001％到约0.99％(w/w)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述提取物的量为约0.0001％到约0.3％(w/w)。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为化妆品组合物，所述化妆品组合物还包括化妆品上有效的稀释剂或载体。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包括至少一种添加剂，所述添加剂选自由脂肪、乳化剂和辅助乳化剂、亲水性或亲脂性胶凝剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、填料、亲水性和亲脂性滤料、染料、中和剂、渗透增强剂和聚合物组成的组。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包括至少一种另外的活性剂，所述活性剂选自由脱色剂、湿润剂、抗皮脂溢剂、抗痤疮剂、角质层分离剂和/或剥离溶解剂、抗刺激剂、安抚剂和视黄醇组成的组。
16.一种非休眠的雪片莲属鳞茎的含水的提取物，其中所述提取物有效地抑制肌肉细胞的收缩活性。
17.如权利要求16所述的提取物，其中所述提取物还有效地保护皮肤避免受到氧化损害。
18.如权利要求16所述的提取物，其中所述雪片莲属是夏雪片莲。
19.如权利要求16所述的提取物，所述提取物呈选自由液体形式和干粉末形式组成的组的形式。
20.一种化妆品组合物，其包括作为活性成分的根据权利要求16-19中任一项所述的含水的提取物，还包括化妆品上有效的稀释剂或载体。
21.如权利要求20所述的化妆品组合物，其用于治疗皮肤的皱纹、细纹和褶皱中的至少一种。
22.如权利要求20所述的化妆品组合物，其中所述提取物呈液体形式时，所述组合物包括约0.01％到约99.9％(w/w)的所述雪片莲属提取物。
23.如权利要求22所述的化妆品组合物，所述组合物包括约0.01％到约30％(w/w)的所述液体雪片莲属提取物。
24.如权利要求20所述的化妆品组合物，其中所述提取物呈干粉末形式时，所述组合物包括约0.0001％到约0.99％(w/w)的所述雪片莲属提取物。
25.如权利要求24所述的化妆品组合物，所述组合物包括约0.0001％到约0.3％(w/w)的所述干的雪片莲属提取物。
26.如权利要求20所述的化妆品组合物，其被配制用于局部应用。
27.如权利要求26所述的化妆品组合物，其以选自水溶液、乳膏、洗液、油包水乳液或水包油乳液、多重乳液、有机硅乳液、微乳液、纳米乳液、凝胶、浆液和乳剂的形式被配制。
28.如权利要求20所述的化妆品组合物，其被配制用于直接应用，所述直接应用选自由皮下注射、皮内注射或透皮递送组成的组。
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