JP2023149101A

JP2023149101A - 組成物及び食品

Info

Publication number: JP2023149101A
Application number: JP2022057486A
Authority: JP
Inventors: 輝楊; Teru Yo; 智康神谷; Tomoyasu Kamiya
Original assignee: Toyo Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Toyo Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-10-13

Abstract

【課題】紫外線による刺激から肌を保護する作用、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る作用、又は肌の保湿作用に優れ、これらのいずれかの用途に用いられる組成物を提供すること。【解決手段】プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ１とし、前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ３とした際に、Ｗ３／Ｗ１が０．２以上２以下である、紫外線による刺激から肌を保護するため等に用いられる組成物。Ｗ３／Ｗ１は０．２以上１．８以下であることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、紫外線を浴びた肌を乾燥から守るために用いられる組成物、紫外線を浴びた肌を乾燥から守るために用いられる組成物、肌の保湿のために用いられる組成物及び食品に関する。

従来、皮膚のバリア機能が肌の保護や乾燥抑制、保湿との関係が知られている。表皮は、外側から「角層」、「顆粒層」、「有棘層」、「基底層）」の４つの層から成っており、その大部分を表皮角化細胞と、それが変化した細胞が占めている。表皮の一番外側にある角層は、死んで角化した細胞（角質細胞）が、何層にも重なり強固に結合することによって作られた頑丈なバリアである。また顆粒層におけるタイトジャンクションという機構もバリア機能の一部である。これらにより肌の水分の蒸散が抑制されるほか、異物の侵入を防ぐなどの皮膚のバリア機能が得られている。これらのことから、表皮角化細胞は皮膚バリア機能に重要な役割を果たす。

特に、特定波長の紫外線（ＵＶＢ）照射による活性酸素種（ＲＯＳ）は、表皮における角化細胞が角質化する過程にダメージを与えることで、皮膚バリア機能に悪影響を及ぼし、これにより皮膚の乾燥が進むと言われている。

例えば特許文献１には、イチヤクソウ科ウメガサソウ属（ＣｈｉｍａｐｈｉｌａＰｕｒｓｈ）に属する植物又はその抽出物を有効成分とする紫外線防御剤が記載されている。同文献には、同文献記載の紫外線防御剤は、安全性が高く、紫外線暴露によって誘導される皮膚障害を予防・軽減する効果を有すると記載されている。

特開２００８－２２２６３３号公報

これまで開発されてきた肌の防護剤はその作用に個人差があり、肌の防護作用が十分に得られない場合や、皮膚炎等の副作用を生じる場合があった。このような需要の多様化に答えるために、従来の紫外線に対する肌の防護剤とは異なる有効成分及び／又は該有効成分の組成を有する剤が求められている。

本発明の課題は、紫外線による刺激から肌を保護する作用、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る作用、又は／及び肌の保湿作用に優れ、これらのいずれかの用途に用いられる組成物を提供することである。

本発明は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、紫外線による刺激から肌を保護するために用いられる組成物を提供するものである。

また本発明は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、紫外線を浴びた肌を乾燥から守るために用いられる組成物を提供するものである。

また本発明は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、肌の保湿のために用いられる組成物を提供するものである。

また本発明は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する食品であって、
前記食品に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記食品に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下であり、
プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による刺激から肌を保護する旨、プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌を乾燥から守る旨、並びに、プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用を示す旨、の中から選択される一種以上を表示した食品を提供するものである。

本発明によれば、紫外線による刺激から肌を保護する作用、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る作用、又は／及び肌の保湿作用に優れ、これらのいずれかの用途に好適に用いられる組成物や食品が提供される。

以下、本発明をその好ましい実施形態に基づいて説明する。以下では、紫外線による刺激から肌を保護するために用いられる組成物、紫外線を浴びた肌を乾燥から守るために用いられる組成物及び肌の保湿のために用いられる組成物をすべて「本発明の組成物」と総称する。また上記の本発明の食品にも、下記で説明する事項は全て適合する。
本発明は、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物である。プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３は、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）に示す化学構造を有する。

