PL223189B1

PL223189B1 - Komórka iNS oraz sposób reprogramowania komórek somatycznych za pomocą czynnika Sox2 oraz Sox2 i c-Myc do komórki iNS

Info

Publication number: PL223189B1
Application number: PL401633A
Authority: PL
Inventors: Piotr Rieske; Ewelina Stoczyńska-Fidelus; Sylwester Piaskowski; Dawid Grzela
Original assignee: Celther Polska Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EP2733202B1; PL401633A1; EP2733202A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest komórka iNS otrzymana w wyniku jednoczynnikowego reprogramowania, charakteryzująca się obecnością markerów Sox2, nestyny (markerów neuralnych komórek macierzystych) i GFAP (kwaśne włókienkowe białko glejowe, glial fibrillary acidic protein), jak też procedura otrzymywania z tych komórek pochodnych charakteryzujących się markerami MAP2+ i beta III + (markerów komórek neuronalnych).

Przedmiotem wynalazku jest również sposób reprogramowania komórek somatycznych (np. fibroblastów, keratynocytów) do komórek iNS za pomocą jednego czynnika re próg ramującego Sox2, lub dwóch czynników: Sox2 i c-Myc.

Wynalazek opisuje reprogramowa nie komórki somatycznej. W odróżnieniu od dotychczasowych metod, odróżnicowanie komórek zostanie wykonane nie do stadium iPS (indukowane pluripotentne komórki macierzyste), a do komórek iNS (neuralnej komórki macierzystej) charakteryzujących się obecnością markerów (Sox2, GFAP i nestyny). Takie rozwiązanie jest korzystniejsze ze względu na mniejsze ryzyko transformacji nowotworowej, jak i z powodu łatwiejszego różnicowania komórek iNS do komórek nerwowych, niż ma to miejsce w przypadku komórek iPS. Skupienie się na otrzym ywaniu komórek o profilu bardziej zbliżonym do docelowo wymaganych, pozwala na uzyskanie większej wydajności procesu reprogramowania jak i późniejszego różnicowania za pomocą czynników różnicujących (np. bFGF) do komórek charakteryzujących się obecnością markerów MAP2+ i beta III +. Bariery jakie zostały pokonane to możliwość otrzymanie konkretnego rodzaju komórek multipotentnych a nie pluripotentnych. Komórki multipotentne nie mogą doprowadzić do pojawienia się potworniaków (teratom). Sox2 i MYC były dotychczas wykorzystane wraz z KLF4 i OCT4, ale w zestawie który doprowadza do zupełnie innego celu niż proponowany w tym zgłoszeniu. Do tej pory nikt nie zauważył, że usunięcie dwóch z nich umożliwi otrzymanie konkretnego rodzaju komórek multipotentnych.

Od wielu lat naukowcy pracują nad możliwością regenerowania lub odtwarzania uszkodzonych komórek oraz tkanek. Możliwości takie dają np.: komórki macierzyste (ES) pochodzące z embrionów co niesie za sobą ogromne problemy etyczne i moralne. Obciążenie tego typu nie jest związane z zastosowaniem indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPS). W przeciwieństwie do ES, iPS nie wywodzą się z zarodków, a z komórek somatycznych, re próg ramowanych z użyciem odpowiednich technik („cofniętych” do stanu pluripotencji, gdy komórki mają zdolność różnicowania w różne typy komórek). Pierwsze tego typu czynności wykonane zostały w 2007 roku w Japonii [Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al.: Induction ot pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors., Cell 2007; 131: 861-72]. Naukowcy ci wykorzystali zestaw genów (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc - „OSKM”), który został wprowadzony podczas transdukcji wirusowej do genomu k omórki somatycznej. Równocześnie, podobny eksperyment został przeprowadzony w laboratorium Thompsona z tym, że w tym przypadku wykorzystano inny zestaw genów OCT4, Sox2, NANOG and LIN28 (OSNL) [Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al.: Induced pluripotet stem cell lines derived from human somatic cells; Science 2007; 318: 1971-20]. W ciągu kilku kolejnych lat rozwijano tę technikę starając się zwiększyć wydajność reakcji, jak też zmniejszyć ryzyko wystąpienia transformacji nowotworowej indukowanych w ten sposób komórek (pierwotnie wykorzystywano niebezpieczne o nkogeny c-Myc) [Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblast. Nat Biotechnol 2008; 26: 101 -6; Wernig M, Meissner A, Cassady JP, et al. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2008; 2: 10-12]. Jednak usunięcie z zestawu genów genu c-Myc spowodowało znaczne, 100-krotne zmniejszenie efektywności procesu, zastosowanie kwasu walproinowego - inhibitora deacetylazy histonów jak i inhibitora metylotransferaz pozwoliło na ponowne zwiększenie jego efektywności. Pozwoliło to również na zmniejszenie liczby wykorzystywanych do reprogramowania czynników do OCT4 i Sox2 [Huangfu K, Maehr R, Guo W, et al.: Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol 2008; 26: 795-7].

Pomimo eliminacji niebezpiecznych czynników ryzyko transformacji nowotworowej jest duże ponieważ, podczas transdukcji retrowirusowych wprowadzane geny wbudowują się w genom w sposób nieprzypadkowy i mogą w ten sposób powodować aktywacje lub inaktywacje ważnych dla prawidłowego funkcjonowania komórki genów co może doprowadzić do zaburzeń w jej funkcjonowaniu, a co za tym idzie do transformacji nowotworowej. Ryzyko transformacji nowotworowej wynika z faktu, że wektory mające elementy wspólne z genomem gospodarza mogą prowadzić do mutagenezy insercyjnej.

PL 223 189 B1

W celu zmniejszenia ryzyka tego zjawiska próbowano stosować kasety zawierające wszystkie niezbędne do reprogramowania czynniki. Pozwalało to na zmniejszenie ilości miejsc, w których wektory wirusowe ingerowały się w genom komórki [Sommer C, Stadtfeld M, Murphy G, Hochedlinger K, Kotton DN, Mostoslavsky G.: Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette; Stem Cell 2009; 27: 543-9; Carey BW, Markoulaki S, Hanna J, Saha K, Gao Q, Mitalipova M. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 157-62],

Aby zupełnie wyeliminować ryzyko uszkodzeń w materiale genetycznym gospodarza stosowano wektory adenowirusowe (nie integrujące w genom gospodarza) [Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K.: Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2008; 322: 945-9], wektory lentivirusowe, które były inaktywowane po okresie dwóch tygodni od wprowadzenia do komórki (czasie niezbędnym do zajścia reprogramowania) [Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, Utikal J, Cowan C, Hochedlinger K. High-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 3: 3405] lub transfekcje za pomocą plazmidowego DNA [Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S.: Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008; 322: 949-53].

W ostatnim czasie rozwijane są próby reprogamowania za pomocą metod eliminujących konieczności stosowania molekuł DNA. Wykorzystywane są ekstrakty zawierające białka opisywanych wyżej czynników transkrypcyjnych, jak też drobnocząsteczkowe związki chemiczne (kwas walproinowy, BIX-01294 oraz inhibitor TGF-beta [Shi Y, Do JT, Desponts C, Hahm HS, Scholer HR, Ding S. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 525-8.; Ichida JK, Blanchard J, Lam K, et al. A small-molecule inhibitor of Tgf-beta signaling replaces Sox2 in reprogramming. Cell Stem Cell 2009; 5: 491-503]).

Innym dającym możliwość bezpiecznego stosowania systemem są transpozony, autonomiczne elementy genetyczne posiadające zdolność przemieszczania się w obrębie genomu komórki, w procesie rekombinacji niehomologicznej zwanej transpozycją. Transpozony dzielą się na dwie grupy: (1) retrotranspozony, których mobilizacja zachodzi za pośrednictwem RNA, oraz (2) DNA-transpozony, u których przemieszczeniu ulega segment DNA ograniczony terminalnymi powtórzeniami transpozonu. W procesie translokacji elementów drugiej grupy, transpozon zostaje wycięty z jednego miejsca („donor locus” - genomowy lub plazmidowy DNA) a następnie zintegrowany w inną pozycję w genomie komórki, dzięki enzymatycznej aktywności transpozazy.

DNA-transpozony posiadają szereg cech, które czynią z nich użyteczne narzędzie stosowane w biotechnologii, inżynierii genomowej, oraz w transgenezie.

Transpozony są wydajnym wektorem służącym do wprowadzania żądanego fragmentu DNA do genomu komórki. Enzymatyczny komponent systemu transpozonowego - transpozaza wykazuje aktywność in trans wobec dowolnego segmentu DNA umieszczonego pomiędzy odwróconymi powtórzeniami terminalnymi (ITRs) transpozonu. Rozmiar takiego segmentu może sięgać do kilkudziesięciu tysięcy par zasad (~70 kbp w przypadku transpozonu piggyBac), co przewyższa pojemność innych systemów transferu DNA.

Transpozony stanowią bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów wirusowych w aplikacjach terapeutycznych. W porównaniu z wektorami adenowirusowymi, nie wywołują one odpowiedzi układu immunologicznego. W odróżnieniu od gamma-retrowirusów, u których opisano silną preferencję do miejsc regulatorowych genów, większość DNA-transpozonów charakteryzuje się przypadkowym profilem integracji genomowej, co zmniejsza ryzyko niepożądanej insercji prowadzącej do aktywacji onk ogenu [VandenDriessche T, Ivies Z, Izsvak Z, Chuah MK.: Emerging potential ot transposons for gene therapy and generation of induced pluripotent stem cells. Blood., 2009;114(8): 1461-8].

Wspólnym mankamentem rozwiązań opierających się o metody nie wykorzystujące integracji wirusowej jest bardzo niska efektywność reprogramowania, na poziomie 0,0001 -0,1% [Xiaogang Zhang, Alejandro De Los Angeles and Jinqiu Zhang: The Art of Human Induced Pluripotent Stem Cells: The Past, the Present and the Future. The Open Stem Cell Journal, 2010, 2, 2-7].

