CN102507937A - 一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，以人生精细胞作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，免疫组化法筛选生精细胞特异性单克隆抗体；然后在蛋白水平上研究所筛选的单克隆抗体识别的抗原分子在肿瘤组织和其他正常组织的表达分布规律。以此为基础，采用免疫组化染色选择针对肿瘤/睾丸抗原表达规律的单克隆抗体，作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体；通过免疫沉淀-质谱分析等现代蛋白组学的技术，鉴定相应单克隆抗体所识别的新肿瘤/睾丸抗原分子。

Description

一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法

技术领域

本发明属于肿瘤抗原的筛选技术领域，涉及一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。在第18届国际抗癌症联盟大会上，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。为应对上述严峻形势，报告呼吁各国制订反癌症的全国计划和具体实施方案，并特别强调对癌症预防、早期检查和早期治疗的重要意义。

尽管两个世纪以前就有人提出用肿瘤疫苗来治疗人类肿瘤的想法，但因长期以来无法在肿瘤细胞上找到肿瘤特异性抗原而进展缓慢。从20世纪80年代开始，各种不同肿瘤抗原的鉴定方法相继建立，发现和鉴定了一系列肿瘤抗原，从而为肿瘤主动免疫治疗和靶向治疗的发展奠定了基础。然而，肿瘤细胞的多种免疫逃逸机制，使得针对所发现的大部分肿瘤抗原作为靶点的免疫治疗效果不尽如人意。

作为免疫治疗理想的肿瘤抗原应具备：在肿瘤细胞特异、稳定表达，正常组织不表达，并且对维持肿瘤细胞的存活至关重要。近年来，随着肿瘤免疫学的快速发展，只局限性表达于肿瘤及睾丸组织中的肿瘤/睾丸抗原的发现，无疑为肿瘤的免疫治疗带来了新的希望。由于肿瘤/睾丸抗原具有诱导机体产生特异性细胞免疫应答或特异性体液免疫应答的特点，使得肿瘤/睾丸抗原较其它类型的肿瘤抗原在肿瘤免疫治疗中更具应用前景，已成为当今肿瘤研究的热点之一。

虽然目前已有许多肿瘤/睾丸抗原被陆续鉴定出来，但可以实际应用于肿瘤疫苗构建及治疗靶点的肿瘤/睾丸抗原仍十分有限。为了大规模快速发现更具应用价值的新肿瘤/睾丸抗原，由美国肿瘤研究院和路德维格癌症研究所牵头，联合8个国家的30个研究机构，成立了“发现人类肿瘤抗原合作项目”的国际合作联盟，足见筛选和鉴定新肿瘤/睾丸抗原的重要性和迫切性。

目前，以T细胞表位克隆技术(T cell epitope cloning)、多肽洗脱法(peptide elute method)、表位预测法(epitope prediction method)、cDNA表达文库血清学筛选分析技术(serological analysis of cDNA expression libraries，SEREX)等为主的免疫学方法，和以差异显示(different display，DD)、代表性差异分析(representational difference analysis，RDA)、cDNA芯片分析(cDNA microarray analysis)、基因表达连续性分析(serial analysis of geneexpression，SAGE)、表达序列标签测序及大规模平行信号测序(massivelyparallel signature sequencing，MPSS)等为主的基因表达分析法，在筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原方面发挥了巨大的作用。

然而，无论是免疫学方法还是基因表达分析法均有一定的局限性。前者依赖于肿瘤患者体内针对肿瘤/睾丸抗原的特异性免疫应答，但多数情况下，肿瘤患者处于免疫抑制状态，所以利用这种方法筛选、鉴定并获得肿瘤/睾丸抗原的机率可能是较低的。鉴于部分蛋白的核酸表达水平与蛋白表达水平有差异，即核酸虽有表达，但并不表示蛋白就一定会表达。因此，肿瘤/睾丸抗原基因表达分析法并不能有效地鉴定差异表达的蛋白，例如备受研究者关注的MPSS法也仅仅鉴定了CT45一个肿瘤/睾丸抗原。显然，目前的肿瘤/睾丸抗原的鉴定方法无法满足肿瘤免疫学的研究。

