DE212020000830U1

DE212020000830U1 - Verwendung einer Kombination von Genen angiogener und neurotropher Faktoren

Info

Publication number: DE212020000830U1
Application number: DE212020000830.2U
Authority: DE
Original assignee: "angiolife" LLC; Angiolife LLC
Current assignee: "angiolife" LLC; Angiolife LLC
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2023-10-30
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: WO2022025783A1

Abstract

Kombination aus einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coVEGF-coANG, welches eine Nukleotidsequenz, die für das VEGF-Protein kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die für das ANG-Protein kodiert, enthält, und einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coGDNF, welches eine Nukleotidsequenz, die für das GDNF-Protein kodiert, enthält; für die Induktion der Angiogenese, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder die Regeneration der Skelettmuskulatur.

Description

Technischer Bereich
Die Erfindung betrifft die Gentechnik, die Biotechnologie und die Medizin, und zwar die Stimulierung der Angiogenese, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und die Skelettmuskelregeneration. Sie kann zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer schlechten Durchblutung einhergehen, insbesondere in der Herz- und Gefäßchirurgie, sowie zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Skelettmuskelverletzungen unter Verwendung einer Kombination von Genen, die für proangiogene und neurotrophe Faktoren kodieren, eingesetzt werden.
Stand der Technik
Zu den derzeitigen Therapiemethoden bei Ischämie, insbesondere bei Ischämie der unteren Gliedmaßen, gehören die medikamentöse und die chirurgische Behandlung, jedoch kann keine der in der praktischen Medizin angewandten Methoden die zugrunde liegende Ursache vollständig beseitigen und führt nicht zu einer vollständigen Wiederherstellung der Mikrozirkulation des betroffenen Gewebes.
Es ist bekannt, dass Diabetes mellitus mit einer Schädigung verschiedener Gefäße einhergeht und damit zu einer schwereren Atherosklerose beiträgt, da diese Prozesse häufig bei denselben Patienten auftreten. In zahlreichen Studien wurde der Zustand der Nervenfasern und Kapillaren in den ischämischen Bereichen bei Patienten mit Typ-1-Diabetes beschrieben. In den letzten Jahren haben viele wissenschaftliche Arbeiten berichtet, dass neurotrophe Faktoren wie GDNF eine wichtige Rolle bei der Angiogenese spielen. In einer Studie [Cen et al., „Denervation in femoral artery-ligated hindlimbs diminishes ischemic recovery primarily via impaired arteriogenesis" 2016 Chinese Medical Journal, 5. Februar 2016, Volume 129, S. 313-319] wurde die Rolle der Denervierung bei der Angiogenese diskutiert. Die Denervierung der ligierten Oberschenkelarterie verschlechtert die postischämische Erholung der Durchblutung in der Hintergliedmaße aufgrund einer beeinträchtigten Perfusion. Die möglichen Mechanismen der beeinträchtigten Perfusion sind eine geringere Anzahl von Kollateralen, eine geringere Kapillardichte und wahrscheinlich ein engeres Lumen. Diese Studie veranschaulicht die entscheidende Rolle der peripheren Nerven bei der Arteriogenese anhand eines Modells der kombinierten Ischämie mit Denervierung in der Hintergliedmaße. In einer Studie [Diao et al., „Effects of denervation on angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling of ischemic limbs" Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 3. Marz 2015; 95 (8): S. 601-605], wurden die Tiere in drei Gruppen eingeteilt: Kontrolle, Ischämie der Hintergliedmaßen, Ischämie der Hintergliedmaßen + Denervierung. Am 28. Tag waren die Ischämie bedingten Schäden, die sich in den Werten des Endothelzellproliferationsindex, der Kapillardichte, der erhöhten NGF-Proteinexpression und der erhöhten VEGF-Proteinexpression in der Gruppe „Ischämie der Hintergliedmaße + Denervierung“ widerspiegelten, deutlich ausgeprägter als in der Gruppe „Ischämie der Hintergliedmaße“, was auf die Rolle der Nervenfasern bei der Ischämie hinweist.
Damit wurde gezeigt, dass die Nervenfasern eine wichtige Rolle bei der Wiederherstellung des postischämischen Blutflusses spielen, was die Notwendigkeit einer Regeneration der Nervenfasern unterstreicht, um eine effektivere Stimulation der Angiogenese zu gewährleisten.
Aus dem Stand der Technik ist ein Patent der Russischen Förderation für die Erfindung Nr. 2517117 „Methode zur Stimulierung der Nervenregeneration unter Verwendung einer nanostrukturierten Matrix und genetischer Konstrukte“ bekannt, wobei sich diese Erfindung jedoch nur auf die Regeneration eines Nervs bezieht und keinen Bezug zum Gefäßwachstum aufweist.
