TW201705972A - 包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑 - Google Patents

Abstract

本發明之目的在於提供一種由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化之改善劑。藉由將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，可使其周圍之真皮纖維母細胞活性化，藉此改善真皮空洞。因此，對引誘脂肪幹細胞之物質進行篩選，結果發現迷迭香萃取物及甘草萃取物具有脂肪幹細胞引誘能力，因此可改善由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化。

Description

包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑

本發明係關於一種包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑。更具體而言，使用甘草萃取物及/或迷迭香萃取物作為脂肪幹細胞引誘劑。

於以使組織重新再生為目標之再生醫學之領域中，為了使已喪失之組織之功能恢復，嘗試活用各種幹細胞。再生醫學不僅被應用於醫療領域，亦被應用於毛髮再生或皮膚再生等美容領域。

所謂幹細胞，係兼具自我複製能力與分化能力之細胞。作為幹細胞，已知除了如胚胎幹細胞(ES細胞)般具有可分化為形成一個體之所有系統之細胞種類的分化萬能性之幹細胞以外，於成人體內亦存在無分化萬能性但具有可分化為複數個系統之分化多能性之成體幹細胞(造血幹細胞、或間葉系幹細胞)。

然而，胚胎幹細胞只能自產生初期之胚胎獲得，而且亦有採取時對母體之危險性或倫理上之問題等，而難以輕易地用於研究、臨床之場合，於美容領域中之利用較困難。於美容領域中，對成體幹細胞之利用進行了研究，但其存在頻度非常低且難以單離，又，亦難以維持自我複製能力與分化能力並且大量培養。

雖然幹細胞中存在各種各樣之種類，但已知自脂肪組織單離之脂肪幹細胞具有移動能力(專利文獻1：日本專利特表2013-507958)， 亦已知其可分化為各種細胞系列，因此期待應用於各種再生治療(非專利文獻1：World J Stem Cells 2014 January 26；6(1)：65-68)。作為於再生治療中之應用，例如已表明，脂肪幹細胞作為控制皮膚幹細胞之活性之皮膚Niche細胞發揮功能，藉此有助於毛囊之再生(非專利文獻2：Cell,(2011)146,761-771)。又，揭示有脂肪幹細胞向皮膚正下方之移植可加速皮膚之創傷癒合能力(非專利文獻3：Journal of Dermatological Science(2007)48,15-24)。又，揭示有藉由脂肪幹細胞與真皮纖維母細胞接觸而促進真皮纖維母細胞之增殖，已知可用於創傷癒合或皮膚之再生(非專利文獻4：Journal of Dermatological Science(2007)48,15-24)。進而，已知藉由脂肪幹細胞之移植試驗而顯示出以膠原蛋白6型作為目標之先天性肌肉萎縮症中之治療效果，脂肪幹細胞亦可用於肌肉再生(非專利文獻5：Stem Cell Research & Theapy 2014,5；21)。

另一方面，臉上所產生之皮膚鬆弛或皺紋係美容中所關心之事。尤其是鬆弛容易於臉線之下巴及臉頰之附近產生。作為鬆弛之原因，可列舉：表情肌之功能降低、支撐表情肌之皮膚之彈力降低、皮下脂肪之增大等(非專利文獻6：Skin Research and Technology,2009；15；299-305)。為了有效地改善鬆弛，必須確定原因並採取相應之改善對策。例如於鬆弛之主要原因為表情肌之功能降低之情形時，為了改善鬆弛，有效的是鍛煉表情肌。又，於鬆弛之主要原因為皮膚之彈力降低之情形時，有效的是攝取與皮膚之彈力相關之彈性纖維、例如膠原蛋白或彈力蛋白之產生促進劑。於鬆弛之主要原因為皮下脂肪之增大之情形時，有效的是鍛煉或限制卡路里、進而燃燒體內脂肪之添加劑(專利文獻2：日本專利特開2007-330178號)。該等鬆弛之原因係一個之情況較少，多數情況下為複合性。因此，作為以改善鬆弛為目的之經口用組合物，揭示有如下組合物：於複數種成分、例如2種以 上之黏多糖中添加膠原蛋白部分分解物及輔酶Q10，以該等3種成分作為有效成分(專利文獻3：日本專利特開2006-143671號)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特表2013-507958號公報

