TWI813400B

TWI813400B - 凡爾賽醋栗萃取物用於製備改善肌膚狀態組合物的用途

Info

Publication number: TWI813400B
Application number: TW111128033A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 賴柏穎; 蘇尹帝
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2022-07-26
Filing date: 2022-07-26
Publication date: 2023-08-21
Also published as: TW202404622A

Abstract

一種凡爾賽醋栗萃取物用於製備改善肌膚狀態組合物的用途，其中凡爾賽醋栗萃取物提取自凡爾賽醋栗的白色果實。

Description

凡爾賽醋栗萃取物用於製備改善肌膚狀態組合物的用途

本發明是關於凡爾賽醋栗萃取物，特別是關於凡爾賽醋栗萃取物用於製備改善肌膚狀態的組合物的用途。

醋栗屬於一種落葉灌木，具有掌狀葉形，夏季會結出大量成串的小球形態可食用果實，其基於果實的顏色有不同的分種。果實有紅色、深色和白色等不同顏色，分別稱為紅醋栗、黑醋栗和白醋栗。其中，白醋栗中的一個品種又稱為White Grape，其外觀晶瑩剔透如水晶般半透明，更擁有浪漫的別名稱為白色凡爾賽(White Versailles)，也叫凡爾塞醋栗。

凡爾塞醋栗的果實比常見的紅醋栗味道更甜，通常作為水果直接食用，或製成果凍等甜點。

為了提升凡爾賽醋栗的價值，發明人繼續研究開發凡爾賽醋栗的果實相關產品及其用途。

有鑑於此，本發明提供一種凡爾賽醋栗萃取物的用途，其是用於製備改善肌膚狀態的組合物，且凡爾賽醋栗萃取物提取自凡爾賽醋栗的白色果實。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以抵抗紫外線損傷。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以降低皮膚紋理而達到提升皮膚平滑度。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以減少皮膚泛紅狀態。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以減少皮膚黑色素含量。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以抑制酪胺酸酶活性。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚光澤以及皮膚彈力。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚纖維細胞抗氧化能力。

在一實施例中，改善肌膚狀態的組合物為食品組合物，且凡爾賽醋栗萃取物的有效劑量為0.7mL/日。

綜上所述，根據本發明任一實施例的凡爾賽醋栗萃取物，其可用於製備改善肌膚狀態的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：抵抗紫外線損傷、降低皮膚紋理而達到提升皮膚平滑度、減少皮膚泛紅狀態、減少皮膚黑色素含量、抑制酪胺酸酶活性、提升皮膚光澤、提升皮膚彈力、提升皮膚纖維細胞抗氧化能力等。

關於本文中所使用之濃度符號「%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。

關於本文中所使用之「凡爾賽醋栗」通常是指凡爾賽醋栗的白色果實。

在一些實施例中，凡爾賽醋栗萃取物是指將凡爾賽醋栗原料以溶劑進行萃取步驟後製得。在一些實施例中，凡爾賽醋栗萃取物是指將凡爾賽醋栗原料以溶劑進行萃取步驟後，再經過濾步驟以除雜質後所製得。在一些實施例中，凡爾賽醋栗萃取物是指將凡爾賽醋栗原料以溶劑進行萃取步驟後，再進行濃縮步驟後所製得。在一些實施例中，萃取溶劑較佳為水。

在一些實施例中，凡爾賽醋栗原料是指凡爾賽醋栗的白色果實，所述白色果實為全果實，全果實包括果皮、果肉及種子。在一些實施例中，凡爾賽醋栗原料是指原始新鮮、經乾燥、經冷凍或以其他物理方式加工以利於處理之完整白色果實。在一些實施例中，凡爾賽醋栗原料是指將白色果實進一步剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果實。舉例而言，將採購自法國的凡爾賽醋栗的白色果實經粉碎機進行粉碎後，再以12目數（mesh）的篩網將其過篩以形成凡爾賽醋栗原料。

