JPH05219981A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH05219981A JPH05219981A JP4026633A JP2663392A JPH05219981A JP H05219981 A JPH05219981 A JP H05219981A JP 4026633 A JP4026633 A JP 4026633A JP 2663392 A JP2663392 A JP 2663392A JP H05219981 A JPH05219981 A JP H05219981A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 毛母細胞に特異的なモノクローナル抗体及び
これを産生するハイブリドーマ。 【効果】 このモノクローナル抗体は毛母細胞と特異的
に反応するため、毛母細胞の検出、精製はもちろん、毛
母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する因子の
解明に利用することができる。
これを産生するハイブリドーマ。 【効果】 このモノクローナル抗体は毛母細胞と特異的
に反応するため、毛母細胞の検出、精製はもちろん、毛
母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する因子の
解明に利用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は毛包組織中の毛母細胞の
みを特異的に認識するモノクローナル抗体及びこれを産
生するハイブリドーマに関する。
みを特異的に認識するモノクローナル抗体及びこれを産
生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】毛包組織は、毛球部において間質系の細
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】こうした毛母細胞と毛
乳頭細胞との相互作用を介在する因子を同定し、これを
活性化することができれば脱毛予防、育毛が可能になる
と考えられる。従って、当該因子の単離、同定が望まれ
ていた。そして、当該因子を単離・同定するためには毛
母細胞と毛乳頭細胞との共存培養系の確立、毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質の開発
等が必要となる。そこで、本発明者らは当該因子の単離
・同定を目的として種々検討し、毛母細胞と毛乳頭細胞
の共存培養系を確立し、先に特許出願した（特願平２−
２１４１８１号）。従って、本発明の目的は毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質、すな
わちモノクローナル抗体を提供することにある。
乳頭細胞との相互作用を介在する因子を同定し、これを
活性化することができれば脱毛予防、育毛が可能になる
と考えられる。従って、当該因子の単離、同定が望まれ
ていた。そして、当該因子を単離・同定するためには毛
母細胞と毛乳頭細胞との共存培養系の確立、毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質の開発
等が必要となる。そこで、本発明者らは当該因子の単離
・同定を目的として種々検討し、毛母細胞と毛乳頭細胞
の共存培養系を確立し、先に特許出願した（特願平２−
２１４１８１号）。従って、本発明の目的は毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質、すな
わちモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、毛母細胞・毛乳頭細
胞共存培養系を抗体のスクリーニング系に応用し、加え
て細胞融合技術を利用することにより毛母細胞を認識す
るモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明
を完成した。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、毛母細胞・毛乳頭細
胞共存培養系を抗体のスクリーニング系に応用し、加え
て細胞融合技術を利用することにより毛母細胞を認識す
るモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明
を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は毛母細胞に特異的なモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
ノクローナル抗体を提供するものである。
【０００６】また本発明は毛母細胞に特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するもので
ある。
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するもので
ある。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体は、自体公知
の細胞融合法、すなわち、例えば毛母細胞で免疫した哺
乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を培養する
ことにより製造することができる。
の細胞融合法、すなわち、例えば毛母細胞で免疫した哺
乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合
させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を培養する
ことにより製造することができる。
【０００８】この方法に使用する抗原である毛母細胞
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウスが好ましい。これらの皮膚を適当なプロ
テアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで使用するプ
ロテーゼとしては、トリプシン等が用いられるが、ディ
スパーゼがより好ましい。得られた真皮は、酵素処理、
例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消化し、次い
でクッションを用いた遠心分離に付すことにより毛母細
胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッションとしては
パーコール、ショ糖などが用いられるが、特にフィコー
ルが好ましい。また、上記の方法以外にヒト頭髪やその
他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実体顕微鏡下
で毛乳頭細胞を除去した毛包を使用することもできる。
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウスが好ましい。これらの皮膚を適当なプロ
テアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで使用するプ
ロテーゼとしては、トリプシン等が用いられるが、ディ
スパーゼがより好ましい。得られた真皮は、酵素処理、
例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消化し、次い
でクッションを用いた遠心分離に付すことにより毛母細
胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッションとしては
パーコール、ショ糖などが用いられるが、特にフィコー
ルが好ましい。また、上記の方法以外にヒト頭髪やその
他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実体顕微鏡下
で毛乳頭細胞を除去した毛包を使用することもできる。
【０００９】得られた毛母細胞で免疫するための哺乳動
物としては、通常はＢａｌｂ／ｃマウスが用いられる
が、抗原を採取した動物がマウスであるため、マウス以
外の動物を用いるのが好ましい。かかる動物としては、
ラット、特にＬｅｗｉｓラットを用いるのが好ましい。
免疫は、いかなる方法によっても行われるが、アジュバ
ンドを用いず、腹腔内投与によって行うことが好まし
い。１〜２週間間隔で４回投与することにより効率よく
ラットを免疫できる。抗体産生細胞としては脾臓、リン
パ節、末梢血液等から分離した細胞などが使用できる
が、特に脾臓が好ましい。
物としては、通常はＢａｌｂ／ｃマウスが用いられる
が、抗原を採取した動物がマウスであるため、マウス以
外の動物を用いるのが好ましい。かかる動物としては、
ラット、特にＬｅｗｉｓラットを用いるのが好ましい。
免疫は、いかなる方法によっても行われるが、アジュバ
ンドを用いず、腹腔内投与によって行うことが好まし
い。１〜２週間間隔で４回投与することにより効率よく
ラットを免疫できる。抗体産生細胞としては脾臓、リン
パ節、末梢血液等から分離した細胞などが使用できる
が、特に脾臓が好ましい。
【００１０】一方、骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒ
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット骨髄腫
細胞を用いるのが望ましいが、γグロブリンを全く合成
しないラット由来の骨髄腫細胞は未だ確立されていな
い。そのため、マウス由来の骨髄腫細胞を使用するのが
好ましい。
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット骨髄腫
細胞を用いるのが望ましいが、γグロブリンを全く合成
しないラット由来の骨髄腫細胞は未だ確立されていな
い。そのため、マウス由来の骨髄腫細胞を使用するのが
好ましい。
【００１１】細胞の融合は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
とを適当な個数及び割合、例えば５：１〜１０：１で混
