KR101552048B1 - 약 유도 시스템을 이용해 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약 유도 신경 개발 시스템(A drug inducible system)을 이용하여 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법은 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 내재된 배아 줄기세포로부터 키메라 동물을 제작하는 단계; 상기 키메라 동물에서 혈액세포를 분리하는 단계; 및 상기 혈액세포를 독시사이클린(Doxycycline)이 함유된 배지에서 배양하여 도파민 신경세포를 유도하는 단계;를 포함한다.

Description

약 유도 시스템을 이용해 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법 {Method of direct lineage reprogramming for generating dopaminergic neurons from monocyte using a drug inducible system}

본 발명은 혈액세포를 신경세포로 직접교차분화 시키는 방법에 관한 것이다.

2011년 마우스와 인간 섬유아세포에 다양한 바이러스 전사인자를 도입하여 신경세포로 직접교차분화 할 수 있다는 논문이 나왔다 (비특허문헌1). 렌티바이러스성 전사인자 도입을 이용한 도파민 신경세포 직접교차분화는 파킨슨 병 세포치료를 위한 기술로써의 중요한 잠재성을 내포하고 있다. 그러나 현재 직접교차분화를 통한 도파민 신경세포는 중뇌의 도파민 신경세포와 그 성질이 완전히 일치하지 않는다. 이와 같은 문제점이 생기는 이유는 리프로그래밍 과정에서 섬유아세포에 직접적으로 바이러스 전사인자를 도입하는데 최적화된 화학량적 비율 및 정량이 구체적으로 확립되지 않았기 때문이다. 또한 바이러스가 감염(infection)이 되는 세포 내 위치 및 감염 빈도 역시 혈액세포를 신경세포를 유도하는데 변수로 작용하기 때문이다. 결과적으로 상기 문제점들 때문에 혈액세포의 도파민 신경세포 리프로그래밍은 아직 불완전하며, 그 효율성이 매우 낮은 실정이다.

또한 직접교차분화와 관련된 연구가 현재 활발히 진행됨에도 불구하고, 아직 국내에서는 리프로그래밍 방법에 대해 새로운 견해를 제시하거나, 리프로그래밍 기전을 확인한 논문이 거의 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 기존의 직접교차분화(direct infection) 보다 더 효율적인 리프로그래밍 방법에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

1. Son, Esther Y. et al. Conversion of Mouse and Human Fibroblasts into Functional Spinal Motor Neurons. Cell Stem Cell 9, 205-218 (2011.09.02).

본 발명의 목적은 전사인자가 내재된 혈액세포에 독시사이클린(Doxycycline)을 처리하여 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전사인자가 내재된 혈액세포 및 독시사이클린을 포함하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전사인자를 내재한 혈액세포에 독시사이클린을 처리하는 약 유도 신경 개발 시스템(drug inducible system)을 개발하여 기존의 직접교차분화(direct infection) 보다 더 효율적인 리프로그래밍 방법을 제시하고자 한다. 이러한 방법은 직접적인 바이러스성 전사인자의 도입이 없이 세포 리프로그래밍을 효과적으로 유도 할 수 있으며, 혈액세포를 효과적으로 도파민 신경세포로 직접교차분화시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 최근 대두되기 시작한 세포 직접교차분화의 효율을 증가시키고, 균질한(homogeneous), 즉 생체 도파민 신경세포와 거의 유사한 도파민 신경세포로 분화할 수 있는 기술이다. 본 발명의 방법에 따른 약 유도 신경 개발 시스템(A drug inducible system)으로 분화한 도파민 신경세포는 중뇌 도파민 신경세포와 그 특성이 분자적, 기능적 측면에서 매우 유사함을 보여준다. 본 발명에 따른 도파민 신경세포 분화는 혈액으로부터 손쉽게 획득하여 신경세포 생성 효율을 증가시키는 것은 물론 파킨슨 병 모델링, 약 스크리닝 더 나아가 세포대체치료에 효과적으로 적용할 수 있는 가능성이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 내재된 배아 줄기세포로부터 키메라 동물을 제작하는 단계; 상기 키메라 동물에서 혈액세포를 분리하는 단계; 및 상기 혈액세포를 독시사이클린(Doxycycline)이 함유된 배지에서 배양하여 도파민 신경세포를 유도하는 단계; 를 포함하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, ‘전사인자’는 전사를 조절하는 인자로써, DNA에 결합하거나, 다른 단백질과 상호작용을 통하여 전사를 조절하며, 본 발명의 구체예에서 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화하기 위해 필수적인 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a를 말한다.

본 발명의 용어 ‘배아줄기세포’란 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)을 가지는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 배아줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 배아줄기세포의 생산방법과 특성이 확립된 인간의 배아줄기세포 또는 마우스의 배아줄기세포를 사용함이 바람직하다. 상기 배아줄기세포를 배양한 배양물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 배아줄기세포로부터 분화된 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 및 내배엽성 세포를 모두 포함하는 배상체(embryoid body)일 수 있으며, 바람직하게는 내배엽 세포 및 중배엽 세포를 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 내배엽 세포 및 심장의 중배엽(CM, Cardiac mesoderm)을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, ‘키메라 동물’은 두개 이상의 유전적으로 다른 개체에서 유래하는 세포, 핵, 염색체 혹은 유전자를 함유한 개체를 말하며, 본 발명에서 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 내재된 배아 줄기세포로부터 제작한 동물로, Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a 유전자를 함유하고 있는 개체를 말하며, 바람직하게는 인간 및 마우스를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, '신경세포'는 신경 체계의 세포이고, 용어 '뉴런' 또는 '뉴런 세포'로 서로 혼용할 수 있다.