[專利文獻2]日本專利特開2007-330178號公報

[專利文獻3]日本專利特開2006-143671號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68

[非專利文獻2]Cell, (2011) 146, 761-771

[非專利文獻3]Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15-24

[非專利文獻4]Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15-24

[非專利文獻5]Stem Cell Research & Theapy 2014, 5; 21

[非專利文獻6]Skin Research and Technology, 2009; 15; 299-305

本發明之課題在於開發一種改善皮膚鬆弛之藥劑。

本發明者等人對皮膚之老化現象、尤其是皮膚鬆弛進行了努力研究，結果發現作為鬆弛之原因之一，產生真皮空洞化。因此，對藉由在經空洞化之真皮中填充空洞而改善鬆弛之方法進行了努力研究，結果獲得了藉由引誘脂肪幹細胞可填充空洞之見解。進而，對可引誘脂肪幹細胞之化妝品素材進行篩選，結果發現甘草及/或迷迭香之萃取物引誘脂肪幹細胞，從而完成了本發明。因此，本發明係關於以下內容。

[1]一種脂肪幹細胞引誘劑，其包含甘草萃取物或迷迭香萃取 物。

[2]一種由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑，其包含如項目1中所記載之脂肪幹細胞引誘劑。

[3]如項目2中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中因藉由如項目1中所記載之脂肪幹細胞引誘劑引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞，而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

[4]如項目3中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中藉由上述所引誘之脂肪幹細胞而包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。

[5]如項目2至4之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中如項目1中所記載之脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。

[6]如項目2至5之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中如項目1中所記載之脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。

[7]一種用以改善由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化之美容方法，其包括應用脂肪幹細胞引誘劑之步驟。

[8]如項目7中所記載之美容方法，其中所應用之脂肪幹細胞引誘劑將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，因所引誘之脂肪幹細胞而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

[9]如項目8中所記載之美容方法，其中上述真皮構造物包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。

[10]如項目7至9之任一項中所記載之美容方法，其中所應用之脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。

[11]如項目7至10之任一項中所記載之美容方法，其中所應用之脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。

[12]如項目7至11之任一項中所記載之美容方法，其中上述脂肪幹細胞引誘劑包含甘草萃取物及/或迷迭香萃取物。

[13]一種皮膚鬆弛或老化改善方法，其包括對患有由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛之對象投予脂肪幹細胞引誘劑。

[14]如項目13中所記載之皮膚鬆弛或老化改善方法，其中所應用之脂肪幹細胞引誘劑將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，因所引誘之脂肪幹細胞而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

[15]如項目14中所記載之皮膚鬆弛或老化改善方法，其中上述真皮構造物包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。

[16]如項目13至15之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善方法，其中上述脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。

[17]如項目13至16之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善方法，其中上述脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。

[18]如項目13至17之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善方法，其中上述脂肪幹細胞引誘劑包含甘草萃取物及/或迷迭香萃取物。

[19]一種脂肪幹細胞引誘劑之用途，其係用於製造由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善藥。

[20]如項目19中所記載之用途，其中因藉由上述脂肪幹細胞引誘劑引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞，而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

[21]如項目20中所記載之用途，其中上述真皮構造物包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。

[22]如項目19至21之任一項中所記載之用途，其中上述脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。

[23]如項目19至22之任一項中所記載之用途，其中上述脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。

[24]如項目19至23之任一項中所記載之用途，其中上述脂肪幹細胞引誘劑包含甘草萃取物及/或迷迭香萃取物。

[25]一種脂肪幹細胞引誘劑，其包含甘草萃取物或迷迭香萃取物。

[26]一種成為間葉系幹細胞之治療目標之症狀之改善用組合物，其包含如項目25之脂肪幹細胞引誘劑。

[27]一種脂肪幹細胞引誘劑，其中成為上述間葉系幹細胞之治療目標之症狀之改善係促進毛髮生長、創傷癒合、皮膚之再生、肌肉之再生、軟組織之再生、骨之再生、心肌之再生、或神經之再生。

