CN103068974B - 体细胞至诱导的重编程神经干细胞(irNSC)的转化 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于将体细胞转化为神经干细胞(NSC)的方法。另外，本申请涉及基于基因转导和化学上定义的培养基诱导的关联步骤，将人成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞转化成神经干细胞的方法。

Description

体细胞至诱导的重编程神经干细胞(irNSC)的转化
本申请涉及用于将体细胞转化为神经干细胞(NSC)的方法。另外，本申请涉及基于基因转导和化学上定义的培养基诱导的关联步骤，将人成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞转化为神经干细胞的方法。
长时间以来普遍认可了充分分化的体细胞具有绝对不可逆特性的学说。当一系列的先驱实验显示可以通过不同对的细胞类型融合完全再激活沉默的基因表达谱时，这种观点开始变化(Blau，H.M.Howfixedisthedifferentiatedstate？Lessonsfromheterokaryons？(分化状态有多固定？来自异核体的教导).TrendsGenet.5，268-272(1989))。最近显示，从一个体细胞类型转移核至去核卵细胞可能导致体细胞的基因表达谱完全回复并且导致能够产生新的完整动物的多潜能细胞状态形成(参见例如Gurdon，J.B.和Melton，D.A.Nuclearreprogrammingincells(细胞中的核重编程).Science322，1811-1815(2008))。Yamanaka和同事(Takahashi，K.和Yamanaka，S.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors(通过定义的因子从小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物中诱导多潜能干细胞).Cell126，663-676(2006))展示，可以通过转导4种定义的因子(Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc)，将体细胞重编程为诱导的多潜能干细胞(iPSCs)。已经将不同类型的体细胞(包括成纤维细胞、角质形成细胞和脂肪细胞)重编程为iPSC多潜能状态。在过去数年期间，出现以下问题：特定体细胞类型是否可以转分化成完全不同的体细胞类型，如神经元。Wernig和同事解决了这个问题，显示通过转导3种关键基因：Mash1、Brn2和Myt11，将小鼠成纤维细胞直接转化为功能性神经元(Wernig等人，Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors(通过定义的因子将成纤维细胞直接转化为功能性神经元).Nature25；463(7284)：1035-41(2010)。然而，所获得的神经元是根据定义不能够增殖和无法承受冷冻和融化过程的有丝分裂期后细胞。US2010/0021437公开了一种从成纤维细胞中产生诱导的多潜能干细胞并且诱导这些细胞以分化成神经表型的方法。
然而，迄今仍未描述将分化的体细胞直接转化成神经干细胞。神经干细胞是多能干细胞并且据报道在特定条件下增殖。它们需要化学上定义的培养基，例如N2B27培养基(N2B27是补充有N2和B27(二者均来自Gibco))的DMEM/F12(Gibco，Paisley，UK)的1∶1混合物，其补充有FGF(成纤维细胞生长因子2)和EGF(表皮生长因子)。它们可以生长为单层贴壁培养物，例如，在聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板上，或在非贴壁细胞培养板中生长为悬浮的神经球。已经报道两种类型的神经干细胞培养物(神经球、贴壁培养物)是完全相互可转化的。神经干细胞可以无限地生长并且仍保持真实多能性。在特定条件下，它们分化成构成成体脑的细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将神经干细胞视为用于治疗患有神经变性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、中风和脊髓损伤的患者的可能治疗剂。
已知可以在体外从胚胎干细胞(ESC)产生神经干细胞(Chambers等人，Nature27；3(2009))或它们可以从脑样品直接分离(ReynoldsBA，RietzeRL(2005)NatMethods2：333-336)。然而，迄今已知的这些方法具有许多重大缺点，因为它们或者引起众多高度敏感的伦理学顾虑和/或它们需要复杂和费力的技术，所述技术遭受严重的重现性难题困扰。迄今未曾描述其中神经干细胞可以直接源自分化的体细胞的方法。原则上，神经干细胞可以从已经源自分化细胞的iPSC获得。然而，这将隐含意味着培养iPSC。已经报道iPSC无限地扩增，但是培养条件复杂并且需要大量工作。另外，已经报道从多潜能干细胞衍生神经干细胞因随机机制而不确定。iPSC和ESC的常见障碍是甚至少数的未分化细胞可能导致畸胎瘤(包含几个细胞类型的生殖细胞肿瘤)形成，这带来不可能忽略的严重污染。体干细胞(如神经干细胞)不形成畸胎瘤。因此，仍需要容易获得和可重复的产生神经干细胞的技术。本发明提供一种用于将体细胞直接转化成神经干细胞的方法。这种新方法减少获得iPS细胞的必要性并且因此消除畸胎瘤形成的风险。对于再生医学应用，缺少畸胎瘤形成能力的这类细胞是有用和安全的。优选地所述体细胞是哺乳动物体细胞，最优选地是人体细胞。所述的人体细胞可以从健康个体或从患者获得。所述体细胞优选地是成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞，最优选地是成纤维细胞。所述成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞可以容易地和安全地源自患者或健康个体，例如通过非侵入性方法如皮肤活组织检查，或来自拔除的毛发。