Andere Erfindungen wie „Verfahren zur Herstellung induzierter reprogrammierter derivativer neuronaler Stammzellen aus nicht-neuronalen Zellen unter Verwendung von HMGA2“ [ RU2646099 ] und „System und Verfahren zur Bestimmung der Lage und Identifizierung funktioneller Nerven, die Arterien versorgen“ [ RU2638438 ] sind ebenfalls bekannt. Diese Erfindungen stehen jedoch nicht in direktem Zusammenhang mit der Regeneration von Blutgefäßnervenfasern.
Bekannt sind ebenfalls „Zusammensetzungen und Verfahren zur Regulierung der Gefäßentwicklung“ [ RU2365382 ], bei denen die Verabreichung eines EGFL7-Antagonisten, eines Antagonisten des vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktors (VEGF), vorgesehen ist. Diese Methode wird jedoch eher zur Unterdrückung als zur Stimulierung der Angiogenese eingesetzt.
Daher besteht die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Methoden und Ansätze zur Stimulierung der Angiogenese, der Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder der Skelettmuskelregeneration.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine neue wirksame und Methode zur Stimulierung der Angiogenese, der Blutgefäßnervenfaserregeneration und/oder der Skelettmuskelregeneration zu entwickeln und das Arsenal der technischen Mittel auf diesem Gebiet zu erweitern.
Das technische Ergebnis besteht in der Entwicklung einer neuen wirksamen und sicheren Methode zur Stimulierung der Angiogenese, der Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder der Skelettmuskelregeneration, die sich durch eine ausgeprägtere Steigerung der Angiogenese und der Regenerationsprozesse auszeichnet und somit durch eine hohe Wirksamkeit bei der Behandlung von Therapiezuständen und/oder Krankheiten, die mit einer schlechten Durchblutung, neurodegenerativen Krankheiten und/oder Skelettmuskelverletzungen einhergehen, gekennzeichnet ist, wobei darüber hinaus die erfindungsgemäße Methode nicht mit der Entwicklung unerwünschter Immunreaktionen einhergeht.
Die vorliegende Erfindung löst das komplexe Problem der Stimulierung der Angiogenese durch angiogene Faktoren (VEGF+ANG) bei gleichzeitiger Regeneration von Blutgefäßnervenfasern durch neurotrophen Faktor (GDNF) und/oder Skelettmuskelregeneration, wodurch die Erfindung insbesondere ein effektives Wachstum stabiler funktioneller Blutgefäße ermöglicht. Die erfindungsgemäße Kombination auf der Basis von Plasmidvektoren wirkt somit umfassend auf die für die Regeneration von Organen und Geweben erforderlichen Schlüsselprozesse, indem sie das Wachstum stabiler und funktionell ausgereifter Gefäße induziert, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und die Regeneration der Skelettmuskulatur ermöglicht.
Dieses technische Ergebnis wird durch die Entwicklung und den Erhalt einer Kombination aus einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coVEGF-coANG, welches eine Nukleotidsequenz, die für das VEGF-Protein kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die für das ANG-Protein kodiert, enthält, und einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coGDNF, das eine Nukleotidsequenz, die für das GDNF-Protein kodiert, enthält, erreicht;
für die Induktion der Angiogenese, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder die Regeneration der Skelettmuskulatur.
Diese Plasmidkombination ermöglicht die gleichzeitige Expression mehrerer rekombinanter Gene und weist eine hohe funktionelle Aktivität auf.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das pBudK-coVEGF-coANG-Plasmid durch die Sequenz SEQ ID Nr:1 gekennzeichnet.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das pBudK-coGDNF-Plasmid durch die Sequenz SEQ ID Nr:2 gekennzeichnet.
Diese Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombination zur Vorbeugung und/oder Behandlung eines Zustands und/oder einer Erkrankung, die mit einer schlechten Durchblutung, einer neurodegenerativen Erkrankung und/oder einer Skelettmuskelverletzung bei einem Patienten verbunden ist. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist der Zustand und/oder die Erkrankung, die mit einer schlechten Durchblutung verbunden ist, eine ischämische Krankheit des Herzes oder eine Ischämie der unteren Gliedmaßen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist eine neurodegenerative Erkrankung eine amyotrophe Lateralsklerose, eine periphere Nervenverletzung oder eine Rückenmarksverletzung. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei einer Skelettmuskelverletzung um einen Muskel- oder Sehnenriss oder eine Knochenfraktur. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Kombination einem Patienten durch eine intramuskuläre Injektion verabreicht.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Induktion der Angiogenese, der Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder der Skelettmuskelregeneration bei einem Patienten, was mit der Verabreichung der erfindungsgemäßen Kombination an den Patienten einhergeht. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist der Patient durch das Vorhandensein eines Zustands und/oder einer Erkrankung gekennzeichnet, der/die mit einer schlechten Durchblutung, einer neurodegenerativen Erkrankung und/oder einer Skelettmuskelverletzung verbunden ist. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist der Zustand und/oder die Erkrankung, die mit einer schlechten Durchblutung verbunden ist, eine ischämische Krankheit des Herzes oder eine Ischämie der unteren Gliedmaßen. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei einer neurodegenerativen Erkrankung um amyotrophe Lateralsklerose, eine periphere Nervenverletzung oder eine Rückenmarksverletzung. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei einer Skelettmuskelverletzung um einen Muskel- oder Sehnenriss oder eine Knochenfraktur. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Kombination einem Patienten durch eine intramuskuläre Injektion verabreicht.
Die Kombination und das Verfahren der Erfindung sind vielversprechend für den Einsatz in der Medizin, nämlich für die Stimulierung der Angiogenese, insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen, die mit schlechter Durchblutung einhergehen, sowie für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und traumatischen Skelettmuskelverletzungen, und kann in der kardiovaskulären Chirurgie zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer schlechten Durchblutung einhergehen (insbesondere ischämische Krankheit des Herzes und Ischämie der unteren Gliedmaßen), und von Störungen neutrophischer Funktionen und zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen (wie amyotrophe Lateralsklerose, periphere Nervenverletzungen, Rückenmarksverletzungen) verwendet werden. Daher ist der Anspruch dieser Erfindung auch ein Verfahren zur Vorbeugung und/oder Behandlung eines Zustands und/oder einer Krankheit bei einem Subjekt, das mit schlechter Durchblutung (insbesondere koronarer Arterienerkrankung und Ischämie der unteren Gliedmaßen) und neutrophischen Störungen assoziiert ist, ein Verfahren zur Behandlung neurologischer Störungen (wie amyotrophe Lateralsklerose, periphere Nervenverletzung, Rückenmarksverletzung).
Neben der Behandlung der Ischämie der unteren Gliedmaßen kann die Erfindung insbesondere zur Behandlung der ischämischen Erkrankung des Herzes, der diabetischen Angiopathie, der diabetischen Neuropathie und in der Sportmedizin eingesetzt werden. Aufgrund der unerwartet festgestellten Eigenschaften des neuen erfindungsgemäßen Genkonstrukts kann dieses Genkonstrukt in der Sportmedizin und der Unfallchirurgie bei Vorfällen wie Muskel- oder Sehnenrissen und schweren Knochenbrüchen eingesetzt werden. Bei den oben genannten Zuständen ist eine gute Blutversorgung für die vollständige Wiederherstellung des Gewebes von entscheidender Bedeutung, die der Körper aufgrund geringer kompensatorischer Reserven (aufgrund von Alter, Begleiterkrankungen usw.) manchmal nicht aus eigener Kraft gewährleisten kann. Die Erfindung kann sowohl als eigenständige therapeutische Option als auch in Kombination mit chirurgischen Verfahren eingesetzt werden, um die Wirkung des operativen Eingriffs zu verstärken. Die erhaltenen experimentellen Daten zeigten eine ausgeprägte Wirkung auf die Stimulierung der Skelettmuskelregeneration, die bei verschiedenen traumatischen Muskelverletzungen (in der Sportmedizin oder Unfallchirurgie usw.) hilfreich sein kann. Die Wirkung der verstärkenden Angiogenese könnte also ein breites Anwendungsspektrum finden, insbesondere in der Sportmedizin und in der Unfallchirurgie.
Aufgrund des Vorhandenseins des glialen neurotrophen Faktors (GDNF) in der erfindungsgemäßen Kombination erscheint es vielversprechend, diese Genkombination für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen einzusetzen. Die Aussichten für den klinischen Einsatz einer innovativen Genkombination gemäß der Erfindung decken somit ein breites Spektrum der Biotechnologie und eine Vielzahl von Erkrankungen ab, bei denen ihr Einsatz möglich ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Kurzbeschreibung der Figuren

