CN116270784A - 青蒿提取物改善皮肤细胞炎性衰老的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了青蒿提取物改善皮肤细胞炎性衰老的应用,其中,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。本发明还涉及青蒿提取物在制备具有改善皮肤细胞炎性衰老作用的产品中的应用,其中所述产品是药品、保健食品或皮肤外用剂,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域和化妆品领域,具体涉及青蒿提取物改善皮肤细胞炎性衰老的应用。
背景技术
机体在衰老的过程中,会伴随有逐渐增强的慢性炎症反应,这种现象被称为炎性衰老(inflamm-aging),由Franceschi等在2000年首次提出。尽管科学家们对炎性衰老的定义有各自的观点,但有一点是绝对的共识,即机体随衰老出现持续的慢性炎症反应是炎性衰老的主要特征。并且发现衰老细胞能通过分泌炎症相关因子促进其附近的细胞发生改变,这些因子被他们称为SASP因子,衰老细胞的这种分泌特征被他们称为衰老相关分泌表型(SASP),这是衰老细胞最重要的生理特征之一。在SASP的参与下,慢性炎症与细胞衰老表现出了互相促进的功效。SASP是炎性衰老中慢性炎症的根源,并且SASP还可以引发正常细胞衰老进而产生更多的SASP,如此便形成一个炎症-衰老循环。SASP会进而诱导其它正常细胞的衰老。皮肤衰老细胞随着年龄增长而逐渐积累,由于其不同的衰老机制,将直接影响皮肤结构和功能。因此,研究如何抑制SASP的发展和分泌,对延缓衰老和预防衰老有重要意义。
在皮肤成纤维细胞中,衰老细胞的线粒体功能受损,导致细胞抗氧化能力减弱,氧自由基含量上升,进一步导致TNF-α、IL-6、IL-1等炎症因子过表达,使机体维持在炎症状态并逐渐发展出稳定的SASP,同时,DNA损伤累积引起的TNF-α、IL-6、IL-1等炎症因子表达上调,也会促进细胞衰老。换言之,SASP是由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等一系列细胞因子组成的,它们可以导致机体慢性低度炎症和疾病,并可以反作用于衰老细胞及其邻近细胞加速它们的衰老进程,因此,抑制和降低皮肤SASP相关指标,是一种改善炎性衰老的有效思路。
现有技术中关于抑制和降低皮肤SASP相关指标来改善炎性衰老的研究很少。例如,中国专利申请CN202111466463.3公开了苦杏仁苷或苦杏仁提取物在制备用于改善炎性衰老的化妆品及药物中的用途;CN202111651354.9公开了瓜蒌苦杏仁复方提取物或精制物在制备改善炎性衰老的化妆品中的用途。但是,这两篇专利均是利用浓度为0.25~8μg/mL脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞24小时构建炎性衰老细胞模型,并非采用的皮肤细胞。此外,中国专利申请CN202110837224.8公开了一种炎性衰老细胞模型的构建方法和应用,也是利用浓度为0.25~8μg/mL脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞24小时构建炎性衰老细胞模型,对IL-1α、IL-6、TNF-α等炎性因子,衰老相关β-半乳糖苷酶和生成活性氧ROS进行指标检测,同样不是在皮肤细胞上进行。
青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分,别名蒿子、臭蒿、香蒿、苦蒿、臭青蒿、香青蒿、细叶蒿、细青蒿、草青蒿、草蒿子。《中国药典》记录,青蒿清热解暑,除蒸,截疟。用于暑邪发热,阴虚发热,夜热早凉,骨蒸劳热,疟疾寒热,湿热黄疸。现代药理学研究,多集中在对于青蒿素一类药物的抗疟疾作用,在对近10年文献的检索,以青蒿与皮肤为关键词,功效主要集中在抗炎抗敏、免疫调节、瘢痕增生和抗菌等方面,另也有在抑制痤疮和日光性皮炎等方面研究。
迄今为止,未有青蒿提取物在针对炎性衰老,特别是在皮肤细胞模型上的炎性衰老作用的相关研究报道。尽管青蒿提取物的抗炎作用报道较多,但和炎性衰老的衰老指标是完全不同的维度和机理靶点,很多具有很好抗炎作用的提取物并不能具有抑制炎性衰老的作用。
因此,本发明意外地发现,青蒿提取物具有改善皮肤细胞炎性衰老的作用,能够抑制和降低由于慢性炎症导致的皮肤炎性衰老指标。
