TWI802255B - 白洛神萃取物用於肌膚保濕的用途 - Google Patents
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Abstract
一種白洛神(
Hibiscus sabdariffa cv.)萃取物用於製備肌膚保濕的組合物的用途,其中白洛神萃取物係於冰晶裂解白洛神花萼的細胞壁後,以溶劑對裂解後的白洛神花萼進行萃取所得。
Description
本發明關於一種白洛神萃取物,特別是涉及一種白洛神萃取物製備肌膚保濕的組合物的用途。
自有機及天然的飲食概念興起後,生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎,植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。
白洛神(
Hibiscus sabdariffacv.)又稱水晶洛神、白洛神葵、白玉洛神葵或白玫瑰茄,為錦葵科木槿屬下的一個種。白洛神為一年生草本植物或多年生灌木植物,生長於熱帶和亞熱帶地區,株高約一、二公尺,可用於消暑降火、提神解勞、調節血脂、降血壓及降膽固醇。
在一些實施例中,一種白洛神(
Hibiscus sabdariffacv.)萃取物用於製備提升肌膚保濕的組合物的用途,其中白洛神萃取物是以冰晶裂解白洛神花萼的細胞壁後,以溶劑對裂解後的白洛神花萼進行萃取所得。
綜上,任一實施例的白洛神萃取物其可製備提升肌膚保濕的組合物。換言之,前述之組合物具有提升肌膚保濕的功能。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下,本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐,不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
在一些實施例中,由白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)的花萼所獲得的白洛神萃取物可具有提升肌膚保濕的能力。因此,白洛神萃取物可用於製備具有提升肌膚保濕的能力的組合物。其中,白洛神萃取物是以冰晶裂解白洛神花萼的細胞壁後,以溶劑對裂解後的白洛神花萼進行萃取所得。
在一些實施例中,在萃取程序中,將白洛神的花萼置於-20±5℃下進行冷凍,使冰晶裂解白洛神花萼的細胞壁後,以水於85±5℃下萃取裂解後的白洛神花萼60分鐘至90分鐘以得到初萃原液。舉例來說,將白洛神花萼浸泡在85±5℃的5倍水中60分鐘至90分鐘。
其中,進行萃取的白洛神花萼可為完整花萼,或為經物理前處理而分離成碎片、顆粒或粉末等型態的花萼。採用的物理前處理可包括下列至少一種:粗碎、切碎、剪碎、搗碎、及研磨。
在一些實施例中,將白洛神的花萼置於-20±5℃下24小時以上進行冷凍,使花萼中所含的水分因急速冷凍形成冰晶。形成的冰晶可破壞花萼的細胞壁後,釋放出更多效性物質。
在一些實施例中,在萃取程序中,初萃原液可進一步進行過濾以去除雜質而得到濾液。在一些實施例中,在萃取程序中,濾液可進一步進行濃縮以得到濃縮液。在一些實施例中,在萃取程序中,濃縮液可進一步過濾以得到濃縮過濾液。
在一些實施例中,濃縮步驟的處理溫度為60±5℃。
也就是說,可依實際需求以萃取程序所得的初萃原液、濾液、濃縮液或濃縮過濾液作為白洛神萃取物。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過提升維持皮膚角質細胞結構相關基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,維持皮膚角質細胞結構相關基因包含轉穀胺醯胺酶1(transglutaminase 1, TGM1)基因以及角蛋白(keratin, KRT)基因。其中,角蛋白基因可為下列至少一者:KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過增加水通道蛋白以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過提升水通道蛋白基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,水通道蛋白基因可為水通道蛋白3(aquaporin 3, AQP3)基因。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過增加神經醯胺以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過提升神經醯胺生成相關基因以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,神經醯胺生成相關基因包含葡糖神經醯胺酶(glucosylceramidase,GBA)基因及鞘磷脂磷酸二酯酶1(sphingomyelin phosphodiesterase 1, SMPD1)基因。
在一些實施例中,白洛神萃取物是透過增加玻尿酸分泌以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,白洛神萃取物係是透過提升玻尿酸合成相關基因表現量以達到提升肌膚保濕的效果。
在一些實施例中,玻尿酸合成相關基因可為玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase, HAS)基因。其中,玻尿酸合成酶基因包括HAS2基因及HAS3基因。
在一些實施例中,白洛神萃取物的有效劑量為1.5毫克/天。
在一些實施例中,白洛神(Hibiscus sabdariffa)萃取物可用於製備提升肌膚保濕的組合物,並且製備得的組合物可為醫藥組合物、食品組合物、或化妝品或保養品組合物。
在一些實施例中,當前述的組合物為醫藥組合物時,此醫藥組合物包含有效含量的白洛神萃取物。其中,此醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地(parenterally)、口服地、或局部地(topically)投藥劑型。
