KR20210056140A - 유리딘 함량이 증가된 적채 발효 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유리딘 함량이 증가된 적채 발효 추출물 및 이를 함유하는 피부장벽 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

유리딘 함량이 증가된 적채 발효 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{EXTRACT OF FERMENTED RED CABBAGE WITH INCREASED URIDINE CONTENT AND COSMETIC COMPOSITION CONTAINING THE SAME, AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 유리딘 함량이 증가된 적채 발효 추출물 및 이를 함유하는 피부장벽 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 하나의 막으로 여러 가지 외부의 자극, 장해, 건조 등의 환경요소로부터 신체를 보호해 주는 다양한 생리적 기능을 수행하여 내부 장기와 그 밖의 체내 기관을 보호 조절하는 역할을 한다.

그러나 나이가 들어감에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하며, 면역세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되고, 외적으로는 오존층 파괴와 같은 환경오염으로 인한 자외선, 자유 라디칼 및 활성산소의 증가로 인하여 발생하는 물리적, 화학적 자극 및 스트레스로 인한 피부의 정상기능이 약화되고 노화가 촉진되며 혈색이 나빠지고 피부가 주름지게 된다.

피부는 크게 표피, 진피, 피하지방조직의 3개 층으로 구성된다. 표피(epidermis)는 바깥쪽에서 안쪽으로 각질층, 투명층, 과립층, 기저층으로 나뉜다. 표피의 최외곽 층인 피부 각질층(stratum corneum)은 피부장벽 기능의 가장 중요한 구조로서, 무핵의 편평한 각질세포(corneocytes)와, 각질세포간 지질(SC intercellular lipid)로 이루어져 있다. 정상적인 표피세포의 분열 및 분화과정을 통해 유지되는 피부장벽의 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층지질막(multi lamella lipid layer)은 피부 내의 수분이 증발하지 않도록 방어막 역할을 한다.

피부 각질층의 각질세포 간에는 다양한 종류의 지질이 존재하고, 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 피부 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 한다.

각종 스트레스나 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 잦은 세안 및 자연적인 피부 노화, 필라그린 유전자(FLG)기능 소실 돌연변이 등의 여러 가지 원인으로 인하여 피부장벽이 손상될 수 있다. 피부장벽이 손상되면 화학물질과 미생물들이 피부 속으로 쉽게 침투하여 피부염, 피부 건조증 등을 유발할 수 있다.

따라서, 피부장벽의 손상이 오기 전에 피부장벽을 선제적으로 보호, 강화 내지는 개선하기 위한 피부 장벽 강화 또는 피부 보습을 위한 조성물이나 기능성 화장품이 최근 주목을 받고 있다.

또한, 화장품 업계에서는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 제품이 다수 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

이에 따라, 생체 안전성이 우수하고 피부장벽 개선 효과가 우수한 천연물 유래 화장품 제품의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.

한국등록특허 제10-0687468호

본 발명의 목적은 유리딘 함량이 증가된 적채 발효 추출물을 포함하는 피부장벽 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, (a) 적채(Brassica Oleracea Capitata; red cabbage)를 동결 건조하는 단계;

(b) 상기 동결 건조된 적채에 발효 균주를 접종하여 발효시키는 단계; 및

(c) 상기 발효물을 용매로 추출하고 감압 농축하는 단계를 포함하는, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 (a) 단계의 동결 건조는 -60℃ 내지 -80℃ 조건에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 적채 잎을 동결 건조 처리한 경우와 열풍 건조한 경우의 유리딘 함량 및 피부장벽 개선 효과 차이를 확인하였으며, 그 결과 동결 건조 처리한 경우에 현저히 높은 유리딘 함량 및 피부장벽 개선 효과를 갖는 것을 확인하였다(도 1 내지 3).

본 발명에서 용어 “적채(Brassica Oleracea Capitata; red cabbage)”는 십자화과에 속하는 식물로서, 붉은꽃 양배추 또는 빨간 양배추, 적양배추, 루비볼이라고도 불리우는 식물을 의미한다. 적채는 흰색의 보통 양배추보다 과당과 포도당, 식물성 단백질 리신, 비타민C 등의 영양 성분이 더 많이 함유되어 있다.