本发明的方法允许将源自健康或患病个体的体细胞如成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞直接转化成神经干细胞。这些健康个体或患者的特定神经干细胞可以无限扩增。培养是容易和充分表征的。可以重复地冷冻和融化健康个体和患者的特定神经干细胞等分试样。具体而言，源自患者的神经干细胞代表了研究CNS疾病的病理生理学的疾病相关性体外模型。将患者特异的体细胞直接转化为神经干细胞代表了一项产生患者特异的神经干细胞生物样品库(BioBank)的容易获得和可重复性技术。这类生物样品库对于CNS相关疾病具有巨大相关性，因为在从神经干细胞产生的3个细胞类型：神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的至少一种中描述了清晰的病变。因此，用本文所述方法获得的神经干细胞是筛选有效和安全药物的有价值疾病模型。
多种神经变性疾病以神经元细胞丧失为特征。成体脑的再生能力在应答于脑损伤和神经变性疾病时相当有限。另外，药理学介入治疗经常日益变得更不有效，因为易感性神经元群体进行性丧失。用本文所述方法获得的神经干细也可以在再生医学用来治疗神经变性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS/鲁盖瑞氏症(ALS/LouGehrig′sDisease))或脊髓损伤。采用本文所述的创造性方法，现在可能提供足够量的神经元前体细胞用于细胞移植疗法中。神经干细胞可以从体细胞获得，所述体细胞从健康个体或从患者分离。对于自体细胞移植疗法而言，通过本文所述的方法获得的患者特异的神经干细胞是一个有吸引力的新供体源，从而消除因患者和供体之间的免疫不相容性所致的任何免疫排斥。这项策略将消除细胞移植疗法中对免疫抑制剂的需求。另外，可以使用创建的源自健康个体的具有不同HLA纯合等位基因的神经干细胞生物样品库作为治疗有需要的个体的供体库。异种移植具有相容性HLA型的神经干细胞降低不利免疫反应的风险，所述的不利免疫反应可能导致对移植细胞的排斥。
为实现这里所述的创造性突破，需要绕过重编程过程的一些现存局限性，以及需要将基因转导与采用特定培养基诱导的步骤组合。
本文中提供了一种用于将体细胞转化为神经干细胞(NSC)的方法，所述方法包括步骤：
a)提供体细胞；
b)通过导入至少两个基因，将所述体细胞重编程为神经干细胞；和
c)用生长因子和小分子诱导重编程。
在又一个实施方案中，这种方法额外包括
d)在适于神经干细胞增殖的条件下孵育步骤b)和c)的产物。一般而言，步骤b)和c)的产物可以在细胞培养物中容易地鉴定为神经球。优选地，适于增殖神经干细胞的所述条件包含收获所述神经球并且在化学上定义的培养基中扩增它们。优选地，所述培养基是扩增培养基(expansionmedium)并且神经球在非贴壁培养条件下培养。扩增培养基的非限制性实例在下文进一步描述。
术语“体细胞”如本文所用指形成生物本体的不是生殖系细胞(例如精子和卵细胞、产生它们的细胞(配子母细胞)和未分化干细胞的任何细胞。内部器官、皮肤、骨、血液和结缔组织均由体细胞构成。用于本文所述的方法中的优选体细胞是成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞并优选地从皮肤活组织检查样品获得。
优选地，用于转化为神经干细胞的体细胞是哺乳动物来源的，最优选地是人来源的。所述的人体细胞可以从健康个体或从患者获得。优选地，所述体细胞选自成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞。这些供体细胞可以容易地从任何适合的来源获得。本文中优选在不对人体进行侵入性操作情况下允许分离供体细胞的来源。用于分离成纤维细胞的方法是本领域熟知的。成纤维细胞可以从任何适合的来源获得，例如来自多种器官组织或皮肤组织。优选的成纤维细胞是肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞和成人皮肤成纤维细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述人成纤维细胞从患者获得，例如通过皮肤活组织检查(例如，Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors(用定义的因子将人体细胞重编程为多能性).GeorgeQ.Daley等人，Nature2008；Amethodfortheisolationandserialpropagationofkeratinocytes，endothelialcells，andfibroblastsfromasinglepunchbiopsyofhumanskin(一种从人皮肤单次冲取活组织检查样品中分离并且连续增殖角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞的方法)，Normand等人，InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal，1995))。脂肪细胞和角质形成细胞也可以通过皮肤活组织检查样品或拔除的毛发容易地衍生(Isolationandcultivationofhumankeratinocytesfromskinorpluckedhairforthegenerationofinducedpluripotentstemcells(从皮肤或拔除的毛发中分离和培育人角质形成细胞用于产生诱导的多潜能干细胞)，Belmonte等人，NatureProtocols2010)并且也是本发明方法的优选供体细胞。
本发明的一个优选方面是一种用于产生患者特异的神经干细胞的方法。本发明的另一个方面是一种用于从健康个体获得的体细胞中产生神经干细胞的方法。
