CN111212654A - 用激活的调节性t细胞治疗肝衰竭 - Google Patents

Abstract

公开了用于治疗肝脏病症的系统、组合物和方法。系统、组合物和方法包括使用激活的调节性T细胞用于缓解、治疗或减少肝脏病症。调节性T细胞可以是以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在的同种异体调节性T细胞。需要治疗的肝脏病症可以是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。

Description

用激活的调节性T细胞治疗肝衰竭

背景

公开领域

本申请涉及用于治疗肝衰竭的系统、组合物和方法。更特别地，所述系统、组合物和方法增强肝脏再生过程。另外地，所述系统、方法和组合物包括使用已被赋予免疫调节/血管生成特性的调节性T细胞以刺激肝脏再生而同时减少肝纤维化。

相关技术描述

肝衰竭是我们医疗保健系统的主要负担，并且是工业化国家中第七大死亡原因。迄今为止，肝衰竭的唯一治愈方法是移植，由于缺乏供体和慢性免疫抑制的副作用，移植受到了严重限制。肝衰竭是由多种急性和慢性临床诱因引起的，包括药物/酒精诱导的肝毒性、病毒感染、血管损伤、自身免疫性疾病或遗传易感性。Kelso,L.A.,Cirrhosis:caringfor patients with end-stage liver failure.Nurse Pract,2008.33(7):第24-30页；quiz 30-1。肝衰竭的表现包括暴发性急性肝炎、慢性肝炎或硬化。在肝脏遭受各种急性损伤之后，该器官由于其独特的自我更新活性而得以再生。如果损伤持续发生，肝脏再生新细胞能力将不堪重负，并且纤维化的非功能性组织会沉积，从而取代肝实质的功能。随后肝细胞功能的降低可引起代谢不稳定，合并破坏人体基本功能(即能量供应、酸碱平衡和凝血)。Bernuau,J.,B.Rueff和J.P.Benhamou,Fulminant and subfulminant liver failure:definitions and causes.Semin Liver Dis,1986.6(2):第97-106页；Farci,P.,等人,Hepatitis C virus-associated fulminant hepatic failure.N Engl J Med,1996.335(9):第631-4页；Navarro,V.J.和J.R.Senior,Drug-related hepatotoxicity.N Engl JMed,2006.354(7):第731-9页。如果不能迅速解决，就会发生肝功能障碍的并发症，诸如失控的出血和败血症，并且由于有毒代谢物积累，诸如脑和肾脏的依赖性器官也会停止运作。Sargent,S.,Management of patients with advanced liver cirrhosis.Nurs Stand,2006.21(11):第48-56页；quiz 58。在紧急情况下，诸如当患者进展为急性至慢性肝衰竭(ACLF)时，肝移植被视为标准治疗。然而，通常非常难获得适合的供体，并且移植后会出现许多并发症，包括排斥和长期坚持免疫抑制方案。Kisseleva,T.,E.Gigante,和D.A.Brenner,Recent advances in liver stem cell therapy.Curr OpinGastroenterol,2010.26(4):第395-402页；Wu,Y.M.,等人,Hepatocyte transplantationand drug-induced perturbations in liver cell compartments.Hepatology,2008.47(1):第279-87页。尽管目前正在开发用于治疗肝衰竭的干细胞疗法，但这些具有许多缺点。胚胎和iPS来源的干细胞都很难大量生长，并且具有致癌或畸胎瘤形成的可能性。另外，肝微环境中的异位组织分化可能具有毁灭性的后果。成体干细胞提供了诱导某些临床益处的可能性；然而，迄今为止的响应还不是很深刻。这部分是由于成体干细胞无法完全取代肝组织。

概述

本公开内容涉及通过施用扩增的调节性T细胞而诱导的免疫调节作为诱导受损的肝脏再生和抑制肝衰竭的手段。更具体地，本公开内容的一方面是提供用于肝脏治疗的改进的系统、组合物和方法。本文提供的实施方案涉及用于治疗肝脏病症的系统、组合物和方法。

一些实施方案涉及用于治疗肝脏病症的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含激活的调节性T细胞。在一些实施方案中，该组合物经配制用于施用给患有肝脏病症的受试者。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞是同种异体调节性T细胞。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞产生肝细胞生长因子。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞增强肝卵圆细胞产生。在一些实施方案中，该组合物经配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约1×10⁶个细胞/毫升的量存在。在一些实施方案中，该组合物降低受试者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白或胆红素水平至健康受试者的水平的5-20％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％或50-70％。在一些实施方案中，肝脏病症是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。在一些实施方案中，该组合物还包含用于治疗肝脏疾病的化合物。在一些实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。一些实施方案涉及输注系统，其包括袋和递送装置。在一些实施方案中，袋包括用于治疗肝脏病症的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含激活的调节性T细胞。在一些实施方案中，药物组合物经配制以施用至患有肝脏病症的受试者。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞是同种异体调节性T细胞。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞产生肝细胞生长因子。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞增强肝卵圆细胞产生。在一些实施方案中，该组合物经配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约1×10⁶个细胞/毫升的量存在。在一些实施方案中，该组合物降低了受试者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白或胆红素水平至健康受试者的水平的5-20％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％或50-70％。在一些实施方案中，肝脏病症是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。在一些实施方案中，药物组合物还包含用于治疗肝脏疾病的化合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。

一些实施方案涉及治疗肝衰竭的方法。在一些实施方案中，该方法包括施用如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含激活的调节性T细胞。在一些实施方案中，药物组合物经配制以施用至患有肝脏病症的受试者。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞是同种异体调节性T细胞。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞产生肝细胞生长因子。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞增强肝卵圆细胞产生。在一些实施方案中，该组合物经配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约1×10⁶个细胞/毫升的量存在。在一些实施方案中，该组合物降低了受试者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白或胆红素水平至健康受试者的水平的5-20％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％或50-70％。在一些实施方案中，肝脏病症是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。在一些实施方案中，药物组合物还包含用于治疗肝脏疾病的化合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，组合物包含通过与同种异体间充质干细胞一起培养被激活以具有增强的肝脏再生因子产生的调节性T细胞群。在一些实施方案中，调节性T细胞群呈现为激活的或已呈现为激活的以通过增强的产生肝细胞生长因子的能力来诱导肝脏增殖，或增强肝卵圆细胞增殖。在一些实施方案中，调节性T细胞在施用前用免疫调节剂处理。

在一些实施方案中，与所述免疫调节剂一起培养诱导调节性T细胞增殖或诱导调节性T细胞产生白血病抑制因子。在一些实施方案中，免疫调节剂是IL-4、IL-10、IL-13、IL-20、TGF-β、CXCL12、VEGF、PGE-2或抑制素、或其组合。在一些实施方案中，将调节性T细胞与2型单核细胞、CD5阳性B细胞、2型NKT细胞、致耐受性树突细胞、γδT细胞、具有免疫调节特性的T细胞、CD34细胞、极小胚胎样干细胞或塞托利细(Sertoli cells)共培养。

在一些实施方案中，间充质干细胞呈有丝分裂失活状态。在一些实施方案中，将间充质干细胞在施用之前与免疫调节剂一起培养。在一些实施方案中，间充质干细胞源自华通氏胶质、骨髓、外周血、经动员的外周血、子宫内膜、毛囊、乳牙、睾丸、脂肪组织、皮肤、羊水、脐带血、网膜、肌肉、羊膜、脑室周流、胎盘组织、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、单性生殖干细胞或体细胞核转移来源的干细胞。在一些实施方案中，间充质干细胞表达STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-I标记物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、凝血调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146或THY-1或其组合。在一些实施方案中，间充质干细胞不表达显著水平的HLA-DR、CD117和CD45。

在一些实施方案中，胚胎干细胞表达阶段-特异性胚胎抗原(SSEA)3、SSEA 4、Tra-1-60和Tra-1-81、Oct-3/4、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、足糖萼蛋白(PODXL)、Rex-1、GCTM-2、Nanog或人端粒酶逆转录酶(hTERT)。在一些实施方案中，诱导型多能干细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2或HLA-A,B,C。在一些实施方案中，诱导型多能干细胞在培养中经历至少40次倍增，同时在传代后维持正常核型。在一些实施方案中，单性生殖干细胞通过添加钙流出诱导剂以激活卵母细胞，然后富集表达SSEA-4、TRA 1-60或TRA1-8的细胞来生成。在一些实施方案中，体细胞核转移来源的干细胞具有对SSEA-1呈阴性和对SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81或碱性磷酸酶呈阳性的表型。

在一些实施方案中，间充质干细胞通过在SMAD-2/3途径的抑制剂或者靶向SMAD-2/3途径的抑制剂核酸的存在下培养从多能干细胞来源分化。在一些实施方案中，抑制剂是SB-431542、反义寡核苷酸、发夹环短干扰RNA、化学合成的短干扰RNA分子或锤头状核酶。在一些实施方案中，间充质干细胞抑制肝星状细胞激活、抑制肝纤维化、刺激肝脏再生或增强肝卵圆细胞或肝祖细胞活性。

在一些实施方案中，治疗肝衰竭包括减少肝纤维化。在一些实施方案中，治疗肝衰竭包括刺激损伤后肝组织生长的增殖。在一些实施方案中，调节性T细胞源自外周血单核细胞、经动员的外周血单核细胞、脐带血、经血或脂肪基质血管组分细胞。在一些实施方案中，经动员的外周血单核细胞获自G-CSF、flt-3配体、血小板生成素或Mozobil的施用。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞抑制用激活增殖的信号刺激的天然T细胞的增殖。在一些实施方案中，激活增殖的信号是抗-CD3和抗-CD28珠、伴刀豆球蛋白A、PHA或用同种异体反应抗原呈递细胞刺激。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞遏制树突细胞成熟。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞表达神经毡蛋白-1、CTLA-4、CD25、CD39、CD73、CD105、CD127、FoxP3、GARP、GITR配体、IL-10或膜结合的TGF-β。在一些实施方案中，经激活的调节性T细胞通过暴露于血管活性肠肽、IL-10、TGF-β、间充质干细胞条件培养基、间充质干细胞来源的外来体、BDNF、人绒毛膜促性腺激素、VEGF、CD3或CD28抗体、缺氧条件、雷帕霉素或促血管生成素而被激活。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞是无反应性T细胞。

附图简述

图1示意性地示出了根据本公开内容的示例输注系统。

图2以图形方式描绘了用根据本公开内容的药物组合物治疗的受试者的血清中丙氨酸氨基转氨酶(ALT)降低的结果。

详述

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，它们不限于所述的特定组合物、方法或方案，因为它们可以变化。还应理解，说明书中使用的术语仅用于描述特定的形式或实施方案，并且无意限制其范围，其范围仅由所附权利要求书来限制。

如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于所公开的实施方案的实践或测试中，但是现在描述优选的方法、装置和材料。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文可互换使用，并且是指任何动物，包括哺乳动物。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。受试者体内的“病症”是其中受试者能够维持体内稳态但是其中与不存在该病症的情况相比，受试者的健康状况不太有利的健康状态。如果不治疗，病症不一定会导致受试者的健康状况进一步下降。如本文所用，“治疗疾病或病症”意指降低个体所经历的该疾病或病症的体征或症状的频率和/或严重性。