在一些實施例中,經腸道或口服的投藥劑型可為,但不限於,錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)或類似之物。在一些實施例中,非經腸道地或局部地投藥劑型可為,但不限於,注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)或類似之物。在一些實施例中,注射品的投藥方式可為皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)或病灶內注射(intralesional injection)。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的醫藥組合物可更包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些實施例中,醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種:溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。其中,作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)或含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)。
在一些實施例中,當前述的組合物為食品組合物時,此食品組合物包含特定含量的白洛神萃取物。其中,食品組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的食品組合物可為食品產品或食品添加物(food additive)。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的食品產品可為飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食補充品(dietary supplements)等。在一些實施例中,含有白洛神萃取物的食品產品可更包括一佐劑。舉例來說,佐劑可為麥芽糖糊精(Maltodextrin)、蘋果酸、蔗糖素、檸檬酸、水果香料、蜂蜜香料、甜菊糖苷或其組合等。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的食品添加物可為調味料、甜味料、香料、pH值調整劑、乳化劑、著色料或穩定劑等。
在一些實施例中,前述的組合物為化妝品或保養品組合物。換言之,化妝品或保養品組合物包含特定含量的白洛神萃取物。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的化妝品或保養品組合物可為下列任一種型態:化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。
在一些實施例中,含有白洛神萃取物的化妝品或保養品組合物可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中,外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
下列範例中的實驗步驟若無特別敘明,即在室溫(25±5℃)、常壓(1 atm)下進行。
例一:
白洛神萃取物及洛神萃取物的製備
原料:
1. 白洛神(學名:Hibiscus sabdariffa cv.)的花萼,產地台灣屏東,係採購自在地農家葉俊宏。
2. 洛神(學名:Hibiscus sabdariffa Linn. Sp. Pl. )的花萼,產地台灣屏東,係採購自在地農家葉俊宏。
3. 二次水,又稱RO水或二次蒸餾水。
製備流程:
1. 將白洛神的花萼移至冷凍庫中24小時,使冰晶裂解白洛神花萼的細胞壁。冷凍庫的溫度設定於-20±5℃。
2. 將裂解後的白洛神的花萼以粉碎機(型號:10 Speed Blender;廠牌:Osterizer)進行粗碎,並且以40網目(mesh)的篩網進行過篩以得到白洛神粗碎物。
3. 將二次水加熱至85±5℃後,投入白洛神粗碎物。使白洛神粗碎物於85±5℃下,白洛神粗碎物比二次水以1:5的重量比進行萃取60分鐘而得到初萃原液。
4. 將初萃原液以400網目(mesh)的濾網對初萃原液過濾而得到濾液。
5. 將減壓濃縮機(型號:Rotavapor R-100;廠牌:BUCHI)溫度設定為60℃,於此情況下,對濾液進行減壓濃縮而得到濃縮液。
6. 將濃縮液以400網目(mesh)的濾網對濃縮液過濾而得到濃縮過濾液。於此,以濃縮過濾液作為後續實驗所使用的白洛神萃取物。其中,濃縮過濾液的糖度為Brix 8.0±0.3。
7. 依照上述製備流程步驟1至6,以洛神的花萼製得洛神萃取物。
8. 所製得的白洛神萃取物及洛神萃取物於冷凍庫中儲存以利進行後續的測試。
例二:維持皮膚角質細胞結構相關基因表現量試驗
材料與儀器:
1. 細胞株:人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes),購自ATCC,細胞編號PCS-200-011,以下簡稱HPEK-50細胞。
2. 培養基:角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM),購自Thermo,產品編號17005042。
3. RNA萃取試劑套組,購自TANBead公司,產品編號6K206。
4. SuperScript® III反轉錄酶,購自Invitrogene公司,產品編號18080-044。
5. ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,購自Thermo Fisher Scientific公司。
6. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit,購自KAPA Biosystems公司,產品編號KK4600。