본 발명의 용어, '도파민 신경세포'는 티로신 수산화효소(tyrosine hydrozylase, TH)를 발현하는 신경세포로서, 중간 뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다. 특히 실제로 체내에서 도파민성 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야만 한다.

본 발명의 용어, '분화'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 행태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 발생 과정 중에서 세포의 특이화를 이끄는 마지막 단계로서, 세포 분화는 각 세포들 내의 유전자 활성이 서로 달라져 유전자들이 서로 다른 방법으로 발현되는 현상이며, 그 결과 각 세포들은 구조적, 기능적으로 완전히 구별되는 특성을 가지게 된다.

본 발명의 용어, ‘직접교차분화(direct lineage reprogramming, direct conversion, trans-differentiation)’는 혈액세포에서 직접 조직특이 세포를 제조하는 방법을 말하며, 본 발명에서 혈액세포로부터 직접적인 바이러스의 도입이 없이 약만을 이용하여 도파민 신경세포를 제조하는 과정을 말한다.

본 발명의 용어, ‘독시사이클린 (Doxycycline)’은 본 발명의 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키기 위해 중요한 역할을 하는 약이다. 본 명세서에서 상기 독시사이클린은 “약” 또는 “Dox”로 지칭된다.

본 발명의 용어, ‘배지(culture media)’는 in vitro 에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, aMEM (a Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 배지는 우태아혈청(FCS), L-글루타민, 스트렙토마이신, 페니실린, 비 필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 2-머캅토에탄올을 포함하는 RPMl 1640 배지를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 혈액세포는 말초혈액으로부터 분리한 것일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 독시사이클린의 함유량은 0.1 내지 10 ug/ml 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 2 ug/ml으로 포함될 수 있다.

본 발명의 구체예에서 상기 독시사이클린이 함유된 배지에서의 체세포 배양은 1 내지 30일 동안 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 체세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법은 직접적인 바이러스성 전사인자를 도입함이 없이, 독시사이클린(약)만을 이용하여 짧은 시간 안에 체세포를 도파민 신경세포로 유도할 수 있다. 본 발명의 구체예에서 체세포가 독시사이클린이 처리된 배지에 7일 동안 노출된 경우, 거의 모든 체세포가 도파민 신경세포로 분화되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 다른 구체예에서, 독시사이클린을 처리하고, 1 내지 3일 후에 약 처리를 중단하더라도 도파민 신경세포의 수가 증가하는 것을 알 수 있었으며, 신경세포가 죽지 않고 지속적으로 생존해 있는 점을 확인하였다. 즉, 본 발명은 기존의 직접교차분화와 비교하여 1 내지 2일의 단 기간에 효율적으로 도파민 신경세포를 획득할 수 있는 장점을 가진다.

아울러 본 발명에 따른 방법은 키메라 동물의 세포를 이용하여 직접교차분화를 수행하므로 유전적으로 균일한 세포가 모두 직접교차분화에 이용되므로 효율이 매우 우수하다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 제조한 도파민 신경세포는 실제 마우스 중뇌의 도파민 신경세포와 매우 유사한 분자적, 기능적 특성을 나타냄을 확인하였다. 이는 종래 직접교차분화로 생산한 도파민 신경세포가 중뇌의 도파민 신경세포와 성질이 완전히 일치하지 않는다는 점을 고려할 때, 본 발명의 방법이 매우 효율적인 도파민 신경세포 리프로그래밍 방법임을 나타내는 결과이다. 따라서 본 발명의 방법은 직접교차분화를 안정적으로 도파민 신경세포로 분화될 수 있는 바, 파킨슨 병 모델링, 약 스크리닝 및 세포대체치료 등에 효과적으로 적용할 수 있다.

또한 본 발명은,

전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 내재된 혈액세포 및 독시사이클린을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 혈액세포는 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 내재된 배아 줄기세포로부터 제작한 키메라 동물에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법은 직접적인 바이러스성 전사인자를 도입함이 없이, 독시사이클린만을 이용하여 짧은 시간 안에 혈액세포를 도파민 신경세포로 유도할 수 있다.