如本文所用的术语“治疗”意指降低受试者经历的疾病或病症的体征或症状的频率和/或严重性。因此，“治疗(treat)”和“治疗(treating)”不限于其中受试者(如患者)被治愈并且疾病或病症被根除的情况。而是，本公开内容还涵盖仅减少体征或症状、改善(至一定程度)和/或延迟疾病或病症进展的治疗。术语“治疗”还指减轻、改善和/或稳定体征或症状，以及延缓疾病或病症的体征或症状进展。如本文所用，“减轻”疾病或病症意指降低受试者经历的疾病或病症的一种或多种体征和/或症状的频率和/或严重性。

如本文所用，术语“有效量”是指对受试者提供治疗或预防益处的量。术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的引发组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，当施用时，该量足以预防所治疗疾病或病症的一种或多种体征和/或症状发展或在某种程度上减轻所治疗疾病或病症的一种或多种体征和/或症状。治疗有效量将根据化合物、疾病或病症、疾病或病症的严重性以及要治疗的受试者的年龄、体重等而变化。

药物组合物

本文提供的实施方案涉及用于治疗肝脏病症的药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物提供或引入输注系统中。在一些实施方案中，药物组合物包含激活的调节性T细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含激活的同种异体调节性T细胞。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞产生肝细胞生长因子。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞增强肝卵圆细胞产生。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞以约1×10⁶个细胞/毫升的量存在。在一些实施方案中，该组合物降低受试者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白、或胆红素水平至健康受试者的水平的5-20％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％或50-70％。在一些实施方案中，肝脏病症是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。在一些实施方案中，药物组合物还包含用于治疗肝脏疾病的化合物。

在一些实施方案中，该组合物经配制以施用至患有肝脏病症的受试者。在一些实施方案中，该组合物经配制用于肠胃外施用，包括例如静脉内、皮下、腹腔内、肌内、胸骨内注射或团注注射。

术语“药学上可接受的”是指从药理学/毒理学的角度来看对于患者而言是可接受的，并且从物理/化学的观点来看，对于组成、配方、稳定性、患者接受度和生物利用度而言是制造药物化学家可接受的那些特性和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性并且对所施用的宿主无毒的介质。

在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或载体，诸如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或囊封材料，参与在患者体内或向患者体内携带或运输本公开中有用的化合物或分子，从而使其可以执行其预期功能。通常，将此类构建体从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的一部分。从与制剂的其他成分(包括本公开中有用的化合物)相容的意义上讲，每种载体必须是“可接受的”，并且对患者无害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与本公开中有用的化合物的活性相容并且对患者是生理上可接受的所有包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、吸收延迟剂等。补充活性化合物也可掺入组合物中。“药学上可接受的载体”还可以包括本公开内容中有用的化合物或分子的药物上可接受的盐。可包含在本公开内容的实践中使用的药物组合物中的其他另外成分是本领域已知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,Pa.)中描述，其通过引用并入本文。

如本文所用，措辞“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸(包括无机酸、有机酸、溶剂化物、水合物或其包合物)制备的施用化合物的盐。如本文所用，术语“组合物”是指在本公开内容中使用的至少一种化合物或分子与一种或多种不同的化合物、分子或材料的混合物。如本文所用，“药物组合物”或“药学上可接受的组合物”是指组合物的具体实例，其中在本公开内容中使用的至少一种化合物或分子与一种或多种药学上接受的载体混合。在某些情况下，药物组合物有助于向患者施用化合物或分子。

输注系统

本公开内容涉及输注系统，其包括用于治疗肝脏病症的药物组合物。在一些实施方案中，输注系统包括容纳药物组合物的容器和递送装置。

在一些实施方案中，容器是袋、注射器、烧瓶或任何用于容纳药物组合物以便随后分配的合适容器。容器可以是适用于储存组合物的任何容器。在一些实施方案中，容器可以是例如预填充的注射器、预填充的药筒、小瓶、安瓿瓶等。在其他实施方案中，该容器可以是具有柔性壁的容器，诸如例如气囊。在一些实施方案中，容器保持无菌。在一些实施方案中，容器包括一个或多个端口，包括例如药物端口、施用端口、入口端口、出口端口。在一些实施方案中，施用端口是药物组合物可流经的出口端口。在一些实施方案中，施用端口流体地连接到药物组合物可流经的管。如本文所述，管可以是任何适合的管，并且可以具有标准大小、尺寸和适合于递送药物组合物的材料。药物组合物从容器流出经管流到递送装置。

在一些实施方案中，递送装置是针、注射器或套管。递送装置使得能够通过肠胃外施用递送药物组合物。如本文所用，肠胃外施用药物组合物包括以受试者组织的物理破坏和通过组织中的缺口来施用药物组合物为特征的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过经过手术切口施加组合物、通过经过穿透组织的非手术伤口施加组合物等来施用药物组合物。特别地，预期肠胃外施用包括但不限于静脉内、皮下、腹腔内、肌内、胸骨内注射或团注注射。

在一些实施方案中，输注系统还包括滴注室、后止回阀、注入口、滑动夹、辊夹、螺纹锁、盖、过滤器或其他用于调节和控制药物组合物通过递送装置流向受试者的组件。此外，本文所述的输注系统可包括使得能够自动递送药物组合物的特征件，并因此还可包括泵、致动器、阀、电路或计算机处理器和存储器。

在一些实施方案中，可以将输注系统配置为自动递送本文所述的组合物。在一些实施方案中，输注系统在被用户致动后，可以自动产生力来递送组合物。以这种方式，递送组合物的力在期望的范围内，并且可以在不同的设备、使用者等之间重复。在一些实施方案中，输注系统包括被配置成产生力以递送组合物的储能构件。

在一些实施方案中，储能构件可以是任何合适的装置或机构，当被致动时，该装置或机构产生力来递送组合物。在一些实施方案中，储能构件可以是产生力以使组合物从容器输送到患者体内的任何适合的装置或机构。组合物通过递送装置经由肠胃外输送到体内。在一些实施方案中，通过采用储能构件产生力，而不是依靠使用者手动产生递送力，可以将组合物以所需的压力和/或流速递送至身体。在一些实施方案中，储能构件降低了药物组合物部分递送的可能性。

在一些实施方案中，储能构件可以是机械储能构件，诸如弹簧、含有压缩气体的装置、含有基于蒸气压的推进剂的装置等。在其他实施方案中，储能构件可以是电储能构件，诸如电池、电容器、磁储能构件等。在其他实施方案中，储能构件可以是化学储能构件，诸如含有当混合时反应以产生能量的两种物质的容器。

在一些实施方案中，储能构件可以相对于容器处于任何位置和/或取向。例如，在一些实施方案中，可以将储能构件定位在与容器间隔开的壳体内。此外，在一些实施方案中，可以将储能构件定位成使得储能构件的纵轴偏离容器。在其他实施方案中，储能构件可以基本上围绕容器。

在一些实施方案中，储能构件可以可操作地耦合至容器和/或其中所含的组合物，以使得力递送组合物。例如，在一些实施方案中，力可以经由活塞或柱塞传递给组合物。在其他实施方案中，力可以经由液力或气动耦合传递给组合物。在其他实施方案中，力可以电传递至组合物。在仍然其他实施方案中，力可以经由以上任一种的组合传递至组合物。

在一些实施方案中，容器可包括弹性体构件，使得由储能构件产生的力通过弹性体构件转移至组合物。在一些实施方案中，输注系统包括壳体、容器、弹性体构件和储能构件。该容器设置在壳体内，并含有组合物。该组合物可以是本文所述的任何组合物。储能构件设置在壳体内，并且被配置成产生力以递送如本文所述的组合物。

在一些实施方案中，输注系统可以是任何适用于自动递送本文所述的任何组合物的装置。在一些实施方案中，输注系统可以是配置成自动递送组合物的医用注射器。在一些实施方案中，医用注射器包括壳体、递送机构、含有用于治疗肝脏病症的药物组合物的容器、盖子、安全锁和/或系统致动器组件。医用注射器可以类似于2006年11月21日提交的名称为“Devices,Systems and Methods for Medicament Delivery”的美国专利No.7,648,482(其通过引用整体并入本文)中所述的自动注射器。

在一些实施方案中，递送装置耦合至容器并且至少部分地限定了流动路径，通过该流动路径可以将组合物递送至体内。在一些实施方案中，输送装置可以直接耦合至容器的远端部分。在其他实施方案中，递送装置可以间接耦合至容器。

在一些实施方案中，在致动储能构件之前，可以将递送装置耦合至容器，但与容器流体隔离。以这种方式，可以在延长的时间段储存输注系统，同时保持容器内所含组合物的无菌性，从而减少(或消除)组合物从容器中的任何泄漏。该布置还减少和/或消除了在可以使用输注系统施用组合物之前的组装操作。以这种方式，输注系统产生了用于递送组合物的快速且精确的机构。在使用之前减少和/或消除组装操作减少了输注系统和/或递送装置的性能受到损害(如，由于不适当的耦合、泄漏等)的可能性。

在一些实施方案中，递送装置可以经由耦合构件耦合至容器。在此类实施方案中，当储能构件被致动时，容器和/或递送装置可被配置为相对于耦合构件移动。此类移动可以使递送装置和容器流体地耦合，从而限定了可以将组合物递送到患者的流动路径。

在一些实施方案中，递送装置可以增强组合物的递送，从而提高组合物的功效。在一些实施方案中，递送装置可以产生具有所需特征的组合物流，以增强组合物的吸收速率，以使组合物向其中该递送不太有效的身体区域的递送最小化，等等。

例如，在一些实施方案中，递送装置可以产生受控流速的组合物。在此类实施方案中，递送装置可以包括一个或多个流动孔、弯曲的流动路径等，以产生期望的压降和/或控制通过递送装置的流动。例如，在一些实施方案中，可以配置递送装置以最小化组合物的过量递送。

例如，在一些实施方案中，可以将递送装置和储能构件进行协作配置，以便在致动储能构件时，输注系统产生治疗有效范围内的一定量的组合物。在一些实施方案中，储能构件被配置为“匹配”递送装置，使得储能构件被配置为产生预定范围内的力以确保递送装置的期望功能。因此，储能构件可以是任何适合的装置或机构，其在被致动时产生期望的力以递送如本文所述的组合物。通过采用储能构件产生力，而不是依靠使用者手动产生递送力，可以将组合物以期望的压力和/或流速递送至体内。

在一些实施方案中，递送装置可以在容器致动之前(如，通过手动压下柱塞、挤压扳机等)耦合至容器，但与容器流体隔离。

在一些实施方案中，递送装置可以经由耦合构件耦合至容器。在此类实施方案中，可以将容器和/或递送装置配置为在致动容器时相对于耦合构件移动。例如，在使用中，在压下柱塞以致动容器时，耦合构件可以相对于容器移动，之后将通过移动柱塞产生的大部分能量施加到组合物上。此类移动可以使递送装置和容器流体地耦合，从而限定了可以将组合物递送至患者的流动路径。

本文公开的容器和/或输注系统可含有任何适合量的用于治疗本文公开的肝脏病症的任何药物组合物。例如，在一些实施方案中，输注系统可以是含有单剂量的量的待递送组合物的单剂量装置。在其他实施方案中，输注系统可以是含有多个剂量的量的待递送组合物的多剂量设备。

尽管已经将各种实施方案描述为具有特定特征和/或组分组合，但是在适当的情况下，也可以是来自任何实施方案的任何特征和/或组分的组合的其他实施方案。本文所述的任何容器可含有本文所述的任何组合物和/或制剂。

图1描绘了示例性输注系统，其包括其中具有药物组合物11的容器10。该系统还包括在图1中描绘为针的递送装置20。图1所示的示例系统还包括滴注室12、管道14、辊夹16和与针20成一体的螺纹锁18。应当理解，图1所示的系统是示例性的，并且在本申请的范围内可以实现各种重复或修改。