1. pBudK-coGDNF Plasmidvektor-Karte (4183 b.p.)
2. pBudK-coVEGF-coANG Plasmidvektor-Karte (5762 b.p.)
3. Vergleich der Ergebnisse der Bestimmung des Bindegewebsproteins Vimentin nach Ischämiemodellierung in einer Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmidkombination und in einer Kontrollprobe.

Definitionen und Begriffe
Verschiedene Begriffe, die sich auf den Gegenstand der Erfindung beziehen, wurden oben, in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet. Sofern nicht anders angegeben, haben alle in dieser Anmeldung verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie dem Fachmann auf vorliegendem Gebiet geläufig sind. Verweise auf in der Beschreibung der Erfindung verwendeten Methoden beziehen sich auf bekannte Methoden, einschließlich Modifikationen dieser Methoden und deren Ersatz durch gleichwertige Methoden, die dem Fachmann bekannt sind.
Wie in der Beschreibung dieser Erfindung verwendet, sind die Begriffe „umfasst“ und „einschließlich“ im Sinne von „umfasst, aber nicht beschränkt auf' zu verstehen. Diese Begriffe sind nicht als „besteht nur aus“ zu interpretieren.
In der Beschreibung dieser Erfindung bezieht sich der Begriff „Gewebe“ auf ein System von Zellen und nicht-zellulären Strukturen, die eine gemeinsame Struktur, in einigen Fällen einen gemeinsamen Ursprung, haben und auf die Ausführung bestimmter Funktionen spezialisiert sind.
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Induktion der Angiogenese“ die Stimulierung des Wachstums neuer Blutgefäße.
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Regeneration von Blutgefäßnervenfasern“ auf die Regeneration von Nervengewebe durch Reparatur von beschädigtem Gewebe (Wiederherstellung seiner Struktur und Funktion) und/oder Stimulierung des Wachstums von Nervenfasern.
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Skelettmuskelregeneration“ auf die Regeneration von Muskelgewebe durch Reparatur beschädigter Muskelfasern (Wiederherstellung ihrer Struktur und Funktion) und/oder Stimulierung des Wachstums neuer Muskelfasern.
Bei den als Vektoren verwendeten Plasmiden handelt es sich um zirkuläre Doppel-DNA-Moleküle, die von einem Bakterien- oder Hefechromosom zu unterscheiden sind und sich unabhängig von den eigenen Chromosomen des Mikroorganismus replizieren können. Speziell für das molekulare Klonen hergestellte Plasmide sind in der Regel nicht groß (wenige Kilobasen groß) und enthalten drei obligatorische Komponenten: den Ori für die Replikation (Kopieren in E. coli oder Hefe), einen oder mehrere selektive Marker (z. B. ein Gen, das die Antibiotikaresistenz bestimmt) und eine oder mehrere Restriktionsstellen, die für die Spaltung der Fremd-DNA verwendet werden können. Wichtige Schritte sind mit der Klonierung im Plasmid der Fremd-DNA mit einer EcoRI-Restriktionsstelle verbunden. Die Identifizierung von Kolonien, die das gewünschte rekombinante Plasmid enthalten, gefolgt von Massenwachstum und Isolierung reiner Plasmid-DNA, ermöglicht die Anreicherung großer Mengen der klonierten Insertion.
Methode der therapeutischen Anwendung