[28]一種脂肪幹細胞引誘方法，其包括對需要引誘脂肪幹細胞之對象投予甘草萃取物或迷迭香萃取物。

[29]一種成為間葉系幹細胞之治療目標之症狀之治療或改善方法，其藉由如項目28中所記載之引誘方法而治療或改善成為間葉系幹細胞之治療目標之症狀。

[30]如項目29中所記載之方法，其中成為上述間葉系幹細胞之治療目標之症狀之改善係以促進毛髮生長、創傷癒合、皮膚之再生、肌肉之再生、軟組織之再生、骨之再生、心肌之再生、或神經之再生為目的。

[30]一種藉由引誘脂肪幹細胞所進行之美容方法，其係藉由應用包含甘草萃取物或迷迭香萃取物之化妝料而引誘脂肪幹細胞。

[31]如項目30中所記載之美容方法，其係以促進毛髮生長、創傷癒合、皮膚之再生為目的。

[32]一種甘草萃取物或迷迭香萃取物之用途，其係用於製造用以引誘脂肪幹細胞之醫藥。

[33]如項目32中所記載之用途，其係用於藉由引誘脂肪幹細胞而治療成為間葉系幹細胞之治療目標之疾病及症狀。

[34]如項目33中所記載之用途，其中成為上述間葉系幹細胞之治療目標之症狀之改善係以促進毛髮生長、創傷癒合、皮膚之再生、肌肉之再生、軟組織之再生、骨之再生、心肌之再生、或神經之再生為目的。

[35]一種由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑，其包含脂肪幹細胞引誘劑。

[36]如項目35中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中因藉由上述脂肪幹細胞引誘劑引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞，而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

[37]如項目36中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中上述真皮構造物包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。

[38]如項目36或37中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中上述脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。

[39]如項目35至38之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中上述脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。

[40]如項目35至39之任一項中所記載之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中上述脂肪幹細胞引誘劑包含甘草萃取物及/或迷迭香萃取物。

[41]一種上述皮膚鬆弛或老化改善劑，其係包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑，且該脂肪幹細胞引誘劑將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，因所引誘之脂肪幹細胞而利用真皮構造物將真皮空洞填充。

本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑中所使用之脂肪幹細胞引誘劑係藉由將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞而發揮作用。脂肪幹細胞可促進真皮纖維母細胞之增殖、或由真皮纖維母細胞產生之間質成分之產 生，藉此可填充成為皮膚鬆弛或老化之原因之真皮空洞。

圖1係自幼齡者及高齡者之皮膚獲取之皮膚組織切片中之真皮層的染色圖。表示於高齡者中，因皮下組織隆起而形成真皮空洞。

圖2(A)係表示空洞化程度與年齡之關係的圖。圖2(B)係表示皮膚物性與空洞化程度之關係的圖。圖2(C)係表示鬆弛程度與空洞化程度之關係的圖。

圖3係表示脂肪幹細胞之存在下及非存在下之培養真皮纖維母細胞之變化的照片(圖3(A))及圖表(圖3(B))。

圖4係表示脂肪幹細胞之存在下及非存在下之培養真皮纖維母細胞數之變化的圖表(圖4(A))，及表示膠原蛋白之產生量之變化的圖表(圖4(B))。

圖5係表示迷迭香萃取物對脂肪幹細胞之引誘作用(圖5(A))及甘草萃取物對脂肪幹細胞之引誘作用(圖5(B))的圖表。

本發明係關於一種包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑。所謂脂肪幹細胞引誘劑，係指可引誘脂肪幹細胞之藥劑。於較佳態樣中，脂肪幹細胞引誘劑可將脂肪幹細胞引誘至皮膚之真皮空洞。

所謂脂肪幹細胞，亦可稱為源自脂肪組織之中間葉幹細胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)，係存在於脂肪組織中之間葉系幹細胞之一種。已知脂肪幹細胞具有移動能力(非專利文獻1及專利文獻1)，認為其可於脂肪組織中移動。脂肪幹細胞係藉由CD90標記基因、CD105標記基因等之表現而被賦予特徵，但並非意圖限定於表現該等標記基因之細胞。脂肪幹細胞可表現各種細胞增殖因子或細胞間資訊轉移因子，該等因子可促進真皮纖維母細胞之增殖 或來自真皮纖維母細胞之間質成分、尤其是膠原蛋白之產生。因此，藉由引誘脂肪幹細胞，而使其周圍之真皮纖維母細胞活性化。

