CN113005083A

CN113005083A - 一种预防干细胞不良反应的细胞组合及其制备方法

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Publication number: CN113005083A
Application number: CN202110232016.5A
Authority: CN
Inventors: 祁岩超; 祁秋干
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明公开了一种预防干细胞不良反应的细胞组合及其制备方法，属于细胞治疗领域。其中，所述细胞组合包括免疫活性细胞和干细胞；所述免疫活性细胞为分离自健康人的CIK细胞，所述干细胞为间充质干细胞。本发明还公开了所述免疫活性细胞和干细胞组合制备方法及其在预防和治疗癌症以及抗衰老方面的应用。本发明的免疫活性细胞来自年轻的健康人的优良细胞，其抗癌抗病毒的免疫能力更好。利用本发明的免疫活性细胞和干细胞组合进行临床应用，既能发挥干细胞的生物功能，又能消除或抑制干细胞的成瘤性隐患，并且无不良反应，安全性高，具有重要的临床价值。

Description

一种预防干细胞不良反应的细胞组合及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体地，涉及一种预防干细胞不良反应的细胞组合及其制备方法。

背景技术

据国家癌症中心2018年2月报告：由于环境恶化等因素，导致全球每年新增癌症患者1400多万，我国每年新发病例429万，占全球新增癌症病例的30％，目前中国有1500多万的症患者，每年死亡病例达300万。癌症已成为危害人类生命和健康的第一杀手。肿瘤的治疗任重道远，美国曾把“向癌症宣战”作为基本国策之一，15年投入25亿美元，但结果不令人满意：肿瘤5年生存率提高4％，但发病率确升高7％。

在我国，肿瘤的三大传统疗法都有其瓶颈和弊端。小肝癌切除例数20年来增加了10倍多，但患者的5年生存率却没有明显提高。传统的放疗化疗或可带来反作用，因为放疗和化疗治癌也可能致癌；目前肺癌的切除率为70％-97％，可肺癌总的5年生存率仅为8％-11％。肺癌的外科治疗可能已达极限。

相比之下，近年来肿瘤的生物治疗却得到了突飞猛进的发展。肿瘤的生物治疗已成为三大治疗技术之后的第四大疗法，也是最有可能治愈癌症的方法。

在过去的20多年中，自体CIK细胞已普遍用于肿瘤的治疗(国家认定为第三类医疗技术)，然而，自体CIK细胞治疗，临床疗效未尽人意：有效率平均在30％以下。

干细胞在抗击疾病，抗衰回春和治疗亚健康中发挥着重要作用。目前已经在治疗某些难治性疾病和抗衰保健方面展现出了良好效果。

然而，干细胞临床应用存在重大的案例隐患：具有成瘤性，曾有患者干细胞卵巢抗衰后引起卵巢瘤，另有小儿脑病患者干细胞脑部注射治疗后出现脑瘤。随着干细胞技术的快速推广和普遍应用，对免疫功能低下的人群和老年人群，这种隐患将更加明显。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明提供的技术方案如下：

本发明一方面提供一种预防干细胞不良反应的细胞组合，包括免疫活性细胞和干细胞，所述免疫活性细胞为分离自健康人的CIK细胞，所述干细胞为间充质干细胞。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)，是一种新型的免疫活性细胞，健康人CIK细胞增殖速度快，抗癌能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。一旦机体需要，这些干细胞可按照发育途径，通过分裂而产生分化细胞，并进一步发育成组织或器官。间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。