在一些实施方案中，药物组合物被预先包装在容器内，并且容器被附接到递送装置。在一些实施方案中，容器包含诸如盐水的中性组合物，例如在注射口中引入了药物组合物。在本文其他地方详细描述药物组合物。

调节性T细胞

本文所述的系统和组合物包括激活的调节性T细胞。因此，本文提供的一些实施方案涉及通过与间充质干细胞进行培养而体外引发的调节性T细胞，或提供免疫调节方式来促进正常肝脏再生的过程或保护正常肝脏再生过程免于纤维化。已经证明，高达70％的肝脏切除会导致完全再生。Fausto,N.,J.S.Campbell和K.J.Riehle,Liverregeneration.Hepatology,2006.43(2Suppl 1):第S45-53页；Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration:alternative epithelial pathways.Int J Biochem Cell Biol,2011.43(2):第173-9页。然而，这是在不抑制肝细胞增殖的情况下。在这些情况下，肝脏依赖于卵圆细胞增殖。在本文公开的一个实施方案中，利用调节性T细胞来刺激卵圆细胞增殖同时抑制星形细胞活化。

在一方面，施用调节性T细胞以使患者能够接受手术诸如活体供体移植、两阶段肝切除术和劈开式肝移植，这对于具有多种肝脏病理或纤维化的患者是不可能的。Clavien,P.A.,等人,Strategies for safer liver surgery and partial livertransplantation.N Engl J Med,2007.356(15):第1545-59页；Adam,R.,等人,Two-stagehepatectomy:A planned strategy to treat irresectable liver tumors.Ann Surg,2000.232(6):第777-85页；Brown,R.S.,Jr.,Live donors in liver transplantation.Gastroenterology,2008.134(6):第1802-13页；Michalopoulos,G.K.,Principles ofliver regeneration and growth homeostasis.Compr Physiol,2013.3(1):第485-513页；Van Thiel,D.H.,等人,Rapid growth of an intact human liver transplantedinto a recipient larger than the donor.Gastroenterology,1987.93(6):第1414-9页。

本公开教导了可以通过使用已被预先激活或“引发”的成纤维细胞来进行干预的肝脏再生有三个阶段：a)引发；b)增殖和c)终止。Fausto,N.,J.S.Campbell和K.J.Riehle,Liver regeneration.Hepatology,2006.43(2Suppl 1):第S45-53页。值得注意的是，肝细胞不是终末分化的细胞，而是处于增殖静止状态的细胞。具体而言，它们与其他再生细胞(诸如造血干细胞)共享特征，因为它们通常处于细胞周期的G0期。这在肝脏再生期间有所改变，如下所述。不受理论的束缚，本公开教导了施用调节性T细胞通过在下述的肝衰竭的一个或多个阶段起作用来抑制肝衰竭并诱导再生。

在引发阶段，由于潜在的损伤而产生了许多损伤信号，这些信号包括toll样受体的激活剂、补体降解产物和损害相关分子模式(DAMP)。这些信号刺激多种细胞，主要是Kupffer细胞，以产生诱导肝细胞进入细胞周期的细胞因子和生长因子，诸如IL-6、TNF-α和HGF。基因敲除研究突出了这些分子信号在肝脏再生起始中的重要性。Cressmann等人在部分肝切除术中证明了肝脏再生的IL-6基因敲除模型阻断与这些小鼠肝细胞中细胞周期G0期钝化退出有关，但与非实质肝细胞无关。此外，他们最终显示出IL-6的重要性，因为术前单剂量的重组IL-6使损伤后的肝细胞进入G1/2恢复到在野生型小鼠中观察到的水平并恢复了生化功能。Cressman,D.E.,等人,Liver failure and defective hepatocyteregeneration in interleukin-6-deficient mice.Science,1996.274(5291):第1379-83页。NF-κB是包括TNF-α和IL-6在内的各种炎性细胞因子的主要下游效应物。Malato等人产生了肝特异性敲除小鼠，其中消融了NF-κB抑制剂IKK2，从而产生了更高水平的本底NF-κB激活。在这些小鼠中，部分肝切除导致肝细胞加速进入细胞周期。Malato,Y.,等人,Hepatocyte-specific inhibitor-of-kappaB-kinase deletion triggers the innateimmune response and promotes earlier cell proliferation during liverregeneration.Hepatology,2008.47(6):第2036-50页。使用与这些信号传导途径相关基因(诸如STAT、p38MAPK和Ras/ERK)的DNA微阵列分析确认了多种炎性或“危险”相关途径在损伤后肝细胞增殖的初始引发中的作用。Li,M.,等人,Study on the activity of thesignaling pathways regulating hepatocytes from G0 phase into G1 phase duringrat liver regeneration.Cell Mol Biol Lett,2014.19(2):第181-200页。本公开教导，根据患者需要，可以在该阶段进行各种免疫干预。例如，如果本公开内容的实践者的目标是上调肝细胞再生的程度，则可以施用先天性免疫刺激剂，诸如TLR激动剂或BCG或β-葡聚糖。应当注意，这些不应是有害的强炎症的刺激剂。在一个实施方案中，可以将TLR刺激剂与诸如间充质干细胞的细胞一起添加，这将遏制由TLR激活剂刺激的炎性响应的某些方面。在另一个实施方案中，可以将单核细胞添加至肝循环或肝内，以增强先天刺激发生的程度。在其他方面，可以添加树突细胞。

肝脏再生的增殖期与离开细胞周期的G1期并进入S期的“引发的”肝细胞相关，其伴随着成视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的磷酸化和许多增殖相关基因(包括细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A和DNA聚合酶)的上调表达。Fan,G.,等人,Modulation of retinoblastomaand retinoblastoma-related proteins in regenerating rat liver and primaryhepatocytes.Cell Growth Differ,1995.6(11):第1463-76页；Spiewak Rinaudo,J.A.和S.S.Thorgeirsson,Detection of a tyrosine-phosphorylated form of cyclin Aduring liver regeneration.Cell Growth Differ,1997.8(3):第301-9页。参与刺激肝细胞增殖的关键细胞因子包括肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)。HGF由间充质细胞、肝星状细胞和肝脏肝窦内皮细胞产生作为一种前蛋白，其在全身和局部均起作用。DeLeve,L.D.,Liver sinusoidal endothelial cells and liver regeneration.J ClinInvest,2013.123(5):第1861-6页；Maher,J.J.,Cell-specific expression ofhepatocyte growth factor in liver.Upregulation in sinusoidal endothelialcells after carbon tetrachloride.J Clin Invest,1993.91(5):第2244-52页。在部分肝切除后观察到HGF的全身升高，Matsumoto,K.,等人,Serial changes of serum growthfactor levels and liver regeneration after partial hepatectomy in healthyhumans.Int J Mol Sci,2013.14(10):第20877-89.页，而局部HGF从其潜在形式释放，其通常结合至胞外基质蛋白。Nakamura,T.,等人,Hepatocyte growth factor twenty yearson:Much more than a growth factor.J Gastroenterol Hepatol,2011.26Suppl 1:第188-202页。激活HGF通过经由由尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)介导的酶促切割发生。Mars,W.M.,等人,Immediate early detection of urokinase receptor after partialhepatectomy and its implications for initiation of liverregeneration.Hepatology,1995.21(6):第1695-701页；Shanmukhappa,K.,等人,Urokinase-type plasminogen activator supports liver repair independent of itscellular receptor.BMC Gastroenterol,2006.6:第40页。在表现出损伤后肝细胞进入细胞周期S期减少的HGF受体c-MET条件性失活的动物中观察到了HGF在肝脏再生增殖期中的重要性。Borowiak,M.,等人,Met provides essential signals for liverregeneration.Proc Natl Acad Sci U S A,2004.101(29):第10608-13页。EGF信号传导也被证实参与损伤后进入增生期。Natarajan等人在部分肝切除术之前在肝细胞中进行了围产期EGFR缺失。他们表明，肝损伤后肝脏中缺乏EGFR的小鼠死亡率增加，伴随有血清转氨酶水平升高，表明肝损害。突变体中的肝脏再生被延迟，因为肝细胞增殖减少。EGFR缺陷型肝脏中细胞周期进展分析表明，有缺陷的G(1)-S期进入、延迟的转录激活和减少的细胞周期蛋白D1蛋白表达，随后减少的cdk2和cdk1表达。Natarajan,A.,B.Wagner,和M.Sibilia,TheEGF receptor is required for efficient liver regeneration.Proc Natl Acad SciU S A,2007.104(43):第17081-6页。在该阶段进行免疫干预将需要施用产生生长因子的免疫细胞。此类细胞可以是可替代激活的巨噬细胞或用刺激物预处理以增加生长因子(诸如上面提及的包括HGF在内的那些)产生的单核细胞。一种刺激免疫细胞产生此类生长因子的方法包括用IGIV培养或用缺氧刺激。本公开的另一个实施方案是通过各种体外培养技术刺激淋巴细胞产生生长因子。例如，通过在肝细胞存在下用抗-CD3和抗-CD28培养来刺激同种异体或自体淋巴细胞可用于刺激生长因子产生，这对体内肝细胞增殖是有益的。

肝脏再生的终止阶段发生在恢复正常的肝质量/体重比为2.5％时。Nygard,I.E.,等人,The genetic regulation of the terminating phase of liverregeneration.Comp Hepatol,2012.11(1):第3页。尽管在肝脏再生的起始阶段几种炎症细胞因子至关重要，在终止阶段中抗炎性细胞因子诸如IL-10(Mosser,D.M.和X.Zhang,Interleukin-10:new perspectives on an old cytokine.Immunol Rev,2008.226:第205-18页)上调，这抑制了增殖刺激。Yin,S.,等人,Enhanced liver regeneration in IL-10-deficient mice after partial hepatectomy via stimulating inflammatoryresponse and activating hepatocyte STAT3.Am J Pathol,2011.178(4):第1614-21页。此外，还产生了具有直接抗增殖活性的细胞因子，诸如TGF-β，其导致增殖性肝细胞的细胞周期停滞。在该阶段，免疫干预可以是抑制肝细胞增殖的停滞，诸如利用抑制TGF-β产生的Th17细胞，或施用具有纤溶作用并表达MMP的细胞，此类细胞包括淋巴细胞、预处理的淋巴细胞和巨噬细胞。Treg与称为糖蛋白A为主的重复序列(GARP)的跨膜蛋白缔合产生潜伏TGF-β1。另外，可以进行被诱导以表达MMP的MSC的施用。

“治疗(Treat)”或“治疗(treatment)”意指改善症状并缓解自身免疫疾病、败血病或肺部疾病。另外，“治疗”意指改善缺血状况。用于测量“治疗”功效速率的方法是本领域已知的，并且包括例如评估炎性细胞因子。

“血管生成”意指有益于组织灌注的现有血管床的任何改变或新脉管系统的形成。这包括通过从现有血管中萌发内皮细胞来形成新血管，或通过对现有血管进行重塑以改变大小、成熟度、方向或流动特性来改善组织的血液灌注。如本文所用，术语“血管生成”、“血运重建”、“侧支循环增加”和“血管再生”被视为同义词。