发明内容
一方面,本发明提供了青蒿提取物改善皮肤细胞炎性衰老的应用,其中,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
在优选的实施方式中,所述青蒿提取物的使用浓度至少为0.1%v/v,优选0.1%v/v至1%v/v。
在优选的实施方式中,所述改善皮肤细胞炎性衰老为抑制IL-6和/或抑制MCP-1的作用。在优选的实施方式中,所述改善皮肤细胞炎性衰老对MMP1没有抑制作用和/或对COL-1没有促进作用。
另一方面,本发明还涉及青蒿提取物在制备具有改善皮肤细胞炎性衰老作用的产品中的应用,其中所述产品是药品、保健食品或皮肤外用剂,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
在优选的实施方式中,青蒿提取物在药品、保健食品或皮肤外用剂中的含量为0.001-20重量%。
在优选的实施方式中,所述皮肤外用剂选自:面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
附图简要说明
图1显示了IL6数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。
图2显示了MCP-1数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。
图3显示了Collagen I数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。
图4显示了MMP-1数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。
图5显示了SA-β-gal染色图片结果(普通正置显微镜—品牌:Olympus,型号:BX53;放大倍数:20倍)。
图6显示了p21数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。
具体实施方式
本发明涉及青蒿提取物在抵御皮肤细胞炎性衰老上的作用。该作用可在化妆品中应用,抑制和降低由于慢性炎症导致的皮肤炎性衰老指标,帮助改善皮肤状态。
为了提供更简明的描述,本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解,无论是否明确地使用了术语“约”,本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值,并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值,包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。
为了提供更简洁的描述,本文中一些数量表述被叙述为约X量至约Y量的范围。应当理解,当叙述范围时,该范围并不限制于所叙述的上下界限,而应包括约X量至约Y量的整个范围或它们之间的任何量。
青蒿提取物
青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分,别名蒿子、臭蒿、香蒿、苦蒿、臭青蒿、香青蒿、细叶蒿、细青蒿、草青蒿、草蒿子。《中国药典》记录,青蒿清热解暑,除蒸,截疟。用于暑邪发热,阴虚发热,夜热早凉,骨蒸劳热,疟疾寒热,湿热黄疸。现代药理学研究,多集中在对于青蒿素一类药物的抗疟疾作用。在对近10年文献的检索,以青蒿与皮肤为关键词,功效主要集中在抗炎抗敏、免疫调节、瘢痕增生和抗菌等方面,另也有在抑制痤疮和日光性皮炎等方面研究,但未见针对炎性衰老,特别是在皮肤细胞模型上的炎性衰老作用的相关研究和报道。
在本发明中的实验条件下(提取工艺和功效研究),证实了青蒿提取物在抵御皮肤细胞炎性衰老上的作用,能够抑制和降低由于慢性炎症导致的皮肤炎性衰老指标。
在一些实施方式中,青蒿提取物的使用浓度至少为0.1%v/v。在一些实施方式中,青蒿提取物的使用浓度为0.1%v/v至1%v/v。
在一些实施方式中,所述改善皮肤细胞炎性衰老为抑制IL-6和/或抑制MCP-1的作用。在一些实施方式中,所述改善皮肤细胞炎性衰老对MMP1没有抑制作用和/或对COL-1没有促进作用。
作为提取方法,可采用通常的溶剂提取方法,例如热提、冷浸和渗滤等,本领域技术人员可以根据实际情况选用合适的提取方法。