W procesach reprogramowania opisanych powyżej otrzymuje się komórki o niskim stopniu zróżnicowania, które w kolejnych etapach za pomocą różnego rodzaju czynników należy zróżnicować do pożądanych komórek. Komórki te mogą się różnicować w sposób niekontrolowany do różnych komórek pochodnych, zmniejszając w ten sposób efektywność całego procesu jak i powodując, że po podaniu ich pacjentowi mogą one migrować do wielu miejsc powodując nieprzewidywalne skutki.

PL 223 189 B1

W procedurze według wynalazku stosuje się unikalne rozwiązania w znaczący sposób usprawniające otrzymywanie pożądanych komórek. Polegają one na zastosowaniu jednego lub dwóch czynników transkrypcyjnych - Sox2 oraz Sox2 i c-Myc. Pozwala to na otrzymanie komórek na innym niż iPS stopniu odróżnicowania. Komórki powstałe w wyniku opisywanej procedury to iNS ( indukowane neuralne komórki macierzyste). Zastosowanie jednego czynnika transkrypcyjnego lub tylko dwóch, podobnie jak stosowanie kaset reprogramujących istotnie zmniejsza liczbę miejsc ingerencji w genom gospodarza. Dodatkowo komórki nie są modyfikowane w bardzo dużym zakresie, a jedynie w taki sposób aby odpowiadały neuralnym komórkom macierzystym. Powoduje to, iż ryzyko transformacji nowotworowej jest niskie natomiast zastosowanie metody z wykorzystaniem wektorów integrujących pozwala na uzyskanie wysokiej efektywności procesu reprogramowania.

W literaturze fachowej znajdują się opisy procedur reprogramowania za pomocą kilku czynników jednocześnie. Tworzy się wręcz kompletne zestawy czynników i otrzymuje za ich pomocą komó rki iPS. Technologia będąca przedmiotem wynalazku jest unikalna ze względu na to, że komórka reprogramowa na jest za pomocą jednego czynnika (Sox2), lub co najwyżej dwóch (Sox2 i c-Myc), a odróżnicowanie (reprogra mowa nie) komórki nie powoduje jej zmiany w komórkę i PS, a jedynie do formy o mniejszym potencjale różnicowania - iNS (z komórki i PS mogą powstawać praktycznie wszystkie komórki organizmu człowieka natomiast z iNS tylko komórki glejowe i neurony, i neurony). Dodatkowym niezmiernie ważnym aspektem wynikającym ze sposobu według wynalazku jest to, że komórki iNS charakteryzują się znacznie mniejszą niż iPS skłonnością do transformacji nowotworowej, co w znacznym stopniu umożliwia ich zastosowania terapeutyczne. Podobnie jak komórki iPS, komórki iNS muszą być różnicowane do pożądanego stadium. W znanych sposobach uzyskuje się to za pomocą różnego rodzaju czynników. Przewaga nowej technologii polega na tym, że od różnicowa nie jest tak głębokie jak w przypadku iPS. Nie zachodzi potrzeba stosowania tylu, i w tak dużych stężeniach substancji prowadzących do ich zróżnicowania do pożądanej komórki. Z komórek iNS można uzyskać tylko dwa opisane rodzaje komórek (glejowe i neurony), ale ich zastosowanie ze względu na mniejszą skłonność do transformacji nowotworowej pozwala na ich szersze wykorzystanie.

Użycie jednego czynnika w procedurach związanych z reprogramowaniem do tej pory pojawia się tylko raz w literaturze i nie dotyczy procedury reprogramowania jak w przypadku wynalazku, ale procedury różnicowania komórek. Naukowcy izolują z organizmu pacjenta mezenchymalne komórki macierzyste (czyli w uproszczeniu pomijają reprogramowa nie, ich zdaniem pobierają komórki, którymi zastępują iPS uzyskane z klasycznego reprogramowania) i różnicują je do komórek neuralnych za pomocą wprowadzenia czynnika Nanog. A zatem, o ile użyty zostaje jeden czynnik, to do zupełnie innego celu [Angel Alvarez, Monowar Hossain, Elise Dantuma, Stephanie Merchant, Kiminobu Sugaya: Nanog overexpression allows Human Mesenchymal Stem Cells to Differentiate into Neural Cells, Neuroscience & Medicine, 2010, 1, 1-13doi:10.4236/nm.2010.11001]. Nie ma natomiast żadnych informacji na temat zastosowania zestawienia czynników Sox2 i c-Myc.

Istotą wynalazku jest neutralna komórka macierzysta (iNS) charakteryzująca się ekspresją markerów Sox2, GFAP i nestyny.

Istotę stanowi również sposób reprogramowania komórek somatycznych charakteryzujący tym, że wykorzystuje się z jeden czynnik reprogramujący. Korzystnie czynnikiem reprogramującym jest kompletna sekwencja kodująca białko Sox2.

Korzystnie, w wyniku procesu reprogramowania komórek somatycznych z jednym czynnikiem reprogramującym powstaje komórka iNS charakteryzująca się obecnością markerów Sox2, nestyny (markerów neuralnych komórek macierzystych) i GFAP (kwaśne włókienkowe białko glejowe, glial fibrillary acidic protein).

Korzystnie, przeciętna wydajność dla reprogramowania z wykorzystaniem jednego czynnika reprogramującego - Sox2 wynosi 0,01%.

Korzystnie, komórki Sox2, GFAP i nestyno pozytywne zdolne są do różnicowania się do komórek chrakteryzujących się obecnością markerów MAP2+ i beta III + w trakcie hodowli z następującym czynnikiem różnicującymi, bFGF w podłożu NBM, DMEM F-12.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób reprogramowania komórek somatycznych charakteryzujący się tym, że wykorzystuje się z dwa czynniki reprogramujące.

Korzystnie, czynnikami reprogramującymi są kompletne sekwencje kodujące białka Sox2 i c-Myc.

Reprogramowanie z samym Sox2 związane jest z trudnościami w stabilizacji komórek Sox2. Jest to proces trudny w standaryzacji. W skrajnych przypadkach kończący się całkowitym niepowodzeniem.

Warunki reprogramowania z samym Sox2 są małopowtarzalne.

PL 223 189 B1

Korzystnie, w wyniku procesu reprogramowania z dwoma czynnikami reprogramującymi powstaje komórka iNS charakteryzująca się obecnością markerów Sox2, nestyny (markerów neuralnych komórek macierzystych) i GFAP (kwaśne włókienkowe białko glejowe, glial fibrillary acidic protein). Korzystnie, przeciętna wydajność dla reprogramowania z wykorzystaniem dwóch czynników reprogramujących Sox2 i c-Myc wynosi 0,1%. Proces reprogramowania jest powtarzalny.

Komórki iNS otrzymane metodą według wynalazku charakteryzują się łatwiejszym i skuteczniejszym efektem różnicowania do komórek docelowych niż komórki iPS.

Komórki iNS otrzymane metodą według wynalazku charakteryzują się również brakiem zdolności do wywoływania teratom.

Po reprogramowaniu za pomocą Sox2 obserwowano ekspresję Sox2, Nestyny i GFAP ale liczba kolonii była bardzo niska- wydajność około 0,01%. Dodanie czynnika c-Myc do procedury reprogramowania nieoczekiwanie pozwala na uzyskanie dziesięciokrotnie wyższej wydajności reprogramowania nawet w stosunku do metody z zastosowaniem jednego czynnika Sox2 a komórki iNS łatwiej ulegały stabilizacji. Powstałe w ten sposób komórki charakteryzują się właściwościami iNS czyli nie wywołują teratom.

Wynalazek jest zilustrowany przez następujące przykłady i odpowiedni rysunek, na którym: fig. 1 przedstawia komórkę wykazującą jądrową ekspresję Sox2 i GFAP (widoczna jest ona po lewej stronie), fig. 2 przedstawia komórkę (która jest widoczna po prawej stronie fotografii) bez jądrowej ekspr esji Sox2 (widoczny jest sygnał jądrowy w postaci DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindolj), komórka po prawej stronie jest GFAP-negatywna, fig. 3 na którym uwidoczniono (w dolnej części fotografii i na powiększeniu) komórkę Sox2 - pozytywną, która wykazuje również ekspresję nestyny. Obecność tych dwóch białek świadczy o obecności nerwowych komórek macierzystych, fig. 4 na którym uwidoczniono ekspresję Sox2 w komórkach reprogramowanych z c-MYC i Sox2 oraz fig. 5 na którym uwidoczniono 5 ekspresję MAP2 w kolonii re próg ramowanej z dwoma czynnikami Sox2 i c-MYC.

Przykłady zastosowania czynnika Sox2

P r z y k ł a d 1.1

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynnika transkrypcyjnego Sox2, oraz wektora lentiwirusowego.

Wektory lentiwirusowe wyróżniają się relatywnie wysoka pojemnością (~8kbp), chromosomalną, integracja przenoszonego materiału genetycznego oraz długotrwała ekspresja transgenu. W odróżnieniu od retrowirusów, transdukują one również komórki niedzielące się. Do ich wad należy ryzyko mutagenezy insercyjnej.

1. Izolacja komórkowego RNA.

Całkowite komórkowe RNA zostało otrzymane z linii komórkowej AD293 (jedna szalka φ 10 cm, ~5·10⁶ komórek). Izolację RNA przeprowadzono przy pomocy zestawu AxyPrep Midi (AxyGen), według załączonej instrukcji. Stężenie wyizolowanego RNA określono spektrofotometrycznie (NanoPhotometer, Implen), a jego integralność została oceniona przy pomocy elektroforezy na żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny (~500 ng RNA; sprawdzono obecność prążków odpowiadających 18S i 5S rRNA). Otrzymane RNA przechowywano w -80°C.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

Wyizolowany RNA użyto jako matrycy do odwrotnej transkrypcji. Reakcja została przeprowadzona za pomocą odwrotnej transkryptazy M-MuLV (NEB) według dołączonego protokołu, przy zastosowaniu primera oligo-dT (18), hybrydyzującego z sygnałem poliadenylacyjnym mRNA, wykorzystanym jako starter do syntezy komplementarnego DNA (cDNA). Mieszaninę zawierającą 5 pg całkowitego RNA, 500 ng Oligo (dT)₁₈, oraz 1 pl 10 mM dNTPs inkubowano przez 5 min w 65°C w celu eliminacji struktur drugorzędowych, a po ochłodzeniu uzupełniono o bufor reakcyjny, DDT, białkowy inhibitor RNaz (RNase Inhibitor, NEB) oraz 200 jednostek odwrotnej transkryptazy. Mieszaninę reakcyjna inkubowano w 50°C przez 60 min, po czym temperaturę podniesiono do 75°C (15 min), w celu inaktywacji enzymu. Otrzymane cDNA przechowywano w -80°C.