또한, 상기 적채는 비타민U 함유량이 많아 위궤양에 효과가 있고, 노화방지와 수은중독 방지, 간기능 회복 등의 역할을 하는 셀렌(셀레늄)도 풍부하여 대표적인 건강채소로 꼽힌다.

십자화과 식물(cruciferous vegetable)에 속하는 겨자, 서양고추냉이, 적채, 무, 콜리플라워, 싹눈, 적채, 케일, 브로콜리, 배추, 냉이, 꽃다지 등은 플라보노이드를 비롯한 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있다.

상기 십자화과 식물들은 글루코시놀레이트(glucosinolates) 및 이들의 가수분해 산물인 인돌(indole), 이소시오시아네이트(isothiocyanate)를 다량 함유하고 있으며, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 글루코시놀레이트 및 그 분해 산물을 다량 함유하므로 이로 인한 항염 또는 항스트레스 활성이 우수하다.

본 발명자들은 상기 적채 발효 추출물의 우수한 유리딘 함량 및 이로 인한 피부 개선 효과를 확인하였으며, 미세먼지 등 외부자극으로부터 피부를 효과적으로 보호하고 피부장벽을 개선할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 (b) 단계의 발효 균주는 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있고, 구체적으로는 바실러스 아밀로리퀘페시언스 AMI-0101(기탁번호 KCCM 12382P)일 수 있으며, 접종 비율은 1:10의 비율로 접종한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 AMI-0101는 적채 발효 균주 중 활성이 가장 우수한 균주를 선정한 것이다.

구체적으로, 상기 바실러스(Bacillus) 균주가 적채 발효에 가장 적합한 균주로 선정되었고, 그 중 외부 자극에 의한 피부 보호 및 항스트레스 효과가 가장 우수한 발효 균주로 바실러스 아밀로리퀘페시언스가 선정되었다.

상기 가장 우수한 효과를 보인 발효 균주를 바실러스 아밀로리퀘페시언스 AMI-0101로 명명하였으며, 이를 한국미생물보존센터에 2018년 11월 12일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM12382P를 부여 받았다.

특히, 본 발명자들은 상기 바실러스 아밀로리퀘페시언스 발효에 의해 적채 추출물에 함유된 다양한 화합물의 가수분해가 촉진되고, 이로 인해 유리딘 함량 증가, 필라그린 발현 촉진 등 피부 개선 효과가 현저히 개선될 수 있음을 확인하였다(도 1 및 2).

본 발명의 일 측면에서, 상기 (b) 단계의 발효는 30℃에서 5 내지 6일간, 호기 조건 하에서 80 내지 90%의 습도를 유지하며 이루어지는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “발효”는 발효 균주 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 발효 균주를 통한 발효과정을 거친 원료는 발효 전보다 최소 2배에서 최대 수십배의 효과가 증대되는 것으로 알려져 있다.

상기 발효를 거친 대사물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산, 항산화 물질을 함유하여 피부대사를 촉진시켜 피부결을 매끄럽게 가꿔준다. 또한, 발효과정을 거치면서 입자가 작아지고 중금속 등의 독성이 분해되어 흡수율이 좋을 뿐 아니라 피부트러블이나 알레르기 부작용이 완화될 수 있다.

본 발명에서 용어 “발효 추출물”은 상기 적채를 멸균하고 발효 균주를 접종하여 소정의 조건에서 발효한 후, 특정 용매로 추출하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어 “추출물”은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분으로 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다.

예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물은 건조 후 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득할 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 60 내지 80% 농도(v/v)의 에탄올에 의해 추출될 수 있다.

상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있으며, 상기 에탄올은 천연 원료의 생리 활성 물질 추출에 있어서 선택성이 뛰어나므로 상기 에탄올 추출에 의해 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다.