脂肪幹細胞引誘劑只要可引誘脂肪幹細胞，則可為任意物質。脂肪幹細胞引誘劑亦可為除引誘效果以外，可促進脂肪幹細胞之移動及增殖之藥劑。作為脂肪幹細胞引誘劑，可為趨化激素或細胞激素等生物體內因子、或多肽及蛋白質等，亦可為低分子化合物、高分子化合物、及萃取物等化妝品素材或醫藥品素材。作為可用作脂肪幹細胞引誘劑之物質，可列舉SDF1 α。又，就用於美容目的之觀點而言，較佳為化妝品素材，例如可列舉甘草萃取物、迷迭香萃取物等植物萃取物。上述脂肪幹細胞引誘劑可單獨使用1種上述萃取物，或將2種以上混合而使用，亦可與現有之脂肪幹細胞引誘劑組合而使用。

作為用於獲得植物萃取物之萃取溶劑，可列舉：水；或甲醇、乙醇、丙醇等脂肪族一元醇；甘油、丙二醇、1,3-丁二醇等脂肪族多元醇；丙酮等酮類；二乙醚、二烷、乙腈、乙酸乙酯等酯類；二甲苯、苯、甲苯等芳香族類；氯仿等鹵化烷基類等有機溶劑。該等萃取溶劑可單獨使用1種，或將2種以上混合而使用。混合而成之萃取溶劑之混合比並無特別限定，可適當調整。作為上述萃取溶劑，較佳為至少含有水之含水萃取溶劑。

作為用以獲得植物萃取物之萃取方法，並無特別限制，可採用先前公知之一般萃取方法。於萃取時，可將各植物之萃取部位直接或乾燥而用作萃取原料。於萃取後，視需要可適當進行過濾、除臭、脫色等精製處理。脂肪幹細胞引誘劑或皮膚鬆弛或老化改善劑可添加至最終製品中而使用。最終製品中所含有之上述各萃取物之濃度並無特別限定，例如就發揮出充分之脂肪幹細胞引誘效果之觀點而言，大致相對於組合物，以典型為0.001~10質量%之範圍、較佳為0.001~1質量%之範圍、最佳為0.01~0.5質量%之範圍調配萃取物。

迷迭香萃取物係源自原產於地中海沿岸之作為唇形科常綠灌木之迷迭香(Rosmarinus officinalis)之芳香性萃取物，可使用該植物之根、葉、莖、花、植物整體作為原材料。萃取方法可使用任意方法，例如可藉由對迷迭香之葉進行水蒸氣蒸餾或溶劑萃取而獲得萃取物。又，作為溶劑，可使用任意萃取溶劑，亦可使用以50%(v/v)之丁二醇進行萃取而獲得之萃取物。

甘草萃取物係源自豆科多年生草本之甘草(Glycyrrhiza glabra L.或Glycyrrhiza uralensis Fisher)之萃取物，可使用該植物之根、葉、莖、花、植物整體作為原材料。甘草之根中包含甘草甜素、葡萄糖、蔗糖等甜味成分。甘草甜素因其分解產物會於生物體之肝臟內與有害產物結合進行解毒而為人所熟知。作為甘草萃取物，較佳為將甘草之根作為原材料進行萃取，萃取方法為任意方法，例如可進行水蒸氣蒸餾、或溶劑萃取。作為溶劑，可使用任意萃取溶劑，亦可使用以50%(v/v)之丁二醇進行萃取而獲得之萃取物。作為甘草萃取物，可為化妝品類別調配成分標準之甘草萃取末或甘草類黃酮(油溶性甘草萃取物)，亦可使用藥典品甘草粗提取物、藥典品甘草提取物。

脂肪幹細胞之引誘可於體外(in vitro)及體內(in vivo)之任一情況下確認。於體外之實驗中，可於具有脂肪幹細胞引誘劑之濃度差之培養基中培養脂肪幹細胞並檢測移動，藉此確定脂肪幹細胞引誘劑之引誘效果。關於體內之確認，可於投予脂肪幹細胞引誘劑後利用組織切片算出脂肪幹細胞之數量或比率，藉此研究引誘之有無。