本発明の組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、プロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした場合、両者の比Ｗ_３／Ｗ_１は０．２以上２以下である。Ｗ_３／Ｗ_１をかかる範囲内に設定することによって、ＵＶＢ照射による表皮角化細胞の細胞死を防止でき、ＵＶＢ照射による表皮角化細胞における活性酸素産生を抑制できる。これにより、組成物がもつ紫外線（特にＵＶＢ）による刺激から肌を保護する効果、紫外線（特にＵＶＢ）を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を十分に高めることができる。なお、本明細書において「肌」とは頭皮も含む。すなわち本発明の組成物は、頭皮に対しても上述の効果を奏するものである。

組成物がもつ紫外線による刺激から肌を保護する効果、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を十分に高める観点から、Ｗ_３／Ｗ_１は０．２以上１．８以下であることが好ましいが、更に、０．３以上１．５以下であることがより好ましく、更に、０．３以上１以下であることが一層好ましく、０．３以上０．７以下であることがより更に好ましく、０．３以上０．６以下であることが特に好ましく、０．３以上０．４９以下であることが最も好ましい。Ｗ_３／Ｗ_１がより好ましい範囲であればあるほど、上述の効果が強く奏されるようになる。

本発明の組成物中のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の含有量は、次のようにして測定する。組成物の重量を精密に測り、１０％エタノールを加えてメスアップし、口径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液を得る。下記の条件でＨＰＬＣに供し、ＰＢ１、ＰＢ３の定量を行う。
（ＨＰＬＣ条件）
・分析カラム：Ｌ－ＣｏｌｕｍｎＯＤＳ３μｍ、４．６×２５０ｍｍ（一般財団法人化学物質評価研究機構製）
・カラム温度：４０℃
・注入量：１０μＬ
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・測定波長：２８０ｎｍ
・移動相：（Ａ液）０．１Ｍ酢酸水溶液
（Ｂ液）０．１Ｍ酢酸アセトニトリル溶液
・グラジエントプログラム：表１参照

本発明の組成物は、その形態に特に制限はないが、例えば食品若しくは化粧品の形態とすることができる。本発明の組成物を食品の形態とする場合、本発明の組成物の形態は特に限定されず、任意の形態とすることができる。例えば、経口的な使用に適した形態、具体的には、粉末状、粒状、顆粒状、錠状、液状、ジェル状、ペースト状、ハードカプセルやソフトカプセルのようなカプセル状、カプレット状、タブレット状、ゲル状、ゼリー状、グミ状、ウエハース状、ビスケット状、クッキー状、ケーキ状、チュアブル状、シロップ状、スティック状、ヨーグルト状などの各形態が挙げられる。本発明の組成物は、紫外線による刺激から肌を保護、紫外線を浴びた肌を乾燥からの保護及び肌の保湿の点から、顆粒状、錠状、カプセル状、液状が好ましく、顆粒状、錠状、カプセル状がより好ましい。ここで、顆粒状とは粉末を造粒した組成物のことを言い、直接飲用してもよく、水などの液体に溶かして飲用してもよい。また、ジェル状とは水と増粘剤又はゲル化剤を含有し、粘性又は弾性を有する組成物のことを言う。

組成物中のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の合計含有量は０．０１質量％以上６０質量％以下とすることが好ましく、０．１質量％以上４０質量％以下とすることがより好ましく、０．２質量％以上２０質量％以下とすることが更に好ましい。組成物中の合計含有量を０．０１質量％以上に設定することによって、本発明のより高い効果が得られる。一方、組成物中の合計含有量を１０質量％超としても上述した効果の増強を得られない場合がある。