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst auch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Kombination an einen Patienten, der die entsprechende Behandlung benötigt. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge“ bezeichnet eine solche Menge der erfindungsgemäßen Kombination, die bei Verabreichung als Monotherapie oder als Teil einer Kombinationstherapie die Induktion der Angiogenese, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder die Skelettmuskelregeneration bewirkt. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Kombination in der Kombinationstherapie mit anderen therapeutischen Wirkstoffen bezieht sich der Begriff „therapeutisch wirksame Menge“ auf eine Kombination von Wirkstoffmengen, deren Verabreichung nach ihrer aufeinanderfolgenden oder gleichzeitigen Verabreichung zu einer präventiven oder therapeutischen Wirkung führt. Die genaue benötigte Menge kann je nach Säugetierart, Körpergewicht und Allgemeinzustand des Patienten, Schweregrad der Krankheit/des Zustands, Kombinationsbehandlung mit anderen Arzneimitteln usw. von Subjekt zu Subjekt unterschiedlich sein.
Die erfindungsgemäße Kombination kann in jeder beliebigen Menge und auf jedem beliebigen Verabreichungsweg, der für die Behandlung und/oder Vorbeugung wirksam ist, in den Körper des Patienten eingeführt werden, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektionen. Die Menge der erfindungsgemäßen Kombination, die für die Behandlung oder Vorbeugung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands wirksam ist, hängt insbesondere von den allgemein bekannten Faktoren ab, die die wirksame Arzneimitteldosierung beeinflussen. Die genaue Dosierung, die vom behandelnden Arzt festgelegt wird, hängt von bekannten Faktoren ab, einschließlich der Verabreichungsmethode, des Alters, des Körpergewichts, des Geschlechts und des allgemeinen Gesundheitszustands des Patienten sowie der Art, des Schweregrads und des klinischen Verlaufs der Krankheit und der Anwendung (oder Nichtanwendung) einer Begleittherapie.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Kombination und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Lösungsmittel und/oder Füllstoffe enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch einen oder mehrere therapeutische Wirkstoffe enthalten. Andererseits kann die erfindungsgemäße Kombination einem Subjekt, das eine entsprechende Therapie benötigt, in Kombination mit einem oder mehreren anderen therapeutischen Regimen verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten eine erfindungsgemäße Kombination zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die beliebige Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Dispersionen oder Suspensionen, Tenside, isotonische Mittel, Verdickungsmittel und Emulgatoren, Konservierungsmittel, Bindemittel, Gleitmittel usw. umfassen können, die für eine bestimmte Darreichungsform geeignet sind. Außer in den Fällen, in denen das Medium herkömmlicher Träger mit der erfindungsgemäßen Plasmidkombination unverträglich ist, z. B. wenn nachteilige biologische Wirkungen und andere unerwünschte Wechselwirkungen mit einem oder mehreren anderen Bestandteilen einer pharmazeutischen Zusammensetzung auftreten, fällt die Verwendung solcher Zusammensetzungen in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei den Zusammensetzungen um eine Lösung, die eine Kombination der Erfindung (Plasmidverhältnis von 1:1) und eine sterile isotonische Kochsalzlösung umfasst.
Ausführungsform der Erfindung
1. pBudK-Plasmid-Vektoren