Amplifikacja sekwencji kodującej Sox2.

Komplementarny DNA (cDNA) został wykorzystany jako matryca do amplifikacji sekwencji k odującej czynnika transkrypcyjnego Sox2. Reakcja PCR została przeprowadzona przy pomocy polim erazy DNA o aktywności naprawczej Pfu Ultra II (Stratagene), przy użyciu pary primerów:

PL 223 189 B1

Sox2 Nhel Fwd. 5'-GACT GCTAGC CGCCACC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG GAG CT-3' Sox2 BamHI Rev. 5'-GACT GGATCC TCA CAT GTG TGA GAG GGG CAG TG-3'

Mieszanina reakcyjna zawierająca:

Bufor reakcyjny 10x	5 pl
dNTPs (25 mM każdego dNTP)	0,5 pl
matryca (cDNA z poprzedniego etapu)	1 pl
primer Sox2 Nhel Fwd. (10 pM)	1 pl
primer Sox2 BamFII Rev. (10 pM)	1 pl
polimeraza Pfu II	1 pl
H2O	40,5 pl

została użyta do amplifikacji PCR przy zastosowaniu następującego programu:

1. Denaturacja

2. Denaturacja

Przyłączanie

95°C 1 min 95°C 20-s 55°C 20r cykli

Wydłużanie Końcowa wydłużanie

2.

72°C 30 s 72°C 3 min

Produkt reakcji PCR został rozdzielony na żelu agarozowym, i prążek odpowiadający wielkości pełnej sekwencji kodującej (~960 bp) został wycięty z żelu. DNA zostało wyizolowane przy pomocy zestawu AxyPrep el Extraction (AxyGen), a jego stężenie oznaczone spektrofotometrycznie (NanoPhotometer, Implen).

4. Klonowanie czynnika Sox2 do wektora plRESneo3.

pg plazmidu plRESneo3 (Clontech) oraz lpg produktu PCR zawierającego sekwencję Sox2 zostało poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymami Nhel/BamHI. Następnie, wektorowy DNA został defosforylowany przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB), według załączonej instrukcji. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wielkością pustemu wektorowi oraz insertowi Sox2 zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu. Reakcja ligacji wektora i insertu Sox 2 została przeprowadzona za pomocą Ligazy faga T4 (NEB), przez 16h w 12°C. Do reakcji użyto 50ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został introdukowany do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA, trawieniu restrykcyjnemu enzymami Nhel/BamHI oraz sekwencjonowaniu, w celu potwierdzenia obecności pełnej ORF Sox2 i braku mutacji.

Do sekwencjonowania użyto następujących primerów:

CMV seq primer 5'-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3' hSox2 seq primer #2 5'-TT A CGC GCA CAT GAA CGG CTG G-3'

5. Subklonowanie fragmentu CMV-hSox2-IVS-IREA do wektora lenitiwirusowego pLOC.

pg plazmidu plRESneo3-hSox2 (zawierającego insert) zostało poddane trawieniu restrykcujnemu enzymami Ndel/BfrBI. 2pg wektora pLOC-RFP, kodującego wariant czerwonego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora CMV zostało poddane tawieniu enzymem restrykcyjnym Nhel. Lepkie końce trawionego wektora zostały wypełnione przy użyciu fragmentu Klenowa, w obecności 1 mM dNTPs i bufora reakcyjnego dostawcy enzymu. Reakcja została przerwana po 30 min. Poprzez suplementację EDTA (do stężenia 100 mM) oraz inaktywację termiczną (65°C, 10 min). Następnie DNA zostało oczyszczone przy użyciu zestawu AxyPrep PCR Cleanup (AxyGen) i poddany trawieniu enzymem restrykcyjnym Ndel. DNA trawionego plazmidu zawierającego insert CMV-hSox-IVS-IRES oraz trawionego wektora lentiwirusowego wypełnionego polimerazą Klenowa zostały rozdzielone na żelu agarozowym. Prążki odpowiadające pustemu wektorowi (~8,8 kbp) oraz insertowi (~1,7 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu przy pomocy AxyPrep Gel Extraction (AxyGen). W celu uzyskania kompletnego wektora lentiwirusowego, wyizolowane DNA zostały poddane ligacji. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl ligazy. Reakcję przeprowadzono w 12°C przez 16 h, i produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę, izolacji

PL 223 189 B1

DNA, oraz testowemu trawieniu restrykcyjnemu enzymami Ndel/EcoRI w celu potwierdzenia obecności prawidłowego insertu (fragmenty ~7,3 kbp i 3 kbp).

6. Transfekcja komórek pakujących HEK293T wektorem pLOC-hSox2.

Szalki przeznaczone do utrzymywania komórek pakujących zostały pokryte Poli-L-lizyną (5 ml 0.0005% roztworu przez ~60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki HEK293T w ilości 6·10⁶ na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących HEK293T przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyeth ylenimine, Polysciences). Transfekcję jednej 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 60 pl PEI (1 pg/pl) do 640 pl 150 mM NaCl. W drugiej probówce zmieszano 5 pg wektora pLOC-hSox2 z 10 pg plazmidów pakujących (równe ilości: pTLAl-Pak, pTLAl-Enz, pTLAl-Env, pTLAl-TetOFF, pTLAl-Tat/Rev) i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono na 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek HEK293T. Szalkę przeniesiono do inkubatora na 8-12 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i zastąpiono roztworem DMEM (+glukoza i antybiotyki), ale bez surowicy. Komórki utrzymywano w tych warunkach przez dalsze 40-48 h. W tym okresie oceniono również efektywność transfekcji poprzez ocenę ekspresji fluorescencyjnego reportera.

7. Izolacja lentiwirusów.

W celu izolacji wirusa, zebrano medium hodowlane i żwirowano je (3000 rpm, 10 min, 4°C) dla usunięcia pozostałości martwych komórek. Następnie medium zawierające wirusy przefi Itrowa no (filter 0,45 pm, przemyty uprzednio PBSem) i przeznaczono do ultra wirowa nia. Medium komórkowe wirowano przez 3 h (50000 G, 4°C) lub 18 h (20000 G, 4°C). Po żwirowaniu, supernatant usunięto, a pelet wirusów zawieszono w jałowym PBS (1:300 pierwotnej objętości medium). Tak otrzymane lentiwirusy rozdzielono do 1,5 ml probówek) w ilości 20-50 pl i przechowywano w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w komórkach PIEK293, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano powyżej 40% GFP-pozytywnych infekowanych komórek.

8. Generacja komórek iNS z fibroblastów/deratynocytów przygotowanym lentiwirusem

Komórki fibro blastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzym anymi lentiwirusami. Każda z linii komorkowych została transdukowana wirusem kodującym hSox2. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48h), medium hodowlane zostało wymienione na wspierające reprogra mowa nie w kierunku iNS i komórki zostały poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę S (5 pg/ml) Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek reprogra mowa nych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycyną (feeder layer - warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells-embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

P r z y k ł a d 1.2

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynnika transkrypcyjneąo Sox2 oraz wektora adenowirusowego

Wektory adenowirusowe charakteryzują się wysoką efektywnością transdukcji, szerokim zakresem specyficzności tkankowej, możliwością ekspresji heterologicznego genu o rozmiarze do ~7 kbp, brakiem integracji chromosomalnej i przejściową ekspresją transgenu, oraz możliwością uzyskania wysokiego miana izolowanych wirionów. Infekcja adenowirusowa powoduje jednak silną odpowiedź ze strony układu immunologicznego.

Etapy 1 -4 sq identyczne jak w przykładzie 1:

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

3. Amplifikacja sekwencji kodującej Sox2.

4. Klonowanie czynnika Sox2 do wektora plRESneo3.

5. Mutageneza wektora pShuttle-CMV-LacZ.

Wektor wahadłowy, do którego planowane było wklonowanie insertu zawierającego sekwencję hSox2 został poddany mutagenezie miejscowo-specyficznej, w celu ułatwienia dalszej pracy z DNA.

PL 223 189 B1

Miejsce restrykcyjne Ndel (pozycja cięcia 7745) w wektorze pShuttle-CMV-LacZ zostało poddane modyfikacji polegającej na zamianie dwóch nukleotydów przy użyciu następujących primerów:

pShuttle mut Fwd. 5'-AAT TAA CAT GCA TGG ATC CAT GCG CGG TGT GAA ATA CCG CAC-3' pShuttle mut Rev. 5'-GTG CGG TAT TTC ACA CCG CGC ATG GAT CCA TGC ATG TT A ATT-3' Reakcję wydłużania primerów przeprowadzono przy zastosowaniu polimerazy DNA o aktywności naprawczej Pfull Ultra HS (Stratagene) używając następującego programu mutagenezy:

1. Denaturacja

2. Denaturacja Przyłączanie

95°C 1 min

95°C 5Θ s 60°C 5QTs cykli

68°C min

Wydłużanie

3. końcowa elongacja 68°C 7 min

Produkt reakcji został następnie poddany trawieniu restrykcyjnemu enzymem Dpnl, którego substratem jest zmetylowany plazmidowy DNA pochodzący z bakterii, co pozwala na usunięcie go i pozostawienie niezmetylowanego produktu mutagenezy. Po oczyszczeniu (AxyPrep PCR Cleanup, AxyGen), zmutowany plazmid został transformowany i propagowany w komórkach E. coli. Prawidłowość reakcji mutagenezy została potwierdzona przy użyciu analizy restrykcyjnej enzymem Nd el i analizy elektroforetycznej trawionego DNA.