本発明の組成物は、Ｗ_３／Ｗ_１が上述の範囲内になるようにプロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３とを配合して調製してもよいが、プロシアニジンＢ１又はプロシアニジンＢ３の少なくとも一部として、松樹皮抽出物を用いてもよい。松樹皮抽出物を用いる場合、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の合計量中、松樹皮抽出物に由来する割合は、例えば３０質量％以上が好ましく挙げられ、５０質量％以上、又は７０質量％以上であってもよい。

プロシアニジンＢ１又はプロシアニジンＢ３として松樹皮抽出物を用いる場合には、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の含有量に特に制限はないが、本発明の効果をより高める観点から、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の合計含有量が１質量％以上の松樹皮抽出物を用いることが好ましく、１．５質量％以上の松樹皮抽出物を用いることがより好ましく、２質量％以上の松樹皮抽出物を用いることが更に好ましく、２．５質量％以上の松樹皮抽出物を用いることが特に好ましく、３質量％以上の松樹皮抽出物を用いることが最も好ましい。また、松樹皮抽出物中のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の合計含有量は、例えば、３０質量％以下であってもよく、２０質量％以下であってもよく、１０質量％以下であってもよい。

松樹皮抽出物中のプロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の質量比（Ｗ_３／Ｗ_１）に特に制限はないが、紫外線による刺激から肌を保護する効果、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を十分に高める観点から、Ｗ_３／Ｗ_１は０．２以上１．８以下であることが好ましく、０．３以上１．５以下であることがより好ましく、０．３以上１以下であることが一層好ましく、０．３以上０．７以下であることがより更に好ましく、０．３以上０．６以下であることが特に好ましく、０．３以上０．４９以下であることが最も好ましい。Ｗ_３／Ｗ_１がより好ましい範囲であればあるほど、本発明の効果が強く奏されるようになる。

前記松樹皮抽出物としては、フランス海岸松（ＰｉｎｕｓＭａｒｔｉｍａ）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等の樹皮抽出物が挙げられる。なお、収穫時期や産地の違いにより、フランス海岸松に含まれるプロシアニジンＢ１やプロシアニジンＢ３の量は大きく異なるため、フランス海岸松の樹皮抽出物のＷ_３／Ｗ_１は０．２以上２以下に含まれる場合も、範囲内に含まれない場合もある。フランス海岸松の樹皮抽出物のＷ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下の範囲に合致しない場合には、プロシアニジンＢ１やプロシアニジンＢ３の精製品を添加することにより、Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下となるように調製して用いても良い。

プロシアニジンＢ１又は／及びプロシアニジンＢ３源となる松樹皮抽出物を得るための松樹皮からの抽出方法としては、加温抽出法や超臨界流体抽出法等の公知の方法を単独で又は複数組み合わせて用いることができる。

加温抽出法は、例えば、被験物質と溶媒とを接触させ、溶媒の沸点以下の温度などで処理して、被験物質に含まれる成分を溶媒に抽出する方法である。還流抽出法であってもよい。加温抽出法で松樹皮抽出物を得る場合、抽出溶媒としては例えば水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｔ－ブチルアルコール、プロピレングリコール、アセトン、アセトニトリル、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロエチレン、食用油脂等を単独で又は複数の溶媒を組み合わせて用いることができる。抽出の効率性の観点から、抽出溶媒としては水、含水エタノール、及び含水プロピレングリコールが好ましく用いられる。これらの溶媒は１種を単独で、又は２種以上を組合せて用いられ得る。抽出の際の温度は、室温から抽出溶媒の沸点以下の温度まで、適宜調整することができる。本発明においては、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ２を効率的に抽出する観点から、水、含水エタノール及び含水プロピレングリコールが好ましく用いられる。

超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体を分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、抽出流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ－ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類を２～２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、この流体を用いて超臨界流体抽出を行うことによって、ＯＰＣ（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ：オリゴメリック・プロアントシアニジン）などの目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、又は分離の選択性を増強させる方法であり、効率的な松樹皮抽出物を得る方法である。