在对青蒿进行溶剂提取时,应当选择具有以下特性的提取溶剂:①溶解性能好,即溶剂对所需成分的溶解度要大,对杂质的溶解度要小,或反之;②惰性,即溶剂不能与植物成分发生化学反应,即使反应也属于可逆性的;③操作简便,在提取的提取物后能够方便地将溶剂与提取物分离,或者能直接将溶于溶剂中的提取物用于下一步骤;④经济安全,即在选择溶剂时要考虑经济易得,毒性小,便于回收和反复使用,并具有一定的安全性,对环境污染小。
可采用惰性溶剂和反应溶剂进行提取的方法。所述惰性溶剂,是指与植物成分不起任何化学反应的溶剂,可以是水、乙醇、甲醇、苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等。所述反应溶剂,是指可增加植物中酸性和碱性成分在极性溶剂中的溶解度的溶剂,可以是稀酸或稀碱的水溶液或醇溶液,如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的溶液。
在本发明的一些实施方式中,采用水(例如,去离子水)进行提取。在本发明的一些实施方式中,采用乙醇进行提取。在本发明的一些实施方式中,可使用体积浓度40%~100%的乙醇,优选使用50%~98%的乙醇,更优选使用70%~95%的乙醇。
本发明的青蒿提取物可以通过微波提取进行制备。例如,可以采用水辅助微波方法进行提取。
本发明的青蒿提取物可以通过超声提取进行制备。例如,可以采用乙醇(例如,70体积%的乙醇)辅助超声方法进行提取。
本发明的青蒿提取物可以通过回流提取进行制备。例如,可以采用乙醇(例如,50体积%的乙醇)辅助回流方法进行提取。
在一些实施方式中,青蒿提取物通过大孔树脂洗脱。采用的大孔树脂包括:非极性,D-101(国药试剂),XAD2(罗门哈斯)、HP-20(三菱化学),HZ-802(华昌聚合物公司);弱极性,AB-8(南开合成科技),DM-130(天津海光)、XAD7(罗门哈斯);极性,DM-301(天津海光)、NKA-9(南开合成科技),HZ-806(华昌聚合物公司)。
含青蒿提取物的药品、保健食品或皮肤外用剂
本发明的青蒿提取物可以作为功效添加剂应用于药品、保健食品或皮肤外用剂中,能够抑制和降低由于慢性炎症导致的皮肤炎性衰老指标,帮助改善皮肤状态。
在一些实施方式中,青蒿提取物在药品、保健食品或皮肤外用剂中的含量0.001-20重量%,优选0.01-5重量%。
在一些实施方式中,所述药品选自:片剂、胶囊、乳剂、混悬剂、粉末剂、颗粒剂、溶液剂、以及本领域已知的各种药品剂型。根据剂型的不同类型添加不同的用量。
保健食品亦称功能性食品。它具有调节人体功能的作用,但不以治疗疾病为目的,适于特定人群食用。在一些实施方式中,所述保健食品可以是粉末剂型。
在一些实施方式中,所述皮肤外用剂选自:面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露和洗面奶。根据制剂的不同类型添加不同的用量。
所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念,例如可以是化妆品组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等,对其剂型无特殊限制,根据不同目的可合理选择。所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
皮肤外用剂含有皮肤学上可接受的载体或媒介物(例如,洗液、面霜、软膏、清洁剂等等)。本领域普通技术人员能够根据本领域公知常识,选择能够以上文所述的浓度溶解或分散这些组分的载体。当使用一种载体时,该载体应当不会导致青蒿提取物的灭活,而且在使用时不会在皮肤上带来任何相反的作用。
本领域普通技术人员能够根据公知常识和它们以最适用于处理时活性组分的浓度而溶解或分散在活性组分中的能力来选择适宜的载体,所述载体例如包括水、醇类、油等。
本发明的皮肤外用剂可以是局部施用产品的形式,其能够从外部施用在皮肤上,并能够以本领域公知的那些普通技术制备。载体可以具有各种实际的形式,例如面霜,敷料,凝胶,洗液,软膏或者液体,其包括敷用和清洗掉的组合物,以及用本领域公知的方法将它们加入到例如干的或湿的涂抹物,水凝胶基质,或粘性(或非粘性)贴片的材料载体中。优选地,载体是一种凝胶或增加水分的洗剂,或者以干或湿的形式的涂抹物。