Bei dieser Erfindung wurde ein pBudK-Vektor verwendet, der für die gleichzeitige Klonierung von zwei Genen bestimmt ist. Der Vektor enthält einen humanen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor (immediate-early promoter) und eine humane Elongationsfaktor (EF) 1α-Untereinheit für die unabhängige Expression von zwei Genen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Merkmale der Strukturelemente dieses Vektors (siehe Tabelle 1). Tabelle 1. Strukturelle Elemente des pBud-Plasmidvektors.

Plasmid 1: pBudK-coVEGF-coANG (5762 b.p.)	Plasmid 2: pBudK-coGDNF (4183 b.p.)
SV40-Terminator	KanR
KanR	EF-1 α-Promotor
EF-1 α-Promotor	coGDNF
coVEGF	bGH_PA_Terminator
bGH_PA_Terminator	pBR322_Origin
pBR322_Origin	KanR
CMV-Promotor
coANG

2. Codonoptimierung der Nukleotidsequenzen der Gene VEGF, ANG und GDNF
Die Codon-Optimierung erhöht die Effizienz der mRNA-Translation in Polypeptide und steigert damit die Effizienz von Expressionsvektoren, die insbesondere in der Gentherapie eingesetzt werden. Je häufiger ein bestimmtes Codon zur Kodierung einer Aminosäure im Körper verwendet wird, desto schneller wird es von den Ribosomen translatiert, da die intrazelluläre Konzentration der tRNA, die ein solches Codon erkennt, hoch ist. Die häufigsten synonymen Codons der Empfängergene werden als optimale Codons verwendet. Es wird angenommen, dass diese Änderungen die Effizienz der therapeutischen Genexpression erhöhen. Die Codon-Optimierung erfolgt durch site-spezifische Mutagenese oder chemische de novo Synthese einer Nukleotidsequenz. Wildtyp-Nukleotidsequenzen des kodierenden Teils der VEGF-, ANG- und GRF-Gene enthalten ein Tandem seltener Codons, die die Translation stoppen oder ihre Effizienz verringern können. Die Codon-Optimierung der Wildtyp-VEGF-, ANG- und GDNF-Gene führte zu einer Verbesserung des Codon-Adaptations-Index CAI (Englisch: „Codon Adaptation Index“) auf 0,95. Um eine bessere mRNA-Stabilität zu gewährleisten, wurde die GC-Zusammensetzung verbessert und lange Abschnitte mit einem hohen Gehalt an GC-Paaren wurden entfernt. Darüber hinaus wurden bei der Optimierung auch potenzielle cis-wirksame Stellen entfernt. Als Ergebnis der Codon-Optimierung haben sich die Aminosäuresequenzabfolgen der Gene VEGF, ANG und GDNF nicht verändert.
3. Konstruktion der erfindungsgemäßen Plasmide pBudK-coVEGF-coANG und pBudK-coGDNF
Die Modifizierung des Plasmidvektors pBudCE4.1 für die duale Genexpression wurde wie folgt durchgeführt:

1. Die rekombinanten Sequenzen Gateway attBI und attBII wurden hinzugefügt;
2. Die Sequenz des Zeocin-Resistenzgens und seines Promotors wurden durch die Sequenz des Kanamycin-Resistenzgens ersetzt. Zeocin- und Kanamycin-Resistenzgene werden sowohl für die Selektion des Plasmidvektors in Bakterienzellen als auch für die Selektion von eukaryotischen Zellen, die mit dem Plasmidvektor transfiziert wurden, verwendet. Das Zeocin-Resistenzgen wurde ersetzt, weil seine Expression in eukaryontischen Zellen (einschließlich menschlicher Zellen) zur Produktion eines fremden Proteins (eines Genexpressionsprodukts) führt, das die Entwicklung einer Antibiotikaresistenz verursachen und ein potenzielles Allergen sein kann. Dadurch wurde das Risiko unerwünschter Immunreaktionen gesenkt.
3. Die Sequenzmarken V5-His (3127-3195 b.p.) und myc-His (719-782 b.p.) wurden entfernt. Das Produkt der Zielmodifikation wurde pBudK genannt.