在一些實施例中，萃取步驟是以凡爾賽醋栗原料與水依1：5的比例提取而得。在一實施例中，萃取步驟是以凡爾賽醋栗原料與水混合後再加熱至85±5℃持續75分鐘到100分鐘提取而得。於此特定比例的萃取溶劑與待萃物（如，粉碎後的果實）或特定的萃取時間可明顯提升萃取效率，並避免萃取時間過長造成萃取物中的有效成分可能產生降解。

在一些實施例中，過濾步驟是指以400目數（mesh）的篩網濾除細微固體。在一些實施例中，濃縮步驟是指以濃縮機在40℃到60℃下進行減壓濃縮至設定白利糖度值時停止濃縮。在一些實施例中，設定白利糖度值（Degrees Brix）是8.0±0.3。

在一實施例中，本發明提供一種凡爾賽醋栗萃取物的用途，其是用於製備改善肌膚狀態的組合物，且凡爾賽醋栗萃取物提取自凡爾賽醋栗的白色果實。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以抵抗紫外線損傷。在一些實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以使皮膚對UVA提升提抵抗力以及防禦力。在一些實施例中，經過凡爾賽醋栗萃取物處理的皮膚細胞可以提升在UVA照射下的細胞存活率。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以降低皮膚紋理以提升皮膚平滑度。意即，凡爾賽醋栗萃取物可以減少皮膚的凹陷與凸起而達到降低皮膚的粗糙度。

通常臉部泛紅是指皮膚的毛細血管擴張或末稍血管時緊時鬆，呈現反復淤血狀態，造成血管迂回擴張，形成紅血絲。在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以減少皮膚泛紅狀態。在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以降低肌膚內的毛細血管擴張的狀態以改善臉部泛紅的外觀狀態。

在一實施例中，該凡爾賽醋栗萃取物用以減少皮膚黑色素含量。在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以抑制酪胺酸酶活性。

在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚光澤以及皮膚彈力。在一實施例中，凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚纖維細胞抗氧化能力。

在一實施例中，改善肌膚狀態的組合物為食品、飲品或營養補充劑，且凡爾賽醋栗萃取物有效劑量為0.7mL/日。換言之，食用、飲品或營養補充劑包含特定含量的凡爾賽醋栗萃取物。在一些實施例中，食品可為一般食品、保健食品、膳食補充品或食品添加物（food additive）。

上述保健食品(food for special health use, FoSHU)也可稱為功能(性)食品(functional food)，是指加工成使得供給營養之外而且有效地表現出生物體調節功能的高效果的食品。在此“功能(性)”是指對人體的結構和功能調節營養素或者對生理學作用等保健用途獲得有用的效果。本發明的食品可以通過本領域常用的方法製備，在上述製備時，可以通過添加本領域通常添加的原料和成分來製備。另外，上述食品的劑型只要被認為是食品的劑型就可以不受限制地製備。本發明的食品用組合物可以以多種形式的劑型製備，並且與一般藥品不同，以食品為原料，因而具有沒有因長期服用藥品而可能產生的副作用等的優點，具有優異的可攜帶性使得本發明的食品可以作為用於增強免疫增強效果的輔助劑來攝入。

在一些實施例中，前述之食品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。

上述組合物可以進一步包含生理學上可接受的載體，並且載體的種類沒有特別限制，並且可以使用本技術領域中常用的任何載體。

另外，上述組合物可以包含通常用於食品中而可提高氣味、味道、視覺等的附加成分。例如，可以包含0.1-5重量%的維生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、菸鹼酸(niacin)、生物素(biotin)、葉酸(folate)、泛酸(panthotenic acid)等。另外，可以包含鋅(Zn)、鐵(Fe)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、鎂(Mg)、錳(Mn)、銅(Cu)、鉻(Cr)等的礦物質。另外，可以包含賴氨酸、色氨酸、半胱氨酸、纈氨酸等的氨基酸。