因此，建立新的、强有力的特异性肿瘤/睾丸抗原筛选工具，不仅将为人们更加全面、系统地发现新的肿瘤抗原，丰富人们对肿瘤分子机制的认识，同时也将促进肿瘤免疫诊断、治疗的发展。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，在人生精细胞作为免疫原筛选的特异性单克隆抗体的基础上，来筛选和鉴定未知肿瘤/睾丸抗原的新方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，包括以下步骤：

1)以人生精细胞作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，免疫组化法筛选识别人生精细胞的特异性单克隆抗体；

2)采用免疫组化染色方法，在蛋白水平上从识别人生精细胞的特异性单克隆抗体当中，筛选出只与人肿瘤组织反应，且与人正常组织不反应的特异性单克隆抗体作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体；

3)利用候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体与人阳性肿瘤细胞的裂解物进行抗原抗体反应，收集形成的免疫沉淀，再将候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体所捕获的肿瘤/睾丸抗原进行蛋白组学分析和鉴定。

所述的在蛋白水平上的筛选为：采用免疫组化染色方法，筛选出只与人肿瘤组织石蜡切片反应，且与人正常组织石蜡切片不反应的特异性单克隆抗体作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体。

所述的免疫沉淀所获得的肿瘤/睾丸抗原的收集为：候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体先与Sepharose 4B交联，再与人阳性肿瘤细胞的裂解物进行抗原抗体反应，形成沉淀之后，沉淀中加入洗脱液，混合后离心，收集上清液，用超滤浓缩管浓缩或用冷丙酮沉淀，然后进行SDS-PAGE，收集所捕获的肿瘤/睾丸抗原所对应的条带；

所述的洗脱液为0.1mol/L的甘氨酸-盐酸，pH2.7。

所述的对免疫沉淀所获得的肿瘤/睾丸抗原进行蛋白组学分析为：将所捕获的肿瘤/睾丸抗原用蛋白酶降解成多肽，收集酶解后的多肽，对其进行质谱分析以确定蛋白序列。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的肿瘤/睾丸抗原的筛选和鉴定方法，是基于生殖细胞的发育过程与肿瘤细胞的发生有许多相似性，以及肿瘤/睾丸抗原基因在体细胞中重新表达的过程可能是肿瘤发生的驱动力，逆向设计的筛选和鉴定未知肿瘤/睾丸抗原的方法。

一般情况下，都是先有已知抗原，通过免疫再制备相应单克隆抗体。而本发明在没有肿瘤抗原或不知道肿瘤抗原、按常理无法制备其单克隆抗体的情况下，基于肿瘤/睾丸抗原限制性表达于睾丸组织的特点，利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，采用免疫组化染色选择只与肿瘤组织反应、而与正常组织不反应的生精细胞特异性单克隆抗体作为候选识别抗体，进而筛选和鉴定新的肿瘤/睾丸抗原分子。

这样既克服了现有免疫学方法依赖于肿瘤患者体内针对肿瘤/睾丸抗原的特异性免疫应答、获得肿瘤/睾丸抗原的机率较低的缺陷；又克服了基因表达分析法核酸表达水平与蛋白表达水平有差异的缺陷。筛选出不同的抗克隆抗体就能够识别不同的肿瘤/睾丸抗原。

本发明提供的肿瘤/睾丸抗原的筛选和鉴定方法，巧妙了解决了肿瘤抗原单克隆抗体难以筛选的问题，再结合其他蛋白组学分析技术，是一种好的高效的肿瘤/睾丸抗原筛选方法，有望发现新的肿瘤治疗靶点；所筛选的相应单克隆抗体也有可能成为潜在的肿瘤治疗性抗体。