試驗流程:
1. 將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度,接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中,並在37℃下培養24小時。
2. 於培養後,將HPEK-50細胞分為以下三組:空白組、實驗組A與實驗組B。其中,空白組的培養液不含任何萃取物;實驗組A的培養液含有0.25%(v/v)的例一製得的白洛神萃取物;實驗組B之培養液含有0.25%(v/v)例一製得的洛神萃取物。各組進行三重複,並於37℃下,培養24小時。
3. 移除培養後的空白組、實驗組A與實驗組B的培養液,並以PBS進行潤洗。
4. 於潤洗後,以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破各組的HPEK-50細胞的細胞膜,以形成細胞溶液。
5. 使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
6. 每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作為模板,藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
7. 使用ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit及表1的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以觀察空白組、實驗組A及實驗組B的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線(melting curve)。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒,95°C反應3秒,60°C反應30秒,並重複40個迴圈。
8. 使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值(Ct),按照以下公式計算倍數變化:
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表1
引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
TGM1-F | SEQ ID NO:1 | GATCGCATCACCCTTGAGTTAC |
TGM1-R | SEQ ID NO:2 | GCAGGTTCAGATTCTGCCC |
KRT1-F | SEQ ID NO:3 | AGAGTGGACCAACTGAAGAGT |
KRT1-R | SEQ ID NO:4 | ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT |
KRT10-F | SEQ ID NO:5 | TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG |
KRT10-R | SEQ ID NO:6 | CCCCTGATGTGAGTTGCCA |
KRT14-F | SEQ ID NO:7 | TTCTGAACGAGATGCGTGAC |
KRT14-R | SEQ ID NO:8 | GCAGCTCAATCTCCAGGTTC |
9. 空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗(student t-test)統計分析得到。(圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著)。
試驗結果:
請參閱圖1。在空白組的HPEK-50細胞並未經過白洛神萃取物或洛神萃取物的處理,也就是指其在正常的生理代謝情況下,設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組,實驗組A(白洛神萃取物)的TGM1基因的表現量為27.73倍,而實驗組B(洛神萃取物)的TGM1基因的表現量為0.44倍;實驗組A(白洛神萃取物)的KRT1基因的表現量為6.90倍,而實驗組B(洛神萃取物)的KRT1基因的表現量為0.81倍;實驗組A(白洛神萃取物)的KRT10基因的表現量為11.07倍,而實驗組B(洛神萃取物)的KRT10基因的表現量為1.36倍;實驗組A(白洛神萃取物)的KRT14基因的表現量為30.38倍,而實驗組B(洛神萃取物)的KRT14基因的表現量為1.56倍。
由此可知,不同於洛神萃取物,白洛神萃取物能明顯提升TGM1基因與KRT1基因的表現量,而洛神萃取物則是減少TGM1基因與KRT1基因的表現量。此外,白洛神萃取物能明顯提升KRT10基因與KRT14基因的表現量,提升效果甚至優於洛神萃取物。
例三:水通道蛋白基因表現量試驗
材料與儀器:
1. 細胞株:人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes),購自ATCC,細胞編號PCS-200-011,以下簡稱HPEK-50細胞。
2. 培養基:角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM),購自Thermo,產品編號17005042。
3. RNA萃取試劑套組,購自TANBead公司,產品編號6K206。
4. SuperScript® III反轉錄酶,購自Invitrogene公司,產品編號18080-044。
5. ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,購自Thermo Fisher Scientific公司。
6. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit,購自KAPA Biosystems公司,產品編號KK4600。
試驗流程:
1. 將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度,接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中,並在37℃下培養24小時。
2. 於培養後,將HPEK-50細胞分為以下三組:空白組、實驗組A與實驗組B。其中,空白組的培養液不含任何萃取物;實驗組A的培養液含有0.25%(v/v)的例一製得的白洛神萃取物;實驗組B之培養液含有0.25%(v/v)例一製得的洛神萃取物。各組進行三重複,並於37℃下,培養24小時。
3. 移除培養後的空白組、實驗組A與實驗組B的培養液,並以PBS進行潤洗。
4. 於潤洗後,以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破各組的HPEK-50細胞的細胞膜,以形成細胞溶液。
5. 使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
6. 每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作為模板,藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
7. 使用ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit及表2的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以觀察空白組、實驗組A及實驗組B的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線(melting curve)。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒,95°C反應3秒,60°C反應30秒,並重複40個迴圈。
8. 使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值(Ct),按照以下公式計算倍數變化:
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表2
引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
AQP3-F | SEQ ID NO:9 | GGGGAGATGCTCCACATCC |
AQP3-R | SEQ ID NO:10 | AAAGGCCAGGTTGATGGTGAG |
9. 空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗(student t-test)統計分析得到。(圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著)。
試驗結果:
請參閱圖2。在空白組的HPEK-50細胞並未經過白洛神萃取物或洛神萃取物的處理,也就是指其在正常的生理代謝情況下,設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組,實驗組A(白洛神萃取物)的AQP3基因的表現量為15.36倍,而實驗組B(洛神萃取物)的AQP3基因的表現量為1.03倍。
由此可知,白洛神萃取物能明顯提升AQP3基因的表現量,提升效果優於洛神萃取物。
例四:神經醯胺生成相關基因表現量試驗
材料與儀器:
1. 細胞株:人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes),購自ATCC,細胞編號PCS-200-011,以下簡稱HPEK-50細胞。
2. 培養基:角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM),購自Thermo,產品編號17005042。
3. RNA萃取試劑套組,購自TANBead公司,產品編號6K206。
4. SuperScript® III反轉錄酶,購自Invitrogene公司,產品編號18080-044。
5. ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,購自Thermo Fisher Scientific公司。
6. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit,購自KAPA Biosystems公司,產品編號KK4600。
試驗流程:
1. 將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度,接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中,並在37℃下培養24小時。
2. 於培養後,將HPEK-50細胞分為以下三組:空白組、實驗組A與實驗組B。其中,空白組的培養液不含任何萃取物;實驗組A的培養液含有0.25%(v/v)的例一製得的白洛神萃取物;實驗組B之培養液含有0.25%(v/v)例一製得的洛神萃取物。各組進行三重複,並於37℃下,培養24小時。
3. 移除培養後的空白組、實驗組A與實驗組B的培養液,並以PBS進行潤洗。
4. 於潤洗後,以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破各組的HPEK-50細胞的細胞膜,以形成細胞溶液。
5. 使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
6. 每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作為模板,藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