典型的载体包括包含水和/或醇和润肤剂的乳剂,其中润肤剂是例如烃的油和蜡,硅油,透明质酸,植物、动物或海洋生物的脂肪或油,甘油酯衍生物,脂肪酸、或脂肪酸酯或醇或醇醚,羊毛脂及其衍生物,多元醇或酯,蜡酯,甾醇,磷脂等等,一般还有乳化剂(非离子的,阳离子的或阴离子的),尽管一些润肤剂本身具有乳化特性。另外,可以利用其组分的不同比例和/或通过掺入例如树胶或其他形式的亲水胶体的增稠剂将这些相同组分配制成面霜、凝胶、或固体棒。
本发明的皮肤外用剂可以包含在皮肤护理组合物中通常能找到的附加组分,例如润肤剂、皮肤调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、螯合剂等,只要它们与皮肤外用剂中其他的组分在物理上和化学上相容、且不影响本发明的青蒿提取物的效果即可。
在本发明的皮肤外用剂的一些实施方式中,可使用一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括对羟基苯乙酮、C1-C4对羟基苯甲酸烷基酯和苯氧基乙醇。基于组合物总重量,防腐剂的用量为大约0.5至大约2重量%,优选大约0.5至1重量%。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中,可使用一种或多种抗氧化剂。适宜的抗氧化剂包括丁化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸棕榈酸酯(BHA)、丁羟茴醚、苯基-α-萘基胺、氢醌、没食子丙酯、去甲二氢愈创木酸、维生素E或维生素E的衍生物、维生素C及其衍生物、泛酸钙、绿茶提取物和混合的多酚,以及上面所述的物质的混合物。所使用的抗氧化剂是组合物总重量的大约0.02至0.5重量%,更最优选的是从大约0.002至0.1重量%的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中,可使用一种或多种润肤剂,通过其保持在皮肤表面上或在角质层中的能力,起到润滑剂的作用,以减少剥落,改善皮肤的外观。典型的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等等。适宜的润肤剂的例子非限定地包括,聚丙二醇(“PPG”)-15十八烷基醚,PPG-10十六烷基醚,Steareth-10,Oleth-8,PPG-4十二烷基醚,维生素E醋酸酯,羊毛脂,鲸蜡醇,鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯,十六十八醇,甘油硬脂酸酯,羟基硬脂酸辛脂,二甲基聚硅氧烷,以及它们的组合。鲸蜡醇,鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯,十六十八醇,甘油硬脂酸酯以及它们的组合是优选的。使用时,润肤剂是基于组合物总重量的大约0.1至大约30重量%,优选大约1至大约30重量%的用量范围。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中,可使用一种或多种保湿剂。保湿剂也称为湿润剂,其有助于提高润肤剂的效果,减少剥落,刺激组成的鳞皮的去除和提高皮肤触感。可使用多元醇作为保湿剂,包括但并不限于,甘油,聚亚烷基二醇,亚烷基多元醇及其衍生物,包含丁二醇、丙二醇、双丙二醇,聚丙三醇,聚乙二醇及其衍生物,山梨醇,羟丙基山梨醇,己二醇,1,3-二丁二醇,1,2,6-己三醇,乙氧基化甘油,丙氧基化甘油,以及它们的组合。使用时,基于组合物的总重量,保湿剂的用量为大约0.1至大约20重量%,优选是大约1至大约15重量%。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中,可使用一种或多种乳化剂。乳化剂可在有效稳定量的范围内使用。优选地,在组合物总重量的基础上,以大约1.0至大约10.0重量%,更优选的是大约3.0至大约6.0重量%的用量来使用乳化剂。可以使用任何与组合物中的组分相容的乳化剂。适宜的乳化剂包括硬脂酸,鲸蜡醇,甘油硬脂酸酯,卵磷脂,十八烷醇,Steareth-2,Steareth-20,丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物,以及它们的组合。