附图说明

图1为FM-1抗体在人睾丸组织及多种肿瘤组织切片中的免疫组化染色；其中：A、睾丸；B、宫颈癌；C、卵巢癌；D、直肠癌；E、结肠癌；F、肝癌；G、肺癌；H、乳腺癌；I、食管癌；

图2为FM-1抗体在人睾丸组织及多种正常组织切片中的免疫组化染色；其中：A、睾丸；J、宫颈；K、卵巢；L、直肠；M、结肠；N、肝；O、肺；P、乳腺；Q、食管。

图3为FM-1单克隆抗体与识别的抗原的免疫沉淀的电泳结果图；

图4为免疫沉淀电泳目标条带的酶解多肽的质谱分析结果。

具体实施方式

本发明提供的肿瘤/睾丸抗原的筛选和鉴定方法，以人生精细胞作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，免疫组化法筛选人生精细胞特异性单克隆抗体；然后在蛋白水平上研究所筛选的单克隆抗体识别的抗原分子在肿瘤组织和其他正常组织的表达分布。以此为基础，采用免疫组化染色选择针对肿瘤/睾丸抗原表达规律的单克隆抗体(即只与人肿瘤组织反应、而与人正常组织不反应的抗人生精细胞特异性单克隆抗体)，作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体；通过免疫沉淀-质谱分析等现代蛋白组学技术，筛选和鉴定相应单克隆抗体所识别的新肿瘤/睾丸抗原分子。下面结合人生精细胞特异性单克隆抗体的制备和筛选，以及新肿瘤/睾丸抗原分子的鉴定对本发明作详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、生精细胞特异性单克隆抗体的制备和筛选

1.1作为免疫原的生精细胞的制备

收集行去势治疗的前列腺癌患者睾丸组织(与患者签订知情同意书)，用眼科剪剪成小块，加0.25％胰蛋白酶34℃轻微振荡消化30min，静置5min使组织块沉降至容器底部，弃上清。组织块用PBS洗涤3次，加入0.1％胶原酶，32℃消化30min，然后经400目筛网过滤，滤过液中即富含生精细胞，PBS洗涤3次后计数备用。

1.2特异性单克隆抗体的制备和筛选

取1×10⁶个生精细胞重悬于1ml PBS，腹腔注射8周龄雌性Balb/c小鼠，依次间隔4周和3周行第2次及第3次加强免疫。第3次免疫后10天用免疫组化法测定免疫血清效价。选择免疫血清效价高于1∶8000倍稀释的小鼠，在细胞融合前3天以相同方法加强免疫1次。处死小鼠取脾制备免疫脾细胞悬液备用。

取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10比例混合，并采用聚乙二醇为促融剂进行细胞融合(具体操作参见细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37℃、5％CO₂孵箱培养。HAT选择培养法筛选杂交瘤，其中HAT，H是次黄嘌呤；A是氨基喋呤；T是胸腺嘧啶核苷。

待克隆出现后，免疫组化法筛选生精细胞染色阳性克隆，脾脏组织切片作为正常组织阴性对照(具体采用福州迈新公司的Elivision Plus试剂盒)。选取睾丸组织染色阳性而脾脏染色阴性的克隆，有限稀释法进行3次克隆化，达100％阳性后扩大培养，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)。

留取杂交瘤细胞培养上清，同时以杂交瘤细胞接种Balb/c小鼠体内制备腹水，(具体按小鼠腹水制备方法制备包含单克隆抗体的腹水，细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。腹水经45％饱和硫酸铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化单克隆抗体，获得一种生精细胞特异性单克隆抗体，并命名为单克隆抗体FM-1。

2、肿瘤/睾丸抗原的筛选和鉴定

2.1免疫组化染色分析FM-1单克隆抗体所识别抗原分子的表达分布：

将人睾丸组织、多种肿瘤组织(宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌)及相对应的正常组织的石蜡切片脱蜡至水并进行抗原修复，0.3％甲醇-双氧水浸泡30min，消除内源性过氧化物酶活性后用羊血清封闭30min；加FM-1单克隆抗体(0.1mg/L)，室温作用60min；依次滴加增强剂(即用型，福州迈新公司的Elivision Plus试剂盒内提供)及HRP标记的二抗(即用型HRP标记羊抗鼠二抗，福州迈新公司的Elivision Plus试剂盒内提供)，室温各作用30min；DAB显色，苏木素复染；以上各操作步骤之间以0.01M PBS浸洗切片5min×3次；苏木素复染之后，将切片依次用梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