7. 使用ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit及表3的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以觀察空白組、實驗組A及實驗組B的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線(melting curve)。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒,95°C反應3秒,60°C反應30秒,並重複40個迴圈。
8. 使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值(Ct),按照以下公式計算倍數變化:
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表3
引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
SMPD1-F | SEQ ID NO:11 | CTGACTCTCGGGTTCTCTGG |
SMPD1-R | SEQ ID NO:12 | TCCACCATGTCATCCTCAAA |
GBA-F | SEQ ID NO:13 | TCCAGTTGCACAACTTCAGC |
GBA-R | SEQ ID NO:14 | TTGTGCTCAGCATAGGCATC |
9. 空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗(student t-test)統計分析得到。(圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著)。
試驗結果:
請參閱圖3。在空白組的HPEK-50細胞並未經過白洛神萃取物或洛神萃取物的處理,也就是指其在正常的生理代謝情況下,設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組,實驗組A(白洛神萃取物)的SMPD1基因的表現量為17.22倍,而實驗組B(洛神萃取物)的SMPD1基因的表現量為1.83倍;實驗組A(白洛神萃取物)的GBA基因的表現量為35.54倍,而實驗組B(洛神萃取物)的GBA基因的表現量為1.40倍。
由此可知,白洛神萃取物能明顯提升SMPD1基因與GBA基因的表現量,提升效果優於洛神萃取物。
例五:玻尿酸合成相關基因表現量試驗
材料與儀器:
1. 細胞株:人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes),購自ATCC,細胞編號PCS-200-011,以下簡稱HPEK-50細胞。
2. 培養基:角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM),購自Thermo,產品編號17005042。
3. RNA萃取試劑套組,購自TANBead公司,產品編號6K206。
4. SuperScript® III反轉錄酶,購自Invitrogene公司,產品編號18080-044。
5. ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,購自Thermo Fisher Scientific公司。
6. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit,購自KAPA Biosystems公司,產品編號KK4600。
試驗流程:
1. 將HPEK-50細胞以每孔1×10
5個的密度,接種於每孔含2 mL的培養基的6孔培養盤中,並在37℃下培養24小時。
2. 於培養後,將HPEK-50細胞分為以下三組:空白組、實驗組A與實驗組B。其中,空白組的培養液不含任何萃取物;實驗組A的培養液含有0.25%(v/v)的例一製得的白洛神萃取物;實驗組B之培養液含有0.25%(v/v)例一製得的洛神萃取物。各組進行三重複,並於37℃下,培養24小時。
3. 移除培養後的空白組、實驗組A與實驗組B的培養液,並以PBS進行潤洗。
4. 於潤洗後,以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液破各組的HPEK-50細胞的細胞膜,以形成細胞溶液。
5. 使用RNA萃取試劑套組分別萃取各組的細胞溶液內的RNA。
6. 每組取2000奈克(ng)所萃取出的RNA作為模板,藉由SuperScript® III反轉錄酶將萃取出的RNA反轉錄為相應的cDNA。
7. 使用ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system,以KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Kit及表4的組合引子將cDNA分別進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以觀察空白組、實驗組A及實驗組B的HPEK-50細胞的各種目標基因的表現量及其解鏈曲線(melting curve)。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒,95°C反應3秒,60°C反應30秒,並重複40個迴圈。
8. 使用2
- ΔΔ Ct方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之目標基因的RNA表現量相對於空白組之同一基因的RNA表現量的倍數變化。2
- ΔΔ Ct方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值(Ct),按照以下公式計算倍數變化:
△Ct = Ct
實驗組之目標基因 / 空白組之目標基因- Ct
GAPDH △△Ct= △Ct
實驗組之目標基因- △Ct
空白組之目標基因倍數變化 = 2
- ΔΔ Ct 平均值
表4
引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
HAS2-F | SEQ ID NO:15 | AAGAACAACTTCCACGAAAAGGG |