“间充质干细胞”或“MSC”是指以下细胞：其(1)附着至塑料，(2)表达CD73、CD90和CD105抗原，而呈CD14、CD34、CD45和HLA-DR阴性，和(3)具有分化为成骨谱系、成软骨谱系和成脂谱系的能力。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”可源自任何组织，包括但不限于：骨髓、脂肪组织、羊水、子宫内膜、滋养细胞来源的组织、脐带血、华通氏胶质(Whartonjelly)、胎盘、源自多能干细胞的羊膜组织和牙齿。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括在最初从组织中分离后为CD34阳性但关于表型和功能与描述的细胞相似的细胞。如本文所用，“MSC”包括使用选自由以下组成的列表的细胞表面标记物从组织中分离的细胞：NGF-R、PDGF-R、EGF-R、IGF-R、CD29、CD49a、CD56、CD63、CD73、CD105、CD106、CD140b、CD146、CD271、MSCA-1、SSEA4、STRO-1和STRO-3或其任何组合，并且在扩增之前或之后都满足ISCT标准。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括文献中描述为以下的细胞：骨髓间充质干细胞(BMSSC)、骨髓分离的成体多能诱导型细胞(MIAMI)细胞、多能成体祖细胞(MAPC)、间充质成体干细胞(MASCS)、

remestemcel-L、间充质前体细胞(MPC)、牙髓干细胞(DPSC)、PLX细胞、PLX-PAD、

Ixmyelocel-T、MSC-NTF、NurOwn^TM、Stemedyne^TM-MSC、

StempeucelCLI、StempeucelOA、HiQCell、Hearticellgram-AMI、

Homeo-GH、AC607、PDA001、SB623、CX601、AC607、子宫内膜再生细胞(Endometrial Regenerative Cells，ERC)、脂肪来源的干细胞和再生细胞(ADRC)。

尽管在某些情况下，诸如在肝衰竭中，典型肝脏再生是由肝细胞介导的，但是肝细胞介导再生的能力是有限的并且肝祖细胞(LPC)必须进行该过程。Fausto,N.,J.S.Campbell和K.J.Riehle,Liver regeneration.Hepatology,2006.43(2Suppl 1):第S45-53页；Miyaoka,Y.和A.Miyajima,To divide or not to divide:revisiting liverregeneration.Cell Div,2013.8(1):第8页。在肝细胞增加受阻时即承担再生功能的LPC的概念最早于1956年得到证明，当时Farber用阻断肝细胞分裂的各种肝致癌物处理大鼠。Farber,E.,Similarities in the sequence of early histological changes inducedin the liver of the rat by ethionine,2-acetylamino-fluorene,and3’-methyl-4-dimethylaminoazobenzene.Cancer Res,1956.16(2):第142-8页。他发现了“卵圆细胞”的存在，这些卵圆细胞随后被证明用作具有分化为肝细胞和胆管细胞两者的能力的LPC。Evarts,R.P.,等人,A precursor-product relationship exists between oval cellsand hepatocytes in rat liver.Carcinogenesis,1987.8(11):第1737-40页。LPC存在于人肝脏的Hering管和胆小管中，并发现在患有慢性肝脏疾病的患者中增加。Libbrecht,L.和T.Roskams,Hepatic progenitor cells in human liver diseases.Semin Cell DevBiol,2002.13(6):第389-96页。尚不清楚LPC的起源是什么，它们来自局部细胞还是直接来自MSC，Banas,A.,等人,Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a sourceof human hepatocytes.Hepatology,2007.46(1):第219-28页，特别是骨髓来源的MSC，Petersen,B.E.,等人,Bone marrow as a potential source of hepatic ovalcells.Science,1999.284(5417):第1168-70页，但是对细胞机制的了解却很少。Margini,C.,等人,Bone marrow derived stem cells for the treatment of end-stage liverdisease.World J Gastroenterol,2014.20(27):第9098-9105页。在2000年，Theise等人在经受治疗性骨髓移植的女性患者的肝脏中发现了源自肝外循环干细胞的肝细胞和胆管细胞。在来自男性供体的两名女性接受者和来自女性供体的四名男性接受者中，肝细胞和胆管细胞的植入率范围分别为4％至43％和4％至38％。Theise,N.D.,等人,Liver from bonemarrow in humans.Hepatology,2000.32(1):第11-6页。鉴于肝脏的强大再生特性，再加上肝外细胞来源可促进再生的可能性，人们进行了许多尝试来利用细胞疗法来治疗肝衰竭。最初的肝细胞疗法涉及同种异体肝细胞的施用，其已经在动物模型中进行了30多年的尝试，并在临床上进行了实验性使用。不幸的是，存在阻碍该程序常规使用的主要障碍，特别是：a)少量的适合供体；b)移植后肝细胞存活力极差，其中某些组低至30％；和c)需要具有固有不良作用的持续免疫抑制。Filippi,C.和A.Dhawan,Current status of humanhepatocyte transplantation and its potential for Wilson’s disease.Ann N YAcad Sci,2014.1315:第50-5页。在一个实施方案中，LPC的刺激可通过施用免疫细胞提供，其为这些细胞提供生长因子支持。这包括施用经培养以具有增强的HGF和其他肝源性生长因子的脐带血单核细胞或单核细胞。在一些方面，将调节性T细胞与LPC一起使用以促进移植、增加存活力并允许增强的再生。

在本领域中已知MSC能够具有一些抗肝衰竭的活性，然而这些在临床环境中还没有被适当地利用。本领域的技术人员参考以下在肝衰竭中使用MSC的实例，如本文所述，可对MSC进行免疫学操作以诱导最佳治疗作用。间充质干细胞(MSC)是具有自我更新能力的成体干细胞，Jackson,L.,等人,Adult mesenchymal stem cells:differentiationpotential and therapeutic applications.J Postgrad Med,2007.53(2):第121-7页，并且已显示分化为多种组织，包括中胚层-和非中胚层-来源的，同上；Pittenger,M.F.,等人,Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science,1999.284(5411):第143-7页，诸如肝细胞。Banas,A.,等人,Rapid hepatic fate specification ofadipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liverfailure.J Gastroenterol Hepatol,2009.24(1):第70-7页；Lee,K.D.,等人,In vitrohepatic differentiation of human mesenchymal stem cells.Hepatology,2004.40(6):第1275-84页；Cho,K.A.,等人,Mesenchymal stem cells showed the highestpotential for the regeneration of injured liver tissue compared with othersubpopulations of the bone marrow.Cell Biol Int,2009.33(7):第772-7页；Hong,S.H.,等人,In vitro differentiation of human umbilical cord blood-derivedmesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells.Biochem Biophys Res Commun,2005.330(4):第1153-61页；Ishikawa,T.,等人,Stem cells for hepatic regeneration:the role of adipose tissue derived mesenchymal stem cells.Curr Stem Cell ResTher,2010.5(2):第182-9页；Seo,M.J.,等人,Differentiation of human adiposestromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo.Biochem Biophys ResCommun,2005.328(1):第258-64页。MSC能够进入和维持卫星细胞龛，特别是在造血中，Crisan,M.,等人,A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiplehuman organs.Cell Stem Cell,2008.3(3):第301-13页；Tavian,M.和B.Peault,Embryonic development of the human hematopoietic system.Int J Dev Biol,2005.49(2-3):第243-50.页，并且在组织修复和再生、老化和调控内稳态中是关键的。Peault,B.,等人,Stem and progenitor cells in skeletal muscle development,maintenance,and therapy.Mol Ther,2007.15(5):第867-77页；Aggarwal,S.和M.F.Pittenger,Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cellresponses.Blood,2005.105(4):第1815-22页；Caplan,A.I.,Adult mesenchymal stemcells for tissue engineering versus regenerative medicine.J Cell Physiol,2007.213(2):第341-7页；Chamberlain,G.,等人,Concise review:mesenchymal stemcells:their phenotype,differentiation capacity,immunological features,andpotential for homing.Stem Cells,2007.25(11):第2739-49页。在肝衰竭的情况下，MSC可有助于肝组织再生，Banas,A.,等人,IFATS collection:in vivo therapeuticpotential of human adipose tissue mesenchymal stem cells aftertransplantation into mice with liver injury.Stem Cells,2008.26(10):第2705-12页；Kharaziha,P.,等人,Improvement of liver function in liver cirrhosispatients after autologous mesenchymal stem cell injection:a phase I-IIclinical trial.Eur J Gastroenterol Hepatol,2009.21(10):第1199-205页；Kuo,T.K.,等人,Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success ofusing bone marrow mesenchymal stem cells.Gastroenterology,2008.134(7):第2111-21页,2121e1-3；Chang,Y.J.,等人,Mesenchymal stem cells facilitate recovery fromchemically induced liver damage and decrease liver fibrosis.Life Sci,2009.85(13-14):第517-25页；Lu,L.L.,等人,Isolation and characterization of humanumbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive functionand other potentials.Haematologica,2006.91(8):第1017-26页；Mohamadnejad,M.,等人,Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem celltransplantation in patients with decompensated liver cirrhosis.Arch Iran Med,2007.10(4):第459-66页；Terai,S.,等人,Improved liver function in patients withliver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy.StemCells,2006.24(10):第2292-8页，及其与免疫系统的相互作用，Chang,C.J.,等人,Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties thatare enhanced in the presence of interferon-gamma.Stem Cells,2006.24(11):第2466-77页；Iyer,S.S.和M.Rojas,Anti-inflammatory effects of mesenchymal stemcells:novel concept for future therapies.Expert Opin Biol Ther,2008.8(5):第569-81页；Nauta,A.J.和W.E.Fibbe,Immunomodulatory properties of mesenchymalstromal cells.Blood,2007.110(10):第3499-506页；Uccelli,A.,V.Pistoia,andL.Moretta,Mesenchymal stem cells:a new strategy for immunosuppression？TrendsImmunol,2007.28(5):第219-26页；Wolbank,S.,等人,Dose-dependent immunomodulatoryeffect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with humanmesenchymal stem cells from adipose tissue.Tissue Eng,2007.13(6):第1173-83页；Wolf,D.和A.M.Wolf,Mesenchymal stem cells as cellularimmunosuppressants.Lancet,2008.371(9624):第1553-4页；Shi,M.,Z.W.Liu,和F.S.Wang,Immunomodulatory properties and therapeutic application ofmesenchymal stem cells.Clin Exp Immunol,2011.164(1):第1-8页，具有在器官移植期间作为佐剂的潜能，Sordi,V.和L.Piemonti,Therapeutic plasticity of stem cellsand allograft tolerance.Cytotherapy,2011.13(6):第647-60页，包括肝移植。Popp,F.C.,等人,Mesenchymal stem cells as immunomodulators after livertransplantation.LiverTranspl,2009.15(10):第1192-8页。

在一个实施方案中，调节性T细胞用于增强MSC在治疗肝衰竭中的活性。

目前，有几种基于MSC的疗法已获得政府批准，包括在加拿大和新西兰注册以用于治疗移植物抗宿主疾病的ProchymalTM。Kurtzberg,J.,等人,Allogeneic humanmesenchymal stem cell therapy(remestemcel-L,Prochymal)as a rescue agent forsevere refractory acute graft-versus-host disease in pediatric patients.BiolBlood Marrow Transplant,2014.20(2):第229-35页；Kellathur,S.N.和H.X.Lou,Celland tissue therapy regulation:worldwide status and harmonization.Biologicals,2012.40(3):第222-4页。尽管就临床转化而言，骨髓MSC是最先进的，但已知MSC的几种其他来源也具有可以对特定条件有用的多种特性。骨髓也是造血干细胞(HSC)的来源，其也已用于肝脏再生。同样，人胎盘是可以在体外进行分化的大量MSC的易于获得的来源。最后，具有组织再生能力的MSC也可以从脂肪组织中分离出来，并大量诱导为肝细胞。