另外，上述組合物可以包含氧化防止劑(丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)等)、著色劑(焦油色素等)、香料(香蘭素、內酯類等)、成色劑(亞硝酸鈉、亞硝酸鈉等)、防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉、水楊酸、脫氫乙酸鈉等)、漂白劑(亞硫酸鈉)、調味料(MSG谷氨酸鈉等)、甜味料(甘素(dulcin)、甜蜜素(cyclamate)、糖精(saccharin)、鈉等)、膨脹劑(明礬、D-酒石酸氫鉀等)、強化劑、乳化劑、增稠劑(糊料)、皮膜劑、膠基礎劑、泡沫抑制劑、溶劑、改良劑等的食品添加物(food additives)。上述添加物可以根據食品的種類擇一或多進行添加以適當的量。

在一些實施例中，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的凡爾賽醋栗萃取物（即作為食品添加物）或亦稱為白醋栗(穗醋栗)汁，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的凡爾賽醋栗萃取物（即作為食品添加物）或亦稱為白醋栗(穗醋栗)汁，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品。

在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含大於有效含量的凡爾賽醋栗萃取物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。

在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。

在一實施例中，改善肌膚狀態的組合物為外用組合物。在一些實施例中，前述之外用組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的凡爾賽醋栗萃取物。

在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。

例一：凡爾賽醋栗萃取物的製備

原料：凡爾賽醋栗(學名： Ribes rubrum 'White Grape')的白色果實，採購自法國。

設備：粉碎機（Osterizer 品牌的12 speed blender）、減壓濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）。

凡爾賽醋栗萃取物的萃取方式是將凡爾賽醋栗的白色果實經粉碎機進行粉碎後形成凡爾賽醋栗原料，將凡爾賽醋栗原料與溶劑以1：5的體積比進行混合，混合後於85±5℃下進行萃取90分鐘而得到初萃取物。於此，溶劑是水。接著，將初萃取物冷卻至室溫，然後將初萃取物以400網目(mesh)的濾網對初萃取物過濾而得到濾液，然後於60±5℃下對濾液進行減壓濃縮，至濾液的白利糖度值達到8 Brix時停止，進而得到濃縮液。於此，濃縮液為凡爾賽醋栗萃取物。

例二：提升抗氧化效能測試

材料：

細胞株採用人類皮膚纖維細胞CCD-966sk，取自生物資源保存及研究中心(BCRC)；Cat. 60153 ，以下簡稱皮膚纖維細胞。

細胞培養基採用含有10 vol% FBS（購自Gibco，Cat.10437028）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1% 青霉素-鏈霉素（購自Gibco，Cat.15140122）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，Cat.11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，Cat.S5761-500G）及0.1 mM非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco，Cat.11140050）所配製而成。

磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。

台盼藍死細胞染色劑（DCFH-DA溶液）：購自Lonza，產品編號17-942E。

雙氧水（H ₂O ₂）：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。

胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。

測試流程：

將皮膚纖維細胞以每孔2×10 ⁵個的數量，接種於每孔培養於每孔含2ml培養基之培養盤中，於5%二氧化碳培養箱(購自ASTEC；Cat. SCA-165DS)中培養24小時。

將上述養成的皮膚纖維細胞分成三組。空白組，不作任何處理。對照組添加1mM的雙氧水。實驗組除了1mM的雙氧水之外，額外加入凡爾賽醋栗萃取物(濃度為0.5mg/mL)。各組進行三重複，並於37℃下，處理1小時。

接下來，添加濃度為5 μg/mL的DCFH-DA溶液2 μL於每孔中的細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。於DCFH-DA處理後，於實驗組的實驗培養基以及對照組的實驗培養基分別加入雙氧水，並於37℃下反應1小時。具體來說，35% wt的雙氧水先稀釋成100 mM（將10 μL的雙氧水加入990 μL的二次蒸餾水），再取20 μL的100 mM的雙氧水加入2mL的細胞培養盤中。反應後，每孔以1mL的1X PBS溶液潤洗2次。將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6mL細胞培養基終止反應。將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有細胞與培養基之離心管以400xg離心10分鐘。離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。再以400xg離心10分鐘。離心後，移除上清液，於暗處以1mL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。