상기 추출물은 추출 원료를 물로 수세한 후 건조 및 분쇄하여, 원료 중량의 8 내지 12배에 달하는 부피의 용매로 약 1 내지 24시간 동안 환류 순환 추출, 가압 추출, 초음파 추출 등 통상적인 방법으로 추출 및 여과하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 감압 증류 또는 동결 건조 등과 같은 추가적인 공정에 의해 분말 상태로 수득할 수 있다.

상기 추출물은 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물은 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “유리딘”은 RNA를 구성하는데 필요한 4개의 리보뉴클레오사이드 중 하나로서 자연계에 널리 분포되어 있는 물질로 분자량은 244.20 이며, 분자식은 C₉H₁₂N₂O₆이다.

현재까지 알려져 있는 유리딘의 약리작용으로는, 유리딘이 체내에 투여되는 경우 유리딘키나제 효소의 촉매작용에 의하여 유리딘 5'-포스페이트로 전환되고, 효소의 결핍이나 피리미딘 뉴클레오타이드 결핍과 핵산합성의 결핍에 유용하여 오르틱산뇨증을 경감시키는 약제로 사용된 경우가 보고된 바 있다. 또한 유리딘을 사용한 콜라겐 관절염 치료제와 관련된 특허가 등록된 바 있으며, 현재까지 의약품에 사용된 경우를 살펴보면 다른 약효물질과 복합제제로서 혈관성 뇌질환, 간장보호, 말초신경증, 조직저산소증 등에 사용된 예가 보고되었다. 유리딘에 대한 독성 실험결과, 건강한 랫트 및 마우스에 유리딘 0.01, 0.1, 10, 100mg/Kg을 투여하고 1주일 이상 관찰하여 아무런 이상을 발견할 수 없어 거의 독성이 없음을 확인하였다.

본 발명에서 상기 유리딘은 유리딘 및 그 유도체를 모두 포함하는 것으로 사용된 것일 수 있으며, 유리딘의 유도체는 우라실, 유리딘모노포스페이트, 유리딘디포스페이트, 트리아세틸 유리딘, 트리벤조일유리딘, 이소프로필리덴 유리딘 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 측면은, 상기한 제조방법으로 제조된, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 유리딘의 함량이 증가된 것으로서, 피부장벽 개선용인 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 “피부장벽 개선”은 피부의 가장 외각에 위치하는 각질층의 장벽기능을 개선하는 것을 의미한다. 피부의 1차 방어막인 각질층은 물리적 자극이나 상처에 의해 손상될 수 있으며, 아토피 피부염이나 건조한 피부를 가지는 사람의 경우 각질층의 피부장벽의 기능이 제대로 이루어지지 않거나 손상되어 있는 것으로 알려져 있다. 아토피나 건조한 피부의 치료나 손상을 줄이기 위해 보습제를 바르는 것이 일반적이나, 일반 보습제는 단순히 수분을 보충하거나 피부를 덮어주는 기능을 할 뿐 근본적인 문제를 해결할 수 없다는 한계점을 가진다.

이러한 측면에서, 본 발명의 피부장벽 개선은 단순한 피부 보습 효과를 넘어서 근본적인 피부장벽 개선과 관련된 인자인 필라그린(filaggrin), 로리크린(loricrin), 인볼루크린(involucrin)과 같은 피부장벽 단백질의 발현량 증가를 의미하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 필라그린의 발현 증가를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 피부장벽 개선 용도 외에도, 피부 보습 또는 피부 진정용도를 추가로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 “피부 진정”은 홍반 또는 자극받은 피부 부위 등을 완화시키고 가라앉히는 것을 의미한다. 예컨대, 상기 피부 진정은 염증 개선 또는 치료, 경피 수분 손실 감소 또는 붉은기 감소를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 유리딘 함량이 증가된 발효 적채의 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 우수한 피부장벽 개선효과를 나타낸다.