如本文所用，“神经干细胞”指表达一些神经标记物(包括例如，巢蛋白(nestin))的多潜能细胞亚群。通过本文所述的方法获得的神经干细胞也称作“irNSC”：诱导的重编程神经干细胞。神经干细胞可以无限扩增并且可以分化成神经元或神经胶质细胞(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“患者特异的神经干细胞”指从患者的体细胞获得的神经干细胞并且也称作自体神经干细胞。如本文所用的“从健康个体获得的神经干细胞”指从未疑似患有任何病症或疾病的个体的体细胞中获得的神经干细胞。
如本文所用，术语“重编程”指将体细胞转化为较不分化的细胞(例如将成纤维细胞、脂肪细胞或角质形成细胞转化为神经干细胞)所需要的一个或多个步骤。通过导入参与维持神经干细胞性能的至少两个基因实现体细胞向神经干细胞的重编程。适于将体细胞重编程为神经干细胞的基因包括但不限于Sox2(SeqIDNo.1)、Brn2(SeqIDNo.2)、Bmi1(SeqIDNo.3)、Mash1(SeqIDNo.4)、Sox11(SeqIDNo.5)、NCam(SeqIDNo.6)、Kpna1(SeqIDNo.7)、Foxg1(SeqIDNo.8)、Emx2(SeqIDNo.9)和Pax6(SeqIDNo.10)。在一个优选实施方案中，导入至少两个基因，在另一个优选实施方案中，导入3个基因。待导入体细胞中的基因的优选组合包含Bmi1和Sox2。在又一个优选的实施方案中，至少两个基因的这种组合额外地包含Mash1。在另一个实施方案中，至少两个基因的这种组合额外地包含选自Mash1、Emx2、Foxg1、Pax6和Sox11的一个基因。在又一个实施方案中，至少两个基因的组合包含Bmi1和Sox2及Mash1。
如本文所用，术语“基因导入”指导致所述基因在体细胞中稳定表达的任何方法。通过本领域已知的方法，通过用重编程载体递送至细胞中或通过用小分子活化所述基因，将所述基因导入体细胞中。重编程载体的实例是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒和转座子。本文中优选使用慢病毒用于递送所述基因。适于稳健激活所述基因的小分子的实例是DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、麦角碱类(例如麦角酸乙酰胺)、黄酮类(例如7’-羟黄酮)、Paullone(例如Kenpaullone)(ReprogrammingofmurinefibroblaststoinducedpluripotentstemcellswithchemicalcomplementationofKlf4(用Klf4的化学互补物将鼠成纤维细胞重编程为诱导的多潜能干细胞).PNAS2009106(22)8912-8917)、L-型通道激动剂(例如BIX01294)、BayK8644和5’氮胞苷((InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicFibroblastsbyOct4andKlf4withSmall-MoleculeCompounds(从小鼠胚胎成纤维细胞通过Oct4和Klf4连同小分子化合物诱导多潜能干细胞)，YanShi等人，CellStemCell-2008年11月6日(第3卷，第5期，第568-574页)。为成功诱导重编程，在补充有生长因子和小分子的合适培养基中培育体细胞。如本文所用，术语“生长因子”意指引起细胞增殖的生物活性多肽并且包括生长因子和它们的类似物。这些生长因子包括但不限于表皮生长因子、转化生长因子、神经生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子和血管生成因子、血小板衍生生长因子、胰岛素和胰岛素样生长因子，包括生长调节素、粘液瘤和痘苗病毒衍生的生长因子。本文所用的优选生长因子是BDNF(脑源神经营养因子)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)和EGF(表皮生长因子)。生长因子可以单独或以配对组合使用，或最优选地一起使用全部3种因子。另外，将成纤维细胞在至少一种小分子存在下培养。如本文所用，术语“小分子”或“小化合物”指合成或自然界中存在的有机或无机分子，它们通常具有小于10,000克/摩尔、任选地小于5,000克/摩尔和任选地小于2,000克/摩尔的分子量。在一个优选的实施方案中，所述小分子包括Rho相关的形成卷曲螺旋的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(ROCK)蛋白激酶家族的抑制剂。ROCK抑制剂的非限制性实例包括法舒地尔(Fasudi1)(1-(5-1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪)、Thiazovivin(N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺)、Y27632((+)-(R)-反-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)和Balanol样324化合物(N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺)。在另一个实施方案中，所述小分子选自一种或多种激酶AMPK的抑制剂(AMP激活的蛋白激酶，β1非催化亚基；正式符号：PRKAB1)，CHK2(CHK2检查点同源物(粟酒裂殖酵母(S.pombe))，正式符号：CHEK2)、MSK1(核糖体蛋白S6激酶，90kDa，多肽5；正式符号：RPS6KA5)、PKA(催化性cAMP依赖性蛋白激酶α；正式符号：PRKACA)、PKGa(I型cGMP依赖性蛋白激酶；正式符号：PRKG1)和SGK1(血清/糖皮质激素调节的激酶1，正式符号：SGK1)。