接下來，使用流式細胞儀(品牌BD Accuri)偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490 nm，放射波長為510-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質(ROS)的生成量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行三重複，故將各組的三重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以空白組的平均值為100%的ROS的生成量為基礎，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖1所示。

所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖1所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。其中「#」代表p值小於0.05，「##」代表p值小於0.01，以及「###」代表p值小於0.001。當「#」越多時，代表統計上相對於空白組的差異越顯著）。

參考圖1。在空白組的皮膚纖維細胞並未經過特別處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其所產生的ROS量為100%。而對照組添加了雙氧水以模擬在氧化傷害下，皮膚纖維細胞所產生的ROS量為396.1%，可見雙氧水會對皮膚纖維細胞產生嚴重的傷害。反觀，實驗組的皮膚纖維細胞同樣在氧化傷害存在的情況下，若添加了凡爾賽醋栗萃取物，則可以大幅減少ROS的產生量，僅有28.4%，不僅遠低於對照組，甚至比空白組更低。可知，凡爾賽醋栗萃取物可以大幅提升皮膚纖維細胞抵抗氧化傷害的能力，甚至具有修復氧化傷害的能力。

例三：抗紫外線測試

材料：

磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。

二甲基亞碸溶液(後續簡稱DMSO溶液)：購自ECHO，產品編號DA1101-000000-72EC。

噻唑藍溶液（後續簡稱MTT溶液）：購自Amresco，產品型號0793。以 1X DPBS 配成最終濃度為 4 mg/ml 的 MTT solution

測試流程：

將皮膚纖維細胞以每孔5×10 ³個的數量，接種於每孔培養於每孔含2ml培養基之96孔培養盤中，於5%二氧化碳培養箱(購自ASTEC；Cat. SCA-165DS)中培養24小時。

將上述養成的皮膚纖維細胞分成三組。空白組與對照組，現階段不作任何處理。實驗組額外加入凡爾賽醋栗萃取物(濃度為0.5mg/mL)。

接下來，空白組靜置1小時，而對照組與實驗組進行紫外線處理。紫外線處理是將培養盤置入紫外線鏈結箱(品牌Cleaver Scientific；產品型號 CL-508)，以12J/cm ²的UVA照射1小時。各組進行三重複。

接下來，各孔添加15 μl/的MTT溶液，並於37℃下作用4小時。反應後，移除培養液，各孔再加入50μl的DMSO溶液後，於軌道震盪器上搖晃10分鐘以得到待測細胞液。

接下來，使用Epoch ^TM的分光光度計(購自BioTek)於OD值設定570下進行量測。透過以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率 (%) = (O.D. _UVA/O.D. _控制組) 100%

因實驗係進行三重複，故將三重複實驗之結果平均後，顯示於圖2。

所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖2所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。其中「#」代表p值小於0.05，「##」代表p值小於0.01，以及「###」代表p值小於0.001。當「#」越多時，代表統計上相對於空白組的差異越顯著）。

參考圖2。在空白組的皮膚纖維細胞並未經過特別處理，也就是指其在正常的生理代謝情況下，設定其細胞存活率為100%。而對照組，以12J/cm ²的UVA照射1小時模擬紫外線傷害下，皮膚纖維細胞的細胞存活率為73.3%，可見紫外線會對皮膚纖維細胞產生傷害而使細胞死亡達26.7%。反觀，實驗組的皮膚纖維細胞同樣在紫外線傷害存在的情況下，若添加了凡爾賽醋栗萃取物，則可以大幅減少細胞死亡的狀況，僅有6.6%，遠低於對照組。可知，凡爾賽醋栗萃取物可以大幅提升皮膚纖維細胞抵抗紫外線傷害的能力，達到防禦UVA的功能。

例四：酪胺酸酶活性測試

經由抑制黑色素之生成可以達到美白的目的，黑色素生成的過程中，酪胺酸酶（Tyrosinase）佔據舉足輕重之地位。酪胺酸酶是一種氧化酶，係調控黑色素生成的限速酶。具體而言，酪胺酸酶參與了黑色素合成的兩個反應：（1）將單酚羥基化為二酚，（2）將鄰二酚氧化為鄰二醌。酪胺酸酶係存在於皮膚黑色素細胞中，係由TYR基因轉錄所形成。因此，透過酪胺酸酶活性的抑制，可以達到減少黑色素之生成，以達到肌膚美白之功效。