在本发明的皮肤外用剂的一个实例中,可使用一种或多种pH调节剂。本发明的皮肤外用剂中有益的pH调节剂包括氨丁三醇。使用时,基于组合物的总重量pH调节剂的用量为大约0.1至大约2重量%,优选是大约0.1至大约1重量%。
在本发明的一个具体实施方式中,皮肤外用剂包含丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、甘油、对羟基苯乙酮、甘油硬脂酸酯和卵磷脂、十六/十八醇、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、氨丁三醇或它们的组合。
在本发明的一些实施方式中,皮肤外用剂中青蒿提取物的用量为0.001%-20%(w/w),优选的重量百分比为0.01%-20%(w/w),更优选的重量百分比为0.01%-10%(w/w),最优选的重量百分比为0.1%-5%(w/w)。
在本发明的一个具体实施方式中,皮肤外用剂中青蒿提取物的用量为0.1-5重量%。在优选的实施方式中,皮肤外用剂中青蒿提取物的用量为0.13重量%。
实施例
下面结合具体实施例,以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是,实施例只用于对本发明进行进一步的说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明,所有的百分比和份数按重量计。
以下实施例中采用的青蒿均来自安徽亳州京皖饮片厂。离心条件包括:上海卢湘仪离心机仪器有限公司,3~20℃,3500~5000rpm条件下离心5~20min。超声提取条件包括:超声时间20~50min,超声2~8s,间隙2~5s。乙醇和丙二醇购自国药试剂,滤纸购自Whatman公司。
实施例中采用的大孔树脂包括:非极性,D-101(国药试剂),XAD2(罗门哈斯)、HP-20(三菱化学),HZ-802(华昌聚合物公司);弱极性,AB-8(南开合成科技),DM-130(天津海光)、XAD7(罗门哈斯);极性,DM-301(天津海光)、NKA-9(南开合成科技),HZ-806(华昌聚合物公司)。
实施例1:青蒿提取物的制备
青蒿50g,用15倍去离子水提取2次,每次1h,筛网过滤(上海宜昌仪器纱筛厂,20目),滤液浓缩至3倍生药量,加入一定量95%乙醇醇沉,滤纸过滤,浓缩回收至无醇味,最终配制成固含1.5%溶液,即得。
实施例2:青蒿提取物的制备
青蒿75g,用25倍去离子水微波提取1次,微波45min,温度35℃,功率0.60kw,离心(5000rpm离心10min)过滤,滤液浓缩至2倍生药量,加入一定量95%乙醇醇沉,离心(5000rpm离心10min)过滤,浓缩回收至无醇味,上大孔树脂(D-101,国药试剂),洗脱回收乙醇,最终配制成固含5.5%溶液,即得。
实施例3:青蒿提取物的制备
青蒿125g,用20倍70%乙醇超声提取2次,每次超声40min(室温超声,超声6s,间隙2s),离心(5000rpm离心10min)过滤,滤液浓缩回收无醇味,配制成固含2.5%溶液,即得。
实施例4:青蒿提取物的制备
青蒿200g,用10倍去离子水提取2次,筛网过滤(上海宜昌仪器纱筛厂,20目),滤液浓缩至1倍生药量,加入一定量95%乙醇醇沉,滤纸过滤,浓缩回收乙醇,过50nm陶瓷膜(厦门福美科技)浓缩至固含4.5%溶液,即得。
实施例5:青蒿提取物的制备
青蒿250g,用6倍50%乙醇60℃回流提取1次,提取1.5h,离心(5000rpm离心10min)过滤,滤液加入去离子水和甘油,其中甘油50%,余下用去离子水配制成固含3.5%溶液,即得。
实施例6:细胞炎性衰老指标测试
本测试采用H2O2刺激成纤维细胞,通过检测样品作用后促炎因子(IL-6)含量、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)含量、Ⅰ型胶原(CollagenΙ)蛋白含量、基质金属蛋白酶1(MMP-1)分泌量、P21基因表达量的变化以及衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性,评价抵御皮肤细胞炎性衰老的效果。
1.细胞模型与主要试剂:
成纤维细胞(广东博溪生物科技有限公司);低糖DMEM培养液(博溪生物)、PBS(博士德)、H2O2(Sigma)、IL-6ELISA试剂盒(Abcam)、MCP-1ELISA试剂盒(Proteintech)、CollagenΙELISA试剂盒(Abcam)、MMP-1ELISA试剂盒(Abcam),RNAiso Plus(Takara)、反转录试剂盒(Takara)、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天)。
2.主要设备
CO2培养箱(Thermo,150i)、超净工作台(苏州安泰,SW-CJ-1F)、酶标仪(BioTek,Epoch)、荧光定量PCR仪(BioRad,CFX-96)、正置显微镜(Olympus,BX53)。
3.实验方法:
3.1实验分组
3.2实验步骤
按1×105/孔的接种密度,接种成纤维细胞至6孔板,然后连续3天,每次加入含400μM H2O2的无血清培养基,刺激2h,加入正常培养基后孵育24h,然后进行5次传代,随后按80%~90%的铺板率,接种细胞至细胞板,收样,进行各指标检测。
ELISA测试:
1)接种:按80%~90%的铺板率接种细胞至6孔板,培养箱(37℃、5%CO2)中孵育24h。
2)ELISA检测:孵育24h后,收集上清液,按照ELISA试剂盒说明书开展检测。
SA-β-gal染色测试:
1)接种:按80%~90%的铺板率接种细胞至6孔板,培养箱(37℃、5%CO2)中孵育24h。
2)孵育24h后,吸除细胞培养液,用PBS洗涤1次,加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液,室温固定15min。
3)吸除细胞固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次3min。
4)吸除PBS,每孔加入1毫升染色工作液。
5)37℃孵育过夜,可以用封口膜封住6孔板防止蒸发。
6)普通光学显微镜下观察拍照。
基因测试:
1)接种:按80%~90%的铺板率接种细胞至6孔板,培养箱(37℃、5%CO2)中孵育24h。
2)收样:孵育24h后,弃掉上清,1mL/孔PBS清洗两次,每孔加入1mL RNAiso Plus,吹打裂解细胞后,收样。
3)检测:提取RNA,反转录至cDNA后,进行荧光定量PCR检测,采用2-△△CT方法进行结果计算。
4.结果统计分析
应用GraphPad Prism作图,结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异,P<0.01认为具有极显著差异。
5.实验结果:
图1显示了IL6数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。如图1所示,与BC组相比,NC组的IL-6含量显著上升,说明本次测试刺激条件有效。与NC组相比,0.3%、0.6%实施例4青蒿提取物均能显著抑制IL6(p<0.01),说明可以抑制衰老细胞中的促炎因子,降低炎性衰老可能。
图2显示了MCP-1数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。如图2所示,与BC组相比,NC组的MCP-1含量显著上升,说明本次测试刺激条件有效。与NC组相比,0.3%、0.6%实施例青蒿提取物均能显著抑制MCP-1(p<0.01),说明可以抑制衰老细胞中的趋化因子,降低炎性衰老可能。
图3显示了Collagen I数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。如图3所示,与BC组相比,NC组的Collagen I含量显著下降,说明本次测试刺激条件有效。与NC组相比,0.3%、0.6%实施例青蒿提取物均能未显示出对Collagen I的促进(p>0.05),一定程度提示了炎性衰老与常规报道抗衰老的促进胶原机理是不同的,并不能通过常规促进胶原的抗衰老作用推测出是否具备抵御炎性衰老作用。
图4显示了MMP-1数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。如图4所示,与BC组相比,NC组的MMP1含量显著上升,说明本次测试刺激条件有效。与NC组相比,0.3%、0.6%实施例青蒿提取物均能未显示出对MMP1的抑制,相反显示出一定的促进(p<0.01),与I型胶原结果类似,同样一定程度提示了炎性衰老与常规报道抗衰老的机理是有所区别的,意味着不能通过常规促进胶原或者降低降解胶原酶的抗衰老作用推测出是否具备抵御炎性衰老作用。