기존의 직접교차분화와 비교하여 본 발명은 단 기간 안에 효율적으로 도파민 신경세포를 획득할 수 있는 장점을 가진다. 또한 본 발명의 방법은 직접교차분화를 안정적으로 도파민 신경세포로 분화될 수 있어 파킨슨 병 모델링, 약 스크리닝 및 세포대체치료 등에 효과적으로 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 유도 신경 개발 시스템(A drug inducible system)으로써 마우스 섬유아세포로부터 도파민 신경세포로 직접교차분화를 하는 연구 전략을 나타낸 모식도이다 ( iDA neurons: 유도 도파민 신경세포, Dox inducible factors: Ascl1, Pixt3, Nurr1, Lmx1a).
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 모든 배아 줄기세포 콜로니에서 발현되는 배아 줄기세포 다능성(pluripotency) 마커 유전자를 나타낸다. Oct4, Nanog, 및 Sox2를 포함하는 마커 유전자를 발현되는 반면, TH 및 Tuj1를 포함하는 신경 유전자는 발현되지 않는다.
도 3은 본 발명의 구체예에 따라, 약(독시사이클린, Dox)을 7일동안 처리하여 마우스 배아 섬유아세포로부터 도파민 신경세포로 직접교차분화 한 것에 대해 도파민신경세포 마커를 이용하여 확인한 도이다 (J1, J2: Pitx3-eGFP-TRE-4F 마우스 배아 섬유아세포 콜로니; DOX-(7D): 약 미처리군; DOX+(7D): 7일간 약 처리군; DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole): 형광염색제; TuJ1, TH, DAT: 신경세포 유전자 마커)
도 4는 본 발명의 구체예에 따라, 약(Dox)을 7일 동한 처리한 후 도파민신경세포 마커 TH(+) 세포가 증가함을 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따라, 전기생리학 연구를 이용하여 유도 도파민 신경세포의 활동전위를 분석하여 본 발명의 유도된 도파민 신경세포가 신경세포임을 증명한 도이다(우: 전류 주입량이 증가함에 따라 유도되는 반복활동전위(n=12); 오른쪽 아래는 전류 주입(-20pA 내지 +120pA)을 나타낸다; 좌: 빠른 내부 소듐 전류 및 느린 불활성 외부 포타슘 전류로 유발된 전압 의존성 막 전류 및 탈분극 스텝 전압).
도 6은 본 발명의 구체예에 따라, 약(Dox)을 처리한 후, 날짜 별(3, 7 및 14일)로 유도 도파민 신경세포의 세포막 특성을 초기(primary) 도파민 신경세포와 비교 분석한 도이다(AP: 활동 전위; Rin: 세포막 입력 저항; RMP: 휴지막 전위) .
도 7은 본 발명의 구체예에 따라, 유도 도파민 신경세포에서 도파민 신경세포 유전자 마커(TH, AADC, DAT)의 발현을 정량적 RT-PCR을 통해 분석한 도이다(Fb: 섬유아세포; iDA : 유도 도파민 신경세포; MB: 실제 마우스 중뇌(신생자 1일령)) .
도8은 본 발명의 구체예에 따라, Pitx3-eGFP 마우스 배아 섬유아세포로부터 직접교차분화에 의해 유도된 eGFP의 발현을 FACS 분석으로 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 구체예에 따라, 직접 바이러스 주입을 통한 직접 교차분화(Direct infection)와 본 발명의 약 유도 신경 개발 시스템(Inducible system)을 사용한 직접교차분화의 효율성에 대한 실험적 가변성을 비교한 도이다.
도 10은 본 발명의 구체예에 따라, 약(Dox)에 의존적인 유도 신경 개발 시스템을 이용해 약을 처리하는 기간에 따른 리프로그래밍 전략을 나타낸 도이다(+Dox: 중단 없이 약을 계속 처리한 경우: -Dox: 기간별로 약 처리를 중단한 경우).
도 11은 본 발명의 구체예에 따라, 약(Dox) 처리 날짜(0일부터 20일까지)에 따라서 TH(+) 신경세포의 수를 보여주는 도이다.
도 12는 본 발명의 구체예에 따라, 약(Dox) 처리 1일, 2일, 3일 후 Dox를 제거했을 때, 날짜 별로 TH(+)신경세포의 수를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 구체예에 따라, 유도 신경 개발 시스템(A drug inducible system)을 이용하여 약(Dox)을 처리하거나 처리하지 않았을 때, 혈액세포(monocyte)로부터 도파민 신경세포로 직접교차분화 했는지 여부를 도파민 신경세포 마커(TH, TuJ1)를 이용하여 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 구체예에 따라, 직접교차분화 도파민 신경세포와 혈액세포(monocyte)를 이용한 유도 신경 개발 시스템 신경세포를 도파민 신경세포 마커 발현 정도를 비교하여 나타낸 히트맵(Heat map)이다. 히트맵은 상대적인 유전자 발현을 나타낸다(Monocytes: 혈액세포; iDA : 유도 도파민 신경세포; Primary DA: 실제 초기 도파민).
도 15는 본 발명의 구체예에 따른 혈액세포를 이용한 유도 신경 개발 시스템으로 유발된 TH+ 유도 도파민 신경세포의 수를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 구체예에 따라, 혈액세포로부터 유도된 도파민 신경세포의 신경돌기 길이를 나타낸 도이다.
도 17은 혈액세포(blood cells)와 혈액세포를 직접교차분화하여 유도한 도파민 신경세포(iDA)에서 방출되는 도파민 레벨을 HPLC 정량으로 비교한 도이다.
도 18은 혈액세포로부터 유도된 도파민 신경세포의 활동전위를 보여주는 도이다.
도 19는 혈액세포로부터 유도된 도파민 신경세포에서 테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)의 영향을 활동전위로 보여주는 도이다.
도 20은 혈액세포로부터 유도된 도파민 신경세포 세포막의 특성을 실제 도파민 신경세포와 비교하여 나타낸 도이다 (iDA : 유도 도파민 신경세포; Primary DA: 실제 초기 도파민; AP: 활동 전위; RMP: 휴지막 전위).

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마우스 섬유아세포로부터 도파민 뉴런을 생산하기 위한 독시사이클린( Dox )-유도 시스템

실시예 1-1. 도파민 유도 전사인자를 포함하는 키메라 마우스 제작

도파민 신경세포로 제작되도록 하는 4개의 약 유도 전사인자(Ascl1, Pitx3, Nurr1, Lmx1a)가 내재된 배아 줄기세포로부터 키메라 마우스를 제작하였다.