超臨界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質・分解する物質にも適用できるという利点、抽出流体が残留しないという利点、溶媒の循環利用が可能であるため、脱溶媒工程などが省略でき、工程がシンプルになるという利点がある。

松樹皮からの抽出は、上述の抽出法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などにより行ってもよい。

抽出により得られた松樹皮抽出物は、限外濾過、吸着性担体（ダイヤイオンＨＰ－２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ－ＬＨ２０、キチンなど）を用いたカラム法、バッチ法などにより精製を行うことが安全性の面から好ましい。

松樹皮抽出物は、保存性や加工性の観点から、粉末状のものであることが好ましく、乾燥粉末状のものであることがより好ましい。乾燥手段は特に限定されず、例えば、溶媒を含む松樹皮抽出物を、加温、日干し、熱風乾燥、凍結乾燥、減圧などによる乾燥手段を挙げることができる。乾燥の程度は、松樹皮抽出物の溶媒含有量が十分に低下したことが確認されるまでの程度であればよく、例えば、溶媒含有量が１０ｗｔ％以下、好ましくは５ｗｔ％以下となるまでの程度である。

松樹皮抽出物乾燥粉末を得るための粉末化の方法としては、例えば、当業者が通常用いる方法であるボールミル、ハンマーミル、ローラーミルなどにより、松樹皮抽出物を粉砕及び粉末化する方法が挙げられるが、これらに限定されない。乾燥と粉末化の順序を入れ替えて、乾燥前の松樹皮抽出物を予め粉砕しておき、この粉砕物を乾燥して松樹皮抽出物乾燥粉末とすることもできる。

また、松樹皮抽出物は市販されているものを用いることもでき、そのような例としては、フラバンジェノール（登録商標；株式会社東洋新薬）等を挙げることができる。

本発明の組成物を食品の形態とする場合、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３の１日の合計摂取量は０．０１ｍｇ以上２０ｍｇ以下とすることが好ましく、０．１ｍｇ以上１０ｍｇ以下とすることがより好ましく、０．２ｍｇ以上５ｍｇ以下とすることが更に好ましい。１日の合計摂取量を０．０１ｍｇ以上に設定することによって、組成物がもつ紫外線による刺激から肌を保護する効果、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果をさらに高めることができる。一方、１日の合計摂取量を１０ｍｇ以下に設定することによって、プロシアニジン高配合により製品の原価が上がることを抑制できる。

本発明の組成物は、プロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ３、及び松樹皮抽出物に含まれる成分以外のその他の成分を含んでもよい。その他の成分としては、組成物の各形態において通常用いられている成分が挙げられる。例えば本発明の組成物が食品である場合、タンパク質、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維等の食物繊維、ビタミン類、ミネラル類、藻類、乳酸菌、酵母等の微生物等を配合することができる。更に必要に応じて通常食品分野で用いられる、デキストリン、でんぷん等の糖類、オリゴ糖類、甘味料、酸味料、着色料、増粘剤、光沢剤、賦形剤、栄養補助剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、乳化剤、食品添加物、調味料等を挙げることができる。これらその他の成分の含有量は、本発明の組成物の形態等に応じて適宜選択することができる。

本発明の組成物を化粧品の形態とする場合、化粧品の種類に特に制限はなく、例えば化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、パック、浴用剤、ヘアートニック、ヘアーローション、ヘアートリートメント、ヘアークリーム、ヘアーコンディショナー、ヘアージェル、ヘアーミスト、ヘアーフォーム、コロン、洗顔料、ボディーシャンプー、シャンプー、リンス及び浴用剤等に使用することができる。