早期研究表明，在骨髓中发现的肝脏再生细胞中，与其他细胞类型诸如造血干细胞相比，MSC组分是最易再生的细胞类型。Cho,K.A.,等人,Mesenchymal stem cellsshowed the highest potential for the regeneration of injured liver tissuecompared with other subpopulations of the bone marrow.Cell Biol Int,2009.33(7):第772-7页。鉴于BM-MSC能够在体外分化为多种组织的事实，以及结合肝修复卵圆细胞的推定骨髓来源，Petersen,B.E.,等人,Bone marrow as a potential source ofhepatic oval cells.Science,1999.284(5417):第1168-70页，研究人员试图确定是否可以通过在可模拟肝脏再生的条件下培养来诱导BM-MSC体外分化为肝细胞。Lee等人开发了通过使用在肝细胞生长因子中培养、然后在制瘤素M中培养进行肝细胞分化的两步方案。诱导4周后，研究者报告称纺锤状BM-MSC呈立方体形态，这是肝细胞的特征。此外，观察到分化细胞以与形态变化相关的时间依赖性方式启动肝特异性基因的表达。从功能的角度来看，生成的肝细胞表现出肝脏细胞的特征，特别是白蛋白产生、糖原储存、尿素分泌、摄取低密度脂蛋白以及苯巴比妥-诱导型细胞色素P450活性。Lee,K.D.,等人,In vitro hepaticdifferentiation of human mesenchymal stem cells.Hepatology,2004.40(6):第1275-84页。为了提高BM-MSC产生的肝细胞的产量和功效，Chen等人利用培养的肝细胞的条件培养基作为分化培养条件的一部分。他们报告了，分化条件下的BM-MSC培养物在第10天和第20天开始呈上皮样双核形态。基因评估揭示了AFP、HNF-3β、CK19、CK18、ALB、TAT和G-6-PasemRNA增加，这已在蛋白质水平上得到证实。另外，通过在条件培养基中培养，细胞开始呈现类似于肝细胞(包括肝细胞样细胞)的功能性表型，还显示了肝脏细胞特有的体外功能，包括糖原存储和尿素分泌活性。观察到这些人为产生的肝样细胞在体内的相关性在于，移植至暴露于化学诱导的肝损伤的免疫缺陷动物后，观察到白蛋白活性得以恢复和肝酶被遏制。Chen,Y.,等人,In vitro differentiation of mouse bone marrow stromal stemcells into hepatocytes induced by conditioned culture medium of hepatocytes.JCell Biochem,2007.102(1):第52-63页。根据受伤的组织介导MSC激活和随后修复的概念，Mohsin等人证明了相比于与天然肝细胞的共培养，BM-MSC与化学损伤的肝细胞的共培养增强了肝分化。Mohsin,S.,等人,Enhanced hepatic differentiation of mesenchymalstem cells after pretreatment with injured liver tissue.Differentiation,2011.81(1):第42-8页。

为了指导调节性T细胞的临床剂量，本公开教导可以使用与用于MSC治疗肝衰竭的那些剂量相似或更高的剂量。示例性临床试验在下面讨论。利用BM-MSC的临床试验显示出极好的安全性特性，对肝衰竭具有不同程度的功效。Mohamadnejad等人，Mohamadnejad,M.,等人,Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem celltransplantation in patients with decompensated liver cirrhosis.Arch Iran Med,2007.10(4):第459-66页，进行了4例失代偿肝硬化患者研究。抽取患者骨髓，培养间充质干细胞，并通过外周静脉输注平均31.73 x 10(6)个间充质干细胞。随访期间患者无副作用。到随访结束时，患者1和4的末期肝脏疾病(MELD)评分模型分别提高了4分和3分。此外，到随访结束时所有四名患者的生活质量得到改善。使用SF-36问卷，平均身体成分尺度从31.44增加到65.19，并且平均心理成分尺度从36.32增加到65.55。另一项研究治疗八名患者(四名乙型肝炎，一名丙型肝炎，一名酒精性和两名隐源性)，其包括了MELD评分>或＝10的末期肝脏疾病。自体BM-MSC取自髂嵴。大约有3000万至5000万个BM-MSC增殖并被注射至外周静脉或门静脉中。实验后，MELD评分从17.9+/-5.6降至10.7+/-6.3(P<0.05)，并且凝血酶原复合物从国际标准化比率从1.9+/-0.4降低至1.4+/-0.5(P<0.05)。血清肌酐从114+/-35降低至80+/-18微摩尔/l(P<0.05)。该试验在临床上用BM-MSC活性在肝衰竭中的功效信号支持了安全性。

更大型的自体BM-MSC试验集中于患有肝衰竭伴有乙型肝炎感染的患者。Peng,L.,等人,Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liverfailure patients caused by hepatitis B:short-term and long-termoutcomes.Hepatology,2011.54(3):第820-8页。部分原理是表明BM-MSC来源的肝细胞对乙型肝炎感染具有抗性的先前研究。Xie,C.,等人,Human bone marrow mesenchymal stemcells are resistant to HBV infection during differentiation into hepatocytesin vivo and in vitro.Cell Biol Int,2009.33(4):第493-500页。Peng等人(同上)治疗了53名患者并且作为对照使用105名匹配了年龄、性别和生物化学指标(包括丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白、总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)和MELD评分)的患者。在细胞施用后的2-3周时间内，与对照组中的那些相比，基于ALB、TBIL和PT的水平以及MELD评分观察了功效。通过以下证明了该程序的安全性：在治疗组和对照组之间在192周时，肝细胞癌(HCC)的发生率或死亡率没有差异。不幸的是，两组之间的肝功能在192周时也相似，这表明BM-MSC的有益作用本质上是短暂的。支持BM-MSC的短暂作用的可能性是失代偿性硬化患者中的27名患者研究，其中15名患者接受BM-MSC并且12名患者接受安慰剂。随访12个月时，MSC组与安慰剂组之间的Child评分、MELD评分、血清白蛋白、INR、血清转氨酶和肝体积的绝对变化无明显差异。不幸的是，该出版物没有提供3或6个月的值。Mohamadnejad,M.,等人,Randomized placebo-controlled trial of mesenchymal stem cell transplantationin decompensated cirrhosis.Liver Int,2013.33(10):第1490-6页。相比之下，最近的一项研究将BM-MSC施用至经基线活检证实为酒精硬化的已经无酒精持续至少6个月的12名患者(11名男性，1名女性)体内。Jang,Y.O.,等人,Histological improvement followingadministration of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells foralcoholic cirrhosis:a pilot study.Liver Int,2014.34(1):第33-41页。根据Laennec纤维化评分量表对11名患者中的6名量化了3个月的组织学改善和纤维化减少评估。此外，在细胞施用后3个月时，10名患者的Child-Pugh评分显著提高，并且在BM-MSC疗法后，转化生长因子-β1、1型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的水平显著降低(如通过实时逆转录酶聚合酶链式反应评估)。总体而言，研究之间不同的基础条件、施用途径和评估时间点使难以得出可靠的结论，尽管看起来存在一定的治疗效果，尽管效果的长短尚不清楚。

鉴于先前研究中长期缺乏功效的一种可能性可能是体内肝细胞分化的不适当水平，Amer等人进行了一项临床试验，其中通过含HGF的培养混合物使BM-MSC向肝细胞谱系预分化。Amer,M.E.,等人,Clinical and laboratory evaluation of patients with end-stage liver cell failure injected with bone marrow-derived hepatocyte-likecells.Eur J Gastroenterol Hepatol,2011.23(10):第936-41页。他们在丙型肝炎患者中进行了40名患者试验，其中20名患者用部分分化的细胞进行脾内或肝内治疗，并且20名患者接受了安慰剂对照。在3个月和6个月的时间点，观察到腹水、下肢水肿和血清白蛋白较对照组显著改善。另外，以Child-Pugh和MELD评分量化了显著优势。肝内或脾内施用之间未观察到差异。这项研究证明了从BM-MSC中半分化的肝细胞产生治疗益处的潜力，而没有报道副作用。在一个实施方案中，将调节性T细胞与已分化为肝谱系的MSC一起施用。

BMMC在肝脏中的最初临床用途之一涉及在施用前纯化CD133阳性细胞，其概念是CD133选择具有增强的再生潜能的细胞。Handgretinger,R.和S.Kuci,CD133-PositiveHematopoietic Stem Cells:From Biology to Medicine.Adv Exp MedBiol,2013.777:第99-111页。此外，骨髓细胞的CD133亚群可能代表了肝原性前体细胞，因为该表型细胞是在部分肝切除术后从骨髓中动员而来的。Zocco,M.A.,等人,CD133+stem cell mobilizationafter partial hepatectomy depends on resection extent and underlyingdisease.Dig Liver Dis,2011.43(2):第147-54页；Harb,R.,等人,Bone marrowprogenitor cells repair rat hepatic sinusoidal endothelial cells after liverinjury.Gastroenterology,2009.137(2):第704-12页；Gehling,U.M.,等人,Partialhepatectomy induces mobilization of a unique population ofhaematopoieticprogenitor cells in human healthy liver donors.J Hepatol,2005.43(5):第845-53页。另一个有趣的点是，据一些研究报道，CD133在肝脏中的卵圆细胞上表达，尽管骨髓来源是有争议的。Rountree,C.B.,等人,A CD133-expressing murine liver oval cellpopulation with bilineage potential.Stem Cells,2007.25(10):第2419-29页；Rountree,C.B.,等人,Isolation of CD133+liver stem cells for clonal expansion.JVis Exp,2011(56)；Yovchev,M.I.,等人,Novel hepatic progenitor cell surfacemarkers in the adult rat liver.Hepatology,2007.45(1):第139-49页。在2005年，amEsch等人描述了在右侧肝段的门静脉栓塞后接受自体CD133(+)BMSC的门内施用以用于扩大左侧肝段的3名患者。计算机断层扫描容量法揭示了，与不施加BMSC的三名连续患者的组相比，左外侧段的平均增殖率提高了2.5倍。am Esch,J.S.,2nd,等人,Portal applicationof autologous CD133+bone marrow cells to the liver:a novel concept to supporthepatic regeneration.Stem Cells,2005.23(4):第463-70页。在2012年，同一组报告了11名用该程序治疗的患者和11名对照。他们报告，当与对照组(62.95mL±40.03；P＝0.004)比较时，在接受CD133细胞的组中门静脉栓塞后14天，II/III段的平均肝生长显著更高(138.66mL±66.29)。事后分析揭示了，与对照相比，接受细胞的组的存活率更高。用另一组进行的类似研究涉及6名接受CD133细胞来加速左外侧段再生的患者，以及7名匹配的对照患者。治疗组中平均未来绝对肝残余量(FLRV)从239.3mL+/-103.5增加至417.1mL+/-150.4，明显高于对照组中的从286.3mL+/-77.1增加至395.9mL+/-94.1。治疗组中的每日肝生长速率(9.5mL/d+/-4.3)显著高于对照组中的每日肝生长速率(4.1mL/d+/-1.9)(P＝.03)。此外，至手术的时间在治疗组中为27天+/-11，并且在对照组中为45天+/-21(P＝.057)。这些数据表明在临床情况下，从BMMC中分离的CD133细胞看起来促进肝脏再生。在一个实施方案中，通过将自体骨髓单核细胞或纯化的亚群(如CD34、CD133或乙醛脱氢酶高)与同种异体调节性T细胞一起的组合来治疗肝衰竭。在一些实施方案中，调节性T细胞可以是自体的。