人睾丸组织及多种肿瘤组织切片中的免疫组化染色结果如图1所示，人睾丸组织及多种正常组织切片中的免疫组化染色结果如图2所示；对比图1和图2，结果发现，FM-1单克隆抗体所识别的抗原在人睾丸组织、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和食管癌有高水平表达，而在相应的正常组织中未见表达，这表明FM-1单克隆抗体只与人肿瘤组织反应，且与人正常组织不反应，符合肿瘤/睾丸抗原的表达分布规律，FM-1单克隆抗体可作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体。

2.2利用FM-1单克隆抗体进行免疫沉淀-质谱分析：

2.2.1FM-1单克隆抗体与Sepharose 4B的交联

称取一定量的Sepharose 4B，1mM HCl浸泡15min，2000rpm离心5s，弃上清，1mM HCl洗涤1次，离心同前，弃上清。以交联缓冲液(碳酸盐缓冲液，pH8.3)洗涤2次，2000rpm离心5s，弃尽上清后备用。

将FM-1单克隆抗体对交联缓冲液透析后与上述处理过的Sepharose 4B混合(10mg抗体：1ml处理过的Sepharose 4B)，室温轻摇2～4h，2000rpm离心5s，弃上清。加入封闭液(3.75克甘氨酸/100ml交联缓冲液)，室温轻摇1～2h，2000rpm离心5s，弃上清。用醋酸盐缓冲液(pH4.5)和交联缓冲液轮流洗涤3次，离心同前，弃上清，PBS洗涤2次，2000rpm离心5s，加入含0.02％NaN₃的PBS后置4℃保存备用。

2.2.2免疫沉淀

消化并收集1～2×10⁹个Hela细胞(人宫颈癌细胞系，高表达FM-1单克隆抗体所识别抗原分子)，冷PBS洗涤2次，弃上清。按10⁷～10⁸个细胞/ml的比例加入预冷的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM NaF，5mM EDTA，pH 7.5)，充分重悬细胞并置4℃，30min。4℃离心12000rpm，10min，将上清移入一个新的离心管中，加入1～2ml无关抗体交联的Sepharose 4B，用垂直混合仪4℃下慢速混匀1～2h。4℃离心2000rpm，1min，将上清移入另一个新的离心管中，加入1～2ml FM-1单克隆抗体交联的Sepharose 4B，用垂直混合仪4℃下慢速混匀4h以上。以洗液(100mM Tris-HCl，500mM NaCl，1％Triton X-100，pH 7.5)洗涤3次，4℃离心2000rpm，1min，移弃上清。沉淀中加入1～2ml洗脱液(0.1M甘氨酸-盐酸，pH2.7)，轻混2～3min，4℃离心2000rpm，1min，收集上清液，用Milipore超滤浓缩管浓缩或用冷丙酮沉淀，SDS-PAGE(120V，60min)分离目的蛋白，考马斯亮蓝染色。SDS-PAGE电泳结果如图3所示，除去FM-1抗体的轻链(25KD)和重链(50KD)外，在28KD处出现一条新的电泳条带，即为免疫沉淀所获得的目的蛋白分子的条带。

2.2.3质谱分析

从凝胶上切下目的蛋白带后，加入胰蛋白酶水解，并收集酶水解后形成的肽；继而应用纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪Q-TOF2(LC-MS/MS)对酶解的肽进行分析：液相色谱(LC)第一维分离为强阳离子色谱分离，将使用含0.1％甲酸的丙烯腈溶解酶解的待测样本，并注入多孔性10s强阳离子交换柱。利用乙酸铵盐溶液作为洗脱液，按浓度为10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，75mM，100mM，250mM，500mM和1000mM共10个梯度进行柱洗脱，流速0.03mL/min。第二维分离为反向色谱仪分离，使用毛细管液相色谱柱，色谱柱连接集成电喷雾喷头，直接与质谱仪中的纳米喷雾接口相连。