유전적으로 상동인 유도(induced) 도파민(DA) 신경세포를 제조하기 위해 마우스 배아 줄기세포(ES cells)를 이용하였다. 상기 마우스 배아 줄기세포는 리버스 테트라사이클린 트랜스액티베이터(reverse tetracycline transactivator) 및 ROSA26 좌위(ROSA26-M2rtTA) 를 표적화 하는 포스포글리세레이트 키나아제1(pgk1) 프로모터-발현 퓨로마이신 저항성 유전자, 그리고 내재성 Pitx3 좌위를 표적화하는 eGFP (enhanced green fluorescent protein) 를 함유한다. 상기 마우스 배아 줄기세포를 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a 를 암호화하는 Dox-유도 렌티바이러스로 감염시켰다(도 1).

렌티바이러스 생산 및 감염은 다음과 같이 수행하였다.

VSVG-코팅된 렌티바이러스는 293 세포에서 증식시켰다(Cell Stem Cell, Volume 9, Issue 5, 413-419, 20 October 2011, Kim et al.). 바이러스 상등액은 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a의 감염을 위해 풀(pool)화 되었으며, Pitx3-eGFP 넉인(KI, knocked in) 배아 줄기세포는 트랜스덕션(transduction) 24시간 전에 시딩(seeded) 되었다. Pitx3-eGFP KI 배아 줄기세포에 세 번의 연속 감염이 수행되었고, 줄기세포 콜로니는 마지막 감염 3일 이후 형태에 기초해서 선택되었다. 감염된 배아 줄기세포는 독시사이클린의 부재에서 표준 마우스 ESC 프로토콜에 따라 유지되고, 20회 연속 계대배양되었다.

상기 네 가지 전사인자를 지닌 배아 줄기세포는 독시사이클린(Dox)의 부재에서도 20 계대 이상 안정하게 배양되었다. 본 명세서에서 네 가지 전사인자를 지닌 배아 줄기세포는 Pitx3-eGFP-TRE-4F 로 지칭한다.

감염된 Pitx3-eGFP-TRE-4F 배아 줄기세포로부터 세 개의 배아 줄기세포 콜로니(Pitx3-eGFP-TRE-4F J1, J2 및 J3)를 선택하여 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a 벡터의 프로바이러스 통합(proviral integrations)여부를 확인하기 위해 서던 블롯 분석을 하였다. J1, J2, J3는 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1, Lmx1a가 내재된 ES cell의 서로 다른 세포를 말한다.

서던 블롯 분석은 다음과 같이 수행했다. 먼저 15μg의 게놈 DNA를 식별된 제한 효소로 절단했다. 전기 영동 및 트랜스퍼(transfer)는 표준 절차에 따랐다. 블롯은 ASCL1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a에 대한 방사성 표지된 프로브를 하이브리딩했다. 백그라운드(background) 및 내생 밴드(endogenous bands)를 결정하기 위한 음성 대조군으로는 ESCs 를 사용했다.

그 결과 각각의 유전자에 약 10개의 프로바이러스 통합이 관찰되었다. 이러한 세 개의 배아 줄기세포 콜로니 J1, J2 및 J3는 Dox의 부재에서 GFP 음성이다. 그리고 모든 배아 줄기세포 콜로니는 마우스 배아 줄기세포의 형태학적 특성을 보여준다. 이러한 배아 줄기세포 다능성(pluripotency)은 Oct4, Nanog, 및 Sox2를 포함하는 마커 유전자를 발현하는 반면, TH 및 Tuj1를 포함하는 신경 유전자는 발현되지 않는 것으로서 확인했다(도 2). 유도 체세포를 생산하기 위해, 본 발명자들은 배반포(B6XDBA F2 숙주 배반포)로 상기 클론 배아 줄기세포주(Pitx3-eGFP 넉인(KI) 배아 줄기세포)를 주입하여 숙주 배반포 유래 세포 뿐만 아니라 Pitx3-eGFP-TRE-4F의 체세포로 구성된 키메라 마우스를 생산하였다.

실시예 1-2. 키메라 마우스로부터 섬유아세포 추출 및 독시사이클린 처리

상기와 같이 생산한 키메라 마우스로부터 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 추출하고, 퓨로마이신으로 처리하였다. 그리고 ROSA26 좌위에서 항시적(constitutively) 활성 퓨로마이신 저항성 카세트를 이용해 숙주 배반포로부터 유래된 세포를 분리하였다.

세포배양은 다음과 같이 실시하였다.

마우스 배아 섬유아세포(MEF) 분리를 위해 척수, 배근 신경절을 함유한 헤드(head) 및 모든 내장을 Pitx3-EGFP 넉인(KI) E13.5 배아에서 제거했다. 나머지 조직을 수동으로 분리하고, 단일 세포를 제작하기 위해 10 ~ 15 분 동안 0.25 % 트립신 (Sigma)에서 배양 하였다. 각 배아로부터 온 세포를 MEF 배지의 15 cm 조직 배양 접시에 플레이팅(plated)했다. 세포가 합류할 때까지 3 ~ 4 일간 37 ℃에서 증식시킨 후 동결했다. 그 후, TTFs(tail-tip fibroblasts)를 Pitx3-eGFP-TRE-4F 키메라 마우스에서 분리했다. 성체 헤테로접합체(adult heterozygote) Pitx3-EGFP-TRE-4F 마우스 (3 주령)에서 수술 가위를 이용하여 테일 클립(tail clip)을 제거 하였다. 테일 클립은 에탄올로 씻어 PBS로 세척 한 후, 가위를 이용하여 분리하고 10 ~ 15 분 동안 0.25 % 트립신과 같이 배양했다. TTFs는 합류(confluent)될 때까지 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Hyclone), β-머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 1% 비필수 아미노산(Gibco), 소듐 피루베이트 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen)을 포함한 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) DMEM 배지 (Invitrogen 사, DMEM)에서 배양되었다, 세포는 15 CM 플레이트에 배양되었다.