본 발명의 조성물은 천연물 유래의 물질이어서 독성이 없으며, 인체에 적용하여도 부작용을 유발하지 않아 화장료 조성물로의 활용도가 높다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 발효 공정에 의한 다량의 유효성분을 포함하므로 피부 개선 효과가 현저히 개선될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 적채를 발효시키거나(Bacillus) 발효시키지 않은 경우(control) 각각에 대하여 열풍 건조 및 동결 건조시킨 경우의 유리딘 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 피부각질세포(HaCaT)에 실시예 및 비교예의 적채발효 추출물을 처리한 경우의 필라그린(Filaggrin) 발현정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 적채발효 추출물을 사용한 경우, 외부 자극에 의해 손상된 피부의 개선효과를 측정한 임상시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 적채발효 추출물을 사용한 경우, 외부 자극에 의해 손상된 피부의 개선정도를 사진으로 촬영한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 동결 건조된 적채 추출물의 제조

깨끗이 씻어 준비한 제주도 산의 유기농 적양배추(적채)의 잎을 -60℃ 내지 -80℃ 조건에서 동결 건조 처리하였다.

상기 동결 건조된 적양배추 잎 300g을 분쇄하여 정량하고, 600g의 정제수를 혼합하여 수분을 흡수시켰다.

상기 동결 건조된 적양배추 잎과 정제수 혼합물에 대하여 10배 부피의 70%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 2시간동안 환류 추출하였다.

상기 추출물을 250메쉬 및 0.5㎛ 필터에 의해 여과하였으며, 40℃에서 감압 농축 후 동결 건조하여 적채 동결 건조 추출물의 고형분을 수득하였다.

실시예 2. 동결 건조된 적채의 발효 추출물의 제조

적채 잎을 -60℃ 내지 -80℃ 조건에서 동결 건조 처리하였다.

상기 동결 건조된 적채 잎 300g을 분쇄하여 정량하고, 600g의 정제수를 혼합하여 수분을 흡수시킨 후, 121℃에서 20분간 고압 멸균처리 하였다.

상기 멸균된 혼합물에 발효 균주로 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) AMI-0101(기탁번호 KCCM12382P) 30g을 접종하였다.

발효 균주가 접종된 적채 분쇄물을 30℃에서 5일간, 호기 조건 하에서 80 내지 90%의 습도를 유지하며 배양하였다. 발효된 적채에 대해 10배 부피의 70%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 80℃에서 2시간동안 환류 추출하였다.

상기 추출물을 250메쉬 및 0.5㎛ 필터에 의해 여과하였으며, 40℃에서 감압 농축 후 동결 건조하여 적채 발효 추출물의 고형분을 수득하였다.

비교예 1. 열풍 건조된 적채의 추출물의 제조

실시예 1의 적채 동결 건조 추출물 제조과정 중 동결 건조 과정을 40℃ 내지60℃의 열풍 건조로 대체한다는 점을 제외하고는 동일한 방법으로 적채 열풍 건조 추출물을 고형분 형태로 수득하였다.

비교예 2. 열풍 건조된 적채의 발효 추출물의 제조

실시예 2의 적채 발효 추출물의 제조과정에서 동결 건조 과정을 40℃ 내지 60℃의 열풍 건조로 대체한다는 점을 제외하고는 동일한 방법으로 열풍 건조된 적양배추의 발효 추출물을 고형분 형태로 수득하였다.

실험예 1. 제조 방법에 따른 적채 추출물의 유리딘 함량 분석

상기 실시예 및 비교예의 방법에 의해 제조된 추출물을 각각 30mg씩 측량하여 물 1ml에 녹인 후 유리딘의 함량을 분석하였다.

구체적으로, Thermofisher사의 Dionex U-3000 UHPLC를 이용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 유리딘의 함량을 분석하였으며, YMC-Triart C18(4.6 x 250mm, 5um)컬럼 및 다이오드 배열 검출기(Diode array detector, DAD; 210, 254, 280, 340 nm)를 사용하였다.

이동상은 물과 메탄올을 사용하였고, 표 1과 같은 농도 구배 프로파일(gradient profile)하에서 1.0ml/min으로 분석을 진행하였다.