本发明将分离自健康人的CIK细胞和间充质干细胞组合使用，一方面可以发挥干细胞的生物功能，另一方面能够消除或抑制干细胞的成瘤性隐患。

在本发明的一些实施方案中，所述CIK细胞分离自健康人外周血。

在本发明的一些具体实施方案中，所述健康人符合以下条件：

(1)年龄18-30岁；

(2)血象WBC在5000/mm³以上，淋巴细胞20％以上；

(3)无传染病：乙、丙肝炎病毒检测合格、艾滋病毒(HIV)、梅毒阴性；

(4)流式细胞仪测：CD45⁺细胞大于2000/mm³；

(5)外周血单核细胞对K562的自然杀伤活性大于80％。

在本发明的一些实施方案中，所述间充质干细胞分离自脐血、脐带、胎盘或骨髓。

在本发明的一些具体实施方案中，所述间充质干细胞分离自骨髓。

本发明第二方面提供一种免疫活性细胞和干细胞组合的制备方法，包括以下步骤：

S1，制备CIK细胞：

S11，获得健康人的单核细胞；

S12，对获得的单核细胞进行扩增培养10-14天，获得所述CIK细胞；

S2，制备间充质干细胞：

S21，采用密度梯度离心法从样本中分离包含间充质干细胞的细胞；

S22，采用贴壁培养筛选；

S23，在无菌条件下进行培养6-7天，制备得到所述间充质干细胞。

在本发明的一些实施方案中，步骤S11中，从健康人外周血中获得单核细胞。在本发明的一些实施方案中，所述健康人符合以下条件：

(1)年龄18-30岁；

(2)血象WBC在5000/mm³以上，淋巴细胞20％以上；

(4)流式细胞仪测：CD45⁺细胞大于2000/mm³；

(5)外周血单核细胞对K562的自然杀伤活性大于80％。

在本发明的一些实施方案中，步骤S21中所述样本为脐血、脐带、胎盘或骨髓。

本发明的第三方面提供本发明第一方面所述的免疫活性细胞和干细胞组合在制备用于预防和治疗癌症的药物的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述癌症为恶性肿瘤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述恶性肿痛包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、食管癌。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的免疫活性细胞和干细胞组合在制备用于防衰老的药物中的应用。

本发明的其他方面提供本发明第一方面所述的免疫活性细胞和干细胞组合在制备用于预防和治疗其他疾病的药物或临床用制剂中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述其他疾病选自免疫缺陷疾病中的一种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述其他疾病为系统性红斑狼疮。

在本发明的一些实施方案中，所述其他疾病包括但不限于慢性肝炎、糖尿病、帕金森综合症、脑血管意外后遗症、脑瘫。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有效效果：

本发明提供的免疫活性细胞和干细胞组合，不仅可以预防干细胞的不良反应，还具有抗癌、抗病和抗衰老的多重作用。

本发明的免疫活性细胞来自年轻的健康人的优良细胞，其抗癌抗病毒的免疫能力更好。

利用本发明的免疫活性细胞和干细胞组合进行临床应用，既能发挥干细胞的生物功能，又能消除或抑制干细胞的成瘤性隐患，并且无不良反应，安全性高。

附图说明

图1示出了肿瘤患者(上)和健康人(下)来源的单核细胞培养21天时CD3CD56(CIK)比较。

图2示出了人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)形态学观察。A：原代hBMSCs(×100)；B：第3代hBMSCs(×100)，

图3示出了hBMSCs传代培养生长曲线。

图4示出了流式细胞仪检测hBMSCs表面标记物结果。

图5示出了hBMSCs体外定向成脂分化诱导结果。A：成脂分化诱导5天油红O染色(×100)；B：成脂分化诱导21天油红O染色(×100)。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1健康人免疫细胞的制备

1.供者条件

①年龄18-30岁，男、女不限，血型不限。

②血象WBC在5000/mm³以上，淋巴细胞20％以上。

③无传染病：乙、丙肝炎病毒检测合格、艾滋病毒(HIV)、梅毒阴性。

④流式细胞仪(FCM)测：CD45⁺细胞大于2000/mm³；

⑤外周血单核细胞对K562的自然杀伤活性大于80％。

2.制备方法

①体检合格的供者1例，采血机抽取其外周血单核细胞50mL。无菌条件下在GMP实验室进一步扩增培养10-14天，制备出细胞数量扩增到百倍以上，抗癌活性增加1.5-2.0倍以上的CIK细胞。