所謂真皮空洞，係指由於因年齡增長或其他某些原因導致皮下組織向真皮層側局部地隆起而形成之洞(圖1)。真皮空洞之大小為具有約10μm~1000μm之直徑之大致球狀，其形狀並不固定。由於真皮空洞內係藉由皮下組織填充，故而亦可簡稱為真皮洞。由於真皮層中所包含之細胞成分或間質成分不包含於真皮空洞內，故而失去皮膚彈 力，產生鬆弛，從而導致皮膚老化。又，由於存在真皮空洞，故而真皮局部地菲薄化，其亦為皮膚鬆弛及老化之一個原因。實際上得知真皮空洞化之程度越高，皮膚之彈性越低，又，外觀之鬆弛程度越高(圖2B、C)。

真皮空洞之程度可藉由於皮膚剖面中將一定長度之真皮之厚度、即自與表皮之交界至與皮下組織之交界為止之厚度累計而測量。若存在真皮空洞，則因皮下組織向真皮層側隆起而導致真皮之厚度降低。通常表皮之厚度為一定，且與真皮相比充分薄，故而亦可藉由僅累計自皮膚表面至皮下組織為止之厚度而計算。由於真皮空洞之程度與肌膚彈性相關(圖2B)，故而亦可藉由使用Cutometer等測定肌膚彈性之機器來測定表示肌膚彈性之指標、例如Uv/Ue值而代替。

所謂因藉由脂肪幹細胞引誘劑引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞，係指所引誘之脂肪幹細胞直接或間接地發揮作用。即，經引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞可藉由分泌各種細胞活性化因子而使存在於周圍之真皮纖維母細胞間接地活性化。如此般經活性化之真皮纖維母細胞進行細胞增殖，並且間質成分之產生量增大。經增殖之真皮纖維母細胞與所產生之間質成分藉由重層化而形成真皮構造物，利用真皮構造物將真皮空洞填充。又，由於脂肪幹細胞為間葉系幹細胞，故而可分化為真皮細胞、例如纖維母細胞等，藉此可直接改善真皮空洞。因此，藉由將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，而改善真皮空洞。

真皮主要包含纖維母細胞、組織細胞、肥大細胞、漿細胞、及樹狀細胞等細胞成分以及填埋細胞間隙之間質成分。間質成分大致分為包含膠原蛋白之膠原纖維、包含血纖維蛋白或彈力蛋白之彈性纖維、及存在於纖維或細胞之間之以糖蛋白或蛋白多糖為主成分之基質。

本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑可對患有由於真皮空洞所導致 的皮膚鬆弛及/或老化之對象進行投予。鬆弛之原因可列舉表情肌之功能降低、支撐表情肌之皮膚之彈力降低、皮下脂肪之增大等，該等原因獨立或共同地引起鬆弛，導致外觀之老化。於本發明中，對患有皮膚鬆弛之對象進行投予，但此種對象較佳為鬆弛之主要原因係皮膚之彈力降低、尤其是由於真皮空洞所導致的真皮層之厚度減少所伴隨之皮膚之彈力降低。為了確認真皮空洞為皮膚鬆弛之主要原因，亦可測定真皮空洞化程度。較佳為對空洞化程度較高之對象應用本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑、或美容方法。亦可根據由真皮空洞化程度之數值所確定之閾值，將超過閾值之對象確定為空洞化程度較高之對象。

本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑可藉由經口或非經口投予等任意路徑進行投予，就直接投予至皮膚之觀點而言，較佳為經皮投予。經皮投予之脂肪幹細胞引誘劑可經由存在於皮膚上之毛孔或汗腺等附屬器官而滲透。由於附屬器官通常到達真皮層之最深部，故而於存在真皮空洞之情形時，到達其極附近。因此，經皮投予之脂肪幹細胞引誘劑可藉由經由附屬器官進行滲透而送達至作為作用部位之真皮空洞部。又，為了促進經由附屬器官向作為作用部位之真皮空洞部之滲透，皮膚鬆弛或老化改善劑可適當選擇其黏度、表面張力、親水性、疏水性。進而，為了促進向真皮空洞之滲透，亦可於應用本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑後，應用高頻率之振動或音波。