样品经一维洗脱后转移到预装液相色谱柱中进行脱盐和富集，流速设定为0.03mL/min。使用流动相乙腈/水(体积比2/98，含0.1％甲酸)冲洗5min后，将系统切换到毛细管液相色谱柱，流动相设定为线性梯度20～95％的乙腈(含0.1％甲酸)，流速设定为0.0003mL/min，洗脱时间85分钟。纳米电喷雾仪器分析参数为：离子喷射电压2200V，分离电位60V，聚焦电位265V，碰撞能量设定为35％。TOF-MS质谱扫描条件设定：TOF-MS全扫描(范围为300-1200Da)，采集时间1秒，随后2次产物离子扫描(范围100-1500Da)，采集时间3秒。筛选标准为：离子质/荷比(m/z)在350到1200之间，负载电荷为2～4，丰度阈值每秒计数大于20，动态排除时间为60秒。

免疫沉淀电泳目标条带的酶解多肽的质谱分析所生成的MS图谱如图4所示，其中横坐标为离子质/荷比，纵坐标为相对丰度。应用Sequest分析软件，得到蛋白质的鉴定和定量结果。检索参数为：至少有一个肽段匹配，肽段对该蛋白质鉴定的可信区间为95％以上，并符合其质谱图波峰对应，并在NCBInr人类蛋白序列数据库中进行检索，最后确定FM-1单克隆抗体所识别的是B细胞相关蛋白31(B cell associated protein 31，BAP31)。由于该分子在蛋白水平的表达分布规律与肿瘤/睾丸抗原的表达分布规律一致，且目前国内外尚无该分子在睾丸及肿瘤组织中高表达的相关文献报道，所以将BAP31定义为一个的新肿瘤/睾丸抗原分子。

Claims (4)

1.一种基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以人生精细胞作为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，免疫组化法筛选识别人生精细胞的特异性单克隆抗体；

2)采用免疫组化染色方法，在蛋白水平上从识别人生精细胞的特异性单克隆抗体当中，筛选出只与人肿瘤组织反应，且与人正常组织不反应的特异性单克隆抗体作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体；

3)利用候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体与人阳性肿瘤细胞的裂解物进行抗原抗体反应，收集形成的免疫沉淀，再将候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体所捕获的肿瘤/睾丸抗原进行蛋白组学分析和鉴定。

2.如权利要求1所述的基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，其特征在于，所述的在蛋白水平上的筛选为：采用免疫组化染色方法，筛选出只与人肿瘤组织石蜡切片反应，且与人正常组织石蜡切片不反应的特异性单克隆抗体作为候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体。

3.如权利要求1所述的基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，其特征在于，所述的免疫沉淀所获得的肿瘤/睾丸抗原的收集为：候选识别肿瘤/睾丸抗原的抗体先与Sepharose 4B交联，再与人阳性肿瘤细胞的裂解物进行抗原抗体反应，形成沉淀之后，沉淀中加入洗脱液，混合后离心，收集上清液，用超滤浓缩管浓缩或用冷丙酮沉淀，然后进行SDS-PAGE，收集所捕获的肿瘤/睾丸抗原所对应的条带；

所述的洗脱液为0.1mol/L的甘氨酸-盐酸，pH2.7。

4.如权利要求1所述的基于生精细胞特异性单克隆抗体筛选和鉴定肿瘤/睾丸抗原的方法，其特征在于，所述的对免疫沉淀所获得的肿瘤/睾丸抗原进行蛋白组学分析为：将所捕获的肿瘤/睾丸抗原用蛋白酶降解成多肽，收集酶解后的多肽，对其进行质谱分析以确定蛋白序列。

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