②质量检查合格后使用(质量标准见表1)。

表1质量合格标准

3.实验结果

健康人CIK和肿瘤患者自体CIK相比，有明显的优势：

(1)打破了肿瘤的“免疫编辑”，实行“异地执法”取得了出人意料的效果。

(2)细胞增殖速度快、数量多(如表2所示)：同样培养时间内，健康人CIK细胞扩增是肿瘤患者CIK扩增的6倍。

(3)对肿瘤细胞杀伤活性强(如表2所示)：体外试验证明，健康人CIK对K562和Lovo肿瘤细胞的杀伤活性是肿瘤患者CIK的1.5-2.0倍。

表2不同细胞来源的CIK细胞扩增与对NK细胞的杀伤活性

(4)CD3⁺CD56⁺双阳性率高(如表3和图1所示)：健康人CIK的CD3⁺CD56⁺双阳性率高明显高于肿瘤患者CIK。

表3不同细胞来源的CIK细胞CD3⁺CD56⁺双阳性率

实施例2间充质干细胞(MSC)的制备和鉴定

1.原料：

脐血、脐带和胎盘或自体骨髓。产妇无传染病和遗传病，胎儿正常，无传染病和遗传病，原料新鲜无污染。

2.分离制备方法：

按目前常规的MSCs的分离方法：密度梯度离心法、贴壁分离筛选，GMP无菌条件下培养制备。

3.MSCs鉴定标准：

①此类细胞必须贴壁生长；

②必须表达CD73、CD90、CD105分子，不表达CD14、CD34、CD45；

③此类细胞必须能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。

4.结果

结果显示，本实施例应用密度梯度离心法从人骨髓血中分离出单个核细胞，通过多次更换培养液去除未贴壁细胞，经过体外培养、常规传代，获得均一性较高的成纤维样细胞群(如图2所示)，并且其生长曲线呈现标准生长曲线形状(如图3所示)。

通过对获得的细胞群进行表面标记物鉴定，结果显示，该细胞群高表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166，不表达CD34、CD45(如图4所示)。

通过对获得的细胞群进行体外成脂、成骨分化诱导实验，结果显示：该细胞群在体外能分化诱导成为脂肪细胞及成骨细胞(如图5所示)。

以上结果表明，本实施例制备的间充质干细胞，符合MSC干细胞国际标准。

实施例3健康人免疫细胞(CIK)和间充质干细胞(MSC)的临床应用

1.取实施例1制备健康人免疫细胞(CIK)10-15个亿(10-15×10⁸)和实施例2制备的检查合格的间充质干细胞(MSC)2-3单位(2000-3000万)。

2.以上细胞加入150mL生理盐水中。

3.用输血器，静脉滴注，每天一次，5次一个疗程，每年1-2个疗程(保健抗衰)。

临床应用结果：

1.袁先生，91岁，美国华侨，15年前患帕金森氏症和前列腺癌。进行上述方法治疗后，身体状况越来越好，并且前列腺癌标记物回复正常。他同时的8位帕金森氏症患者，5年内均不幸离去。

2.黄先生，80岁，印尼华侨，患帕金森氏病10年余。在英国、美国、日本及当地多家医院治疗效果不佳。近年走路困难，上下楼梯靠人抬轮椅，伴睡眠差，记忆力减退。经过二次上述治疗后，黄先生能够脱离轮椅自行上下楼。

3.关女士，48岁，患严重红斑狼疮，狼疮脑、狼疮肾炎10年，伴双下肢水肿，皮肤逐渐变黑，溃疡，有异味，坏疽及剧痛2年余，加重3个月。多方治疗效果不佳，且病情逐渐加重。使用上述方法治疗后，病情神奇好转，双下肢水肿全部消，11处坏疽、溃疡的疮面基本愈合，黑色痂皮脱落，呈现出了新鲜健康的皮肤组织。现在患者已能自由活动，进入正常生活。