本發明之皮膚鬆弛或老化改善劑可調配至化妝品、醫藥品、或準藥品中。於美容目的中較佳為調配至化妝品中。所調配之化妝品之劑型為任意，可以液體、凝膠、氣泡、乳液、乳霜、軟膏、片材等形態進行調配而使用。作為所調配之化妝品、醫藥品、或準藥品，可應用於外用藥用製劑、化妝水、乳液、乳霜、軟膏、洗劑、油、面膜等基礎化妝料，洗面乳或皮膚清洗料、除毛劑、脫毛劑、鬚後水、鬚前 水、剃鬚膏，粉餅、口紅、腮紅、眼影、眼線、睫毛膏等彩妝化妝料，洗髮精、潤絲精、護髮素、洗前護髮素、整髮劑、燙髮劑、養髮劑、染髮劑、生髮/養髮料等頭髮化妝料，浴用劑等各種製品。

於本發明之另一態樣中，本發明亦可關於一種篩選由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑之方法。該篩選方法可藉由在具有試驗物質之濃度差之培養基中培養脂肪幹細胞，而研究試驗物質之引誘能力。更具體而言，可使用採取如下構成之細胞移動試驗孔：設置具有細胞培養細胞可通過之程度之直徑的1個或複數個流路，於流路之一出入口處配置細胞培養孔，於另一出入口處配置試驗物質添加孔。流路亦可藉由具有一定孔徑之膜而代替。用於篩選之試驗物質藥劑可使用任意藥劑，為了開發化妝用品，可自已可確認安全性之化妝品素材庫中選擇試驗物質。

藉由上述篩選而獲得之甘草萃取物或迷迭香萃取物具有脂肪幹細胞引誘活性，可用作脂肪幹細胞引誘劑或組合物。脂肪幹細胞係已知分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、及神經細胞等各種間葉系細胞之間葉系幹細胞(非專利文獻1)。於該非專利文獻1中，揭示有源自脂肪幹細胞之軟骨細胞可用於關節軟骨疾病、例如變形性關節症等之治療，源自脂肪幹細胞之成骨細胞可應用於骨缺損部位，藉由分化為心肌或血管細胞而有助於心功能之改善。進而，藉由源自脂肪幹細胞之分泌因子而產生血管新生之亢進、細胞凋亡之減少、及神經發芽之促進，故而除了應用於脂肪幹細胞分化為目標細胞之直接之再生醫療以外，亦期待應用於經由分泌因子之間接之再生醫療。因此，本發明之脂肪幹細胞引誘組合物可用於治療或改善成為間葉系幹細胞、尤其是脂肪幹細胞之治療目標之症狀。作為成為間葉系幹細胞之治療目標之症狀之改善，可列舉：促進毛髮生長、創傷癒合、皮膚之再生、肌肉之再生、軟組織之再生、骨之再生、心肌之再生、或神 經之再生。於該等中，關於脂肪幹細胞與促進毛髮生長之關係，非專利文獻2中顯示，藉由作為控制皮膚幹細胞之活性之皮膚Niche細胞發揮功能而有助於毛囊之再生，且揭示有藉由引誘脂肪幹細胞可促進毛髮生長。又，關於脂肪幹細胞與創傷癒合及/或皮膚之再生之關係，非專利文獻3中揭示有藉由脂肪幹細胞與真皮纖維母細胞接觸而促進真皮纖維母細胞之增殖，已知可用於創傷癒合或皮膚之再生。進而，關於脂肪幹細胞與肌肉再生之關係，非專利文獻4中揭示有藉由脂肪幹細胞之移植試驗而顯示出以膠原蛋白6型作為目標之先天性肌肉萎縮症中之治療效果，脂肪幹細胞亦可用於肌肉再生。

[實施例] 真皮空洞化之檢測

自幼齡及高齡之被試驗者之女性腹部獲得皮膚組織切片，進行蘇木精-伊紅染色。依照常法使用蘇木精-伊紅染色用試劑，於顯微鏡下觀察經染色之組織(圖1)。於幼齡者之皮膚組織切片中，真皮組織與皮下組織之交界平滑，另一方面，於高齡者之皮膚組織切片中，真皮組織與皮下組織之交界混亂，因皮下組織之一部分隆起而形成真皮空洞。