시간(min)	H2O	메탄올
0-5	100%	0%
3-30	100-0%	0-100%
30-35	0%	100%

상기와 같은 방법으로 제조 방법에 따른 적채 추출물의 유리딘 함량을 분석하였고, 그 결과는 표 2 및 도 1에 나타내었다.

건조 방법	발효여부	유리딘 함량 (mg/g)
열풍 건조	비 발효	0.433
	발효	0.632
동결 건조	비 발효	0.640
	발효	0.807

상기 표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, 동결 건조한 경우 열풍 건조한 경우보다 유리딘 함량이 증가하는 경향을 보이며, 적채를 발효시킨 경우 발효시키지 않은 경우보다 유리딘 함량이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 열풍 건조된 비 발효 적채 추출물(비교예 1)의 유리딘 함량(0.433)에 비해 동결 건조된 발효 적채 추출물(실시예 2)의 유리딘 함량(0.807)이 두배 가까이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 2. 적채 발효 추출물의 피부장벽 개선효과 확인

적채 발효 추출물의 피부장벽 개선 효과를 확인하기 위하여, 피부장벽의 강화 인자로 알려진 필라그린(filaggrin, FLG)의 발현량 변화를 측정하였다.

구체적으로, 피부각질세포인 HaCaT에 미세먼지(PM_2.5) 및 적채 추출물을 처리하고, HaCaT 세포에서의 필라그린 발현 정도를 확인하였다.

이를 위해, HaCaT 세포를 각각 미세먼지를 처리하지 않은 대조군, 미세먼지 만을 처리한 군(-), 미세먼지와 비교예 1의 추출물을 처리한 군(A), 미세먼지와 비교예 2의 추출물을 처리한 군(B), 미세먼지와 실시예 1의 추출물을 처리한 군(C) 및 미세먼지와 실시예 2의 추출물을 처리한 군(D)으로 구별하였다.

상기 피부각질세포인 HaCaT 세포는 Dr. C.G. Hyun (제주 국립 대학교, 대한민국)로부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였으며, 3~4일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.

상기 HaCaT 세포를 24 웰 플레이트에 1.0 × 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 무혈청(serum-free) DMEM으로 배지를 교환하고, 미세먼지(PM_2.5) 및 적채 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하고, 각 실험군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후 단백질 정량에 영향을 줄 수 있는 약물이 포함되지 않은 PBS를 처리하였다. 이후 저온, 상온에서 인큐베이션을 반복하여 세포를 용해시킨 후 단백질을 수거하였다.

필라그린(Filaggrin)의 정량은 Filaggrin-ELISA kit (Elabscience Biotechnology Co., Ltd)를 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 수행하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 미세먼지(PM_2.5)와 비교예 1의 추출물을 처리한 실험군(A)과 비교할 때, 미세먼지와 실시예 2의 추출물을 처리한 실험군(D)는 2배 정도의 필라그린 발현 촉진 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

반면, 적채 추출물을 처리하지 않고 미세먼지만을 처리한 실험군(-)과 미세먼지 및 비교예 1의 추출물을 처리한 실험군(A) 사이에는 필라그린 발현정도에 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

즉, 상기 실험 결과는 적채를 열풍 건조하고 발효시키지 않는 경우(비교예 1) 피부장벽 개선효과를 거의 나타내지 못하는 반면, 적채를 동결 건조하고 발효시키는 경우 현저히 우수한 피부장벽 개선 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

실험예 3. 피부 보습 효과 확인

본 발명의 적채 발효 추출물을 1회 도포 시 피부 보습 지속력을 알아보기 위하여, 건조를 호소하거나, 건성 피부라고 생각되는 30~40대 성인 남, 녀 50명에게 상기의 화장료 조성물을 얼굴 및 전박 내측에 도포한 후, 24시간 동안 코니오미터(corneometer; CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 수분량을 측정하였다. 코니오미터는 피부의 표피 내에 존재하는 수분의 양을 센서를 이용하여 수분의 이온 정도를 측정하고 이를 수치화하여 수분의 양을 계산함으로써 보습력을 측정하는 것이다.