Die Korrektheit des Zusammenbaus der genetischen Konstrukte pBudK-coVEGF-coANG und pBudK-coGDNF wurde durch die Restriktionsanalyse und die Sanger-Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 1. Bewertung der Angiogenese-Induktion nach Verabreichung von Plasmiden mit angiogenen und neurotrophen Faktoren
Die Experimente wurden an vietnamesischen Hängebauchschweinen durchgeführt. Zunächst wurde ein chirurgischer Eingriff durchgeführt, um eine Ischämie der Hintergliedmaßen zu simulieren, gefolgt von der Verabreichung einer Kombination von Plasmiden pBudK-coVEGF-coANG + pBudK-coGDNF gemäß der Erfindung. Unmittelbar nach der Modellierung der Ischämie erhielten die Tiere an vier Stellen eine Injektion der genetischen Konstrukte in die folgenden Muskeln (zwei Stellen in jedem Muskel) der ischämischen Gliedmaßen: 1) den Gastrocnemius-Muskel, 2 und 5 cm von der Achillessehne entfernt, 2) den vorderen Schienbeinmuskel, 3 und 5 cm vom seitlichen Knöchel entfernt. Die Wirksamkeit der Stimulation der Angiogenese und der Verbesserung des Blutflusses in der Extremität wurde mit zwei Methoden bewertet: Immunhistochemie (nachfolgend „ICH“) mit Antikörpern gegen Marker von Endothelzellen (CD31) und mittels Messung des Blutflusses in der operierten Extremität mit einem Laser-Doppler-Fluometrie-Geräts. Die ICH-Untersuchung ergab eine mehr als 2,5-fache Zunahme der Anzahl der Blutgefäße im Vergleich zur Kontrollgruppe (der Kontrollgruppe wurde NaCl verabreicht). Die Laser-Doppler-Fluometrie ermöglicht es, die Durchblutung in einer ischämischen Extremität nach der Verabreichung genetischer Konstrukte zu quantifizieren. Nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen genetischen Konstrukte wurde eine 45%ige Zunahme der Durchblutung in der ischämischen Extremität nachgewiesen.
Beispiel 2. Bestimmung eines Bindegewebsproteins durch Western Blotting in einem Ischämiemodell nach Verabreichung von Plasmiden mit angiogenen und neurotrophen Faktoren
Western Blotting ist ein Verfahren, bei dem eine Mischung von Proteinen durch Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf eine geeignete Membran (z. B. PVDF) elektrisch übertragen wird. Nachdem die Proteine auf die PVDF-Membran übertragen wurden, können sie zur Visualisierung gefärbt und durch N-terminale Sequenzierung, Massenspektrometrie oder immunologische Tests direkt identifiziert werden. Bei der Immundetektion wird ein Protein durch seine Reaktion mit einem spezifischen Antikörper identifiziert. Aufgrund der räumlichen Auflösung liefert diese Methode Informationen über das Molekulargewicht einzelner Proteine und ermöglicht die Unterscheidung von Isoformen, Zwischenstufen und anderen posttranslationalmodifizierte Proteinformen.
Unmittelbar nachdem die Tiere aus dem Versuch herausgenommen worden waren, wurden die Muskeln des Gastrocnemius und des vorderen Schienbeins im ischämischen Bereich sofort entnommen und einem Western Blotting unterzogen (n = 4 für jede Gruppe). Das Gesamtprotein wurde aus dem Gastrocnemius und dem vorderen Schienbeinmuskel in RIPA-Puffer (Sigma) nach dem Standardprotokoll extrahiert. Nach der Messung der Proteinkonzentration in jeder Probe wurden die Proteinlysate einer SDS-PAGE unterzogen und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 5%igem Magermilchpulver in PBS/0,5% Tween 20 geblockt. Anschließend wurden die Membranen in PBS/0,5 % Tween 20 gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit dem Antikörper inkubiert. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit Meerrettichperoxidasekonjugierten Antikörpern (HRP) nachgewiesen und mit einem Satz von Substraten für ECL Western Blotting (HRP) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) entwickelt. Die Dichte der Banden wurde mit ImageJ Version 1.46 nach Abzug des Hintergrunds quantifiziert und relativ zum b-Actin-Niveau normalisiert.
Erhaltene Ergebnisse:
Vimentin (Englisch „Vimentin“) ist ein Protein der Intermediärfilamente von Bindegeweben und anderen Geweben mesodermaler Herkunft. In diesem Fall kann eine Abnahme von Vimentin in den Gruppen, in denen die erfindungsgemäße Plasmidkombination verwendet wurde, als eine Abnahme der Menge an Muskelbindegewebe (d.h. Fibrose), d.h. als eine Abnahme des Ischämiegrades im Vergleich zur Kontrolle, angesehen werden (Tabelle 2, 3). Tabelle 2. Ergebnisse der Bestimmung eines Bindegewebsproteins - Vimentin