来自BMMC的另一种纯化的细胞类型是表达CD34的细胞，其通常已知具有造血干细胞区室。Sidney,L.E.,等人,Concise review:evidence for CD34 as a common markerfor diverse progenitors.Stem Cells,2014.32(6):第1380-9页。另外地，类似于CD133，CD34存在于肝脏内的卵圆细胞上，表明当肝细胞增殖受抑制时骨髓来源的CD34细胞在肝脏再生中起作用的可能性。Crosby,H.A.,D.A.Kelly,和A.J.Strain,Human hepatic stem-like cells isolated using c-kit or CD34can differentiate into biliaryepithelium.Gastroenterology,2001.120(2):第534-44页；Theise,N.D.,等人,Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation.Hepatology,2000.31(1):第235-40页。Gordon等人报告了5名用分离的CD34阳性细胞治疗的肝衰竭患者。Gordon,M.Y.,等人,Characterization andclinical application of human CD34+stem/progenitor cell populations mobilizedinto the blood by granulocyte colony-stimulating factor.Stem Cells,2006.24(7):第1822-30页。有趣的是，研究人员不是从骨髓收集物中收获细胞，而是通过用G-CSF处理动员了骨髓细胞。研究人员首先证明，这些CD34细胞能够在体外分化为产生白蛋白的肝细胞样细胞。尝试在5名肝衰竭患者中进行了临床试点研究。将CD34细胞注射到门静脉(3名患者)或肝动脉(2名患者)中。没有观察到与该过程相关的并发症或特定副作用。五分之三的患者显示出血清胆红素水平有所提高，并且五分之四的患者血清白蛋白水平有所提高。同一小组的随后公开报告了胆红素水平提高维持了18个月。Levicar,N.,等人,Long-termclinical results of autologous infusion of mobilized adult bone marrowderived CD34+cells in patients with chronic liver disease.Cell Prolif,2008.41Suppl 1:第115-25页。由Gasbarrini等人进行的随后病例报告描述了在患有尼美舒利诱导的急性肝衰竭的酒精中毒患者中使用经由门静脉施用的自体CD34+BMMC作为挽救治疗。同上。输注后20天进行的肝活检显示坏死灶周围肝细胞复制增强；在最初的30天内，合成肝功能也有所改善。

在对CD133和CD34细胞的初步研究之后，研究者评估了未纯化的BMMC对肝衰竭的作用。Terai等人用静脉内施用的自体BMMC治疗了9由于多种原因而患有肝硬化的患者。Terai,S.,等人,Improved liver function in patients with liver cirrhosis afterautologous bone marrow cell infusion therapy.Stem Cells,2006.24(10):第2292-8页。在BMMC疗法后24周，观察到血清白蛋白水平和总蛋白显著提高。在第4周和第24周时，观察到显著提高的Child-Pugh评分。BMMC输注后，肝活检组织中的甲胎蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)表达显著升高。没有发现重大副作用。一项酒精相关的失代偿性肝衰竭的后续研究检查了与接受标准医学护理的30名患者相比，28名患者中门静脉内施用的自体BMMC的作用。3个月后，BMMC组和对照组中分别有2名和4名患者死亡。不良事件在各组之间平均分布。随访期间，两组中MELD评分同时提高。两组中比较4周时与基线的肝活检，脂肪变性改善，并且增殖的HPC趋于下降。Spahr,L.,等人,Autologous bone marrow mononuclear celltransplantation in patients with decompensated alcoholic liver disease:arandomized controlled trial.PLoS One,2013.8(1):第e53719页。尚不清楚为什么与最初的较小型研究相比，这项较大型研究产生了负面结果。有趣的是，在其中对32名失代偿性肝硬化患者进行了自体BMMC治疗并且15名患者接受了标准护理的另一项研究中，观察到了显著改善。具体而言，观察到ALT、AST、白蛋白、胆红素和组织学评分均得到提高。与对照组相比，BMMC移植的功效持续了3-12个月。与对照相比，BM-MNC输送的患者中严重并发症(诸如肝性脑病和自发性细菌腹膜炎)也明显减少。然而，这些改善在移植后的24个月内就消失了。Bai,Y.Q.,等人,Outcomes of autologous bone marrow mononuclear celltransplantation in decompensated liver cirrhosis.World J Gastroenterol,2014.20(26):第8660-6页。BMMC的作用在肝衰竭中可能是短暂的，持续少于12个月。例如，Lyra等人报告了10名接受自体BMMC的Child-Pugh B和C肝衰竭患者。胆红素水平在细胞移植后的1个月(2.19+/-0.9)和4个月(2.10+/-1.0)低于基线水平(2.78+/-1.2)。Lyra,A.C.,等人,Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear celltransplantation in patients with advanced chronic liver disease.World JGastroenterol,2007.13(7):第1067-73页。BMMC输注后4个月的白蛋白水平(3.73+/-0.5)高于基线水平(3.47+/-0.5)。细胞移植后一个月，国际标准化比率(INR)从1.48(SD＝0.23)降至1.43(SD＝0.23)。同一组使用相似方法进行的较大型研究报告了相似的短暂益处。Lyra,A.C.,等人,Infusion of autologous bone marrow mononuclear cells throughhepatic artery results in a short-term improvement of liver function inpatients with chronic liver disease:a pilot randomized controlled study.Eur JGastroenterol Hepatol,2010.22(1):第33-42页。具体来说，用在移植列表上的被随机至接受BMMC或支持性护理的肝硬化患者进行了30名患者研究。与对照相比，细胞疗法组中前90天Child-Pugh评分提高。在治疗组中，MELD评分保持稳定，但在对照组中在随访期间有所增加。在治疗组中白蛋白水平有所提高，而在对照中，它们在前90天内保持稳定。对照中胆红素水平升高，而它们在治疗组中前60天期间降低；组之间的INR RC差高达10％。观察到的变化没有持续超过90天。

利用骨髓干细胞进行肝脏再生的其他方法包括通过提供诸如G-CSF的试剂刺激内源性干细胞的动员。研究HSC动员以用于肝细胞形成的实验研究得出了相互矛盾的结果，Cantz,T.,等人,Reevaluation of bone marrow-derived cells as a source forhepatocyte regeneration.Cell Transplant,2004.13(6):第659-66页；Jang,Y.Y.,等人,Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days withoutfusion.Nat Cell Biol,2004.6(6):第532-9页；Kanazawa,Y.和I.M.Verma,Littleevidence of bone marrow-derived hepatocytes in the replacement of injuredliver.Proc Natl Acad Sci U S A,2003.100Suppl 1:第11850-3页，但Shitzu等人在2012年显示了在鼠急性肝衰模型中的有益作用。Shizhu,J.,等人,Bone marrow mononuclearcell transplant therapy in mice with CCl4-induced acute liver failure.Turk JGastroenterol,2012.23(4):第344-52页。在一个实施方案中，施用调节性T细胞连同骨髓动员一起进行以治疗肝衰竭。

在一个实施方案中，将冷冻保存的脐带血袋(1个单位袋)解冻并在含有0.5％HSA(Baxter Healthcare,Westlake Village,CA)的CliniMACS缓冲液(Miltenyi Biotec,Bergish Gladbach,Germany)中洗涤，以纯化单核细胞。随后，根据制造商的说明(MiltenyiBiotec,Bergish Gladbach,Germany)，使用磁激活的细胞分选(MACS)通过阳性选择进行细胞CD25+细胞富集。检查细胞的存活力，然后将其通过与CD3/28共表达的

(ClinExVivo^TM CD3/CD28,Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)以1个细胞:3个珠的比率9共培养来刺激，并以1×10⁶个细胞/ml重悬浮于补充了10％人AB血清(Gemini Bio-Products,Sacramento,CA)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma,St.Louis,MO)、1％青霉素-链霉素(Gibco/Invitrogen,Grand Island,NY)]和200IU/ml白介素(IL)-2(CHIRON Corporation,Emeryville,CA)的X-VIVO 15培养基(Cambrex BioScience,Walkersville,MD)中。CD25+细胞和珠粒的离体共培养是在37℃下于含5％CO2的空气气氛中在组织培养烧瓶中进行的。通过每48-72小时添加新鲜培养基和IL-2(维持200IU/ml)，将CB-来源的CD25+富集的T细胞维持在1×10⁶个细胞/ml。在某些培养物中进行华通氏胶质MSC的添加。所述MSC以50％汇合度预涂铺，之后添加如上所述的脐带血细胞。

以上源于任何上述组织的细胞的细胞扩增发生在洁净室设施中，该设施旨在用于细胞疗法的生产并符合GMP洁净室分类。在位于10,000级清洁生产套件中的无菌II级生物安全柜中，将细胞在受控条件下解冻，并在15mL锥形管中用补充了来自奶牛的20％胎牛血清(Atlas)的10ML完全DMEM低葡萄糖培养基(cDMEM)(GibcoBRL,Grand Island,N.Y.)洗涤，培养基被证实没有BSE％胎牛血清，并指定为内毒素水平小于或等于100EU/mL(其水平通常小于或等于10EU/mL)和血红蛋白水平小于或等于30mg/dl(其水平通常小于或等于25mg/dl)。隐蔽所使用的血清批次，并且所有实验均使用一个批次。随后将细胞置于含有45mLcDMEM的T-225烧瓶中，并在37℃下在5％CO2下在完全湿润的气氛中培养24小时。这使MSC得以粘附。通过轻轻冲洗烧瓶，使用cDMEM冲洗掉未粘附的细胞。每个起始的T-225烧瓶大约产生600万个细胞。然后将第一烧瓶的细胞分成4个烧瓶。将细胞生长4天，之后每个烧瓶中存在约600万个细胞(总计2400万个细胞)。重复该方案，但是细胞没有扩增超过10代，然后存入600万细胞等分试样中装在密封的小瓶中以进行递送。生成、扩增和产物生产中的所有过程均在符合目前良好制造过程和适当控制以及FDA在1998年发布的指南Guidance forIndustry:Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy；2008Guidance for FDA Reviewers and Sponsors Content and Review of Chemistry,Manufacturing,and Control(CMC)Information for Human Somatic Cell TherapyInvestigational New Drug Applications(IND)的条件和测试下进行；并遵循了1993年FDA有关主细胞库的指导性文件(points-to-consider document)，以生成所述的细胞产物。将供体细胞在无菌条件下收集，运送到合同制造厂，评估是否缺乏污染并进行扩增。将扩增的细胞储存在约600万个细胞/小瓶的冷冻小管中，每个供体约有100个小瓶。在扩增的每个步骤，都有质量控制程序以确保没有污染或异常细胞生长。