HAS2-R | SEQ ID NO:16 | GGCTGGGTCAAGCATAGTGT |
HAS3-F | SEQ ID NO:17 | CGCAGCAACTTCCATGAGG |
HAS3-R | SEQ ID NO:18 | AGTCGCACACCTGGATGTAGT |
9. 空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗(student t-test)統計分析得到。(圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著)。
試驗結果:
請參閱圖4。在空白組的HPEK-50細胞並未經過白洛神萃取物或洛神萃取物的處理,也就是指其在正常的生理代謝情況下,設定其基因的表現量為1倍。相對於空白組,實驗組A(白洛神萃取物)的HAS2基因的表現量為2.77倍,而實驗組B(洛神萃取物)的HAS2基因的表現量為0.37倍;實驗組A(白洛神萃取物)的HAS3基因的表現量為14.10倍,而實驗組B(洛神萃取物)的HAS3基因的表現量為0.59倍。
由此可知,不同於洛神萃取物,白洛神萃取物能明顯提升HAS2基因與HAS3基因的表現量,而洛神萃取物則是減少HAS2基因與HAS3基因的表現量。
例六:玻尿酸分泌量試驗
材料與儀器:
1. 細胞株:人類初代皮膚角質細胞(Human primary epidermal keratinocytes),購自ATCC,以下簡稱HPEK-50細胞。
2. 培養基:角質細胞專用之無血清培養基(Keratinocyte-SFM),購自Thermo,產品編號17005042。
3. 人類玻尿酸檢測套組(Human Hyaluronic acid, HA ELISA Kit),購自Cusabio Biotech。
4. 酵素免疫分析儀(ELISA reader),購自BioTek公司(美國)。
5. 白洛神萃取物及洛神萃取物,由本案例一的製備方式所製得。
試驗流程:
1. 將HPEK-50細胞以每孔1×10
4個的密度,接種於每孔含100 μL的培養基的96孔培養盤中,並將HPEK-50細胞分為以下三組:空白組、實驗組A與實驗組B。其中,空白組的培養液不含任何萃取物;實驗組A的培養液含有0.0625%(v/v)的例一製得的白洛神萃取物;實驗組B之培養液含有0.0625%(v/v)的例一製得的洛神萃取物。各組進行三重複,並於37℃下,培養24小時。
3. 每孔取100 μL的培養基,加至預塗(pre-coated)的ELISA盤中,於37℃下培養2小時。
4. 移除每孔中的培養基,勿進行清洗。
5. 於每孔中添加100 μL的生物素抗體(Biotin-antibody),並於37℃下培養1小時。
6. 反應完畢後,移除每孔的培養基,並以200 μL的洗滌緩衝液(Wash Buffer)進行清洗,每次清洗靜置2分鐘,重複此步驟三次。最後一次清洗完成後,透過抽吸除去所有剩餘的洗滌緩衝液。
7. 於每孔中添加100 μL的HRP-抗生物素蛋白(HRP-avidin),並在37℃下培養1小時。
8. 反應完畢後,移除每孔的培養基,並以200 μL的洗滌緩衝液(Wash Buffer)進行清洗,每次清洗靜置2分鐘,重複此步驟五次。最後一次清洗完成後,透過抽吸除去所有剩餘的洗滌緩衝液。
9. 於每孔中避光添加90 μL的TMB底物(TMB Substrate),並於37℃下避光反應30分鐘。
10. 於每孔中添加50 μL的終止液(Stop Solution),輕輕敲打培養盤以確保其充分混合。
11. 利用酵素免疫分析儀於5分鐘內測量每孔450 nm的吸光值。
12. 空白組與實驗組的測量結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗(student t-test)統計分析得到。(圖式中「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著)。
試驗結果:
請參閱圖5。在空白組的HPEK-50細胞並未經過白洛神萃取物或洛神萃取物的處理,也就是指其在正常的生理代謝情況下,設定其所能產生的玻尿酸量為100%。而實驗組A的HPEK-50細胞在經過白洛神萃取物的處理後,其相對於空白組所產生的玻尿酸量為120.9%;實驗組B的HPEK-50細胞在經過洛神萃取物的處理後,其相對於空白組所產生的玻尿酸量為114.4%。換言之,與空白組相較之下,實驗組A及實驗組B的相對玻尿酸分泌率皆有提升。其中,實驗組A(白洛神萃取物)之相對玻尿酸分泌與空白組相比提升20.9%,而實驗組B(洛神萃取物物)之相對玻尿酸分泌與空白組相比提升14.4%。由此可知,白洛神萃取物及洛神萃取物皆可明顯促進HPEK-50細胞產生玻尿酸,且白洛神萃取物的提升玻尿酸分泌的能力相較洛神萃取物優異。基此可知,白洛神萃取物具有促進玻尿酸分泌的效果,進而有益於保留皮膚膠原蛋白、增加皮膚含水量,並提供皮膚彈性和柔韌性。
玻尿酸可以防止皮膚自然老化,並保護皮膚免於太陽紫外線、煙草煙霧和空氣中污染物質之危害。玻尿酸亦具有幫助增加皮膚水份,使肌膚結構緊密澎潤,以減少皮膚細紋和皺紋的出現。另外,玻尿酸在傷口癒合中也起著關鍵作用,當皮膚細胞需要修復或受損時其濃度亦會增加,且其應用於皮膚傷口已被證明可以減輕傷口的大小且減緩疼痛,亦可幫助降低傷口細胞感染風險。
另外,玻尿酸對於骨關節炎亦具有幫助,實驗證實每天食用80-200毫克玻尿酸至少兩個月,即可顯著減輕骨關節炎患者的膝關節疼痛,亦有助於減輕胃酸反流症狀,而玻尿酸具有出色的保濕性,其亦常用於治療乾眼症、減緩骨質疏鬆及減輕膀胱疼痛症候群等諸多功效。
例七:人體試驗
-
改善肌膚狀況試驗
令9位25-55歲的健康成人受試者每日飲用一瓶50 g白洛神萃取物飲品(其含有1.5 g的使用例一所製得的白洛神萃取物),連續服用4週(即28日)。