如本文所用，“用于诱导重编程的合适培养基”也称作“诱导培养基”，指用于诱导体细胞的重编程的任何化学上定义的培养基。本文中优选的是补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。本文所用的优选培养基含有10-50μg/ml胰岛素、10-100μg/ml转铁蛋白和10-50nM孕酮。适于诱导重编程的无血清培养基的实例是N2B27培养基(N2B27是补充有N2和B27(二者均来自Gibco)的DMEM/F12(Gibco，Paisley，UK)的1∶1混合物)、N3培养基(由DMEM/F12(Gibco，Paisley，UK)、25μg/ml胰岛素、50μg/ml转铁蛋白、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮(Sigma)、100nM腐胺(Sigma)组成)或NS-A增殖培养基(StemcellTechnologies)。本文中最优选的是如上文所述的无血清培养基，其额外地补充有FGF2、EGF、BDNF和ROCK抑制剂。优选地，所述ROCK抑制剂包含法舒地尔或Balanol样324化合物。在一个优选实施方案中，培养基补充有10-50ng/mLFGF2、10-50ng/mLEGF、1-20ng/mLBDNF和1-50μM法舒地尔或1-10μMBalanol样324化合物。在导入至少两个基因后，待进行重编程的体细胞优选地在所述诱导培养基中培育至少1日，优选地1日至7日、最优选地2日至3日。
在一个实施方案中，步骤a)的体细胞用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂预处理。如本文所用的“进行预处理”或“预处理”意指在补充有所述HDAC抑制剂的合适培养基中孵育体细胞4至60小时，优选地48小时。本文中有用的HDAC抑制剂选自丁酸钠(丁酸，钠盐)、制滴菌素A(TSA，7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧代庚-2，4-二烯酰胺)和丙戊酸(2-丙基-戊酸)。在一个实施方案中，步骤a)的体细胞用丙戊酸(Valproicacid)预处理。在另一个实施方案中，步骤a)的体细胞用丙戊酸预处理48小时。
为扩大增殖作为神经球培养物的神经干细胞，在扩增培养基中培育诱导的神经干细胞，所述扩增培养基包含如上文所述的补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮及生长因子的无血清培养基。优选地，所述生长因子包含FGF2、BDNF和EGF。在另一个实施方案中，所述扩增培养基额外地包含选自肝素、抗坏血酸、SHH(重组人音猬因子)、FGF8(重组人FGF8a同工型)、DLL4(重组人DLL4)、Jagged1(重组人Jagged1Fc嵌合体)、法舒地尔和Balanol样324化合物的一种或多种补充物。
在本发明的另一个实施方案中，在下一个步骤中通过省略重编程培养基的至少一种生长因子而刺激借助本文所述方法获得的神经干细胞以便分化。优选地，待撤回的生长因子包括EGF和FGF。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用标记基因来促进筛选成功重编程的神经干细胞并对其定量。例如，通过慢病毒转导，将编码荧光标记蛋白的基因导入靶体细胞中。荧光标记蛋白的实例是GFP、YFP、EGFP或DsRed。优选地，所述标记基因与巢蛋白启动子有效连接。巢蛋白在神经干细胞中特异性表达，因此在巢蛋白启动子控制下的标记基因允许快速筛选和鉴定诱导的重编程的神经干细胞。此后，筛选这些细胞以鉴定表现所需表型的细胞(即神经球)。选择和收获大于20μm、优选地大于50μm的神经球用于进一步扩增。
在本发明的另一个方面，提供了通过前述方法中任一种产生的神经干细胞群体。优选地，这个神经干细胞群体是患者特异的，即源自从患病个体获得的体细胞。在另一个实施方案中，所述干细胞群体从健康个体获得。所述神经干细胞可以无限扩增。培养是容易和充分表征的。可以重复地冷冻和融化神经干细胞等分试样。源自患者的神经干细胞代表了研究CNS疾病的病理生理学的疾病相关性体外模型。将患者特异的体细胞直接转化为神经干细胞代表了一项产生患者特异的神经干细胞生物样品库的容易获得和重复性技术。因此，在本发明的又一个优选方面，构思了包含患者特异的神经干细胞的生物样本库。在另一个实施方案中，产生了包含从健康个体所获得的不同神经干细胞群体的生物样本库。如本文所用的术语“生物样本库”意指从不同个体或物种取得的生物学样品的文库。标本和相关数据的归档收集物意在用于研究目的，目的在于对付神经疾病，如神经变性疾病，如阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩侧索硬化(ALS/鲁盖瑞氏症)、中风和脊髓损伤，或用于治疗所述神经学疾病。
本发明的另一个方面是由这种方法获得的神经干细胞的用途。在一个优选实施方案中，使用由这种方法获得的神经干细胞作为研究CNS疾病的病理生理学的体外模型。例如，由本发明方法获得的神经干细胞可以用于筛选逆转、抑制或阻止神经学疾病的化合物。另外，它们可以用于筛选逆转、抑制或阻止药品(例如糖尿病药品)的神经副作用的化合物。
优选地，由本文所述的本发明方法获得的神经干细胞源自患病受试者。
在另一个方面，本发明提供一种治疗用组合物，其含有由前述任一种方法产生的细胞或含有前述细胞群体的任一个。优选地，这种治疗用组合物还包含生理相容的溶液，包括例如人工脑脊液或磷酸盐缓冲盐水。所述治疗用组合物可以用来治疗、阻止或稳定神经学疾病，例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或ALS、溶酶体贮积疾病、多发性硬化或脊髓损伤。例如，成纤维细胞、角质形成细胞或脂肪细胞可以通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或从健康个体中获得并且过本发明的方法重编程为神经干细胞。在本发明的一个实施方案中，收获神经干细胞并且将其导入个体中以治疗病状。在另一个实施方案中，神经干细胞在导入个体之前在适于分化成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞的条件下培养并且可以用来替换或辅助患病或受损组织的正常功能。本发明的巨大优点在于它提供来自健康个体的患者特异的人神经细胞或相容性神经干细胞的基本上无限制供应，其中所述健康个体具有适于移植的相同HLA型。细胞疗法中自体和/或相容性细胞的使用提供了相对于使用非自体细胞的优势，所述非自体细胞可能是免疫排斥的对象。相反，自体细胞不可能激发明显的免疫反应。