6. Subkonowanie fragmentu CMV-hSox2-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE do wektora wahadłowego pShuttle.

pg plazmidu pShuttle-CMV-LacZ(mut) zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ndel/Blpl, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 pg plazmidu lentiwirusowego (pLOChSox2) zawierającego fragment CMV-hSox2-tGFP(2A)Blast-WPRE zostało trawione enzymami Ndel/Bsu36l. Następnie, DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki o dpowiadające wektorowi (~7,3 kbp) oraz insertowi (~4,3 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcję ligacji wektora wahadłowego oraz insertu zawierającego sekwencję Sox2 została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16 h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i trawieniu restrykcyjnemu enzymami Xhol/Notl w celu potwierdzenia obecności pełnego insertu (oczekiwane 2 prążki - 10 kbp oraz 1,6 kbp).

7. Rekombinacja homologiczna in vivo wektora wahadłowego pShuttle i adenowirusowego Pa dEasy-1.

Do otrzymania pełnego wektora adenowirusowego zastosowano proces rekombinacji homologicznej pomiędzy plazmidem wahadłowym pShuttle-hSox2 a E1-defektywnym wektorem pAdEasy-1, zawierającym pozostałą część genomu adenowirusowego. Do rekombinacji użyto elektrokompetentnych bakterii E.coli BJ5183-AD-1 (pre-transformowane plazmidem pAdEasy-1 Stratagene) posiadających natywny gen recA. Plazmid pShuttle-hSox2 poddano linearyzacji enzymem restrykcyjnym Pmel, a następnie dodano go do zawiesiny bakterii w ilości ~100 ng.

Elektroporację przeprowadzono przy następujących parametrach: 200 Ω 2,5 kV, 25 pF, po czym, po ~1 h inkubacji w medium SOC w 37°C, komórki przeniesiono na agarowe podłoże selekcyjne z kanamycyną. Następnego dnia wybrano 10 koloni bakteryjnych, z których po ~8 h inkubacji i ekspansji w medium LB z kanamycyną wyizolowano DNA (AxyPrep Plasmid Miniprep, Axygen). Zrekombinowane wektory adenowirusowe zidentyfikowano przy pomocy analizy restrykcyjnej z użyciem enzymu Poci (oczekiwane 2 produkty ~32 kbp oraz 3 kbp).

DNA z pozytywnie zidentyfikowanych kolonii transformowano następnie recA i end1-negatywne chemicznie kompetentne komórki E. coli (Turbo, NEB), z których po propagacji w medium selekcyjnym wyizolowano i oczyszczono plazmid ze zrekombinowanym, kompletnym genomem adenowirusowym (przy użyciu AxyPrep Plasmid Maxiprep, Axygen).

8. Transfekcja komórek pakujących AD-293 i generacja pierwotnych łysinek adenowirusowych.

Szalki przeznaczone do hodowli komórek pakujących zostały pokryte poli-L-lizyną (5 ml 0,0005% roztworu przez ~60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki AD-293 w ilości 6-10⁶ na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących AD-293 przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyethylenimine, Polysciences). Do

PL 223 189 B1 transfekcji użyto DNA kompletnego wektora adenowirusowego zawierającego sekwencję hSox2 zlinearyzowanego przy użyciu enzymu restrykcyjnego Pacl. Transfekcję jednej φ 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 20 pl PEI (1 pg/pl) do 680 pl 150 mM NaCI. W drugiej probówce umieszczono 5 pg zlinearyzowanego wektora i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono do 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek AD-293. Szalkę przeniesiono do inkubatora na 12 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i komórki delikatnie pokryto 3,5 mL 1% niskotopliwej agarozy w medium hodowlanym (uprzednio ogrzanej do temperatury 42°C). Po zakrzepnięciu agarozy szalki uzupełniono 7 mL medium DMEM (z glukozą i antybiotykami). Komórki utrzymywano w inkubatorze, w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Po 5 dniach usunięto płynne medium i naniesiono kolejną warstwę 3,5 mL 1% agarozy w DMEM. Łysinki adenowirusowe powinny być zauważalne po 7-10 dniach od transfekcji.

9. Ekspansja pierwotnych łysinek adenowirusowych w komórkach pakujących AD-293.

Po 10 dniach od transfekcji, łysinki adenowirusowe aspirowano przy użyciu pipety ze sterylną 1 mL końcówką. Łysinki zawieszono w 0,5 mL PBS i w celu uwolnienia adenowirusa poddano czterem cyklom mrożenia-rozmrażania (-80°C-37°C). W celu amplifikacji adenowirusa, 500 pl zawiesiny pierwotnych wirusów dodano do medium butelki hodowlanej Tl 50, w której znajdowały się komórki pakujące AD-293 (w ok ~70% kofluencji). Infekowane komórki utrzymywano w inkubatorze w 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 5-7 dni do momentu zauważalnej lizy komórek. Zebrane medium hodowlane (wraz z komórkami) zostało poddane czterem cyklom mrożenia-rozmrażania (-80°C-37°C) w celu uwolnienia adenowirusa, a następnie żwirowane w 3000 rpm, 4°C, 5 min w celu oddzielenia od pozostałości k omórkowych. Zebrany supernatant (surowy ekstrakt) został użyty do izolacji adenowirusów.

10. Izolacja i oczyszczanie adenowirusów.

Adenowirusy zostały wyizolowana przy użyciu ultrawirowania na gradiencie chlorku cezu. W 50 mL probówce do ultrawirowania zostało umieszczone 2,5 mL roztworu CsCI (5=1,4 g/mL) w TBS. Górną warstwę stanowił roztwór CsCI o gęstości 5=1,25 g/mL. Na gradient CsCI zostało naniesione 5 mL surowego ekstraktu adenowirusowego, które następnie zostało pokryte 2 mm oleju mineralnego, w celu uniknięcia areozolizacji i kontaminacji aparatury wirusem. Tak przygotowane próbki poddano wirowaniu w 35000 rpm, przez 1 h w 15°C. Po żwirowaniu biały prążek na granicy faz gradientu CsCI został pobrany przy użyciu jednorazowej strzykawki zaopatrzonej w igłę 20 G (dolny prążek, górny prążek stanowią białka pustego kapsydu adenowirusowego). Wyizolowany adenowirus został dializowany w 4% roztworze glukozy w PBS, a następnie rozporcjowany w ilości 20-50 μ1 i przechowywany w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w komórkach HEK293T, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano co najmniej 50% GFP-pozytywnych infekowanych komórek.

11. Generacja komórek iNS z fibroblastów/keratynocytów przygotowanym adenowirusem

Podobnie jak w przypadku wektora lentiwirusowego będącego źródłem ekspresji czynnika hSox2, komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzym anymi adenowirusami. Każda z linii komórkowych została transd u kowana wirusem kodującym hSox2. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48 h), medium hodowlane zostało wymienione na wspomagające reprogra mowa nie w kierunku iNS komórki zostały poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę (5 μg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji spec yficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek reprogra mowa nych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycyną (feeder layer - warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells-embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

P r z y k ł a d 1.3

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynnika transkrypcyjnego Sox2 oraz wektora retrowirusowego.

Wektory retrowirusowe, podobnie jak lentiwirusy wyróżniają się wysoką pojemnością (~8 kbp), chromosomalną integracją przenoszonego materiału genetycznego oraz długotrwałą ekspresją transgenu. Nie transdukują jednak komórek niedzielących się. W ich przypadku istnieje ryzyko mutagenezy

PL 223 189 B1 insercyjnej oraz preferencyjna integracja w regionach transkrypcyjnie aktywnych. W odróżnieniu od wektorów lentiwirusowych pseudotypowanych białkiem VSV-G (pantropicznych), w niniejszym protokole użyto plazmidów pakujących ampho- i dualtropicznych, wykorzystujących odmienny mechanizm transdukcji komórkowej (poprzez receptory Ram-1 i GALV)

Etapy 1-4 są identyczne jak w przykładzie 1:

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

3. Amplifikacja sekwencji kodującej Sox 2.

4. Klonowanie czynnika Sox2 do wektora plRESneo3.

5. Subklonowanie fragmentu hSox2-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE do wektora retrowirusowego pFB.

pg plazmidu pFB zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Notl, inkubacji z nukleazq Mung, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 pg plazmidu lentiwirusowego (pLOChSox2) zawierającego fragment hSox2-tGFP(2A)Blast-WPRE zostało trawione enzymami Clal/Bsu36l, inkubacji z nukleazą Mung w celu uzyskania tępych końców i podd ane fosforylacji przy użyciu kinazy faga T4. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wektorowi (~5,3 kbp) oraz insertowi (~3,7 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcję ligacji wektora wahadłowego oraz insertu zawierającego sekwencję Sox2 została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i trawieniu restrykcyjnemu enzymami Bsu36l/BamHI w celu potwierdzenia właściwej orientacji insertu (oczekiwane 2 prążki - 7,2 kbp oraz 1,7 kbp).

6. Transfekcja komórek pakujących HEK293T wektorem pFB-hSox2.

Szalki przeznaczone do utrzymywania komórek pakujących zostały pokryte poli-L-lizyną (5 ml 0,0005% roztworu przez ~60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki HEK293T w ilości 6-10⁶ na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących HEK293T przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyethylenimine, Polysciences). Transfekcję jednej φ 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 40 pl PEI (1 pg/pl) do 660 pl 150 mM NaCI. W drugiej probówce zmieszano 3 pg wektora pFB-hSox2, 3 pg pVPack-GP i 3 pg plazmidów kodujących białka otoczki (pVPack-Ampho lub pVPack-10A1); i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono do 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek HEK 293T. Szalkę przeniesiono do i nkubatora na 8-12 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i zastąpi ono roztworem DMEM (+glukoza i antybiotyki), ale bez surowicy. Komórki utrzymywano w tych warunkach przez dalsze 40-48 h. W tym okresie oceniono również efektywność transfekcji poprzez ocenę ekspresji fluorescencyjnego reportera.