구체적으로, 측정하고자 하는 피부 부위에 코니어미터 프로브를 올려놓고, 프로브를 피부에 누르면 센서를 통하여 피부의 전기 전도도(capacitance)가 수치화되어 화면에 표시되며, 이를 확인하는 방법으로 측정하였다.

상기 방법으로 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 코니오미터를 이용하여 피부 수분량을 측정하여 기본 값으로 삼고, 12시간, 24시간 경과 후의 변화를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타난 바와 같다.

시료	피부 수분량(%)
	도포 전	12시간 후	24시간 후
실시예 1	30.2	39.0	37.4
실시예 2	30.0	48.4	44.0
비교예 1	30.1	38.1	37.3
비교예 2	30.4	37.9	37.0

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 추출물을 도포한 경우 보습력이 24시간 이상 지속되고 피부 수분 함량 증가 효과 또한 실시예 1 및 비교예 1, 2를 도포한 경우에 비해 현저히 높음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 피부 진정 효과 확인

자극에 민감하거나, 민감성 피부라 생각되는 성인 남, 녀 30명(나이 28±3)을 선발하여, 항온, 항습 조건(24~ 26℃, 상대 습도 40 ~ 50%)에서 1시간을 대기시킨 후, 여름철 얼굴의 온도 상승시와 같은 효과를 나타내기 위해 운동(25분간 줄넘기)을 통해 얼굴에 열을 발생시켰다. 상기 실시예 1, 2 및 비교예 1, 2의 추출물을 함침시킨 시트를 한쪽 광대뼈 부위에 올려 놓고 10분간 방치한 후 시트를 제거하고 제거 직후부터 시간에 따른 피부 온도를 측정하였다.

시간	온도(℃)
	실시예 1	실시예 2	비교예 1	비교예 2
운동 후(-10분)	33.0	32.8	33.5	33.0
시트 제거(0분)	32.3	29.5	32.4	32.1
10분	32.3	29.9	32.5	32.1
20분	32.2	30.2	32.6	32.2
30분	31.2	30.4	32.5	32.3

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 피부 온도 변화에 있어서 실시예 2의 경우 실시예 1 및 비교예 1, 2에 비하여 온도 저하 정도가 더 크고, 시간이 지나도 상대적으로 더 낮은 온도를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 비교예 1의 경우, 피부 온도가 약간 감소하였을 뿐 크게 감소하지 못하였고, 시간이 흐른 후에도 실시예 2에 비해 여전히 높은 온도를 나타내는 것을 알 수 있었다.상기와 같은 결과로부터 실시예 2의 경우 낮은 피부 온도를 지속적으로 유지시켜줌으로써 피부 진정 효과가 실질적으로 일어날 수 있게 하는 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 피부장벽 개선효과 확인

인체를 대상으로 본 발명 적채 발효 추출물의 피부장벽 개선 효과를 확인하기 위해, 19~60세(평균나이 45.6세)의 여성 20명을 선발하여 외부 자극에 의해 피부를 손상시킨 후, 실시예 2의 발효 적채 추출물로 제조한 제품을 사용할 때의 손상된 피부의 장벽 개선효과를 측정하였다.

피부 측정을 위해 시험대상자는 준비된 세정제로 먼저 전박 부위를 세정한 후 항온항습조건(온도 20~24℃, 습도 40~60%)의 공간에서 약 30분간 피부 안정을 취해 측정 환경에 적응하도록 하였다.

이후, 시험대상자의 전박 부위에 적채 발효 추출물 처리부위와 미 처리부위를 구획한 뒤, 1% SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 용액을 IQ Chamber에 적하하여 각 부위에 24시간 동안 첩포하였다.

상기 SLS 용액을 이용하여 인위적으로 피부를 손상시킨 뒤 첩포를 제거하고, 정해진 제품 사용 부위에만 실시예 2로 제조한 제품을 2주간 사용하도록 한 후 SLS 첩포 전과 제품 사용 전(SLS 24시간 첩포 및 제거 후), 제품 사용 1일 후, 제품 사용 7일 후 및 제품 사용 14일 후 각 부위의 피부 경표피 수분손실량을 측정하였다. 본 시험은 매번 같은 조건에서 동일한 연구자에 의해 진행되었다.