TTFs를 충분히 계대배양한 후 직접교차분화를 위해 2μg/ml 의 Dox를 첨가한 N3 신경배지에 넣었다.

키메라 Pitx3-eGFP-TRE-4F 배아로부터 유래된 섬유아세포의 리프로그래밍 전사인자의 유도 발현을 평가하기 위해, 트랜스진(transgenes)의 특이 프라이머로 정량적 RT-PCR를 실시하였다.

정량적 RT-PCR은 다음과 같이 실시하였다.

총 RNA를 RNeasy 키트 (QIAGEN 사)를 이용하여 분리하였다. DNase 처리한 RNA 1 마이크로그램을 퍼스트 스트랜드 합성 키트 (First Strand Synthesis kit , Invitrogen 사)를 이용하여 역전사했다. 정량적 RT-PCR 분석은 플래티넘 SYBR green qPCR SuperMix (Invitrogen 사)을 이용하여 ABI 프리즘 7000 (ABI Prism 7000 , Applied Biosystems 사)의 역전사 반응의 1/50을 사용하여 삼중으로 수행하였다. 배아줄기세포(ES) 및 신경 마커에 대한 유전자 발현 분석은 RT-PCR로 수행하였다.

그 결과, Pitx3-eGFP-TRE-4F J1 섬유아세포주에서 강한 Dox-의존적 인자를 관찰하였다. 이는 배아 줄기세포마다 유전자 카피 정도가 다르게 되는데, 그 중 J2 ALC J3에 비해 J1에서 상대적으로 많은 양의 전사인자가 도입되었기 때문이다. 따라서 후속 실험에서 Pitx3-eGFP-TRE-4F J1 섬유아세포주를 사용하였다. 이러한 결과는 Dox의 부재에서는 어떠한 바이러스 전사인자도 탐지되지 않으며, 트랜스진 발현이 엄격히 약 의존적임을 나타내는 것이다.

실시예 1-3. 유도 도파민 신경세포 발현 확인

독시사이클린(Dox) 처리에 반응하는 유도 섬유아세포의 리프로그래밍 활성을 평가하였다. 배지에 Dox를 첨가함으로써 섬유아세포의 드라마틱한 형태학적 변화를 확인하였으며, 도파민 신경세포를 효과적으로 생산함을 알 수 있었다(도 3). 상기 섬유아세포주에 독시사이클린을 7일 처리한 후, 대부분의 섬유아세포가 도파민 신경세포로 리프로그래밍 된 것을 확인하였다. Dox 도입 7일 후, 대부분의 섬유아세포는 배지에서 TH+ 도파민 뉴런으로 나타났다.

유도 도파민 신경세포임을 증명하기 위해서 형광 현미경을 통해 도파민 신경세포 마커인 TH, DAT, Tuj1가 존재함을 확인하였다(도 3). 형광면역법으로 유도 도파민 신경세포가 도파민 신경세포 마커인 TH, DAT 및 Tuj1 으로 재활성되는 것을 증명하였다(도 3). 면역세포화학(Immunocytochemistry)은 세포를 PBS에 4 % 파라포름알데히드로 고정하고, 하기 일차 항체를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 면역 염색하여 수행하였다 : TH (PEL-FREEZ 사), Tuj1 (Sigma 사), MAP2 (Sigma 사), DAT (케미콘 사), AADC (Protos Biotech 사), Pitx3 (Zymed 사), eGFP (Abcam 사), Oct4 (Santa cruz 사) 및 적절한 형광 이차 항체 (Invitrogen 사).

또한 직접교차분화 된 TH(+) 도파민 신경세포 수를 분석한 결과 필드(field) 당 약 90개의 세포가 도파민 신경세포로 유도된 것을 확인하으며(도 4), Pitx3-eGFP-TRE-4F J1 섬유아세포에서 높은 TH+ 유도 도파민 신경세포가 유도됨을 관찰하였다(도 4). 다른 유도 도파민 신경세포의 리프로그래밍 효율은 트랜스진 발현 수준과 분명히 일치하는 것으로 나타났다.

또한 배지의 도파민 신경세포-관련 유전자의 발현을 정량화하였다. 도파민 신경세포 마커인 TH, AADC, DAT의 RNA 발현 정도를 알아보기 위해 RT-PCR을 진행하였다(도 7). 도파민 신경세포 마커(TH, AADC, DAT)의 발현 정도를 중뇌의 도파민 신경세포와 비교하였다. 그 결과 유도 도파민 신경세포는 중뇌 도파민 신경세포와 비슷한 발현 정도를 보였다. MAPT와 NEFL과 같은 신경세포 유전자 마커는 유도 도파민 신경세포에서 RNA 발현이 증가한 반면에 섬유아세포 유전자 마커의 발현은 감소한 것을 확인하였다. 구체적으로, Pitx3-eGFP-TRE-4F J1 섬유아세포의 Dox-유도 7일 후, 내재성 TH, AADC, DAT 및 VMPT2의 발현이 상당히 증가되었고, 발현 수준은 출생 후 마우스 중뇌의 수준보다 높았다(도 7). 또한 MAPT, 및 NEFL와 같은 전체-신경세포 유전자(pan-neuronal genes)의 특정 유도가 유도 도파민 뉴런에서 관찰되었다. 반면 섬유아세포 유전자의 발현은 유도 도파민 신경세포에서 상당히 하향조절되었다.