7. Izolacja retrowirusów.

W celu izolacji wirusa, zebrano medium hodowlane i żwirowano je (3000 rpm, 10 min, 4°C) dla usunięcia pozostałości martwych komórek. Następnie medium zawierające retrowirusy przefiltrowano (filter 0,45 pm, przemyty uprzednio PBSem) i przeznaczono do ultrawirowania. Medium komórkowe wirowano przez 3 h (50000 G, 4°C) lub 18 h (20000 G, 4°C). Po żwirowaniu, supernatant usunięto, a pelet wirusów zawieszono w jałowym PBS (1:300 pierwotnej objętości medium). Otrzymane retrowirusy rozdzielono do 1,5 ml probówek z zakręcanym wieczkiem (dla uniknięcia kontaminacji wirusem otoczenia) w ilości 20-50 pl i przechowywano w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w komórkach HEK293, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano powyżej 40% G F P-pozytywnych infekowanych komórek.

8. Generacja komórek iNS z fibroblastów/keratynocytów przygotowanym retrowirusem

Komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzym anymi retrowirusami. Każda z linii komórkowych została transd u kowana wirusem kodującym hSox2. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48 h), medium hodowlane zostało wymienione na wspierające reprogra mowa nie w kierunku iNS i komórki zostały

PL 223 189 B1 poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek re próg ramowanych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycynq (feeder layer-warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells-embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

P r z y k ł a d 1.4

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynnika transkrypcyjneąo Sox2 oraz wektora transpozonowego piggayBac.

Wektor transpozonowy piggyBac, charakteryzuje się wysoką pojemnością (do 100 kbp), chromosomalną integracją przenoszonego materiału genetycznego oraz długotrwałą ekspresją transgenu. Istotną jego cechą jest możliwość usunięcia wektora z genomu poprzez transfekcję indukowanych komórek przy użyciu plazmidu kodującego transpozazę. Prowadzi to do przywrócenia oryginalnego genotypu komórki, co jest istotne, jeżeli tak uzyskane linie mają zostać użyte do celów terapeutycznych.

Etapy 1 -4 są identyczne jak w przykładzie 1:

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

3. Amplifikacja sekwencji kodującej Sox 2.

4. Klonowanie czynnika Sox2 do wektora plRESneo3.

5. Subklonowanie fragmentu CMV-hSox2-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE pomiędzy odwrócone powtórzenia terminalne transpozonu.

pg plazmidu pPB51x-EFl a-Puro (SBI) zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ascl/Fsel (znajdujących się poza obrębem sekwencji insulatora HS4), inkubacji z nukleazą Mung, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 pg plazmidu lentiwirusowego (pLOC-hSox2) zawierającego fragment CMV-hSox2-tGFP(2A)Blast-WPRE zostało trawione enzymami SanDI/Bsu36l, inkubacji z nukleazą Mung w celu uzyskania tępych końców i poddane fosforylacji przy użyciu kinazy faga T4. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wektorowi (~5,5 kbp) oraz insertowi (~4,5 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcję ligacji wektora piggy Bac oraz insertu zawierającego sekwencję Sox2 pod kontrolą promotora CMV została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16 h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i analizie restrykcyjnej.

6. Transfekcja pierwotnych komórek fibroblastycznych/keratynocytów przygotowanym wektorem piggyBac oraz plazmidem kodującym transpozazę.

Kultywowane komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pochodzące od pacjentów zostały poddane transfekcji przygotowanym transpozonem oraz plazmidem kodującym enzymatyczny komponent-transpozazę (plazmid „Super PiggyBac transposase”, SBI; kodujący optymizowany wariant e nzymu). DNA introdukowano w optymalnym dla tego syatemu stosunku 1:5 (transposazadranspozon), w celu uniknięcia efektu hamowania reakcji poprzez defektywne warianty enzymu (overproduction inhibition). Do transfekcji użyto reagentu Fugene HD (Roche). 9 pg DNA (1,5 pg plazmidu kodującego transpozazę piggyBac oraz 7,5 pg transpozonu) zostało wprowadzone do 700 pl medium hodowlanego DMEM (pozbawionego suplementów jak antybiotyki i surowica). Następnie dodano 18 pl reagentu Fugene, uzupełniono objętość do 800 pl, wymieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 min. Fibroblasty oraz keratynocyty utrzymywano na szalkach φ 10 cm. Do transfekcji użyto komórek znajdujących się powyżej 50% kofluencji. Mieszaninę Fugene/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek, po czym przeniesiono je do inkubatora na 48 h.

7. Selekcja komórek posiadających chromosomalnie zintegrowany transpozon i generacja k omórek iNS

Dwa dni po transfekcji, medium komórkowe zostało usunięte i zastąpione wspierającym reprogra mowa nie w kierunku iNS. Równocześnie rozpoczęto selekcję komórek blastycydyną (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów

8. Remobilizacja transpozonu

PL 223 189 B1

Zintegrowany transpozon został usunięty poprzez transfekcję reprogramowanych komórek plazmidem kodującym wyłącznie transpozazę. Do transfekcji φ 10 cm szalki użyto 10 pg plazmidu „Super PiggyBac transposase” (SBI), który został wprowadzony do 700 pl medium hodowlanego DMEM (pozbawionego dodatków antybiotyków i surowicy). Następnie dodano 20 pl reagentu Fugene, uzupełniono objętość do 800 pl, wymieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 min. Po tym czasie, mieszaninę Fugene/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek i przeniesiono je do inkubatora na 48 h, utrzymując je w medium pozbawionym blastycydyny. Remobilizację (utratę) transpozonu oceniono poprzez zanik fluorescencji reprogramowanych komórek (obecnej dzięki kasecie tGFP(2A)Blast). Tak uzyskane komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek reprogramowanych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycynq (feeder layer - warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells-embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

Przykłady dotyczące reprogra mowa nia za pomocą dwóch czynników reproaramuiacych Sox2 i c-Myc

P r z y k ł a d 2.1

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynników transkrypcyjnych Sox2 oraz c-Myc z zastosowaniem wektora lentiwirusowego.

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

Wyizolowany RNA użyto jako matrycy do odwrotnej transkrypcji. Reakcja została przeprowadzona za pomocą odwrotnej transkryptazy M-MuLV (NEB) według dołączonego protokołu, przy zastosowaniu primera oligo dT (18), hybrydyzującego z sygnałem poliadenylacyjnym mRNA, wykorzystanym jako starter do syntezy komplementarnego DNA (cDNA). Mieszaninę zawierającą 5 pg całkowitego RNA, 500 ng Oligo (dT)₁₈, oraz 1 pl 10 mM dNTPs inkubowano przez 5 min w 65°C w celu eliminacji struktur drugorzędowych, a po ochłodzeniu uzupełniono o bufor reakcyjny, DDT, białkowy inhibitor RNaz (RNase Inhibitor, NEB) oraz 200 jednostek odwrotnej transkryptazy. Mieszaninę reakcyjną ink ubowano w 50°C przez 60 min, po czym temperaturę podniesiono do 75°C (15 min), w celu inaktywacji enzymu. Otrzymane cDNA przechowywano w -80°C.

3. Amplifikacja sekwencji kodującej Sox2 i c-Myc.

Komplementarny DNA (cDNA) został wykorzystany jako matryca do amplifikacji sekwencji k odującej czynniki trans kry pcyj ne Sox2 i c-Myc. Reakcja PCR została przeprowadzona przy pomocy polimerazy DNA o aktywności naprawczej Pfu Ultra II (Stratagene), przy użyciu pary primerów:

Sox2 Nhel Fwd.

Sox2 BamHI Rev.

5'-GACT GCTAGC CGCCACC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG GAG CT-3'

5'-GACT GGATCC TCA CAT GTG TGA GAG GGG CAG

TG-3' c-Myc Nhel Fwd. 5‘-GACT GCTAGC CGC CAC CAT GGA TTT TTT TCG GGT AGT

GGA AAA CCA GC-3‘ c-Myc BamHI Rev. 5'-GACT ggatcc TT A CGC ACA AGA GTT CCG TAG CTG TTC

AAG-3‘

Mieszanina reakcyjna zawierająca:

Bufor reakcyjny 10x 5 pl dNTPs (25 mM każdego dNTP) 0,5 pl matryca (cDNA z poprzedniego etapu) 1 pl primer Fwd. (10 pM) 1 pl primer Rev. (10 pM) 1 pl polimeraza Pfu II 1 pl

H2O 40,5 pl

PL 223 189 B1

95°C 20_s

55°C 20 i- 40 cykli s

72°C 3 min

95°C

Została użyta do amplifikacji PCR przy zastosowaniu następujących programów:

(Sox2)

1. Denaturacja 95°C 1 min

2. Denaturacja Przyłączanie

Wydłużanie 72°C

3. Końcowa elongacja (c-MYC)

1. Denaturacja

2. Denaturacja Przyłączanie

Wydłużanie 72°C 45 s

3. końcowa elongacja 72°C 3 min

Produkt reakcji PCR został rozdzielony na żelu agarozowym, i prążek odpowiadający wielkości pełnej sekwencji kodującej (~960 bp dla Sox2 oraz ~137 bp dla c-Myc) został wycięty z żelu. DNA zostało wyizolowane przy pomocy zestawu AxyPrep Gel Extraction (AxyGen), a jego stężenie oznaczone spektrofotometrycznie (NanoPhotometer, Implen).

4. Klonowanie sekwencji czynników transkrypcyjnych do wektora plRESneo3.

pg plazmidu plRESneo3 (Clontech) oraz 1 pg produktu PCR zawierających sekwencję Sox2 i c-Myc zostało poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymami Nhel/BamHI. Następnie, wektorowy DNA został defosforylowany przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB), według załączonej instrukcji. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wielkością pustemu wektorowi oraz insertom Sox2 i c-Myc zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu. Reakcja ligacji wektora i insertu została przeprowadzona za pomocą Ligazy faga T4 (NEB), przez 16h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został introdukowany do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA, trawieniu restrykcyjnemu enzymami Nhel/BamHI oraz sekwencjonowaniu, w celu potwierdzenia obecności pełnej ORF czynników Sox2 i c-Myc, oraz braku mutacji.