酪胺酸酶是生物體內黑色素合成的關鍵，酪胺酸酶會催化酪胺酸轉變為L-Dopa，接著產生Dopaquinone進而形成黑色素。於此，藉由檢測酪胺酸酶活性來了解凡爾賽醋栗萃取物對於黑色素細胞產生黑色素的能力影響，當酪胺酸酶活性低時，黑色素細胞產生黑色素的能力就會相對降低。

材料：

細胞株採用小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自美國典型培養物保存中心（American Type CμLtureCollection，ATCC酶，No.6475），以下簡稱B16F10細胞。

培養基是將DMEM改良培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，購自Gibco，Cat. 12100-038）添加額外成分使其含有10 vol% FBS（fetal bovine Serum，購自Gibco，10438-026）及1%青黴素-鏈黴素 (購自Gibco，Cat. 15140122)。

磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。

麴酸（Kojic acid）：購自Sigma-Aldrich，產品編號K3125-5G。

全稱放射免疫沉澱法緩衝液蛋白質裂解液（RIPA Lysis Buffer （PMSF））：購自Sigma-Aldrich，產品編號10837091001。

Bio-rad Protein Assay，購自Biotek，產品編號Epoch。

10 mM的L-多巴（L-Dopa）：將9.8 mg 的 L-多巴（購自Sigma-Aldrich，產品編號D9628-5G。）溶於5mL的0.1mM，pH值7.0的PBS溶液中。

胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。

測試流程：

於每一孔中加入2mL上述培養基，並將B16F10細胞以每孔1.5×10 ⁵的密度種入一6孔盤中，於37°C下，培養24小時。

本實驗分為控制組、對照組、實驗組。其中，各組加入2mL的新鮮DMEM培養液。而對照組之培養液額外加入麴酸(Kojic acid)，使其濃度為0.5 mg/mL，其中麴酸已被廣泛認知為具有抑制細胞酪胺酸酶活性之物質；實驗組之培養液額外加入凡爾賽醋栗萃取物，使其濃度為0.5mg/mL。各組進行三重複，並反應培養48小時。

培養完畢後，將培養液移除，以1x PBS（Gibco）清洗兩次。再加入胰蛋白酶-EDTA對細胞作用3分鐘，回收懸浮的細胞於15 mL離心管，以400 xg離心5分鐘使細胞沉澱。再將沉澱細胞以1x PBS清洗兩次後，以200 μL細胞裂解液讓細胞懸浮，震盪混合後以12,000 xg離心20分鐘。將上清液取出至1.5 mL離心管中，進行蛋白質定量。

蛋白質定量是先將Bio-rad染劑與去離子水混合（體積比為1:4），分裝500 μL至微量離心管中。而後，分別於前述微量離心管中，加入10、8、6、4、2、1與0 μL 2mg/mL的BSA以製備標準濃度蛋白質。再加入2 μL測試樣本進行檢測。取出前述反應後之測試樣本200 μL於96孔盤中，以酵素免疫分析儀(ELISA reader)（BioTek）測定595 nm的吸光值。

接著，於每孔中加入400 μg蛋白質，再加入90 μL細胞裂解液，包括控制組及對照組。在避光環境下，在37°C下加入10 μL的L-Dopa，每10分鐘觀察一次，直到懸浮液變黑。之後再利用酵素免疫分析儀(ELISA reader)測定405 nm的吸光值進而定量細胞的黑色素含量。

由圖3之結果可知，在本發明之凡爾賽醋栗萃取物的處理下，可達到抑制酪胺酸酶活性的功效。具體而言，對照組相對空白組之酪胺酸酶活性為89.8%，實驗組(凡爾賽醋栗萃取物)相對空白組之酪胺酸酶活性為84.5%，由此可知，本案凡爾賽醋栗萃取物於抑制酪胺酸之功效更甚於麴酸之抑制酪胺酸酶活性效果。因此，藉由本發明實施例所製備之凡爾賽醋栗萃取物，確實可降低酪胺酸酶活性，進而可減少黑色素的生成，故可應用於減少皮膚黑斑、提升肌膚光澤、白皙度肌膚美白的相關組合物的成分中。