本发明的另一个实施方案是神经干细胞生物样品库用于治疗神经学疾病的用途。这些生物样品库优选地包含从具有几种HLA型的患者或健康个体所获得的神经干细胞。移植从健康供体获得的细胞至需要用相容性HLA型治疗的个体避免了正常情况下与异源性型细胞移植相关的突出的排斥反应问题。常规地，通过施用免疫抑制剂或抗排斥药物如环孢菌素阻止或减少排斥。然而，这类药物具有明显的不利副作用，例如，免疫抑制、致癌性、肾毒性以及十分昂贵。本发明应当消除或至少大幅减少抗排斥药物如环孢菌素、imulan、FK-506、糖皮质激素和雷帕霉素及其衍生物的需要。
就本发明的治疗方法而言，不意在使施用神经干细胞至哺乳动物限于特定施用模式、给药剂量或频率；本发明构思了全部施用模式，包括足以提供充分阻止或治疗疾病的剂量的肌内、静脉内、关节内、病灶内、皮下或任何其他途径。神经干细胞可以按单剂量或多剂量施用至哺乳动物。当施用多剂量时，剂量可以彼此相隔例如1周、1月、1年或10年。也可以在施用细胞之前、其期间或之后施用一种或多种生长因子、激素、白介素、细胞因子、小分子或其他细胞以进一步使得这些细胞偏向于特定细胞类型。
附图简述：
图1：用于将人成纤维细胞转化为irNSC的方法的示意图。第0日：将人成纤维细胞用胰蛋白酶消化并且使用诱导培养基(含有FGF、EGF30ng/mL；BDNF20ng/mL；法舒地尔10μM，Polybrene4μg/ml的N2B27)，以小体积用基因和巢蛋白GFP报道分子的组合转染。将成纤维细胞以10000-30000个细胞/em2的浓度铺种在正常的组织培养板中。第1日：将培养基更换为新鲜的诱导培养基。GFP/巢蛋白阳性(GFP+)irNSC开始出现，频率非常低(每100000个细胞中约50个irNSCGFP+)。第2日：GFP+irNSC数目增加并且它们开始移动在一起，形成细胞团簇。第3日：细胞团簇以清楚的球体结构组织，所述结构漂起并开始作为GFP+神经球浮动。计数和收获大于20μm的神经球用于进一步扩增。
图2：人巢蛋白GFP报道分子慢病毒的示意图。将荧光蛋白copGFP和Zeocin选择标记克隆于来自人巢蛋白内含子2的与最小CMV启动子连接的1.8kb增强子片段的表达控制下。
图3：在重编程诱导方法的第1日时的irNSC。上半小图：未转化的人胎儿肺成纤维细胞IMR90(相差)。下半小图：irNSCGFP+细胞的产生(相差和GFP通道）。
图4：在重编程诱导方法的第2日时的irNSC。细胞倾向于移行靠在一起并且开始形成带有irNSCGFP+核芯的球体结构(相差和GFP通道)。
图5：在重编程诱导方法的第3日时的irNSC。在第2日形成的球体结构物现在完全成熟，作为漂浮在培养基中的神经球出现。神经球具有直径范围20-100μm的尺度，同时细胞密度高。irNSC由巢蛋白GFP表达标记并且可以是在几乎全部神经球中鉴定到，虽然并非全部神经球均具有相同比例的irNSCGFP+(相差和GFP通道)。
图6：用不同基因组合产生的神经球的数目。
图7：用Sox2-Bmi1转导后附着的神经球。附着的神经球显示伸长双极细胞的特征性形态。下半小图：irNSCGFP+神经球的更高放大率。
图8：EGF和FGF撤除1周后的分化细胞。撤除增生性生长因子时，irNSC产生具有非常细的突出物的细胞，其对于神经元标记物tuj1染色为阳性。
图9：产生用于扩增和表征的irNSC神经球批次。三百六十万个人成纤维细胞IMR90用胰蛋白酶消化并且使用补充有法舒地尔10μM和Polybrene4μg/ml的诱导培养基(具有FGF、EGF30ng/mL；BDNF20ng/mL的N2B27)，以小体积用Sox2、Bmi1、巢蛋白GFP报道分子感染。从第4日至第8日：收获大于50μm的GFP+神经球并且进一步用于扩增。已经使用含有法舒地尔的扩增培养基(具有FGF、EGF30ng/mLBDNF20ng/mL的N2B27)扩增一半神经球并且使用不含法舒地尔的扩增培养基扩增另一半。第15日：在含有法舒地尔的扩增培养基中生长的神经球具有更好的形态和更清晰和鲜明的边界(充分形成的神经球的标志，小图B)；不含法舒地尔时，神经球具有模糊的边界(小图A)。
图10：对irNSC神经球表达NSC标记物Sox2和巢蛋白的免疫细胞化学表征。第15日，用法舒地尔扩增的irNSC神经球已经铺在PO/Lam包被的板上并且在48小时后，针对Sox2和巢蛋白表达进行染色。irNSC神经球附着并且irNSC从球状体扩展开来。irNSC具有常见的NSC形态并且为Sox2和巢蛋白阳性。小图A：合并通道和单通道DAPI、Sox2、巢蛋白；20x放大率；小图B：合并通道DAPI、Sox2、巢蛋白；10x放大率。
图11：比较法舒地尔和Balanol样324化合物刺激产生irNSC神经球的作用。人成纤维细胞IMR90用胰蛋白酶消化并且使用补充有法舒地尔10μM(斜线图)或Balanol样324化合物2μM(黑色图)的诱导培养基(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Polybrene4μg/ml的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))，以小体积用Sox2、Bmi1、巢蛋白GFP报道分子感染。将成纤维细胞以10000-30000个细胞/cm2的浓度铺种在正常的组织培养板中。第1日：将培养基更换为新鲜的诱导培养基。第4日：计数大于50μm的GFP+神经球。Balanol样324小分子化合物增加神经球生成效率大约2倍(1.9倍)并且具有更好的重现性(STDEV，n＝3)。
图12：丙戊酸(VPA)预处理人成纤维细胞改善GFP+irNSC神经球的产量。用Sox2、Bmi1、巢蛋白GFP报道分子感染之前，将人成纤维细胞IMR90在具有或没有HDAC抑制剂丙戊酸(2-丙基-戊酸，单钠盐)(1mM)的情况下预处理48小时。诱导培养基(具有FGF、EGFBDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Balanol样3242μM的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))。第7日：计数大于50μm的神经球(小图A)并且报告每个神经球的GFP+irNSC平均数(小图B)。用VPA预处理产生的irNSC神经球的代表性画面(小图C)。VPA预处理在第7日没有显著影响神经球数目；不过VPA处理增加GFP+irNSC数目(2.1倍)(STDEV，n＝3)。