本発明の組成物は、後述の実施例に示すように、紫外線を浴びた表皮細胞（特に、表皮角化細胞）の生存率を向上させる効果と、該細胞による活性酸素の産出を低減する効果と、を有する。表皮は、水分を含む生体成分の散逸を防ぐバリアとなり、水分の過剰な蒸散を防ぐものであるから、紫外線を浴びた表皮細胞（特に、表皮角化細胞）の生存率を向上させることができる。本発明の組成物は、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を奏する。
また、紫外線を浴びた表皮細胞（特に、表皮角化細胞）内に活性酸素が産出されると、当該活性酸素に起因して、該表皮細胞（特に、表皮角化細胞）のＤＮＡ損傷及びアポトーシスが進行し、表皮のバリア機能が低下する。本発明の組成物は、紫外線を浴びた表皮細胞（特に、表皮角化細胞）による活性酸素の産出を低減することができるので、紫外線（特にＵＶＢ）による表皮のバリア機能の低下を抑制し、紫外線（特にＵＶＢ）による刺激から肌を保護する効果を奏する。本発明の組成物は紫外線３０秒以上の照射に対して表皮角化細胞の保護作用を有している。

本発明の組成物は、いずれの形態であっても、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による刺激から肌を保護する」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による刺激から肌を助ける」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による刺激から肌をサポートする」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による肌の刺激が気になる方に適した」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌を乾燥から守る」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌を乾燥から保護する」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌の乾燥を改善する」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌の乾燥が気になる方に適した」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用を示す」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用をサポートする」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用を助ける」、「プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用を改善する」等の文言が包装体や広告物等に付されているものを含む。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明する。しかしながら本発明の範囲は、かかる実施例に制限されない。

＜表皮角化細胞の生存率試験＞
〔実施例１〕
（１）培地の調製
被験物質として熱水で抽出されたフランス海岸松の松樹皮抽出物を用いた。この被験物質中のプロシアニジンＢ１の含有量は２．５２質量％、プロシアニジンＢ３の含有量は１．２２質量％であり、両者の合計含有量は３．７５質量％、Ｗ_３／Ｗ_１は０．４８であった。
被験物質にＤＭＳＯを加えて、被験物質を６．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＤＭＳＯ溶液を調製した後、血清入り培地Ａでさらに１０００倍希釈し、被験物質を６．２５μｇ／ｍＬの濃度で含有する実施例１の被験物質・血清含有培地を得た。なお、血清入り培地Ａは、Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose培地（SIGMA、以下「ＤＭＥＭ培地」ともいう。）に、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum、Japan Bio Serum）を１０容量％添加したほか、Penicillin-Streptomycin（SIGMA）を１容量％添加したものであった。

（２）表皮角化細胞の培養
ヒト表皮角化細胞であるＨａＣａＴ細胞を以下の手順で培養した。

ＨａＣａＴ細胞を、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内に設置された７５ｃｍ^２フラスコ中で、血清入り培地Ａによって培養した。培養後のＨａＣａＴ細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により浮遊させた。浮遊した細胞入り培地を、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１００μＬずつ播種した。ｗｅｌｌ中のＨａＣａＴ細胞を３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で前培養した。

前培養後、培地を除去した後、被験物質・血清含有培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で２４時間培養した（ｎ＝６）。

（３）細胞生存率の測定
細胞培養後の各ｗｅｌｌから培地上清を除去した。次いで、ｗｅｌｌ中の細胞をナカライテスク株式会社製ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略す）で３回洗浄した。ＰＢＳを５０μＬ程度残し、２０ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線Ｂ波（波長２８０～３２０ｎｍ、以下、ＵＶＢともいう。）を３０秒間照射した。ＵＶ照度計（ＵＶＰ社製）を用いて測定したＵＶ照度に基づき、照射時間を以下の式によって定めた。
照射時間（単位：秒）＝積算光量（２０、単位：ｍＪ／ｃｍ^２）／ＵＶ照度（単位：ｍＷ／ｃｍ^２）
ＵＶＢの照射後、ＰＢＳを除去し、被験物質含有無血清培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で１８時間培養した。
被験物質含有無血清培地は以下のようにして調製したものだった。
上記被験物質にＤＭＳＯを加えて、被験物質を６．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＤＭＳＯ溶液を調製した後、無血清培地Ａ’でさらに１０００倍希釈し、被験物質を６．２５μｇ／ｍＬの濃度で含有する実施例１の被験物質含有無血清培地を得た。なお、無血清培地Ａ’は、ＤＭＥＭ培地に、Penicillin-Streptomycin（SIGMA）を1容量％添加したものであった。