受試者於開始服用前(臉部已清潔,第0週)、服用14日(臉部已清潔,第2週)及服用28日(臉部已清潔,第4週)後,進行肌膚檢測及膚況問卷調查。肌膚檢測為依據不同檢測項目,使用對應的儀器及測量方式,紀錄臉部肌膚之數值、並拍攝服用前及服用後的照片。(於服用前及服用後進行檢測時,受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致,以減少外界的溫濕度等因素會對肌膚所造成的影響)。
將分別對肌膚進行以下檢測項目的檢測:
1. 肌膚保濕效力(skin moisturizing efficacy)
使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司的肌膚含水量檢測探頭Corneometer® CM825 (C+K Multi Probe Adapter System,Germany) 對同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係基於電容的原理進行測量。當水分含量發生變化時,肌膚的電容值亦發生變化,故可通過測定肌膚電容值,分析肌膚表面的含水量。
2. 經皮水分散失量(transepidermal water loss,TEWL)
使用購自德國Courage+Khazaka electronic公司的肌膚水分散失檢測探頭Tewameter® TM 300(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)對同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係使用兩端開放的圓柱形腔體在皮膚表面形成相對穩定的測試環境,通過測定不同兩點的水蒸氣壓梯度,計算出經表皮蒸發的水分量,以此來衡量皮膚表面水分流失情況。
3. 肌膚彈性(skin elasticity)
使用購自義大利Callegari 1930公司的舒膚特皮膚生理檢測儀Soft Plus對同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後的面部肌膚進行檢測。該檢測儀係基於吸力和拉伸原理,在皮膚表面產生一個負壓,並且將皮膚吸進一個測試探頭內,透過光學測試系統檢測皮膚被吸進探頭內的深度,並以軟體分析計算皮膚彈性。
4. 肌膚皺紋(skin wrinkle)
使用購自美國Canfield scientific公司的VISIA高階數位膚質檢測儀(VISIA Complexion Analysis System)對同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後的面部肌膚進行檢測。該檢測儀係透過高解析度之相機鏡頭對面部肌膚進行拍攝,藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化,即可偵測紋理位置並得到一數值,可代表皮膚的平滑程度。
5. 膠原蛋白密度(collagen density)
使用購自丹麥Cortex Technology公司的高頻超音波檢測探頭(High Freq. Ultrasound Module) (DermaLab® USB皮膚分析儀,Denmark)對同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後的面部肌膚進行檢測。該檢測探頭係利用發送聲學脈衝波至皮膚中,將不同強度的反射信號轉化成不同色標,顏色越淺或越亮表示皮膚膠原蛋白含量較多。
6. 膚況問卷調查:
同一受試者在服用白洛神萃取物飲品前、服用14日及服用28日後進行膚況問卷調查。其中,膚況問卷調查為針對皮膚乾癢、皮膚鬆弛及皮膚缺少彈性項目進行自我評估。
試驗結果:
需要特別說明的是,第0週分別與第2週及第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是以student t-test統計分析得到。圖式中「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05、「**」代表在與第0週比較下其p值小於0.01,以及「***」代表在與第0週比較下其p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著。
1. 關於受試者之「肌膚保濕效力」的檢測結果,其顯示於圖6。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)以肌膚含水量檢測探頭Corneometer® CM825所檢測出來平均肌膚保濕度視為100%。受試者在持續服用2及4週後,其平均肌膚保濕度分別為110.4%及117.7%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚保濕度提升10.4%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚保濕度提升17.7%。由此可知,白洛神萃取物確實具有改善肌膚保濕度的能力。
2. 關於受試者之「經皮水分散失量」的檢測結果,其顯示於圖7。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)以肌膚水分散失檢測探頭Tewameter® TM 300所檢測出來平均肌膚經皮水分散失量視為100%。受試者在持續服用2及4週後,其平均肌膚經皮水分散失量分別為102.0%及87.1%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚經皮水分散失量減少12.9%。由此可知,白洛神萃取物確實可使經表皮水分散失率減少,因此提升肌膚的保濕能力,並具改善TEWL值異常之相關皮膚疾病之潛力。
3. 關於受試者之「肌膚彈性」的檢測結果,其顯示於圖8。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)以舒膚特皮膚生理檢測儀Soft Plus所檢測出來平均肌膚彈性視為100%。受試者在持續服用2及4週後,其平均肌膚彈性分別為101.9%及109.5%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚彈性提升1.9%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚彈性提升9.5%。由此可知,白洛神萃取物確實可促進並改善肌膚彈性的能力。