在不背离本公开的精神的情况下，可以优化间充质干细胞以及间充质干细胞和调节性T细胞的培养物以具有增强的免疫调节性质。在一个实施方案中，这可通过暴露间充质干细胞于缺氧条件进行，特别是缺氧条件可包括低于10％的氧水平。在一些实施方案中，缺氧条件包含至多约7％氧。例如，缺氧条件可包括至多约7％、至多约6％、至多约5％、至多约4％、至多约3％、至多约2％或至多约1％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％或至多1％氧。在一些实施方案中，缺氧条件包括约1％氧至多达约7％氧。例如，缺氧条件可包括约1％氧至多达约7％氧；约2％氧至多达约7％氧；约3％氧至多达约7％氧；约4％氧至多达约7％氧；约5％氧至多达约7％氧；或约6％氧至多达约7％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括1％氧至多达7％氧；2％氧至多达7％氧；3％氧至多达7％氧；4％氧至多达7％氧；5％氧至多达7％氧；或6％氧至多达7％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括约1％氧至多达约7％氧；约1％氧至多达约6％氧；约1％氧至多达约5％氧；约1％氧至多达约4％氧；约1％氧至多达约3％氧；或约1％氧至多达约2％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括1％氧至多达7％氧；1％氧至多达6％氧；1％氧至多达5％氧；1％氧至多达4％氧；1％氧至多达3％氧；或1％氧至多达2％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括约1％氧至多达约7％氧；约2％氧至多达约6％氧；或约3％氧至多达约5％氧。作为另一个实例，缺氧条件可包括1％氧至多达7％氧；2％氧至多达6％氧；或3％氧至多达5％氧。在一些实施方案中，缺氧条件可包括不大于2％氧。例如，缺氧条件可包括不大于2％氧。

治疗肝脏病症的方法

一些实施方案涉及治疗肝脏病症的方法。如本文所用，肝脏病症或肝脏疾病是指由某些因素引起的肝细胞损伤或损害，然后可能导致肝功能障碍。根据本发明，本文所述的组合物可用于改善肝脏疾病或病症。本文所用的术语“肝损害”是指与正常肝脏相比具有组织学或生化功能障碍的肝脏。在一个特定的实施方案中，如本文所用，术语“肝损害”是指由酒精或非酒精因素(诸如高脂饮食或肥胖)引起的肝脏病变。在一个特定的实施方案中，术语“肝损害”可以是具有选自脂肪变性、小叶炎症、肝细胞膨胀和肝细胞产生的囊泡脂肪滴的一种或多种特征的肝组织损害。在一个特定的实施方案中，术语“肝损害”可以是肝脏的生化功能障碍，其可以通过丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)的活性来确定。ALT或AST的较高活性水平表明肝脏的生化功能严重功能障碍。

肝脏病症可以是指影响肝脏的任何疾病或病症。肝脏的疾病或病症很多，并且已经表征了一百多种类型的肝脏疾病。肝脏疾病的实例包括但不限于阿拉吉耶综合征(Alagille Syndrome)；酒精相关的肝脏疾病；α-1抗胰蛋白酶缺乏症；自身免疫性肝炎；良性肝肿瘤；胆道闭锁；肝硬化；半乳糖血症；吉尔伯特综合征；血色素沉着症；甲型肝炎；乙型肝炎；丙型肝炎；肝细胞癌；肝性脑病；肝囊肿；肝癌；新生儿黄疸；非酒精性脂肪肝脏疾病(包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎)；原发性胆汁性肝硬化(PBC)；原发性硬化性胆管炎(PSC)；雷伊综合征(Reye Syndrome)；I型糖原贮积病和威尔逊病(WilsonDisease)。

在一些实施方案中，该方法包括选择患有或疑似患有肝脏病症的受试者。在一些实施方案中，例如，基于发展肝脏病症的遗传或环境倾向选择具有发展肝脏病症倾向的受试者。在一些实施方案中，对受试者的治疗包括减轻肝脏病症的症状，预防肝脏病症的症状，再生肝细胞或降低发展肝脏病症的可能性。如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“治疗”或“疗法”不一定意味着完全治愈或消除疾病或疾患。

如本文所用，术语“抑制”是指减少或预防肝脏病症。减少可以为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或者在由任意两个前述值定义的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”是指将诸如肝脏病症的事件减慢、推迟或延迟到比原先预期的时间要晚的时间。延迟可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在由任意两个前述值定义的范围内的量的延迟。术语抑制和延迟不应解释为必须表示100％抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。

在一些实施方案中，该方法包括施用如本文所述的药物组合物，其中药物组合物包含激活的调节性T细胞群。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞群通过与同种异体间充质干细胞一起培养而具有增强的肝脏再生因子产生。在一些实施方案中，调节性T细胞群被激活或已被致使为激活的以通过增强的产生肝细胞生长因子的能力来诱导肝增殖，以及增强肝卵圆细胞增殖。在一些实施方案中，治疗肝衰竭包括减少肝纤维化。如本文所用，肝纤维化是指功能性肝细胞减少。在一些实施方案中，治疗肝衰竭包括刺激损伤后肝组织生长增殖。如本文所用，肝脏再生被定义为肝细胞的增殖。

如本文所用，肝卵圆细胞或肝祖细胞是负责在其中肝细胞响应于损伤或损害而停止增殖的条件下生成新的肝组织的细胞。

在一些实施方案中，调节性T细胞源自外周血单核细胞、经动员的外周血单核细胞、脐带血、经血或脂肪基质血管组分细胞。在一些实施方案中，经动员的外周血单核细胞获自G-CSF、flt-3配体、血小板生成素或Mozobil的施用。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞抑制用激活增殖的信号刺激的天然T细胞的增殖。在一些实施方案中，激活增殖的信号是抗-CD3和抗-CD28珠、伴刀豆球蛋白A、PHA或用同种异体抗原呈递细胞刺激。在一些实施方案中，经激活的调节性T细胞遏制树突细胞的成熟。如本文所用，树突细胞的成熟是CD80、CD40、CD86或HLA II的上调。在一些实施方案中，经激活的调节性T细胞表达神经毡蛋白-1、CTLA-4、CD25、CD39、CD73、CD105、CD127、FoxP3、GARP、GITR配体、IL-10或膜结合的TGF-β。在一些实施方案中，经激活的调节性T细胞通过暴露于血管活性肠肽、IL-10、TGF-β、间充质干细胞条件培养基、间充质干细胞来源的外来体、BDNF、人绒毛膜促性腺激素、VEGF、CD3或CD28抗体、缺氧条件、雷帕霉素或促血管生成素而被激活。在一些实施方案中，激活的调节性T细胞是无反应性T细胞。

在一些实施方案中，将调节性T细胞与2型单核细胞、CD5阳性B细胞、2型NKT细胞、致耐受性树突细胞、γδT细胞、具有免疫调控性质的T细胞、CD34细胞、极小胚胎样干细胞或塞托利细胞共培养。

在一些实施方案中，间充质干细胞呈有丝分裂失活状态。在一些实施方案中，调节性T细胞在施用前用免疫调节剂处理。在一些实施方案中，间充质干细胞在施用前与免疫调节剂一起培养。在一些实施方案中，免疫调节剂诱导调节性T细胞增殖或诱导调节性T细胞产生白血病抑制因子。在一些实施方案中，免疫调节剂是IL-4、IL-10、IL-13、IL-20、TGF-β、CXCL12、VEGF、PGE-2或抑制素或其组合。在一些实施方案中，间充质干细胞表达STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-I标记物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、凝血调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146或THY-1或其组合。在一些实施方案中，间充质干细胞不表达显著水平的HLA-DR、CD117和CD45。在一些实施方案中，间充质干细胞源自华通氏胶质、骨髓、外周血、经动员的外周血、子宫内膜、毛囊、乳牙、睾丸、脂肪组织、皮肤、羊水、脐带血、网膜、肌肉、羊膜、脑室周流、胎盘组织、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、单性生殖干细胞或体细胞核转移来源的干细胞。

在一些实施方案中，胚胎干细胞表达阶段-特异性胚胎抗原(SSEA)3、SSEA 4、Tra-1-60和Tra-1-81、Oct-3/4、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、足糖萼蛋白(PODXL)、Rex-1、GCTM-2、Nanog或人端粒酶逆转录酶(hTERT)。在一些实施方案中，诱导型多能干细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2或HLA-A,B,C，并且其中所述诱导型多能干细胞在培养中经历至少40次倍增，同时在传代后维持正常核型。在一些实施方案中，通过添加钙流出诱导剂以激活卵母细胞，然后富集表达SSEA-4、TRA 1-60或TRA 1-8的细胞来生成单性生殖干细胞。在一些实施方案中，体细胞核转移来源的干细胞具有对SSEA-1呈阴性和对SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81或碱性磷酸酶呈阳性的表型。在一些实施方案中，间充质干细胞通过在SMAD-2/3途径的抑制剂或者靶向SMAD-2/3途径的抑制剂核酸的存在下培养从多能干细胞来源中分化。在一些实施方案中，抑制剂是SB-431542、反义寡核苷酸、发夹环短干扰RNA、化学合成的短干扰RNA分子或锤头核酶。在一些实施方案中，间充质干细胞抑制肝星状细胞激活、抑制肝纤维化、刺激肝脏再生或增强肝卵圆细胞或肝祖细胞活性。

实施例：通过Treg细胞治疗四氯化碳诱导的肝衰竭

将冷冻保存的脐带血袋(1单位袋)在含有0.5％HSA(Baxter Healthcare,Westlake Village,CA)的CliniMACS缓冲液(Miltenyi Biotec,Bergish Gladbach,Germany)中解冻并洗涤，以纯化单核细胞。随后，根据制造商的说明(Miltenyi Biotec,Bergish Gladbach,Germany)，使用磁激活的细胞分选(MACS)通过阳性选择进行细胞CD25+细胞富集。检查细胞的活力，然后将其通过与CD3/28共表达的

(ClinExVivo^TMCD3/CD28,Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)以1个细胞：3个珠的比率9共培养来刺激并以1×10⁶个细胞/ml重新悬浮于补充了10％人AB血清(Gemini Bio-Products,Sacramento,CA)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma,St.Louis,MO)、1％青霉素-链霉素(Gibco/Invitrogen,GrandIsland,NY)]和200IU/ml白介素(IL)-2(CHIRON Corporation,Emeryville,CA)的X-VIVO15培养基(Cambrex BioScience,Walkersville,MD)中。在37℃下于含5％CO2的空气气氛中，在组织培养瓶中进行CD25+细胞和珠的离体共培养。通过每48-72小时添加新鲜培养基和IL-2(维持200IU/ml)，将CB-来源的CD25+富集的T细胞维持在1×10⁶个细胞/ml。在某些培养物中进行华通氏胶质MSC的添加。所述MSC以50％汇合度预涂铺，之后添加如上所述的脐带血细胞。将培养的Treg细胞用CD25珠纯化，并按指定浓度静脉内注入小鼠。从正常对照的小鼠、用四氯化碳处理的小鼠、以及用四氯化碳处理并在CCL4施用后3天静脉内注射细胞的小鼠收集血清样品。Treg明显降低了ALT的血清水平。条形图表示三次独立实验的平均值±SEM，如图2所示。所示数据代表所进行的三次独立实验的代表，每组10只小鼠。

本文所述的一些方面还涉及以下编号的实施方案。

1.一种用于通过施用调节性T细胞群来治疗肝衰竭的方法，其中所述调节性T细胞群通过与同种异体间充质干细胞一起培养被激活以具有增强的肝脏再生因子的产生。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞被激活或已呈现为激活的从而通过增强的产生肝细胞生长因子的能力来诱导肝增殖，以及增强卵圆细胞增殖。

3.如实施方案1所述的方法，其中所述胎盘来源的间充质干细胞处于有丝分裂失活状态。

4.如实施方案3所述的方法，其中所述调节性T细胞在施用前用免疫调节剂处理。

5.如实施方案1所述的方法，其中所述胎盘间充质干细胞在施用前用免疫调节剂培养。

6.如实施方案5所述的方法，其中用所述免疫调节剂的所述培养的时间段足以诱导调节性T细胞增殖的能力。

7.如实施方案5所述的方法，其中用所述免疫调节剂的所述培养的时间段足以诱导从调节性T细胞产生白血病抑制因子的能力。

8.如实施方案4所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：IL-4、IL-10、IL-13、IL-20、TGF-β、CXCL12和抑制素。