실시예 2. 섬유아세포로부터 도파민( DA ) 신경세포를 분화시키기 위한 최적의 직접교차분화 리프로그래밍

실시예 2-1. DOX 처리일수에 따른 유도 도파민 신경세포 분석

다음으로 본 발명자들은 Dox 도입 후 0, 7, 14일에 유세포분석기(flow cytometry)로 리프로그래밍 효율을 관찰하였다. 모든 유세포 분석은 Accuri 장치 (Becton-Dickinson)에서 실시했다. 데이터는 FlowJo 소프트 소프트웨어 (TreeStar)를 사용하여 분석했다. 구체적으로, 세포를 5 분 동안 트립신으로 분리 시키고, 이어서 단일 세포를 펠릿화하고, 차가운(ice-cold) 4 % 파라포름알데히드 중에서 다시 현탁하여, 4 ℃에서 10 분간 배양 하였다. 세포를 두 번 세척하고 FACS 분석을 위해 FACS 완충액에 다시 현탁했다.

Pitx3-eGFP-TRE-4F 유도 도파민 신경세포는 Dox 도입 후 7일째에 47% Pitx3-eGFP-양성을 나타냈고, 14일째에 총 세포의 약 60%로 최대치에 도달했다(도 8).

실시예 2-2. 전기생리학적 유도 도파민 신경세포 분석

한편, 도파민을 방출하고 생산하는 기능적 도파민 신경세포 생산을 예상한대로 본 발명 유도 도파민 신경세포는 고 포타슘(56 mM)- 유도 탈분극 양상을 나타내어 도파민을 방출함을 감지할 수 있었다. 또한 기능적 도파민 신경세포의 특성으로서 전기생리학적 특성을 나타내는 유도 도파민 신경세포인지 여부를 관찰했다. 구체적으로 Dox 도입 이후 날짜에 따라 전-세포 패치 클램프(patch-clamp) 분석을 사용해 유도 도파민 신경세포를 관찰하였다.

전기생리학적 기록을 위해 세포를 12mm 커버 유리에서 증식시켜 세포 외 용액을 함유하는 기록 배지로 이동시켰다 (mM 단위): 130 NaCl, 4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 글루코오스 (pH는 7.35, 325 mOsm). 패치 피펫은 다음의 세포 내 욕액으로 충전했다(단위 : mm) : 110 글루콘산 칼륨, 20 KCl, 2 Mg-ATP, 10 소듐 크레아틴인산, 1.0 EGTA, 0.3 GTP-트리스 및 20 HEPES (pH는 7.25, 320 mOsm). 전극은 유리 모세관 플러 (Sutter Instruments 사)를 이용하여 보로실리케이트 유리 모세관 튜브 (Warner Instruments)에서 제조했다. 패치 전극은 마이크로포지 (Narishige 사)에서 파이어-폴리쉬(fire-polished)되었고, 2-4 M의 저항을 갖는다. 전-세포 모드를 설정 한 후, 세포막의 용량과 직렬 저항을 패치 클램프 증폭기(Axopatch 200B; Molecular Devices 사)를 사용하여 75 %까지 전기적으로 보상시켰다. 데이터 생성 및 검색은 아날로그-디지털 변환기(Digidata 1440A; Axon Instruments)를 탑재한 IBM 컴퓨터에서 pClamp10 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 활동 전위는 전사인자가 감염되고 10 일 이후 유도 도파민 신경세포에서 유발되었다. 상승된 세포체 및 분기되고 확장된 신경 돌기의 존재를 포함한 신경-유사 형태를 고려하여 11 일째에 기록을 하였다. 전류-클램프 모드가 생성되면, 세포는 약 -65 ~ -70 mV의 전위를 유지했다. 전류 주입 프로토콜 단계는 -100pA와 +120 pA 범위로 적용되었다. 안쪽 소듐 전류와 바깥쪽 칼륨 전류는 -55에서 55 mV 범위의 전압 단계 프로토콜과 전압-고정(voltage-clamp) 모드로 측정했다.

Dox 도입 후, 7일에, 대조군 섬유아세포와 대조적으로 유도 도파민 신경세포의 주요 유도된 활동 전위가 음성으로 관찰되었다. 또한 Pitx3-eGFP-TRE-4F 유도 도파민 신경세포는 전압 의존적 이온 흐름을 보였다(도 5). Dox 도입 후 4일째에, 유도 도파민 신경세포의 평균 안정막 전위는 45.18 ±5.3 mV이었다(평균± SEM, n = 14). 입력 저항은 1.07 ± 0.47 GΩ이었다(평균± SEM, n = 14). 활동 전위 진폭은 64.26±6.83 mV (평균± SEM, n = 14)이었다. 이것은 도파민 신경세포의 잘 발달된 나트륨 채널 및 칼륨채널의 존재를 나타낸다(도 6). 또한 이러한 결과는 본 발명의 유도 시스템이 생체 도파민 신경세포와 매우 유사한 기능적 유도 도파민 신경세포로 빠르게 직접 전환되는 것임을 나타낸다.