Kontrolle (NaCl wurde verabreicht) 5,163238 3,070333

pBudK-coVEGF-coANG + pBudK-coGDNF 2,447039 2,950631
Darüber hinaus ist die Erfindung vielversprechend, um die Wirksamkeit der Behandlung von Bindegewebsverletzungen und/oder Erkrankungen des menschlichen Bewegungsapparates zu verbessern. Dies gilt insbesondere für Skelettmuskelverletzungen. Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zeigten, dass die Verabreichung dieses genetischen Konstrukts zu einer 81-fachen Erhöhung der Anzahl Zentralkernmuskelfasern im Vergleich zur Kontrollgruppe führte (der Kontrollgruppe wurde NaCl injiziert). Die Zunahme der Anzahl der Zentralkernmuskelfasern erfolgt in der Phase der aktiven Skelettmuskelregeneration, was ein nicht offensichtlicher Beweis für die regenerative Wirkung dieses Genkonstrukts ist.
Die Kombination zweier Zweikassetenplasmide gemäß der Erfindung ermöglicht eine gleichzeitige Genexpression, die die Wirksamkeit der Gentherapie aufgrund der Synergie zwischen den Genen durch die gleichzeitige therapeutische Genexpression gemäß der Erfindung erhöht. Infolgedessen kann neben der höheren biologischen Sicherheit des Plasmidvektors eine ausgeprägtere Zunahme der Angiogenese und eine verstärkte Regeneration erwartet werden.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die offengelegten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, dass die im Detail beschriebenen spezifischen Experimente nur der Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung in irgendeiner Weise ausgelegt werden sollten. Es sollte klar sein, dass verschiedene Modifikationen möglich sind, ohne von dem Kern der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

RU 2646099 [0006]
RU 2638438 [0006]
RU 2365382 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Cen et al., „Denervation in femoral artery-ligated hindlimbs diminishes ischemic recovery primarily via impaired arteriogenesis“ 2016 Chinese Medical Journal, 5. Februar 2016, Volume 129, S. 313-319 [0003]
Diao et al., „Effects of denervation on angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling of ischemic limbs“ Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 3. Marz 2015; 95 (8): S. 601-605 [0003]

Claims

Kombination aus einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coVEGF-coANG, welches eine Nukleotidsequenz, die für das VEGF-Protein kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die für das ANG-Protein kodiert, enthält, und einem rekombinanten Expressionsplasmid pBudK-coGDNF, welches eine Nukleotidsequenz, die für das GDNF-Protein kodiert, enthält; für die Induktion der Angiogenese, die Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder die Regeneration der Skelettmuskulatur.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Sequenz des rekombinanten Expressionsplasmids pBudK-coVEGF-coANG eine Sequenz der SEQ ID Nr:1 ist.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Sequenz des rekombinanten Expressionsplasmids pBud-coGDNF eine Sequenz der SEQ ID Nr:2 ist.
Verwendung der Kombination nach Anspruch 1 zur Vorbeugung und/oder Behandlung eines Zustands und/oder einer Erkrankung, die mit einer unzureichenden Durchblutung, einer neurodegenerativen Erkrankung und/oder einer Skelettmuskelverletzung bei einem Subjekt verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Zustand und/oder die Erkrankung, die mit einer unzureichenden Durchblutung verbunden ist, eine ischämische Krankheit des Herzes oder eine Ischämie der unteren Gliedmaßen ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die neurodegenerative Erkrankung amyotrophe Lateralsklerose, eine periphere Nervenverletzung oder eine Rückenmarksverletzung ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Skelettmuskelverletzung ein Muskel- oder Sehnenriss oder einen Knochenbruch ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Kombination einem Patienten intramuskulär verabreicht wird.
Kombination nach Anspruch 1 zur Induktion der Angiogenese, der Regeneration von Blutgefäßnervenfasern und/oder der Skelettmuskelregeneration bei einem Subjekt.
Kombination zur Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Subjekt einen Zustand und/oder eine Erkrankung aufweist, der/die mit einer unzureichenden Durchblutung, einer neurodegenerativen Erkrankung und/oder einer Skelettmuskelverletzung verbunden ist.
Kombination zur Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Zustand und/oder die Erkrankung, die mit einer unzureichenden Durchblutung verbunden ist, eine ischämische Krankheit des Herzes oder eine Ischämie der unteren Gliedmaßen ist.
Kombination zur Verwendung nach Anspruch 10, wobei es sich bei der neurodegenerativen Erkrankung um amyotrophe Lateralsklerose, eine periphere Nervenverletzung oder eine Rückenmarksverletzung handelt.
Kombination zur Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Skelettmuskelverletzung ein Muskel- oder Sehnenriss oder eine Knochenfraktur ist.
Kombination zur Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Kombination dem Subjekt intramuskulär verabreicht wird.