图13：限定与Sox2和Bmi1组合用于高效诱导irNSC神经球的最少基因汇集物。用Sox2、Bmi1、巢蛋白GFP报道分子外加不同候选基因感染以解决其协同作用之前，将人成纤维细胞IMR90用VPA(1mM)预处理48小时。诱导培养基：具有FGF、EGFBDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Balanol样324化合物2μM的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies)。在第7日对大于50μm的irNSC神经球定量。Mash1、Emx2、Foxg1、Pax6和Sox11与Bmi1和Sox2协同以产生irNSC神经球。
图14：从成年人皮肤成纤维细胞(HDFa)产生irNSC神经球。成年人皮肤成纤维细胞由GIBCO提供(目录号：C-013-5C)。成年人皮肤成纤维细胞用胰蛋白酶消化并且使用补充有法舒地尔10μM的诱导培养基(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))，以小体积用Sox2、Bmi1、巢蛋白GFP报道分子感染。第8日：检测到irNSC神经球(代表性画面2.5X和10X放大率)。
图15：使用抗坏血酸、音猬因子(Shh)、Jagged1、DLL4和FGF8的组合扩增irNSC神经球以获得irNSCGFP+的单层培养物。人成纤维细胞IMR90使用诱导培养基(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Balanol样3242μM的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))，用Sox2、Bmi1、Mash1和巢蛋白GFP报道分子感染。第7日：将大于50μm的神经球收获并且进一步用含有扩增培养基(NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies)，其具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Balanol样3242μM；抗坏血酸0.2mM、SHH(重组人音猬因子，目录号：1845SH)500ng/mL、FGF8(重组人FGF8a同工型，目录号：4745F8)100ng/mL、DLL4(重组人DLL4，目录号：1506D4)500ng/mL、Jagged1(重组人Jagged1Fc嵌合体，目录号：1277JG)500ng/mL、来自hESC源NSC的条件培养基1/10，所述NSC在具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies)中培养2日(Human，StemCellsTechnologies))扩增。在第14日用上文报告的扩增培养基扩增的irNSC神经球的代表性画面(小图A)。神经球具有定义的边界，并且可以观察到来自神经球的脊状突出物(小图B，放大)。在第21日，将扩增的irNSC神经球分离并且铺在上PO/Lam包被的板上，以获得irNSCGFP+的均匀单层培养物(小图C，在单层上培养4日后irNSC单层的相差和GFP通道)。
图16：对irNSC神经球表达NSC标记物巢蛋白和早期神经元标记物Tuj1的免疫细胞化学表征。第21日，将如图15中所述那样产生的irNSC神经球分离并且在NSC自我更新条件下铺种(具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))以检验巢蛋白标记物的表达(48小时候小图A，全部细胞均为巢蛋白+和Tuj1-)或在分化条件下铺种(具有BDNF20ng/mL的NS-A分化试剂盒(Human，StemCellsTechnologies))，并且在第7日对Tuj1和巢蛋白染色(小图B，全部细胞均为Tuj1+并且少数细胞是巢蛋白+)。
实施例
这种方法可以通过参考本文中图1来显示，图1描述本发明的方法用于将人成纤维细胞转化为神经干细胞(NSC)。在这种方法中，将人成纤维细胞在第0日用胰蛋白酶消化，计数并且测定它们的生存力。将1.0x105-3.0x105个之间胰蛋白酶消化的成纤维细胞随后重悬于诱导培养基中并且将基因的组合作为慢病毒递送。在诱导培养基中，添加Polybrene(溴化己二甲胺)以增加慢病毒转导的效率。感染在微量离心管中进行15分钟。与基因组合时，使用人巢蛋白GFP报道分子。巢蛋白是NSC中特异性表达的熟知标记物。在巢蛋白报道分子中，荧光蛋白GFP在人巢蛋白启动子控制下表达(图2)，因此这允许轻易筛选诱导的重编程的神经干细胞(irNSC)GFP+。
使用适宜的诱导培养基体积中的10000-30000个细胞/cm2浓度，将感染的细胞铺在组织培养板中。在第1日，更新全部诱导培养基。可能鉴定到与人成纤维细胞相比形态清楚变化的一些irNSCGFP+(图3)。irNSCGFP+获得双极和伸长的形态，具有NSC常见的更稠密细胞质。另外，irNSC在压紧的单层培养物中生长，所述压紧的单层培养物与常规NSC培养物中所获得的用于激活促增殖性Notch途径信号的常见细胞-细胞相互作用相似。在第2日，irNSCGFP+处于更成熟的状态并且开始形成十分压紧的细胞团簇。这些irNSC团簇开始形成具有致密核芯的球体结构，所述致密核芯含有irNSCGFP+(图4)。在第3日，球体结构完全形成并且开始从组织培养板脱落，作为神经球漂浮在培养基中。神经球具有大约20-100μm尺度，具有清晰边界和其中可能鉴定到irNSCGFP+的高密度细胞核芯(图5)。