실시예 3. 리프로그래밍 키네틱( Reprogramming kinetics )

실시예 3-1. 전사인자 직접 감염 및 본 발명 약 유도 프로그래밍의 효율 비교

다음으로 직접 감염과 비교하여 Pitx3-eGFP-TRE-4F 시스템의 재현가능성을 결정하기 위한 실험을 실시하였다. 4개의 전사인자(Ascl1, Pitx3, Nurr1, Lmx1a)를 직접 주입한 섬유아세포와 약 유도 직접교차분화를 한 섬유아세포를 약 유도 한 후 10일 동안 배양하였다. 구체적으로 Aslc1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a를 암호화하는 렌티바이러스로 직접 감염된 Pitx3-eGFP 섬유아세포와, 본 발명의 Dox 도입 후 10일째 TH+ 세포를 스코어화했다. 그 결과로 TH(+) 세포 수를 비교 하였는데 약 10배 이상의 세포 수 차이를 보였다(도 9). 직접 렌티바이러스 감염에 의한 TH+ 유도 신경세포 생산은 상당한 변이를 보여주었다. 반면 유도 시스템은 체세포 섬유아세포로부터 TH+ 유도 도파민 신경세포의 생산에서 훨씬 적은 변이를 보여준다(도 9). 두 조건 사이의 RNA 발현차이를 RT-PCR을 통해 확인한 결과 2배 이상 높은 RNA 발현을 보였다. 또한 TH, Tuj1, VMAT2, AADC, 및 DAT와 같은 도파민 신경세포 유전자는 직접 감염과 비교하여 본 발명의 Pitx3-eGFP-TRE-4F 시스템에서 훨씬 더 잘 유도되는 것으로 나타났다.

실시예 3-2. 약 유도를 통한 직접교차분화의 기간별 효율성

직접교차분화 리프로그래밍 프로세스의 트랜스진 발현을 위한 최소 요구도를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 1 내지 20일 사이의 다양한 기간 동안 Dox에 Pitx3-eGFP-TRE-4F 섬유아세포를 노출시키고, TH 발현 확인을 위해서 이들을 염색하였다. 각 지점 별로 약 유도 직접교차분화의 효율을 확인하였다(도 10). 그 결과, 1일 이상 Dox에 노출된 Pitx3-eGFP-TRE-4F-J1 유도 섬유아세포에서 뉴런 형태로 TH+ 유도 도파민 신경세포가 나타났다. 반면, Dox가 도입되지 않거나 1일보다 적게 처리된 경우, 배지에서 TH+ 유도 도파민 신경세포가 관찰되지 않았다(도 11). 이는 약을 1일 이하로 처리 할 경우 직접교차분화가 거의 되지 않지만, 2일 이상으로 약을 처리하였을 때 TH(+) 세포가 급격하게 증가한 것으로 보아, 신경세포로 분화된 것을 알 수 있었다. 즉, 유도 도파민 신경세포의 수는 TH+ 유도 도파민 신경세포의 정량화에 의해 Dox에 장기적으로 노출될수록 증가한다는 것을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해, 4개의 약 유도 전사인자가 주입된 섬유모세포에 Dox를 지속적으로 처리하였을 때 약 유도 도파민 신경세포가 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3-3. 유도 도파민 신경세포의 Dox 의존성 측정

또한 유도 도파민 신경세포의 Dox 의존성을 측정하기 위해, Dox-유도된 Pitx3-eGFP-TRE-4F 섬유아세포에서 도입하고 1, 2 또는 3일 후에 Dox 처리를 중단하였다. 그리고 Dox 처리를 중단한 후 최대 20일까지 TH+ 유도 도파민 신경세포의 생성 수를 관찰하였다. 그 결과 Dox 처리 1일 후에 Dox를 제거한 경우, 유도 섬유아세포에서는 적은 수의 TH+ 유도 도파민 신경세포를 발견하였다(도 12). 반면, Dox 처리 2일 이후에, 처리를 중단한 경우에는 TH+ 유도 도파민 신경세가 안정하게 증가하는 것으로 나타났으며, Dox를 제거하더라도 TH+ 세포의 손실이 없음을 확인했다(도 12). 이러한 결과는 본 발명의 유도 시스템이 Dox의 존재하에서 배양될 때 유도 도파민 신경세포를 효율적으로 생산할 수 있음을 증명한다. 또한 Dox 약 처리를 중단하더라도 신경세포가 죽지 않고 지속적으로 생존하는 것을 말한다. 이를 통해 본 발명의 도파민 신경세포는 안정적으로 리프로그래밍 되며, 외인성 트랜스진 발현과 관계가 없다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 혈액세포를 이용한 직접교차분화

실시예 4-1. 혈액세포 분리

분화능을 가진 세포로 전환하기 위한 유도 개발 시스템은 다양한 체세포 형태가 유도만능줄기세포 iPSC(induced pluripotent stem cell)로 전환될 수 있는 가능성을 결정하는 방법으로 사용되고 있다. (Hanna et al., 2008; Kim et al., 2011; wernig et al., 2008). 특히, 혈액세포 역시 유사한 유도 개발 시스템을 사용하여 iPSC로 전환할 수 있다는 가능성을 보였다. (Eminli et al., 2009; Hanna et al., 2008)

말초혈액은 신체에서 가장 접근하기 쉬운 세포이기 때문에, 말초혈액의 혈액세포(monocyte)로부터 유도 신경 개발 시스템을 적용하여 도파민 신경세포로 직접교차분화가 되는지 분석하였다.

혈액세포가 유도 도파민 신경세포로 직접교차분화가 가능한 지를 평가하기 위해서 상기 실시예 1-1의 유도 신경 개발 시스템의 마우스 말초혈액으로부터 혈액세포(monocyte)를 분리하였다.