9.如实施方案8所述的方法，其中所述免疫调节剂是TGF-β。

10.如实施方案4所述的方法，其中所述免疫调节剂是TGF-β、VEGF和PGE-2的组合。

11.如实施方案1所述的方法，其中将所述调节性T细胞与选自由以下组成的细胞组的细胞共培养：a)间充质干细胞；b)调节性T细胞；c)2型单核细胞；d)CD5阳性B细胞；e)2型NKT细胞；f)致耐受性树突细胞；g)γδT细胞；h)具有免疫调控性质的T细胞；i)CD34细胞；j)极小胚胎样干细胞和k)塞托利细胞。

12.如实施方案11所述的方法，其中所述间充质干细胞源自包括选自以下的组的组织：a)华通氏胶质；b)骨髓；c)外周血；d)经动员的外周血；e)子宫内膜；f)毛囊；g)乳牙；h)睾丸；i)脂肪组织；j)皮肤；k)羊水；l)脐带血；m)网膜；n)肌肉；o)羊膜；o)脑室周流；和p)胎盘组织。

13.如实施方案12所述的方法，其中所述间充质干细胞表达选自由以下组成的组的一种标记物或多种标记物：STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-I标记物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、凝血调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146和THY-1。

14.如实施方案13所述的方法，其中所述间充质干细胞不表达显著水平的HLA-DR、CD117和CD45。

15.如实施方案11所述的方法，其中所述间充质干细胞由多能干细胞生成。

16.如实施方案15所述的方法，其中所述多能干细胞选自由以下组成的组：a)胚胎干细胞；b)诱导型多能干细胞；c)单性生殖干细胞；和d)体细胞核转移来源的干细胞。

17.如实施方案16所述的方法，其中所述胚胎干细胞群表达选自由以下组成的组的基因：阶段-特异性胚胎抗原(SSEA)3、SSEA 4、Tra-1-60和Tra-1-81、Oct-3/4、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、足糖萼蛋白(PODXL)、Rex-1、GCTM-2、Nanog和人端粒酶逆转录酶(hTERT)。

18.如实施方案16所述的方法，其中所述诱导型多能干细胞具有选自由以下组成的组的标记物：CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A,B,C，并具有在培养中经历至少40次倍增同时在传代后维持正常核型的能力。

19.如实施方案16所述的方法，其中所述单性生殖干细胞其中通过添加钙流出诱导剂以激活卵母细胞、然后富集表达选自由SSEA-4、TRA 1-60或TRA 1-81组成的组的标记物的细胞来生成所述单性生殖来源的干细胞。

20.如实施方案16所述的方法，其中所述体细胞核转移来源的干细胞具有对SSEA-1呈阴性的表型和对SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶呈阳性的表型。

21.如实施方案15所述的方法，其中所述间充质干细胞通过在SMAD-2/3途径的抑制剂的存在下培养从多能干细胞来源分化而来。

22.如实施方案21所述的方法，其中所述间充质干细胞通过在靶向SMAD-2/3途径的抑制剂核酸的存在下培养从多能干细胞来源分化而来。

23.如实施方案22所述的方法，其中所述核酸抑制剂选自由以下组成的组：a)反义寡核苷酸；b)发夹环短干扰RNA；c)化学合成的短干扰RNA分子；和d)锤头核酶。

24.如实施方案22所述的方法，其中所述SMAD-2/3途径的抑制剂是小分子抑制剂。

25.如实施方案24所述的方法，其中所述小分子抑制剂是SB-431542。

26.如实施方案15所述的方法，其中选择过程用于富集从所述多能干细胞群中分化的间充质干细胞。

27.如实施方案26所述的方法，其中所述富集方法包括阳性选择表达与间充质干细胞相关的标记物的细胞。

28.如实施方案27所述的方法，其中所述间充质干细胞的标记物选自由以下组成的组：STRO-1、CD90、CD73、CD105、CD54、CD106、HLA-I标记物、波形蛋白、ASMA、胶原蛋白-1、纤连蛋白、LFA-3、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD61、CD18、CD29、凝血调节蛋白、端粒酶、CD10、CD13、STRO-2、VCAM-1、CD146和THY-1。

29.如实施方案11所述的方法，其中所述间充质干细胞被赋予增强的免疫调节活性，所述增强通过暴露于在所述间充质干细胞中诱导应激响应的试剂或多种试剂来诱导。

30.如实施方案29所述的方法，其中所述免疫调节活性是抑制肝星状细胞激活的能力。

31.如实施方案29所述的方法，其中所述免疫调节活性是抑制肝纤维化的能力。

32.如实施方案29所述的方法，其中所述免疫调节活性是刺激肝脏再生的能力。

33.如实施方案29所述的方法，其中所述免疫调节活性是增强卵圆细胞或肝祖细胞活性的能力。

34.如实施方案30所述的方法，其中所述星状细胞活性的抑制与肝纤维化减少相关。

35.如实施方案32所述的方法，其中所述肝纤维化被定义为功能性肝细胞减少。

36.如实施方案32所述的方法，其中所述肝脏再生被定义为刺激损伤后肝组织生长的起始期或增殖期。

37.如实施方案32所述的方法，其中所述肝脏再生被定义为肝细胞的增殖。

38.如实施方案33所述的方法，其中所述卵圆细胞或肝祖细胞被定义为在其中肝细胞响应于损伤或损害而停止增殖的条件下负责生成新的肝组织的细胞。

39.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞源自外周血单核细胞。

40.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞源自经动员的外周血单核细胞。

41.如实施方案40所述的方法，其中所述动员通过施用G-CSF来实现。

42.如实施方案40所述的方法，其中所述动员通过施用flt-3配体来实现。

43.如实施方案40所述的方法，其中所述动员通过施用血小板生成素来实现。

44.如实施方案40所述的方法，其中所述动员通过施用Mozobil来实现。

45.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞源自脐带血。

46.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞源自经血。

47.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞源自脂肪基质血管组分细胞。

48.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞具有抑制用激活增殖的信号刺激的天然T细胞增殖的能力。

49.如实施方案48所述的方法，其中激活增殖的所述信号选自由以下组成的组：a)抗-CD3和抗-CD28珠；b)伴刀豆球蛋白A；c)PHA；和d)用同种异体抗原呈递细胞刺激。

50.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞能够遏制树突细胞的成熟。

51.如实施方案50所述的方法，其中所述树突细胞成熟是选自由以下组成的组的分子的上调：CD80；CD40；CD86；和HLA II。

52.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞具有GITR配体的表达。

53.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达神经毡蛋白-1。

54.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CTLA-4。

55.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CD25。

56.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CD105。

57.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达膜结合的TGF-β。

58.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞产生IL-10。

59.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于血管活性肠肽被激活。

60.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于IL-10被激活。

61.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于TGF-β被激活。

62.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于间充质干细胞条件培养基被激活。

63.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于间充质干细胞来源的外来体被激活。

64.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于BDNF被激活。

65.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于人绒毛膜促性腺激素被激活。

66.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于VEGF被激活。

67.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于CD3和CD28抗体被激活。

68.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞是无反应性T细胞。

69.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于缺氧条件被激活。

70.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于促血管生成素被激活。

71.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达FoxP3。

72.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CD39。

73.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CD73。

74.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达CD127。

75.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞表达GARP。

76.如实施方案1所述的方法，其中所述调节性T细胞通过暴露于雷帕霉素被激活。

应该理解，描述、具体实例和数据，虽然指示示例性实施方案，但是是通过示例的方式给出的，并不旨在限制本公开内容的各个实施方案。根据本文的描述和所含的数据，本公开内容的各种改变和修改对技术人员而言将变得显而易见，并且因此被认为是本公开内容的各种实施方案的一部分。

Claims (26)

1.用于治疗肝脏病症的药物组合物，其包含激活的调节性T细胞，其中所述组合物经配制用于施用给患有肝脏病症的受试者。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述激活的调节性T细胞是同种异体调节性T细胞。

3.如权利要求1-2中任一项所述的药物组合物，其中所述激活的调节性T细胞产生肝细胞生长因子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述激活的调节性T细胞增强肝卵圆细胞产生。

5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物经配制用于静脉内施用。

6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述激活的调节性T细胞以约5×10⁵至2×10⁶个细胞的量存在。

7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述激活的调节性T细胞以约1×10⁶个细胞/毫升的量存在。

8.如权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物将受试者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白或胆红素水平降低至健康受试者的水平的5-20％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％或50-70％。

9.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述肝脏病症是肝炎、硬化、慢性肝脏疾病、急性肝脏疾病或肝衰竭。

10.如权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其还包含用于治疗肝脏疾病的化合物。

11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。

12.一种输注系统，其包括：

袋，其包含如权利要求1-11所述的包含激活的调节性T细胞的用于治疗肝脏病症的药物组合物，其中所述组合物经配制用于施用给患有肝脏病症的受试者；和

注射器或递送装置。

13.治疗肝衰竭的方法，其包括施用如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含通过与同种异体间充质干细胞一起培养被激活以具有增强的肝脏再生因子产生的调节性T细胞群。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述调节性T细胞群被激活或已呈现为激活的以通过增强的产生肝细胞生长因子的能力来诱导肝增殖，以及增强肝卵圆细胞增殖。

15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞处于有丝分裂失活状态。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞或所述间充质干细胞在施用前用免疫调节剂处理。

17.如权利要求16所述的方法，其中用所述免疫调节剂的所述培养诱导调节性T细胞增殖或诱导调节性T细胞产生白血病抑制因子。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述免疫调节剂是IL-4、IL-10、IL-13、IL-20、TGF-β、CXCL12、VEGF、PGE-2或抑制素，或以上的组合。

19.如权利要求13-18中任一项所述的方法，其中将所述调节性T细胞与2型单核细胞、CD5阳性B细胞、2型NKT细胞、致耐受性树突细胞、γδT细胞、具有免疫调节特性的T细胞、CD34细胞、极小胚胎样干细胞或塞托利细胞共培养。

20.如权利要求13-19中任一项所述的方法，其中治疗肝衰竭包括减少肝纤维化。

21.如权利要求13-20中任一项所述的方法，其中治疗肝衰竭包括刺激损失后肝组织生长的增殖。

22.如权利要求13-21中任一项所述的方法，其中所述调节性T细胞源自外周血单核细胞、经动员的外周血单核细胞、脐带血、经血、或脂肪基质血管组分细胞。

23.如权利要求13-22中任一项所述的方法，其中所述激活的调节性T细胞抑制用激活增殖的信号刺激的天然T细胞的增殖。

24.如权利要求13-23中任一项所述的方法，其中所述激活的调节性T细胞抑制树突细胞的成熟。

25.如权利要求13-24中任一项所述的方法，其中所述激活的调节性T细胞表达神经毡蛋白-1、CTLA-4、CD25、CD39、CD73、CD105、CD127、FoxP3、GARP、GITR配体、IL-10或膜结合的TGF-β。

26.如权利要求13-25中任一项所述的方法，其中所述激活的调节性T细胞通过暴露于血管活性肠肽、IL-10、TGF-β、间充质干细胞条件培养基、间充质干细胞来源的外来体、BDNF、人绒毛膜促性腺激素、VEGF、CD3或CD28抗体、缺氧条件、雷帕霉素或促血管生成素被激活。

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