为实现创新性突破，需要使用基因的特定组合。参与体内和体外维持NSC特性的以下基因名单取自文献知识：Sox2(Sox转录因子和NSC的重要标记物)、Brn2(已知与Sox蛋白结合的POU结构域蛋白。据报道Sox2和Brn2结合在巢蛋白启动子上。Brn2KO小鼠具有受损的CNS发育)、Bmi1(参与调节细胞周期的蛋白质，据报道增加细胞周期蛋白E/cdk2复合物的p21和p27抑制物的表达。细胞周期蛋白E/cdk2抑制作用决定成视网膜细胞瘤蛋白对细胞周期的控制丧失，这导致在NSC的自我更新状态期间快速的细胞周期)、Mash1(据称是神经前体细胞体内增殖的重要调节物)、Sox11(据报道在体内于SGZ中表达的Sox蛋白)、NCam(流式细胞术中的NSC标记物并且在CNS的不同区域中表达)、Kpna1(作为输入蛋白α5更知名，所述输入蛋白α5与输入蛋白β一起在外胚层来源的组织中负责蛋白质的核输入)。
全部基因均作为cDNA克隆至慢病毒质粒中并且随后包装入慢病毒中。将慢病毒包装的Sox2、Bmi1、Mash1、Sox11、NCam、Kpna1、巢蛋白GFP报道分子的粒子直接转导至人成纤维细胞中。在上文描述方法中测试不同的基因组合。在第3日，可能通过计数产生的神经球评价产生irNSC成功与否。仅考虑大于50μm的神经球。
如图6中所代表，转导巢蛋白报道分子慢病毒而不向诱导培养基添加法舒地尔没有使人成纤维细胞重编程为irNSC。将法舒地尔添加至诱导培养基，报告产生神经球(约50μm)和一些更小的神经球(约20μm，未计数)。
采用我们的创造性方法产生的神经球利用以下基因组合：将Sox2-Bmi1在第3日收获并且另外扩增14日。irNSCs神经球的扩增是关键步骤。使用补充有FGF、EGF、BDNF的N2B27培养基在特定的超低非贴壁板(Corning)中培养神经球。为了实现均匀的irNSCGFP+神经球群体，每2-3日采用清洁过程。在14日扩增期间，具有低密度irNSCGFP+的一些神经球不能够恰当地增殖，最有可能归因于被未转化的成纤维细胞污染。这类污染的神经球裂解成需要除去的单细胞。在第14日，测试神经球在聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板上附着和产生神经元样细胞。对于附着，将20-40个神经球/cm2铺种在聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板上的扩增培养基中，其中所述扩增培养基仅第1日补充10μM法舒地尔，以便改善改善细胞附着和展开。在第1日，培养物可能显示神经球的附着和展开(图7)。在展开的神经球的中心，我们鉴定到具有常见NSC形态的irNSCGFP+。将神经球培育额外3日，并且随后仅将BDNF添加至N2B27(神经元分化条件)。在EGF和FGF撤除后，irNSC改变形态。它们变得更拉伸并且开始形成神经突样细胞突出物。在分化条件的第7日，将细胞固定并且对神经元标记物tuj1染色(图8)。
在法舒地尔存在下扩增的神经球具有更好的形态以及清晰和鲜明的边界(充分形成的神经球的标志物，图9，小图B)；在法舒地尔不存在下，神经球具有模糊的边界(图9，小图A)。irNSC具有常见的NSC形态并且为Sox2和巢蛋白阳性(图10)。
图11显示Rock激酶抑制剂Balanol样324化合物增加GFP+神经球的产率。
这些证据显示，这种方法能够基于基因转导(最佳组合：Sox2-Bmi1、Sox2-Bmi1-Mash1、Sox2-Bmi1-Sox11、Sox2-Bmi1-Emx2、Sox2-Bmi1-Foxg1和Sox2-Bmi1-Pax6，也参见图13)和化学上定义的培养基诱导的关联步骤，将人成纤维细胞转化为irNSC。
为了增加irNSC的产率，将人成纤维细胞用或者不用HDAC抑制剂丙戊酸(VPA，2-丙基-戊酸，单钠盐)预处理。处理快结束时，将人成纤维细胞在感染之前于补充有FBS10％和L-谷氨酰胺的DMEM/F12中孵育，其中补充有1mMVPA(图12)。
图14显示从成年人皮肤成纤维细胞(HDFa)中产生irNSC神经球。
图15显示使用抗坏血酸、音猬因子(Shh)、Jagged1、DLL4和FGF8的组合扩增irNSC神经球。图16显示对irNSC神经球表达NSC标记物巢蛋白和早期神经元标记物Tuj1的免疫细胞化学表征。
材料和方法
细胞培养物：
诱导培养基：N2B27(N2B27是补充有N2和B27(二者均来自Gibco)的DMEM/F12(Gibco，Paisley，UK)的1∶1混合物，其补充有人EGF(Peprotech)30ng/mL、人FGF230ng/mL(Peprotech)、人BDNF(Roche)20ng/mL和法舒地尔(Calbiochem)10μM或Balanol样324化合物(N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3，5-二甲基-苯甲酰胺)2μM。
扩增培养基：补充有人EGF(Peprotech)30ng/mL、人FGF230ng/mL(Peprotech)、人BDNF(Roche)20ng/mL的N2B27，或
具有FGF、EGF、BDNF20ng/mL；肝素2μg/ml；Balanol样3242μM；抗坏血酸0.2mM、SHH(重组人音猬因子，目录号：1845SH)500ng/mL、FGF8(重组人FGF8a同工型，目录号：4745F8)100ng/ml、DLL4(重组人DLL4，目录号：1506D4)500ng/mL、Jagged1(重组人Jagged1Fc嵌合体，目录号：1277JG)500ng/mL的NS-A增殖试剂盒(Human，StemCellsTechnologies)。
分化培养基：补充有人BDNF(Roche)20ng/mL、层粘连蛋白2μg/ml(Invitrogen)的N2B27。
人成纤维细胞：IMR90胎儿肺成纤维细胞(ATCC批号580229699)或成年人皮肤成纤维细胞(GIBCO，目录号：C-013-5C)。