皮膚鬆弛之測量

對身體質量指數(BMI)未達25之具有標準體型之30~50歲之30名健康女性被試驗者(國籍：日本)進行試驗。被試驗者進行洗臉，於標準之環境下適應。於標準光條件下利用數位相機(Nikon D-100；Nikon Corporation,Tokyo,Japan)於就座狀態下自左右45°之角度拍攝臉之照片。對於上頰之鬆弛嚴重度，按照基於照片之基於6等級之評價基準之已報告之方法(Ezure T,Hosoi J,Amano S,Tsuchiya T.Skin Res Technol.2009 Aug；15(3)：299-305.)進行評價。

真皮空洞化之觀察

使用超音波檢查法非侵入性地觀察真皮層之內部構造。以相同之體位測定與利用Cutometer之測量部位相同之部位。將作為13MHz之探針之Prosound alpha 5(Aloka Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)垂直地應用於經超音波凝膠之薄層覆膜之皮膚，然後使用B模式測定皮膚構造。使用Image J，測量自表皮至脂肪層為止之最短距離，將使正負反轉之值(mm)作為真皮空洞化之程度。

真皮彈性之測量

對於真皮彈性，利用基於吸引與解除時之皮膚之變形與恢復之測量的非侵入性皮膚彈性測量器(Cutometer MPA 580(註冊商標)，Courage & Khazaka,Cologne,Germany)評價真皮彈性。使用大直徑(6mm)之吸引探針。使被試驗者橫躺於床上，然後為了於測量真皮彈性時降低重力之影響，使臉傾斜45°之角度。測量點係設置於上頰之中心。以400mbar之壓力進行2秒皮膚吸引，繼而設定為2秒之弛豫期，根據皮膚變形曲線而獲得Ue(皮膚之立即擴張，表示彈性變形)、Uv(於彈性變形後發生之黏彈性蠕變)、Uf(弛豫期結束時之最終擴張，表示皮膚之總擴展性)、Ur(皮膚之立即回縮即彈性變形恢復)。計算Uv/Ue(黏彈性相對於彈性擴張之比率)值，作為皮膚物性(Skin Research and Technology 2010；16：332-338,Skin Research and Technology 2012；18：259-264)。

關於以上所確定之空洞化程度、皮膚物性、年齡、及鬆弛程度，將年齡與空洞化程度之關係示於圖2(A)，將空洞化程度與皮膚物性之關係示於圖2(B)，將空洞化程度與鬆弛程度之關係示於圖2(C)。關於圖2A之年齡與空洞化程度之關係、及圖2(B)之空洞化程度與皮膚物性之關係，進行Pearson檢定。又，關於圖2(C)之空洞化程度與鬆弛程度之關係，進行Spearman檢定。

脂肪幹細胞之真皮纖維母細胞活性化試驗

真皮纖維母細胞係自Lonza購買，於包含10%FBS之DMEM中進行培養。脂肪幹細胞(ADSC)係自Invitrogen購買，於MessenPro RS medium培養基中進行培養。將真皮纖維母細胞以成為1×10⁴ cells/well之方式播種於Transwell(trans well for 6 well plate：Falcon)之上層。ADSC係利用10μg/mL絲裂黴素處理3小時後，以成為2×10⁵ cells/well之方式播種於Transwell(trans well for 6 well plate)之下層。24小時後將培養基更換為包含10%FBS、250μM抗壞血酸之DMEM，開始共培養。7天後以多聚甲醛將上層固定，進行HE染色並觀察(圖3A)。測量上層之厚度並示出(圖3B)。作為對照群，於無ADSC之條件下單獨培養纖維母細胞。於ADSC存在下，真皮纖維母細胞經活性化，真皮層之厚度增大(學生t檢定：P<0.05)。