培地を除去後、無血清培地Ａ’で３回洗浄し、株式会社同仁化学研究所製Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８の試薬を無血清培地Ａ’で３０容量倍に希釈した培地を１５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で１時間培養した。次いで、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン株式会社製SpectraMax i3x）で測定した。測定された吸光度（Ｄａｔａ照射あり）に基づき、以下の式から、細胞生存率を求めた。
細胞生存率（％ｏｆＵＶ照射なし群）＝（Ｄａｔａ照射あり－Ｄａｔａ照射ありｂｌａｎｋ）／（Ｄａｔａ照射無し－Ｄａｔａ照射無しｂｌａｎｋ）
「Ｄａｔａ照射無し」は紫外線照射を行わなかった以外は同様にして得られたサンプルの吸光度である。また「Ｄａｔａ照射ありｂｌａｎｋ」及び「Ｄａｔａ照射無しｂｌａｎｋ」は、被験物質を添加していない培地の吸光度である。

〔実施例２〕
被験物質を１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＤＭＳＯ溶液を血清含有培地Ａで１０００倍希釈して被験物質を１２．５μｇ／ｍＬの濃度で含有する被験物質・血清含有培地を調製した。また被験物質含有無血清培地における被験物質量も同様とした。その点以外は実施例１と同様にして、細胞生存率を測定した。

〔比較例１〕
被験物質を含有しないＤＭＳＯを血清入り培地Ａ、無血清培地Ａ’でそれぞれ１０００倍希釈して比較例１の培地を調製し、これを被験物質・血清含有培地及び被験物質含有無血清培地の代わりにそれぞれ用いた以外は実施例１と同様にして、細胞生存率を測定した。

〔比較例２及び３〕
上記被験物質に代えて、プロシアニジンＢ１（比較例２）又はプロシアニジンＢ３（比較例３）を２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＤＭＳＯ溶液を血清入り培地Ａ、無血清培地Ａ’で１０００倍希釈して被験物質・血清含有培地及び被験物質含有無血清培地をそれぞれ調製した以外は、実施例１と同様にして、細胞生存率を測定した。なお、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３は純度９８％以上の市販品（ＡｄｏｏＱ－ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）を使用した。後述する実施例及び比較例で使用したプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３についても同様である。

表２には各実施例及び各比較例における細胞生存率を示す。比較例１の細胞生存率は２９．６％、比較例２の細胞生存率は３８．８％、比較例３の細胞生存率は３９．７％であったことから、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３は、それぞれ単独で用いた場合でも表皮角化細胞の生存率を向上させる効果が認められた（比較例２及び３）。これに対し、両成分をＷ_３／Ｗ_１＝０．４８の質量比で含有する被験物質（特定の松樹皮抽出物）を用いた実施例１及び２は、各成分を単独で使用した比較例２及び３と比較して、それぞれ４９．１％、４９．３％と１０％以上高い値であり、低濃度であっても高い表皮角化細胞の生存率を示した。

＜表皮角化細胞の活性酸素産生量試験＞
〔実施例３〕
（４）培地の調製及び表皮角化細胞の培養
実施例２と同様にして、上記被験物質を１２．５μｇ／ｍＬの濃度で含有する被験物質・血清含有培地を調製した。次いで、ＨａＣａＴ細胞を、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内に設置されたフラスコ中で、血清入り培地Ａによって培養した。培養後のＨａＣａＴ細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により浮遊させた。浮遊した細胞入り培地を、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１．５×1０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１００μＬずつ播種した。ｗｅｌｌ中のＨａＣａＴ細胞を３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で２４時間、前培養した。