慢病毒：预包装的即用型慢病毒粒子从Sigma(StemgentReprogrammingLentivirushumanSox2，目录号ST070012)、Genecopeia(人Bmi1Lentifect慢病毒粒子，目录号LP-B0015-Lv105；Sox11Lentifect慢病毒粒子，目录号LP-MO425-LV105；Mash1Lentifect慢病毒粒子，目录号LP-Z0740-LV105；人Kpna1Lentifect慢病毒粒子，目录号LP-U1286-Lv105；NCamlLentifect慢病毒粒子，目录号LP-Z2645-Lv105)和SBISystemsBiosciences(巢蛋白GFP报道分子：pGreenZeoTM-hNestin转录的报道分子病毒，SR10035VA-1)获得。
滴度：巢蛋白GFP1.45＊105/μl、BMI14.3＊105/μl、Sox21.07＊104/μl、Sox113.2＊106/μl、Mash14.7＊106/μl、NCam3.3＊104/μl、Kpna11.8＊105/μl。
操作方案：
1.irNSCs的产生：
-在具有300μl诱导培养基(其含有polybrene(溴化己二甲胺，Sigma)4μg/ml)的微量离心中，针对不同的基因组合(感染复数(M.O.I.)，每个单一慢病毒使用30)和报道分子巢蛋白GFP慢病毒(M.O.I，使用10)，将200,000个IMR90人成纤维细胞以慢病毒感染。
-在室温孵育15分钟。
-在处理的6孔组织培养板中的一个孔内，在1.7ml诱导培养基中接种300μl
-第1日，更新2ml诱导培养基/每孔
-第3日，收获神经球，小心地收集具有漂浮球状体的2ml
-扩增神经球
2.神经球的扩增：
-从6孔板的3个孔中收集具有漂浮神经球的培养基于15ml管内
-使球状体沉降10分钟
-十分小心地移除上清液(单细胞将不沉降并且随上清液一起吸出)
-在4ml终体积扩增培养基中重悬球状体
-接种在超低贴壁性B6板(Corning)中
-孵育2-3日
-每2-3日重复扩增流程直至与产生irNSC相距14日
3.分化神经球：
-第14日irNSC的产生和在扩增流程后，在立体显微镜下选择具有清晰边界和富含irNSCGFP+的圆形神经球
-使用扩增培养基在事先用聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的24孔板中铺种40个球状体，同时添加法舒地尔10μM或Balanol样324化合物2μM。
-次日，更新为不含法舒地尔/Balanol样324化合物2μM的扩增培养基。
-孵育3日
-移除扩增培养基并添加分化培养基
-在3-4日后更新分化培养基
-孵育3-4日
-用PFA4％固定细胞并且进行免疫染色
irNSC神经球染色操作方案：在第15日用以下抗体将神经球染色用于表征：小鼠抗巢蛋白和兔抗Sox2O/N和随后第二抗小鼠488和抗兔555，持续1小时。
第一抗体：
单克隆小鼠抗巢蛋白，1/500稀释(MAB5326Millipore)
多克隆兔抗Sox2，1/500稀释(AB5603MIMillipore)
第二抗体：
Alexafluor488，IgG，1/1000稀释，山羊抗小鼠(A11029Invitrogen)
Alexafluor555，IgG1/1000稀释，山羊抗兔(A21429Invitrogen)

Claims (8)

1.一种产生神经干细胞(NCS)的方法，包括：
a)提供在化学上定义的培养基中的哺乳动物成纤维细胞，
b)通过导入基因的组合将所述成纤维细胞重编程为NSC，其中所述基因的组合选自Sox11和Mash1；Bmi1和Sox2；Mash1,Bmi1和Sox2；Sox11,Mash1和Sox2；Sox11,Mash1,Bmi1和Sox2；Sox11,Mash1,Ncam和Kpna1；Bmi1,Sox2,Ncam和Kpna1；Sox11,Bmi1和Sox2；Bmi1,Sox2和Brn2；Bmi1,Sox2和Gli3；Bmi1,Sox2和Pax6；Bmi1,Sox2和Foxg1；Bmi1,Sox2和Hes1；Bmi1,Sox2和Ncam；Bmi1,Sox2和Otx2；Bmi1,Sox2和Olig2；Bmi1,Sox2和Klf5；和
c)用生长因子和ROCK抑制剂诱导重编程，其中所述生长因子选自FGF2、EGF和BDNF。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括
d)在适于NSC增殖的条件下孵育步骤b)和c)的产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)的成纤维细胞是人的成纤维细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中化学上定义的培养基是补充有胰岛素、转铁蛋白和孕酮的无血清培养基。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组合由Bmi1、Sox2和Mash1组成。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中ROCK抑制剂选自1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺、(+)-(R)-反-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐和N-{(3R,4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基)-苯甲酰氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3,5-二甲基-苯甲酰胺。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述成纤维细胞用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂预处理。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因的组合通过慢病毒递送至所述成纤维细胞。
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