Do sekwencjonowania plazmidów użyto następujących primerów:

CMV seq primer 5'-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3' plRESneo3 rev 5'-GAG TAC TCA CCC CAA CAG-3'

5. Subklonowanie fragmentów CMV-hSox2-IVS-IRES oraz CMV-c-Myc-IVS-IRES do wektora lentiwirudowego pLOC.

pg plazmidu pIRESneo3-hSox2 i pIRESneo3-c-Myc (zawierających insert) zostało poddane trawieniu restrykcyjnemu enzymami Ndel/BfrBI. 2 pg wektora pLOC-RFP, kodującego wariant czerwonego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora CMV zostało poddane trawieniu enzymem restrykcyjnym Nhel. Lepkie końce trawionego wektora zostały wypełnione przy użyciu fragmentu Klenowa, w obecności 1 mM dNTPs i bufora reakcyjnego dostawcy enzymu. Reakcja została przerwana po 30 min poprzez suplementację EDTA (do stężenia 100 mM) oraz inaktywację termiczną (65°C, 10 min). Następnie DNA zostało oczyszczone przy użyciu zestawu AxyPrep PCR Cleanup (AxyGen) i poddany trawieniu enzymem restrykcyjnym Ndel. DNA trawionych plazmidów zawierających czynniki transkrypcyjne, oraz trawionego wektora lentiwirusowego wypełnionego polimerazą Klenowa zostały rozdzielone na żelu agarozowym. Prążki odpowiadające pustemu we ktorowi (~8,8 kbp) oraz insertowi (~1,7 oraz 2,1 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu przy pomocy AxyPrep Gel Extraction (AxyGen). W celu uzyskania kompletnego wektora lentiwirusowego, wyizolowane DNA zostały podd ane ligacji. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl ligazy. Reakcję przeprowadzono w 12°C przez 16h, i produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę, izolacji DNA, oraz testowemu trawieniu restrykcyjnemu enzymami Ndel/EcoRI w celu p otwierdzenia obecności prawidłowego insertu (fragmenty ~7,3 kbp i ~3 kbp).

6. Trasfekcja komórek pakujących HEK293T wektorem pLOC-hSox2, c-Myc.

PL 223 189 B1

Szalki przeznaczone do utrzymywania komórek pakujących zostały pokryte Poli-L-lizyną (5 ml 0,0005% roztworu przez ~60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki HEK293T w ilości 6·10⁶ na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących HEK293T przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyethylenimine, Polysciences). Transfekcję jednej φ 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 60 pl PEI (1 pg/pl) do 640 pl 150 mM NaCI. W drugiej probówce zmieszano 5 pg wektora pLOC-hSox2 z 10 pg plazmidów pakujących (równe ilości: pTLA1-Pak, pTLA1-Enz, pTLA1-Env, pTLA1-TetOFF, pTLA1-Tat/Rev) i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono do 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek HEK 293T. Szalkę przeniesiono do inkubatora na 8-12 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i zastąpiono roztworem DMEM (+glukoza i antybiotyki), ale bez surowicy. Komórki utrzymywano w tych warunkach przez dalsze 40-48 h. W tym okresie oceniono również efektywność transfekcji poprzez ocenę ekspresji fluorescencyjnego reportera.

7. Izolacja lentiwirusów

W celu izolacji wirusa, zebrano medium hodowlane i zwirowano je (30000 rpm, 10 min, 4°C) dla usunięcia pozostałości martwych komórek. Następnie medium zawierające wirusy przefiltrowano (filtr 0,45 pm, przemyty uprzednio PBSem) i przeznaczono do ultra wirowania. Medium komórkowe wirowano przez 3 h (50000 G, 4°C) lub 18 h (20000 G, 4°C). Po zwirowaniu, supernatant usunięto, a pelet wirusów zawieszono w jałowym PBS (1:300 pierwotnej objętości medium). Tak otrzymane lentiwirusy rozdzielono do 1,5 ml probówek w ilości 20-50 pl i przechowywano w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w koórkach HEK293, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano powyżej 40% GFP-pozytywnych infekowanych komórek.

8. Generacja komórek iNS z fibroblastów/keratynocytów przygotowanym lentiwirusem

Komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzym anymi lentiwirusami. Każda z linii komórkowych została transdukowana wirusami kodującymi czynniki Sox2 oraz c-Myc. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48 h), medium hodowlane zostało wymienione na wspierające reprogra mowa nie w kierunku NS i komórki zostały poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek reprogramowanych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycynq (feeder layer - warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells-embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

P r z y k ł a d 2.2

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynników transkrypcyjnych Sox2 oraz c-Myc, z zastosowaniem wektora adenowirusowego

Etapy 1-4 są identyczne jak w przykładzie 2.1:

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

3. Amplifikacja sekwencji kodujących Sox2 i c-Myc.

4. Klonowanie czynników transkrypcyjnych do wektora plRESneo3

5. Mutageneza wektora pShuttle-CMV-LacZ.

Wektor wahadłowy, do którego planowane było wklonowanie insertu zawierającego czynnik transkrypcyjny został poddany mutagenezie miejscowo-specyficznej, w celu ułatwienia dalszej pracy z DNA. Miejsce restrykcyjne Ndel (pozycja cięcia 7745) w wektorze pShuttle-CMV-LacZ zostało poddane modyfikacji polegającej na zamianie dwóch nukleotydów przy użyciu następujących primerów:

pShuttle mut Fwd. 5'-AAT TAA CAT GCA TGG ATC CAT GCG CGG TGT GAA ATA CCG CAC -3'

PL 223 189 B1 pShuttle mut Rev. 5‘-GTG CGG TAT TTC ACA CCG CGC ATG GAT CCA TGC ATG TT

A ATT -3'

Reakcję wydłużanie primerów przeprowadzono przy zastosowaniu polimerazy DNA o aktywności naprawczej Pfull Ultra HS (Stratagene) używając następującego programu mutagenezy:

1. Denaturacja

2. Denaturacja

95°C

95°C min 50 s

Wydłużanie 68°C 11 min

3. końcowa elongacja 68°C 7 min

Produkt reakcji został następnie poddany trawieniu restrykcyjnemu enzymem Dpnl, którego substratem jest zmetylowany plazmidowy DNA pochodzący z bakterii, co pozwala na usunięcie go i pozostawienie niezmetylowanego produktu mutagenezy. Po oczyszczeniu (AxyPrep PCR Cleanup, AxyGen), zmutowany plazmid został transformowany i propagowany w komórkach E. coli. Prawidłowość reakcji mutagenezy została potwierdzona przy użyciu analizy restrykcyjnej enzymem Ndel i an alizy elektroforetycznej trawionego DNA.

6. Subkonowanie fragmentu CMV-TF-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE do wektora wahadłowego pShuttle.

μg plazmidu pShuttle-CMV-LacZ(mut) zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ndel/Blpl, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 μg plazmidu lentiwirusowego pLOC-hSox2 oraz pLOC-c-Myc zawierających fragment CMV-TF-tGFP(2A)Blast-WPRE zostało trawione enzymami Ndel/Bsu36l. Następnie, DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wektorowi (~7,3 kbp) oraz insertowi (~4,3 i 4,7 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcja ligacji wektora wahadłowego oraz insertu została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16 h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 μl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i trawieniu restrykcyjnemu enzymami Xhol/Notl w celu potwierdzenia obecności pełnego insertu (oczekiwane 2 prążki - 10 kbp oraz 1,6/1,9 kbp).

7. Rekombinacja homologiczna in vivo wektora wahadłowego pShuttle i adenowirusowego pAdEasy-1.

Do otrzymania pełnego wektora adenowirusowego zastosowano proces rekombinacji homologicznej pomiędzy plazmidem wahadłowym pShuttlehSox2 (oraz pShuttle-c-Myc) a E1-defektywnym wektorem pAdEasy-1, zawierającym pozostałą część genomu adenowirusowego. Do rekombinacji użyto elektrokompetentnych bakterii E.coli BJ5183-AD-1 (pretransformowane plazmidem pAdEasy-1 Stratagene) posiadających natywny gen recA. Plazmid pShuttle-hSox2 poddano linearyzacji enzymem restrykcyjnym Pmel, a następnie dodano go do zawiesiny bakterii w ilości ~100 ng. Elektroporację przeprowadzono przy następujących parametrach: 200 Ω, 2,5 kV, 25 pF, po czym, po ~1 h inkubacji w medium SOC w 37°C, komórki przeniesiono na agarowe podłoże selekcyjne z kanamycyną. Następnego dnia wybrano 10 kolonii bakteryjnych, z których po ~8 h inkubacji i ekspansji w medium LB z kanamycyną wyizolowano DNA (AxyPrep Plasmid Miniprep, Axygen). Zrekombinowane wektory adenowirusowe zidentyfikowano przy pomocy analizy restrykcyjnej z użyciem enzymu Pacl (oczek iwane 2 produkty ~32 kbp oraz 3/3,3 kbp).

DNA z pozytywnie zidentyfikowanych kolonii transformowano następnie recA i endl-negatywne chemicznie kompetentne komórki E. coli (Turbo, NEB), z których po propagacji w medium selekcyjnym wyizolowano i oczyszczono plazmid ze zrekombinowanym, kompletnym genomem adenowirusowym (przy użyciu AxyPrep Plasmid Maxiprep, Axygen).

8. T ransfekcja komórek pakujących AD-293 i generacja pierwotnych łysinek adenowirusowych.

Szalki przeznaczone do hodowli komórek pakujących zostały pokryte poli-L-lizyna (5 ml 0,0005% roztworu przez ~60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki AD-293 w ilości 6·10⁶na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących AD-293 przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyethylenimine, Polysciences). Do transfekcji użyto DNA kompletnego wektora adenowirusowego zawierającego

PL 223 189 B1 sekwencję hSox2 zlinearyzowanego przy użyciu enzymu restrykcyjnego Pacl. Transfekcję jednej φ 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 20 pl PEI (1 pg/pl) do 680 pl 150 mM NaCI. W drugiej probówce umieszczono 5 pg zlinearyzowanego wektora i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono do 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek AD-293. Szalkę przeniesiono do inkubatora na 12 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i komórki delikatnie pokryto 3,5 mL 1% niskotopliwej agarozy w medium hodowlanym (uprzednio ogrzanej do temperatury 42°C). Po zakrzepnięciu agarozy szalki uzupełniono 7 mL medium DMEM (z glukozą i antybiotykami). Komórki utrzymywano w inkubatorze, w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Po 5 dniach usunięto płynne medium i naniesiono kolejną warstwę 3,5 mL 1% agarozy w DMEM. Łysinki adenowirusowe powinny być zauważalne po 7-10 dniach od transfekcji.