4.蔡先生，18岁，患系统性红斑狼疮，狼疮脑、狼疮肾炎伴双侧胸腔小量积液，全身浮肿，咳嗽、咳痰、呕吐等5年。经多方治疗，效果不佳，而且贫血严重，靠每周输血一次维持生命。经过上述治疗，一疗程后，病情明显好转，咳嗽、咳痰、呕吐症状明显好转，浮肿消失，双侧胸腔积液消失。二个疗程后实验室检查，除蛋白尿生物治疗前后无明显改变外(如表4所示)，其它指标基本恢复正常，现已恢复了休学三年的正常学习。

表4免疫细胞和间充质干细胞治疗结果

指标	生物治疗前	生物治疗后	参考值
				血红蛋白	75.0g/L	115g/L	120-160g/L
血清尿素氮	24.5mmol/L	4.9mmol/L	1.8-7.1mmol/L
				血清IgA	1.03	1.10	0.69-3.82
血清IgG	5.160	6.200	8-16
				血清IgM	0.441	0.646	0.62-2.77
补体3	0.716	1.250	0.85-1.93
				补体4	0.249	0.276	0.12-0.36
尿蛋白	3.0g/L	3.0g/L	0g/L

5.杨女士，58岁，退休干部。患二型糖尿病10余年，药物控制，但体质渐弱，致使困倦乏力明显。步行上三楼，腰酸腿软，活动后，头晕目眩。晚间夜尿频繁(4-6次)，影响睡眠。如此恶性循环，使体质变弱，精神淡漠，用上述治疗后，各项症状明显好转：(1)夜尿次数减少(1-2次)，精神明显好转，原来睡眠差(4-5h)。现睡眠良好(7-9h)；(2).症状明显改善，原有的头痛头胀不适症状恢复正常；原来视物幻觉完全消失，视力明显好转；(3)体质增强，步行2.5h不知困，能一口气登上五楼不知累；(4)胰岛素用量明显减少：原来是早10u、晚8u维持血糖；治疗后全天4u即感觉良好，治疗后三个月内，停用胰岛素，血糖完全正常。

6.多例临床应用数据如表5。

表5临床治疗数据统计

说明：

1.以上是不完全统计。

2.保健抗衰，免疫性疾病有效率最好：90％左右。

3.本实施例中的肿瘤基本都是三大常规治疗后复发的晚期肿瘤，有效率60％左右。

4.脑血管后遗症，帕金森氏病有效率70％以上。

5.其余疾病有效率40-50％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种预防干细胞不良反应的细胞组合，包括免疫活性细胞和干细胞，其特征在于，所述免疫活性细胞为分离自健康人的CIK细胞，所述干细胞为间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞组合，其特征在于，所述CIK细胞分离自健康人外周血。

3.根据权利要求1所述的细胞组合，其特征在于，所述间充质干细胞分离自脐血、脐带、胎盘或骨髓。

4.根据权利要求3所述的细胞组合，其特征在于，所述间充质干细胞分离自骨髓。

5.权利要求1所述细胞组合的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备CIK细胞：

S11，获得健康人的单核细胞；

S2，制备间充质干细胞：

S22，采用贴壁培养筛选；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S11中，从健康人外周血中获得单核细胞。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述健康人符合以下条件：

(1)年龄18-30岁；

(2)血象WBC在5000/mm³以上，淋巴细胞20％以上；

(4)流式细胞仪测：CD45⁺细胞大于2000/mm³；

(5)外周血单核细胞对K562的自然杀伤活性大于80％。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S21中所述样本为脐血、脐带、胎盘或骨髓。

9.权利要求1所述的免疫活性细胞和干细胞组合在制备用于预防和治疗癌症的药物中的应用。

10.权利要求1所述的免疫活性细胞和干细胞组合在制备用于防衰老的药物中的应用。