말초 혈액 단핵구 세포에서 마우스 단핵구의 분리를 위해, Easysep 마우스 단핵구 농축 키트 (스템 셀 테크놀로지, cat: 191971)를 사용했다. 단핵구를 10 % 열 불활성 우태아혈청(FCS), 0.03 %의 L-글루타민, 100 mg / ml 스트렙토마이신, 100 mg / ml 페니실린, 1mM 비 필수 아미노산, 1mM 소듐 피루베이트 및 0.02 mM 2-머캅토에탄올 (Invitrogen) 을 함유한 RPMI1640 배지(Gibco BRL)에서 유지하였다.

실시예 4-2. 혈액세포로부터 도파민 신경세포의 직접교차분화 리프로그래밍

조혈 계통이 유도 도파민 신경세포로 직접교차분화 리프로그래밍하기에 적합한 지 여부를 판단 하기 위해, 본 발명자들은 말초 혈액 에서 단핵구를 분리하고, 도파민 신경 세포를 생성하는 능력을 검토했다. 단핵구를 Pitx3 - EGFP - TRE - 4F - J1 배아 줄기세포(도 13)로부터 유래된 키메라 마우스에서 분리했다. 분리된 단핵구(monocyte)를 5 일간 2μg/ml 의 Dox를 포함한 생체 외 단핵구 배양 배지를 사용하여 배양하였다. dox 유도 5 일 후, 직접교차분화를 위해 세포를 2μg/ml 의 dox를 함유하는 신경배지로 옮겼다. 혈액세포를 유도 도파민 신경세포로 직접교차분화 한 후, 면역형광법으로 도파민 신경세포 마커를 확인하였다(도 13). Dox 처리 10 일 후, 재프로그래밍 된 유도 도파민 신경세포가 관찰됐다. 면역형광염색은 단핵구 유래 도파민 신경세포가 도파민 마커 TH, TuJ1로 균일하게 발현된 것을 보여준다(도 13). 유도 도파민 신경세포를 보이기 위해 TH(+)세포 수와 신경 돌기 길이를 혈액세포와 비교하여 나타내었다. TH+ 도파민 신경세포의 수와 신경돌기 길이는 dox 처리 리프로그래밍 단핵구에서 크게 증가하였다(도 15, 16).

약 처리 15일 후에 유도 도파민 신경세포와 생체 도파민 신경세포를 RT-PCR를 통해 mRNA 발현 수준을 비교하였다.(도 14) 또한 도 2에서 생체 도파민 신경세포와 본 발명의 mRNA발현 정도가 거의 유사함을 보였다. 이는 본 발명의 단핵구 유래 유도 도파민 신경세포가 초기의 중뇌 도파민 신경세포와 매우 유사한 유전자 발현 프로파일을 확립한 것임을 보여준다.

실시예 4-3. 전기생리학적 혈액세포 유도 도파민 신경세포 분석

또한 혈액세포(monocyte)로부터 직접교차분화 된 유도 도파민 신경세포를 전기생리학적으로 분석하였다. 유도 도파민 신경세포는 Na와 K 채널의 발생으로 인해 활동전위가 생기는 것을 확인하였다. 즉, 분석된 유도 도파민 신경세포는 전류 주입으로 탈분극 될때, 그리고 내향 Na 전류 및 외향 K 전류를 빠르게 생성할 때 활동 전위를 보였다(도 18, 19). 또한 유도 도파민 신경세포의 안정막 전위와 AP 진폭(amplitude)을 분석한 결과, 본 발명의 유도 도파민 신경세포가 생체 도파민 신경세포와 매우 유사함을 알 수 있었다(도 20). HPLC 분석은 혈액세포 유도 도파민 신경세포를 50mM 의 KCl 로 자극하였다. 그 결과, 세포 내 및 세포 외 배지 중으로 방출될 수 있는 도파민을 수준을 혈액세포와 비교했을 때 그 분비량이 훨씬 많다는 것을 확인할 수 있었다.(도 17)

따라서 위의 실험 결과를 통해, 독시사이클린을 이용한 혈액세포(monocyte) 유도 도파민 신경세포는 생체 도파민 신경세포와 매우 유사한 특성을 가지는 것을 확인하였다.

Claims (7)

1. 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 형질도입된 배아 줄기세포로부터 키메라 동물을 제작하는 단계;
   상기 키메라 동물에서 혈액세포를 분리하는 단계; 및
   상기 혈액세포를 독시사이클린(Doxycycline)이 함유된 배지에서 배양하여 도파민 신경세포를 유도하는 단계;
   를 포함하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법으로서,
   상기 키메라 동물은 마우스인 것을 특징으로 하고, 그리고
   상기 혈액세포에 형질도입된 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a는 독시사이클린에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 혈액세포는 말초혈액으로부터 분리한 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 독시사이클린의 함유량은 0.1 내지 10 ug/ml 인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 독시사이클린이 함유된 배지에서의 체세포 배양은 1 내지 30일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 형질도입된 혈액세포 및 독시사이클린을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키기 위한 조성물로서,
   상기 혈액세포에 형질도입된 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a는 독시사이클린에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 혈액세포를 도파민 신경세포로 직접교차분화시키기 위한 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 혈액세포는 전사인자 Ascl1, Pitx3, Nurr1 및 Lmx1a가 형질도입된 배아 줄기세포로부터 제작한 키메라 동물에서 분리된 것을 특징으로 하고, 그리고
   상기 키메라 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 조성물.

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