본 발명의 적채 발효 추출물 사용 부위와 미사용 부위 간의 피부 측정 변화 값의 유의성 여부를 판단하기 위하여 통계 분석 프로그램인 SPSS 23.0을 사용하여 검증하였으며, 유의확률은 95% 신뢰구간에서 p<0.05 일 때 통계적 유의성을 확인하였다.

피부 경표피 수분손실량 측정은 부위당 1회 측정하였고, 그 단위는 g/m²h이다. 경표피 수분손실량 측정값은 피부장벽 개선 정도와 반비례하므로 측정값이 낮을수록 피부장벽이 개선됨을 의미한다.

상기한 방법으로 경표피 수분손실량을 측정한 결과를 표 5 및 도 3에 나타내었다.

시간	제품사용여부	평균±표준편차 (g/m2h)	변화율a(%)	유의확률b(p값)
Baseline (1%SLS 첩포 전)	미사용	9.060±1.650	-
	사용	9.260±1.666	-
제품 사용 전 (1% SLS 24시간 첩포 및 제거 후)	미사용	23.240±4.250	-
	사용	23.775±4.049	-
제품 사용 1일 후	미사용	22.120±6.653	-4.467	0.324
	사용	20.845±5.871	-11.803
제품 사용 7일 후	미사용	12.390±2.778	-46.227	0.139
	사용	11.725±2.207	-50.153
제품 사용 14일 후	미사용	10.655±2.006	-53.142	0.046
	사용	9.580±1.487	-58.887

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 외부 자극에 의해 손상된 피부의 피부장벽 개선 정도를 측정한 결과, 실시예 2의 적채 발효 추출물을 사용한 부위의 경표피 수분손실량 측정값이 미사용 부위 대비 제품 사용 14일 후 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였다(p<0.05).또한, 시험제품 적용여부에 따른 외부 자극에 의한 손상 피부 개선 정도를 사진 촬영한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 적채 발효 추출물로 제조한 제품을 사용하는 경우 미사용한 경우보다 피부 진정 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.

제조예 1. 본 발명의 추출물을 함유하는 에센스 제조

하기의 표 6와 같이 에센스 제형의 화장료 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).

원료명	함량(중량%)
세테아릴알코올	2
세테아릴글루코사이드	1
호호바씨오일	5
실리카	0.5
글리세린	10
본 발명 추출물	5
정제수	To 100

제조예 2. 본 발명의 추출물을 함유하는 크림 제조 하기의 표 7과 같이 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).

조성물	함량(중량%)
본 발명 추출물	5
스테아린산	15
에탄올	1
수산화칼륨	0.7
글리세린	5
프로필렌글리콜	3
방부제	적량
향	적량
정제수	to 100

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12382P 20181112

Claims (10)

1. (a) 적채(Brassica Oleracea Capitata; red cabbage)를 동결 건조하는 단계;
   (b) 상기 동결 건조된 적채에 발효 균주를 접종하여 발효시키는 단계; 및
   (c) 상기 발효물을 용매로 추출하고 감압 농축하는 단계를 포함하는, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 동결 건조는 -60℃ 내지 -80℃ 조건에서 이루어지는 것인, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 발효 균주는 바실러스 아밀로리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) AMI-0101(기탁번호 KCCM12382P)인, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 발효는 30℃에서 5 내지 6일간, 호기 조건 하에서 80 내지 90%의 습도를 유지하며 이루어지는 것인, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계의 추출 용매는 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 용매인 것인, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물의 제조방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 유리딘의 함량이 증가된 적채 발효 추출물.
7. 제6항의 적채 발효 추출물을 포함하는, 화장료 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 유리딘의 함량이 증가된 것인, 화장료 조성물.
9. 제7항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부장벽 개선용인 것인, 화장료 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 피부 보습 또는 피부 진정용도를 추가로 포함하는 것인, 화장료 조성물.

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