Po 10 dniach od transfekcji, łysinki adenowirusowe aspirowano przy użyciu pipety ze sterylną lmL końcówką (z filtrem, dla uniknięcia kontaminacji sprzętu). Łysinki zawieszono w 0,5 mL PBS i w celu uwolnienia adenowirusa poddano czterem cyklom mrożenia-rozmrażania (-80°C-37°C). W celu amplifikacji adenowirusa, 500 pl zawiesiny pierwotnych wirusów dodano do medium butelki hodowlanej T150, w której znajdowały się komórki pakujące AD-293 (w ok ~70% kofluencji). Infekowane komórki utrzymywano w inkubatorze w 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 5-7 dni do momentu zauważalnej lizy komórek. Zebrane medium hodowlane (wraz z komórkami) zostało poddane czterem cyklom mrożenia-rozmrażania (-80°C-37°C) w celu uwolnienia adenowirusa, a następnie żwirowane w 3000 rpm, 4°C, 5 min w celu oddzielenia od pozostałości komórkowych. Zebrany supernatant (surowy ekstrakt) został użyty do izolacji adenowirusów.

10. Izolacja i oczyszczanie adenowirusów.

Adenowirusy zostały wyizolowana przy użyciu ultrawirowania na gradiencie chlorku cezu. W 50 mL probówce do ultrawirowania zostało umieszczone 2,5 mL roztworu CsCI (5=1,4 g/mL) w TBS. Górną warstwę stanowił roztwór CsCI o gęstości 5=1,25 g/mL. Na gradient CsCI zostało naniesione 5 mL surowego ekstraktu adenowirusowego, które następnie zostało pokryte 2 mm oleju mineralnego, w celu uniknięcia areozolizacji i kontaminacji aparatury wirusem. Tak przygotowane próbki poddano wirowaniu w 35000 rpm, przez 1 h w 15°C. Po żwirowaniu biały prążek na granicy faz gradientu CsCI został pobrany przy użyciu jednorazowej strzykawki zaopatrzonej w igłę 20 G (dolny prążek, górny prążek stanowią białka pustego kapsydu adenowirusowego). Wyizolowany adenowirus został dializowany w 4% roztworze glukozy w PBS, a następnie rozporcjowany w ilości 20-50 pl i przechowywany w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w komórkach HEK293T, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano co najmniej 50% GFP-pozytywnych infekowanych komórek.

Podobnie jak w przypadku wektora lentiwirusowego, komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzymanymi adenowirusami. Każda z linii komórkowych została transd u kowana wirusem kodującym hSox2. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48 h), medium hodowlane zostało wymienione na różnicujące w kierunku NS i komórki zostały poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistoch emicznej analizie ekspresji specyficznych markerów. W ciągu kolejnych trzech tygodni kolonie komórek reprogramowanych do iNS poddawano transferowi na warstwę fibroblastów traktowanych mitomycyną (feeder layer - warstwa odżywcza) w medium ESC (embrionie stem cells- embrionalne komórki macierzyste). Po około miesiącu wykonano różnicowanie komórek iNS do komórek glejowych i neuronalnych.

P r z y k ł a d 2.3

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynnika transkrypcyjnego Sox2, c-Myc oraz wektora retrowirusowego.

Etapy 1-4 są identyczne jak w przykładzie 2.1:

1. Izolacja komórkowego RNA

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

3. Amplifikacja sekwencji kodującej Sox 2 i c-Myc.

4. Klonowanie czynników transkrypcyjnych do wektora plRESneo3.

PL 223 189 B1

5.Subklonowanie fragmentu TF-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE do wektora retro wirusowego pFB.

pg plazmidu pFB zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI/Notl, inkubacji z nukleaza Mung, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 pg plazmidu lentiwirusowego pLOChSox2 i pLOC-c-Myc zawierającego fragment hSox2-tGFP(2A)BlastWPRE oraz c-Myc-tGFP(2A)Blast-WPRE zostało trawione enzymami Clal/Bsu36l, inkubacji z nukleazą Mung w celu uzyskania tępych końców oraz poddane fosforylacji przy użyciu kinazy faga T4. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wektorowi (~5,3 kbp) oraz insertowi (~3,7/4.1 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcję ligacji wektora wahadłowego oraz insertu zawierającego sekwencję Sox2 (lub c-Myc) została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16 h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i trawieniu restrykcyjnemu enzymami Bsu36l/BamHI w celu potwierdzenia właściwej orientacji insertu (oczekiwane 2 prążki - 7,2 kbp oraz 1,7/2,1 kbp).

6. Transfekcja komórek pakujących HEK293T wektorem pFB.

Szalki przeznaczone do utrzymywania komórek pakujących zostały pokryte poli-L-lizynq (5 ml 0.0005% roztworu przez -60 min). W medium hodowlanym DMEM umieszczono komórki HEK293T w ilości 6·10⁶ na szalkę i zapewniono równomierną ich dystrybucję. Komórki utrzymywano w 37°C w atmosferze 5% CO₂. Następnego dnia, komórki przemyto PBSem i dodano 10 ml świeżego medium hodowlanego. Transfekcję komórek pakujących HEK293T przeprowadzono przy użyciu PEI (Polyethylenimine, Polysciences). Transfekcję jednej φ 10 cm szalki przeprowadzono według schematu: w jednej 1,5 ml probówce dodano 40 pl PEI (1 pg/pl) do 660 pl 150 mM NaCI. W drugiej probówce zmieszano 3 pg wektora pFB kodującego odpowiedni czynnik transkrypcyjny, 3pg pVPack-GP i 3pg plazmidów kodujących białka otoczki (pVPack-Ampho lub pVPack-10A1); i uzupełniono 150 mM NaCI do końcowej objętości 700 pl. Następnie dodano roztwór PEI w NaCI do probówki zawierającej DNA, zawartość wymieszano i żwirowano, i pozostawiono do 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zawierający kompleksy PEI/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek HEK 293T. Szalkę przeniesiono do inkubatora na 812 h. Następnego dnia, usunięto medium hodowlane i zastąpiono roztworem DMEM (+glukoza i antybiotyki), ale bez surowicy. Komórki utrzymywano w tych warunkach przez dalsze 40-48 h. W tym okresie oceniono również efektywność transfekcji poprzez ocenę ekspresji fluorescencyjnego reportera.

7. Izolacja retrowirusów.

W celu izolacji wirusa, zebrano medium hodowlane i żwirowano je (3000 rpm, 10 min, 4°C) dla usunięcia pozostałości martwych komórek. Następnie medium zawierające retrowirusy przefiltrowano (filter 0,45 pm, przemyty uprzednio PBSem) i przeznaczono do ultrawirowania. Medium komórkowe wirowano przez 3 h (50000 G, 4°C) lub 18 h (20000 G, 4°C). Po żwirowaniu, supernatant usunięto, a pelet wirusów zawieszono w jałowym PBS (1:300 pierwotnej objętości medium). Otrzymane retrowirusy rozdzielono do 1,5 ml probówek z zakręcanym wieczkiem (dla uniknięcia kontaminacji wirusem otoczenia) w ilości 20-50 pl i przechowywano w -80°C. Biologiczną efektywność transdukcji sprawdzono w komórkach HEK293, i do dalszej pracy przeznaczono te wirusy (i ich koncentracje), dzięki którym uzyskano powyżej 40% GFP-pozytywnych infekowanych komórek.

8. Generacja komórek iNS z fibroblastów/ keratynocytów przygotowanym retrowirusem

Komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pobrane od pacjentów zostały infekowane otrzym anymi retro wirusa mi. Każda z linii komórkowych została transdukowana równolegle wirusami kodującym czynniki Sox2 i c-Myc. Pobrane komórki były utrzymywane na podłożu MEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą. Po osiągnięciu 40-80% konfluencji zostały poddane infekcji. Po transdukcji wirusem (48 h), medium hodowlane zostało wymienione na wspierające reprogra mowa nie w kierunku iNS i komórki zostały poddane selekcji przy użyciu medium uzupełnionego o blastycydynę (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów.

P r z y k ł a d 2.4

Protokół generacji komórek iNS uzyskanych przy użyciu czynników transkrypcyjnych Sox2 i c-Myc, z zastosowaniem wektora transpozonowego piggyBac.

Etapy 1-4 są identyczne jak w przykładzie 2.1:

1. Izolacja komórkowego RNA.

2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i uzyskanie cDNA.

PL 223 189 B1

3. Amplifikacja sekwencji kodujących Sox 2 i c-Myc.

4. Klonowanie czynników transkrypcyjnych do wektora plRESneo3

5. Subklonowanie czynników transkrypcyjnych do wektora pośredniego CMV-TF-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE

6. Subklonowanie fragmentu CMV-TF-IRES-tGFP(2A)Blast-WPRE pomiędzy odwrócone powtórzenia terminalne transpozonu.

pg plazmidu pPB51x-EFl α-Puro (SBI) zostało poddane trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ascl/Fsel (znajdujących się poza obrębem sekwencji insulatora HS4), inkubacji z nukleazq Mung, a następnie defosforylowane przy użyciu antarktycznej fosfatazy (NEB). 2 pg plazmidu lentiwirusowego pLOC-hSox2 oraz pLOC-c-Myc zostało trawione enzymami SanDI/Bsu36l, inkubacji z nukleazq Mung w celu uzyskania tępych końców i poddane fosforylacji przy użyciu kinazy faga T4. DNA zostało rozdzielone na żelu agarozowym, i prążki odpowiadające wektorowi (~5,5 kbp) oraz insertowi (~4,5 i 4,8 kbp) zostały wyizolowane i oczyszczone z żelu (AxyPrep Gel extraction, AxyGen). Reakcję ligacji wektora piggyBac oraz insertu zawierającego czynnik transkrypcyjny pod kontrolą promotora CMV została przeprowadzona przy użyciu Ligazy faga T4 (NEB), przez 16 h w 12°C. Do reakcji użyto 50 ng wektora, 200 ng insertu oraz 0,5 pl enzymu. Produkt ligacji został wprowadzony do chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Kilka wyizolowanych kolonii bakteryjnych zostało poddanych ekspansji w medium LB zawierającym ampicylinę a następnie izolacji DNA i analizie restrykcyjnej.