前培養後、培地を除去した後、被験物質含有・血清培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で１８時間培養した（ｎ＝６）。

（５）活性酸素産生量の評価
培地を除去後、ＨＢＳＳ（＋）１５０μＬで２回洗浄し、２０μＭ濃度のＤＣＦＨＤＡ（２’，７’－ジクロロフルオレセインジアセタート）試薬溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５体積％ＣＯ_２のインキュベーター内で３０分間培養した。ここで、ＤＣＦＨＤＡ（２’，７’－ジクロロフルオレセインジアセタート）試薬溶液は、ＤＣＦＨＤＡを、ＤＭＳＯで１０ｍＭ溶液とした後、これを無血清培地Ａ’で２０μＭ濃度に希釈したものであった。
なお、ＨＢＳＳ（＋）とは、１０×ＨＢＳＳ（－）ｗｉｔｈｏｕｔＰｈｅｎｏｌＲｅｄ（ＷＡＫＯ）の１００ｍＬ、ＨＥＰＥＳ（２３８．３）の２．３８ｇ、ＮａＨＣＯ_３３５０ｍｇ、ＣａＣｌ_２１４０ｍｇ、ＭｇＣｌ_２１００ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１００ｍｇを９５０ｍＬ超純水に入れ、１ＭＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した後、全量を１Ｌにすることで得られたものである。
試薬を除去後、ＨＢＳＳ（＋）１５０μＬで２回洗浄した後、ＨＢＳＳ（＋）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。その後、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定し、紫外線照射前の蛍光強度を得た。測定後、ＨＢＳＳ（＋）を５０μＬ／ｗｅｌｌ抜き、２０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ（波長２８０～３２０ｎｍ）を３０秒程度照射した。ＵＶＢの照射時間は細胞生存率の測定と同様な方法で計算している。ＵＶＢを照射後、同様に蛍光光度を測定し、蛍光強度を得た（「照射終了後０時間目」）。次いで、インキュベーター内で培養し、照射終了後１、２時間後の各時点における蛍光強度を、照射前における蛍光強度で除することで、相対蛍光強度（％）を算出した。算出された相対蛍光強度を表３に示す。

〔比較例４及び５〕
フラバンジェノールに代えて、プロシアニジンＢ１（比較例４）又はプロシアニジンＢ３（比較例５）を２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＤＭＳＯ溶液を血清入り培地Ａで１０００倍希釈して被験物質・血清含有培地を調製した以外は実施例３と同様にして、紫外線を１時間照射後及び２時間照射後の蛍光強度を得た。得られた各時点における蛍光強度を、後述するコントロールの照射前、照射終了後１時間時点及び２時間時点における蛍光強度でそれぞれ除することで算出される相対蛍光強度（％）を表３に示す。

〔対照例〕
被験物質を含まないＤＭＳＯ溶液を血清入り培地Ａで１０００倍希釈して培地を調製し、被験物質・血清入り含有培地の代わりに用いた以外は実施例３と同様にして、紫外線を照射前、照射終了後１時間時点及び２時間時点のコントロールの蛍光強度を得た。

本試験において使用された２’，７’－ジクロロフルオレセインジアセタートは細胞透過性の非蛍光性プローブであり、細胞内の活性酸素と速やかに反応して蛍光性の物質に変換される。よって、本試験によって測定される蛍光強度が高いほど、紫外線照射後の細胞内に活性酸素が産生されていることを示す。本試験においても、対照例における蛍光強度は、紫外線照射前に比べて、紫外線照射後１時間後には２．４～２．８倍、照射後２時間後には２．７～３．１倍、増強していた。この点に関し、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３をＷ_３／Ｗ_１＝０．４８の質量比で含有する被験物質を用いた実施例３は、プロシアニジンＢ１又はプロシアニジンＢ３を単独で用いた比較例４～５と比較して、相対蛍光強度が低かった。すなわち、プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３をＷ_３／Ｗ_１＝０．４８の割合で含有する被験物質は、低濃度であっても、プロシアニジンＢ１又はプロシアニジンＢ３を単独で使用した場合よりも効果的に表皮角化細胞による活性酸素の産生を抑制することが分かる。