例五： 凡爾賽 醋栗萃取物食品人體試驗

受試者：8位受試者（肌膚較暗沉、鬆垮不緊緻者等狀況的成年人，年齡分布於20~55歲之間）。

測試項目及儀器：

1、肌膚泛紅狀態(Redness)：使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對受試者的面部肌膚進行檢測。其原理乃採用RBX偏振光技術進行臉部肌膚拍攝，以偵測皮膚深層血管或血紅素。於此，所測量到的肌膚泛紅數值越高，代表皮膚泛紅狀況越嚴重。

2、肌膚紋理(Texture)：使用美國Canfield所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀對受試者的面部肌膚進行檢測。其原理乃以可見光拍攝高解析度之肌膚影像，並以內建軟體根據皮膚的凹陷與凸起進行粗糙度分析。於此，測量肌膚紋理數值越高，代表皮膚越粗糙。

3、肌膚黑色素指數：使用購自德國Courage+ Khazaka electronic公司之肌膚黑色素指數檢測探頭Mexameter® MX18 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)是通過測定特定波長的光照在人體皮膚上後的反射量來確定皮膚中黑色素的含量。於此，測量肌膚黑色素指數越高，代表皮膚中黑色素含量越高。

4、肌膚光澤(Brightness)：使用購自德國Courage+ Khazaka electronic公司之肌膚光澤度檢測探頭Glossymeter GL200 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)，是由照射到皮膚表面的光的直接反射和散反射來反映的。於此，測量到的肌膚光澤數值越高，說明皮膚越具有光澤。

5、肌膚彈力(Elasticity)：使用購自德國Courage+ Khazaka electronic公司之肌膚彈力檢測探頭Cutometer® MPA580 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany)測試原理是基於吸力和拉伸原理，在被測試的皮膚表面產生一個負壓將皮膚吸進一個測試探頭內，透過光學測試系統檢測皮膚被吸進探頭內的深度，並以軟體分析計算皮膚彈性與緊實度。於此，測量到的肌膚彈力數值越高，說明皮膚越具彈性。

測試方式：

令8位受試者每日飲用1瓶凡爾賽醋栗飲（50 ml/瓶, 每瓶含0.7 mL凡爾賽醋栗萃取物），並連續飲用8周。於飲用前（即第0周，又稱對照組）及飲用8周後（即第8周，又稱為實驗組），分別使用上述儀器設備測定各受試者的面部肌膚狀況。

於此，於飲用前、後進行儀器檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響。

其中，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在如圖4到圖8中，「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，當「*」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。

需要特別說明的是，下圖中顯示的係以相對倍率呈現，即將對照組的定量結果視為100%來將實驗組的定量結果換算成相對於空白組的表現量。

測試結果：

請參閱圖4，經過八周的每日飲用凡爾賽醋栗飲後，8位受試者中有7位的肌膚泛紅數值有下降，意即改善狀況達到88%。並且，8位受試者的平均肌膚泛紅數值由100%下降到85%。意即，每日飲用0.7mL的凡爾賽醋栗萃取物可以有效減少肌膚泛紅狀態達15%。

請參閱圖5，經過八周的每日飲用凡爾賽醋栗飲後，8位受試者中有8位的肌膚紋理數值有下降，意即改善狀況達到100%。並且，8位受試者的平均肌膚紋理數值由100%下降到74.3%。意即，每日飲用0.7mL的凡爾賽醋栗萃取物可以有效提升肌膚光滑度達到25.7%。

請參閱圖6，經過八周的每日飲用凡爾賽醋栗飲後，8位受試者中有6位的肌膚黑色素指數值有下降，意即改善狀況達到75%。並且，8位受試者的平均肌膚黑色素指數由100%下降到97.8%。意即，每日飲用0.7mL的凡爾賽醋栗萃取物可以有效減少肌膚的黑色素指數達2.2%。