图5显示了SA-β-gal染色图片结果(正置显微镜,Olympus BX53,放大倍数为20倍)。如图所示,与BC组相比,NC组的SA-β-gal阳性细胞率显著上升(蓝色染色细胞),说明本次测试刺激条件有效。而0.3%、0.6%实施例青蒿提取物可见蓝色染色细胞明显降低,意味着SA-β-gal阳性细胞率的降低。说明0.3%、0.6%实施例青蒿提取物均可减少细胞衰老关键标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-gal),从而提示抑制了细胞炎性衰老。
图6显示了p21数据结果的柱状图。用t-test方法进行统计分析时,与BC组相比,显著性以#表示,P值<0.05表示为#,P值<0.01表示为##;与NC组相比,显著性以*表示,P值<0.05表示为*,P值<0.01表示为**。如图6所示,与BC组相比,NC组的P21基因含量显著上升,说明本次测试刺激条件有效。与NC组相比,0.3%实施例青蒿提取物显示出对p21的抑制。P21是一种细胞周期蛋白抑制因子,在衰老的细胞和组织中P21存在明显的高表达。基因测试结果说明实施例青蒿提取物可以降低细胞衰老指标,减少炎性衰老。
本发明所述的青蒿提取物可以作为中间体原料或功效添加剂用于药品、保健食品或皮肤外用剂的制备,所述皮肤外用剂优选为化妆品组合物,包括但不限于面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾(清洁泡)、喷雾、沐浴露和洗面奶等剂型的产品的制备,实施例1-5青蒿提取物,在皮肤外用剂中的重量百分比为0.0001%-20%(w/w)。优选的重量百分比为0.001%-10%(w/w)。更优选的重量百分比为0.001%-5%(w/w)。最优选的重量百分比为0.01%-5%(w/w)。
以下是实施例1-5获得青蒿提取物在皮肤外用剂中的具体应用例,以及这些剂型的配方和制备方法。具体应用例如下:
应用例1:胶囊的制备
取实施例1制备的青蒿提取物的固含溶液,浓缩至稠膏,加入麦芽糊精,混匀,制粒,装入胶囊,每粒装0.2g,制成1000粒,即得。
应用例2:中药制剂的制备
将实施例2制备的青蒿提取物的固含溶液,在室温下用超滤膜(200nm陶瓷膜),截留分子量大于30000,将经过超滤膜的超滤液(分子量小于30000)保存备用。在室温下用纳滤膜过滤分子量小于30000的超滤液,截留分子量大于300的浓缩液备用。将分子量大于300的浓缩液无菌冷冻干燥,制成冻干粉。将冻干粉制成胶囊和粉针剂,获得目标产物--用青蒿提取物制成的中药制剂。
应用例3:面霜的制备
应用例4:乳液的制备
应用例5:啫喱的制备
应用例6:化妆水的制备
应用例7:精华液的制备
应该例8:面膜的制备
应用例9:眼霜的制备
应用例10:气雾(清洁泡)的制备
应用例11:喷雾的制备
应用例12:沐浴露的制备
应用例13:洗面奶的制备
Claims (10)
1.青蒿提取物改善皮肤细胞炎性衰老的应用,其中,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
2.如权利要求1所述的应用,其中,所述青蒿提取物的使用浓度至少为0.1%v/v。
3.如权利要求2所述的应用,其中,所述青蒿提取物的使用浓度为0.1%v/v至1%v/v。
4.如权利要求1所述的应用,其中,所述改善皮肤细胞炎性衰老为抑制IL-6和/或抑制MCP-1的作用。
5.如权利要求1所述的应用,其中,所述改善皮肤细胞炎性衰老对MMP1没有抑制作用和/或对COL-1没有促进作用。
6.青蒿提取物在制备具有改善皮肤细胞炎性衰老作用的产品中的应用,其中所述产品是药品、保健食品或皮肤外用剂,所述青蒿提取物采用溶剂提取法制备。
7.如权利要求6所述的应用,其中,青蒿提取物在药品、保健食品或皮肤外用剂中的含量为0.001-20重量%。
8.如权利要求6所述的应用,其中,所述皮肤外用剂选自:面霜、乳液、啫喱、化妆水、精华液、面膜、眼霜、气雾清洁泡、喷雾、沐浴露、或洗面奶。
9.如权利要求6所述的应用,其中,所述改善皮肤细胞炎性衰老为抑制IL-6和/或抑制MCP-1的作用。
10.如权利要求6所述的应用,其中,所述改善皮肤细胞炎性衰老对MMP1没有抑制作用和/或对COL-1没有促进作用。
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