7. Transfekcja pierwotnych komórek fibroblastycznych/keratynocytów przygotowanym wektorem piggy Bac oraz plazmidem kodującym transpozazę.

Kultywowane komórki fibroblastyczne oraz keratynocyty pochodzące od pacjentów zostały poddane transfekcji przygotowanymi transpozonami oraz plazmidem kodującym enzymatyczny komponent - transpozazę (plazmid „Super PiggyBac transposase”, SBI; kodujący zoptymizowany wariant enzymu). DNA introdukowano w optymalnym dla tego syatemu stosunku 1:5 (transposazadranspozon), w celu uniknięcia efektu hamowania reakcji poprzez defektywne warianty enzymu (overproduction inhibition). Do transfekcji użyto reagentu Fugene HD (Roche). 9 pg DNA (1,5 pg plazmidu kodującego transpozazę piggyBac oraz 7,5 pg transpozonu) zostało wprowadzone do 700 pl medium hodowlanego DMEM (pozbawionego suplementów jak antybiotyki i surowica). Następnie dodano 18 pl reagentu Fugene, uzupełniono objętość do 800 pl, wymieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 min. Fibroblasty oraz keratynocyty utrzymywano na szalkach φ 10 cm. Do transfekcji użyto komórek znajdujących się powyżej 50% kofluencji. Mieszaninę Fugene/DNA przeniesiono kroplami do medium kultywowanych komórek, po czym przeniesiono je do inkubatora na 48 h.

8. Selekcja komórek posiadających chromosomalnie zintegrowany transpozon i generacja k omórek iNS

Genomową integrację transpozonów potwierdzono przy użyciu PCR z primerami specyficznymi dla Sox2 i c-Myc. Dwa dni po transfekcji, medium komórkowe zostało usunięte i zastąpione wspierającym reprogra mowa nie w kierunku iNS. Równocześnie rozpoczęto selekcję komórek blastycydyną (5 pg/ml). Po tygodniowej selekcji, komórki zostały poddane ocenie morfologicznej i immunohistochemicznej analizie ekspresji specyficznych markerów.

9. Remobilizacja transpozonu

Różnicowanie komórek iNS oraz iPS w standardowych warunkach dla otrzymywania komórek mięśnia sercowego i komórek wątroby.

PL 223 189 B1

Jedną z niezaprzeczalnych przewag komórek otrzymywanych według opisywanej metody jest brak powstawania w wyniku ich różnicowania teratom. Czyli nowotworów wywodzący się z pluripotencjalnych komórek zarodkowych: w którym dochodzi do ich rozrostu i różnicowania się w linie zawierające cechy wszystkich listków zarodkowych: ektodermy, endodermy, mezodermy oraz sporadycznie trofoblastu. Ponieważ komórki iNS nie są cofnięte aż do poziomu komórek o tak wszechstronnym spektrum różnicowania nie ma w ich przypadku możliwości generowania komórek z kilku różnych listków zarodkowych.

W celu praktycznego udowodnienia wynikających z powyższego opisu właściwości przeprowadzono eksperymenty w których równolegle różnicowano otrzymane w laboratorium komórki i PS oraz iNS do komórek mięśnia sercowego oraz komórek wątroby.

Komórki iPS zostały otrzymane z fibroblastów za pomocą zestawu CytoTune™ cat. No. A13780-01 (Life Technologies). Komórki iNS zostały otrzymane za pomocą technologii ujawnionej w zgłoszeniu.

Procedura różnicowania komórek do komórek wątroby

Komórki iNS oraz równolegle IPS hodowane w medium 1640 medium (Hyclone, Logan, UT] z dodatkiem 0,5 mg/ml albuminy frakcja V(Sigma-Aldrich) i 100 ng/mi Activin A przez 1 dzień. W kolejnych dwóch dniach stopniowo zwiększano dawkę w medium, 0,1% i 1% insulintransferrinseienium (ITS) (Sigma-Aldrich), W trzecim dniu od rozpoczęcia suplementacji Activin A zmieniono podłoże na podłoże do hodowli hepatocytów (HCM) (Cambrex, Baltimore, MD) wzbogacone o 30 ng/ml FGF4 and 20 ng/ml BMP2 kontynuowano hodowlę przez kolejne pięć dni. W kolejnym trwającym pięć dni etapie do podłoża HCM dodano 20 ng/ml

HGF oraz 10 ng/ml Oncostatin M oraz 0,1 pM Dexamethasone. Zmian podłoża dokonywano codziennie.

W wyniku tego zabiegu biotechnologicznego otrzymano w przypadku 1RS komórki pozytywne w barwieniu przeciwciałami przeciwko ludzkiej α-fetoproteinie (AFP) oraz Albuminie (Alb) DAKO (Glostrup, Denmark). W przypadku iNS zaobserwowano w traktowanych w ten sposób kulturach zwiększony odsetek komórek GFAP pozytywnych (brak reakcji z AFP i Alb). Świadczy to o dużo wyższej elastyczności w różnicowaniu komórek iPS niż INS powstałe w wyniku procesu komórki o cechach hepatocytów występują tylko w naczyniach hodowlanych, w których początkowo znajdowały się iPS. W naczyniach hodowlanych z iNS powstały komórki neuralne z przewagą astrocytów (GFAP+).

Procedura różnicowania komórek do komórek mięśnia sercowego

Komórki iNS oraz równolegle IPS hodowane w medium DMEM bez glutaminy z wysokim stężeniem glukozy na mitotycznie inaktywowanych mysich embrionalnych ffbroblastach (MEF) pożywka hodowlana wzbogacona została za pomocą 1 mmol/L L-glutaminy, 0,1 mmol/L mercaptoethanol, 4 ng/mL ludzkiego rekombinowanego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) oraz 1% zestawu aminokwasów(invitrogen, Carlsbad, Calif). Następnie w celu Indukcji różnicowania komórek, zostały one poddane trawieniu za pomocą kolagenazą IV (1 mg/ml, 20 minut, Life Technologies, Carlsbad, Calif) uzyskano w ten sposób małe kolonie komórek które następnie przeniesiono do płytek Petriego z tworzywa sztucznego, w których utworzyły embryoid bodies (EBS) i hodowano w zawieszeniu do 10 dni. EBS następnie wysiewano na powlekane 0,1% żelatyną naczynia hodowlane I hodowano do uzyskania spontanicznych skurczy komórek.

Tylko w przypadku komórek uzyskanych przez różnicowanie komórek iPS zaobserwowano występowanie w ich pewnym odsetku spontanicznych skurczy. Żadna komórka uzyskana przez różnic owanie z INS nie wykazała tej aktywności,, były one pozytywne na GFAP, MAP-2, beta-tubulinę.

Dodatkową korzyścią z zastosowania reprogra mowa nia tylko do komórek INS jest to, że otrzymujemy tylko komórki z jednej neuralnej linii po procesie różnicowania. W przypadku komórek otrzymanych przez różnicowanie komórek iPS, pomimo zastosowania wielu czynników różnicujących otrzymujemy obok komórek pożądanych, szereg innych, nierzadko zupełnie innych niż zakładany list listków zarodkowych.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Neuralna komórka macierzysta (iNS), znamienna tym, że charakteryzuje się ekspresją markerów Sox2, GFAP i nestyny.

PL 223 189 B1

2. Sposób reprogra mowa nia komórek somatycznych, znamienny tym, że wykorzystuje się z jeden czynnik reprogramujący.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że czynnikiem reprogramującym jest kompletna sekwencja kodująca białko Sox2.

4. Sposób według zastrzeżenia 2-3, znamienny tym, że w wyniku procesu powstaje komórka iNS charakteryzująca się obecnością markerów Sox2, nestyny (markerów neuralnych komórek macierzystych) i GFAP (kwaśne włókienkowe białko glejowe, glial fibrillary acidic protein).

5. Sposób według zastrz. 2-4, znamienny tym, że przeciętna wydajność dla reprogra mowa nia z wykorzystaniem jednego czynnika reprogramującego - Sox2 wynosi 0,01 %.

6. Sposób według zastrz. 2-5, znamienny tym, że komórki Sox2, GFAP i nestyno pozytywne zdolne są do różnicowania się do komórek chrakteryzujących się obecnością markerów MAP2+ i beta III + w trakcie hodowli z następującym czynnikiem różnicującymi, bFGF w podłożu NBM, DMEM F-12.

7. Sposób reprogra mowa nia komórek somatycznych, znamienny tym, że wykorzystuje się dwa czynniki reprogramujące.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czynnikami reprogramującymi są kompletne sekwencje kodujące białka Sox2 i c-Myc.

9. Sposób według zastrzeżenia 7-8, znamienny tym, że w wyniku procesu powstaje komórka iNS charakteryzująca się obecnością markerów Sox2, nestyny (markerów neuralnych komórek macierzystych) i GFAP (kwaśne włókienkowe białko glejowe, glial fibrillary acidic protein).

10. Sposób według zastrz. 7-9, znamienny tym, że przeciętna wydajność dla reprogra mowa nia z wykorzystaniem dwóch czynników reprogramujących Sox2 i c-Myc wynosi 0,1%.

11. Sposób według zastrz. 7-10, znamienny tym, że komórki Sox2, GFAP i nestyno pozytywne zdolne są do różnicowania się do komórek chrakteryzujących się obecnością markerów MAP2+ i beta III + w trakcie hodowli z następującym czynnikiem różnicującymi, bFGF w podłożu NBM, DMEM F-12.