請參閱圖7，經過八周的每日飲用凡爾賽醋栗飲後，8位受試者中有8位的肌膚光澤數值有增加，意即改善狀況達到100%。並且，8位受試者的平均肌膚光澤數值由100%提升到121.9%。意即，每日飲用0.7mL的凡爾賽醋栗萃取物可以有效提升肌膚光澤達21.9%。

請參閱圖8，經過八周的每日飲用凡爾賽醋栗飲後，8位受試者中有8位的肌膚彈力數值有增加，意即改善狀況達到100%。並且，8位受試者的平均肌膚彈力數值由100%提升到103.1%。意即，每日飲用0.7mL的凡爾賽醋栗萃取物可以有效提升肌膚彈力達3.1%。

例六： 凡爾賽醋栗萃取物 指紋圖譜分析

於此，利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）對例一所製得的凡爾賽醋栗萃取物中的生物活性物質進行分析。

測試流程：

使用的溶劑為甲醇與水，並在甲醇與水各自添加0.1%甲酸，設定流速為1ml/min，設定沖提條件為0分鐘時甲醇：水為2：98，10分鐘時甲醇：水為2：98，40分鐘時甲醇：水為70：30，50分鐘時甲醇：水為100：0，60分鐘時甲醇：水為100：0。樣品濃度為50 mg/ml，注射量為10μL，實驗時，管柱溫度為40 ^oC。

測試結果：

參考圖9。本發明的凡爾賽醋栗萃取物經由上述的測試流程，驗證包括有如圖9上的數個波峰。其中，橫軸表示滯留時間(Min)，縱軸表示吸光強度(mAU)。結果顯示，凡爾賽醋栗萃取物至少具有以下滯留時間之HPLC波峰(表一)。

表一

波峰編號	滯留時間(分鐘)
01	30.2
02	27.4
03	31.8

雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

圖1 是凡爾賽醋栗萃取物相對ROS生成量實驗結果圖。圖2 是凡爾賽醋栗萃取物相對細胞存活率實驗結果圖。圖3 是凡爾賽醋栗萃取物相對酪胺酸酶活性抑制實驗結果圖。圖4 是凡爾賽醋栗萃取物人體實驗肌膚泛紅狀態實驗結果圖圖5 是凡爾賽醋栗萃取物人體實驗肌膚紋理狀態實驗結果圖。圖6 是凡爾賽醋栗萃取物人體實驗肌膚黑色素指數實驗結果圖。圖7 是凡爾賽醋栗萃取物人體實驗肌膚光澤提升實驗結果圖。圖8 是凡爾賽醋栗萃取物人體實驗肌膚彈力改善實驗結果圖。圖9 是凡爾賽醋栗萃取物的指紋圖譜。

Claims

一種凡爾賽醋栗萃取物的用途，其用於製備改善肌膚狀態的組合物，且該凡爾賽醋栗萃取物是以5倍水在85±5℃下萃取凡爾賽醋栗(Ribes rubrum 'White Grape')的白色果實75分鐘到100分鐘而得，其中該改善肌膚狀態是抵抗紫外線損傷、降低皮膚紋理而達到提升皮膚平滑度、減少皮膚泛紅狀態、減少皮膚黑色素含量、抑制酪胺酸酶活性、提升皮膚光澤、提升皮膚彈力、提升皮膚纖維細胞抗氧化能力其中至少一種或其組合。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以抵抗紫外線損傷。
如請求項2所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以預防紫外線造成的皮膚纖維細胞死亡。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以抑制酪胺酸酶活性。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以降低皮膚紋理而達到提升皮膚平滑度。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以減少皮膚泛紅狀態。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚光澤。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚彈力。
如請求項5到8其中任一項所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物的有效劑量為0.7mL/日。
如請求項1所述的用途，其中該凡爾賽醋栗萃取物用以提升皮膚纖維細胞抗氧化能力。