真皮纖維母細胞係自Lonza購買，於包含10%FBS之DMEM中進行培養。脂肪幹細胞(ADSC)係自Invitrogen購買，於MessenPro RS medium培養基中進行培養。將真皮纖維母細胞以成為1×10⁵ cells/well之方式播種於Transwell(trans well for 6 well plate：Falcon)之上層。ADSC係利用10μg/mL絲裂黴素處理3小時後，以成為2×10⁵ cells/well之方式播種於Transwell(trans well for 6 well plate)之下層。24小時後將培養基更換為包含10%FBS、250μM抗壞血酸之DMEM，開始共培養。48小時後將細胞回收，進行RT-PCR及Alamar Blue檢測。RT-PCR係按照製品說明書使用Light cycler套組(Roche)進行反轉錄，使用下述引子進行定量(圖4B)。又，於Alamar Blue檢測中，按照製品說明書使用Alamar Blue(Bio-Rad Company)測定活細胞數(圖4A)。於ADSC之存在下，活細胞數增加(學生t檢定：P<0.05)，並且膠原蛋白(COL1A1)之表現量亦增加(學生t檢定：P<0.05)。

脂肪幹細胞之引誘試驗

將源自脂肪之幹細胞(Invitrogen(Carlsbad,CA))於包含MessenPro RS培養基(DMEM；GIBCO/BRL(Carlsbad,CA))之燒瓶中於37℃、5%CO₂加濕下進行培養。於成為亞匯合時使用Accutase(PAA(Linz,Austria))將細胞回收，然後使用2μM之PKH67(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))按照製品說明書進行標記。以3×10⁴標記細胞/well播種於24 well Fluoroblok plate(Becton Dickinson(Mountain View,CA))之上部孔。於培養6小時後，將培養基替換為不帶補充品之MessenPro RS培養基(DMEM；GIBCO/BRL(Carlsbad,CA))。繼續培養12小時，將試驗物質以0.1%之濃度添加至Fluoroblok之下部孔。8小時後，通過具備螢光濾波器之顯微鏡對Fluorobolok膜之下側拍攝照片，使用Image J.以大於孔尺寸之螢光區域之形式對通過膜而引誘之細胞進行計數。源自脂肪之幹細胞之引誘活性係藉由對照孔中之螢光值與試驗孔中之螢光值之比較而進行評價。

作為試驗萃取物，將大量化妝品素材供於篩選，結果顯示，於其中，迷迭香(Rosemarinus Officinalis)之葉萃取物(丸善製藥，商品編碼：6435，萃取溶劑：50%(w/v)之丁二醇)及甘草(Glycyrrhiza Glabra)之根萃取物(丸善製藥，商品編碼：9488，萃取溶劑：50%(w/v)之丁二醇)具有優異之脂肪幹細胞引誘活性。添加有迷迭香萃取物及甘草萃取物之孔與不帶萃取物而僅包含萃取溶劑之對照孔相比，顯示出明 顯高之螢光(表1、圖5A及B，學生t檢定：P<0.05)。於迷迭香萃取物及甘草萃取物之情形時，其萃取溶劑為50%(w/v)之丁二醇，於對照孔中僅添加該溶劑代替試驗萃取物。

<110> 日商資生堂股份有限公司

<120> 包含脂肪幹細胞引誘劑之皮膚鬆弛或老化改善劑

<130> P150440

<160> 4

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

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<213> 人工序列

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

Claims (7)

1. 一種脂肪幹細胞引誘劑，其包含甘草萃取物或迷迭香萃取物。
2. 一種由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑，其包含如請求項1之脂肪幹細胞引誘劑。
3. 如請求項2之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中因藉由如請求項1之脂肪幹細胞引誘劑引誘至真皮空洞之脂肪幹細胞，而利用真皮構造物將真皮空洞填充。
4. 如請求項3之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中藉由上述所引誘之脂肪幹細胞而包含真皮纖維母細胞、及由該真皮纖維母細胞產生之間質成分。
5. 如請求項2至4中任一項之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中如請求項1之脂肪幹細胞引誘劑係經由附屬器官而滲透。
6. 如請求項2至5中任一項之皮膚鬆弛或老化改善劑，其中如請求項1之脂肪幹細胞引誘劑於真皮空洞中發揮作用。
7. 一種上述皮膚鬆弛或老化改善劑，其係包含脂肪幹細胞引誘劑之由於真皮空洞化所導致的皮膚鬆弛或老化改善劑，且該脂肪幹細胞引誘劑將脂肪幹細胞引誘至真皮空洞，因所引誘之脂肪幹細胞而利用真皮構造物將真皮空洞填充。