上述した通り、ＨａＣａＴ細胞のような皮膚角化細胞は、皮膚の最外層の表皮に存在する主要な細胞であり、皮膚バリア機能において重要な役割を果たす。従って、紫外線への曝露によってＨａＣａＴ細胞の死滅を抑制できることは、紫外線照射による皮膚バリア機能の低下を抑制し、紫外線刺激から肌を保護できることや、皮膚バリア機能の一つである水分蒸散抑制機能の低下を抑制し、皮膚の乾燥を防止し、保湿につながることを意味する。
またＨａＣａＴ細胞において、紫外線曝露に伴う活性酸素の産生を抑制できることは、表皮角化細胞内において、活性酸素（ＲＯＳ）が発生し、それに起因して、表皮細胞（表皮角化細胞を含む）のＤＮＡ損傷、皮膚細胞のアポトーシスが進行し、皮膚のバリア機能が低下することを防止することにつながる。なおＲＯＳにはＯ_２の逐次１電子還元産物であるＯ_２ ^－，Ｈ_２Ｏ_２，・ＯＨなどが含まれる。

以上より、本発明の組成物が、紫外線による刺激から肌を保護する用途、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る用途、及び肌の保湿用途に用いる組成物として好適であることが明らかである。

＜粉末飲料の製造＞
表４に示す割合でプロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ３、及びデキストリンを混合することにより、実施例４～１０の粉末飲料を製造した。ただし、表４において「Ｗ_３／Ｗ_１」以外は質量部を表す。実施例４～１０の粉末飲料を１回あたり１ｇ、１日１回摂取することにより、紫外線による刺激から肌を保護する効果、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を奏するものである。特に、実施例９及び１０の粉末飲料は、実施例４～８の粉末飲料に比べて優れた効果を発揮する。表４の配合の数値は質量部である。

＜錠剤の製造＞
表５に示すように、各原料を混合後、ロータリー打錠機を用いて打錠を行い、実施例１１～１２の錠剤を製造した。錠剤は、錠径８ｍｍφ、錠厚４．５ｍｍ、重量３００ｍｇ、硬度５ｋｇｆ以上で製造した。実施例１１～１２の錠剤を１日あたり２粒摂取することにより、紫外線による刺激から肌を保護する効果、紫外線を浴びた肌を乾燥から守る効果、及び肌の保湿効果を奏するものである。
ただし、表５において「松樹皮抽出物Ａ」及び「松樹皮抽出物Ｂ」は、プロシアニジンＢ１並びにプロシアニジンＢ３を合計で４質量％含有し、表５に記載のＷ_３／Ｗ_１値を有する。表５の配合の数値は質量部である。

本発明の組成物は、健康食品等として用いることができることから、産業上有用である。

Claims

プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、紫外線による刺激から肌を保護するために用いられる組成物。
プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、紫外線を浴びた肌を乾燥から守るために用いられる組成物。
プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する組成物であって、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記組成物に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下である、肌の保湿のために用いられる組成物。
プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有する食品であって、
前記食品に含まれるプロシアニジンＢ１の質量をＷ_１とし、
前記食品に含まれるプロシアニジンＢ３の質量をＷ_３とした際に、
Ｗ_３／Ｗ_１が０．２以上２以下であり、
プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線による刺激から肌を保護する旨、プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が紫外線を浴びた肌を乾燥から守る旨、並びに、プロシアニジンＢ１及び／又はプロシアニジンＢ３が肌の保湿作用を示す旨、の中から選択される一種以上を表示した食品。