4. 關於受試者之「肌膚皺紋」的檢測結果,其顯示於圖9。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)以VISIA高階數位膚質檢測儀所檢測出來平均肌膚皺紋程度視為100%。受試者在持續服用2及4週後,其平均肌膚皺紋程度分別為82.7%及70.3%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚皺紋程度減少17.3%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚皺紋程度減少29.7%。由此可知,白洛神萃取物確實可減少肌膚皺紋,並改善受試者肌膚狀況,即白洛神萃取物具有撫平細紋的功效。
5. 關於受試者之「膠原蛋白密度」的檢測結果,其顯示於圖10。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)以高頻超音波檢測探頭所檢測出來平均肌膚膠原蛋白密度視為100%。受試者在持續服用2及4週後,其平均肌膚膠原蛋白密度分別為104.9%及106.6%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚膠原蛋白密度提升4.9%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚膠原蛋白密度提升6.6%。由此可知,白洛神萃取物確實可增加肌膚膠原蛋白。
6. 關於受試者之「膚況問卷調查」的自我評估結果,其顯示於圖11。將9位受試者在服用白洛神萃取物飲品前(第0週)自我評估的膚況視為100%。其中,膚況包含肌膚乾癢、肌膚鬆弛及肌膚缺少彈性。受試者在持續服用2及4週後,其肌膚乾癢嚴重度為80.0%及80.0%;其肌膚鬆弛嚴重度為72.2%及67.1%;其肌膚缺少彈性嚴重度為77.1%及71.3%。換言之,相較於服用白洛神萃取物飲品前(第0週),持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚乾癢情況減少20.0%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚乾癢情況減少20.0%;持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚鬆弛情況減少27.8%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚鬆弛情況減少32.9%;持續飲用2週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚缺少彈性情況減少22.9%,而持續飲用4週含有1.5 mL白洛神萃取物的飲品後可使此些受試者肌膚缺少彈性情況減少28.7%。換言之,受試者感覺皮膚乾燥、瘙癢、鬆弛和彈性差的嚴重程度有所減輕。
綜上,任一實施例的白洛神萃取物其可製備提升肌膚保濕的組合物。換言之,前述之組合物具有提升肌膚保濕的功能。在一些實施例中,換言之,白洛神萃取物所製得的組合物還具有下列一種或多種功能:提升維持皮膚角質細胞結構相關基因表現量、增加水通道蛋白、提升水通道蛋白基因表現量、增加神經醯胺、提升神經醯胺生成相關基因、增加玻尿酸分泌以及提升玻尿酸合成相關基因表現量。
無
圖1為細胞實驗中維持皮膚角質細胞結構相關基因相對表現量的結果圖。
圖2為細胞實驗中水通道蛋白基因相對表現量的結果圖。
圖3為細胞實驗中神經醯胺生成相關基因相對表現量的結果圖。
圖4為細胞實驗中玻尿酸合成相關基因相對表現量的結果圖。
圖5為細胞實驗中玻尿酸相對分泌量的結果圖。
圖6為人體實驗中,第0週、第2週及第4週檢測肌膚保濕度的結果圖。
圖7為人體實驗中,第0週、第2週及第4週檢測經皮水分散失度的結果圖。
圖8為人體實驗中,第0週、第2週及第4週檢測肌膚彈性度的結果圖。
圖9為人體實驗中,第0週、第2週及第4週檢測皺紋程度的結果圖。
圖10為人體實驗中,第0週、第2週及第4週檢測膠原蛋白密度的結果圖。
圖11為人體實驗中,第0週、第2週及第4週膚況問卷調查的自我評估的結果圖。
Claims (10)
- 一種白洛神萃取物用於製備提升肌膚保濕的組合物的用途,其中該白洛神萃取物係於-20±5℃下冰晶裂解一白洛神(Hibiscus sabdariffa cv.)花萼的細胞壁後,以水於85±5℃下對裂解後的該白洛神花萼進行萃取所得。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過提升維持皮膚角質細胞結構相關基因表現量以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過增加水通道蛋白以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過提升水通道蛋白基因表現量以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過增加神經醯胺以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過提升神經醯胺生成相關基因以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過增加玻尿酸分泌以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物係透過提升玻尿酸合成相關基因表現量以達到提升該肌膚保濕的效果。
- 如請求項1所述的用途,其中該白洛神萃取物的有效劑量為1.5毫克/天。
- 如請求項1所述的用途,其中該組合物為一醫藥組合物、一食品組合物、或一化妝品或保養品組合物。
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