合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０や
ＭＢＭ培地中で５０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００〜６０００程度）を用いて行うことができる。
このほかにもセンダイウィルスを用いたり、電気的に細
胞融合を行うことも可能である。
とを適当な個数及び割合、例えば５：１〜１０：１で混
合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０や
ＭＢＭ培地中で５０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００〜６０００程度）を用いて行うことができる。
このほかにもセンダイウィルスを用いたり、電気的に細
胞融合を行うことも可能である。
【００１２】得られた融合細胞からの抗体産生ハイブリ
ドーマのスクリーニングは、骨髄腫細胞としてＰ３−Ｎ
Ｓ１／１Ａｇ４．１を用いた場合は、ＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培
地）で培養することによりハイブリドーマのみを生育さ
せて行うことができる。抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングは、一般的にはマイクロタイタープレートを
用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行う
ことができる（単クローン抗体実験マニュアル、富山朔
二、安東民衛編、講談社）。
ドーマのスクリーニングは、骨髄腫細胞としてＰ３−Ｎ
Ｓ１／１Ａｇ４．１を用いた場合は、ＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培
地）で培養することによりハイブリドーマのみを生育さ
せて行うことができる。抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングは、一般的にはマイクロタイタープレートを
用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行う
ことができる（単クローン抗体実験マニュアル、富山朔
二、安東民衛編、講談社）。
【００１３】抗体産生ハイブリドーマは、毛母細胞・毛
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウスが好ましい。得られた毛母細胞を真皮ファイブ
ロブラスト画分共存下で細胞外基質を含むゲル中で培養
する。使用される基質としてはいずれでも良いが、特に
マウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好ましい。これ
に適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻
害するハイブリドーマを選択することによって毛母細胞
を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選
択することができる。また、選択されたハイブリドーマ
を単クローン化する方法としては、例えばフィーダー細
胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法に数度かけ
ることにより行うことができる。
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウスが好ましい。得られた毛母細胞を真皮ファイブ
ロブラスト画分共存下で細胞外基質を含むゲル中で培養
する。使用される基質としてはいずれでも良いが、特に
マウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好ましい。これ
に適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻
害するハイブリドーマを選択することによって毛母細胞
を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選
択することができる。また、選択されたハイブリドーマ
を単クローン化する方法としては、例えばフィーダー細
胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法に数度かけ
ることにより行うことができる。
【００１４】得られた単クローン化ハイブリドーマを用
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０5〜１０6個／
mlの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培
地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが増殖
するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体が産
生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば本発
明のモノクローナル抗体を得ることができる。得られた
培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのままでも
使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、プロテインＡ結合担体等によって精
製して用いることがより好ましい。
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０5〜１０6個／
mlの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培
地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが増殖
するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体が産
生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば本発
明のモノクローナル抗体を得ることができる。得られた
培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのままでも
使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、プロテインＡ結合担体等によって精
製して用いることがより好ましい。
【００１５】かくして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛母細胞と強く反応する
が、毛乳頭細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはＩｇＧに属するものとＩｇＭに
属するものとがある。
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛母細胞と強く反応する
が、毛乳頭細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはＩｇＧに属するものとＩｇＭに
属するものとがある。
【００１６】本発明モノクローナル抗体を用いて通常の
免疫学的測定法を実施すれば、毛母細胞及びこの細胞に
存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出できる。
本発明モノクローナル抗体を適用することができる免疫
学的測定法としては特に限定されないが、例えば、スラ
イドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色法な
どが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒド、
ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定された組
織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応させ、結
合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラットイ
ムノグロブリン抗体で検出することにより行うことがで
きる。これらの方法に使用される抗ラットイムノグロブ
リン抗体の標識は酵素の場合、ペルオキシダーゼ、βガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等があり、
そのほかに金コロイドやＩ125、Ｈ3などが挙げられる。
免疫学的測定法を実施すれば、毛母細胞及びこの細胞に
存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出できる。
本発明モノクローナル抗体を適用することができる免疫
学的測定法としては特に限定されないが、例えば、スラ
イドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色法な
どが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒド、
ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定された組
織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応させ、結
合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラットイ
ムノグロブリン抗体で検出することにより行うことがで
きる。これらの方法に使用される抗ラットイムノグロブ
リン抗体の標識は酵素の場合、ペルオキシダーゼ、βガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等があり、
そのほかに金コロイドやＩ125、Ｈ3などが挙げられる。
【００１７】
【発明の効果】本発明モノクローナル抗体は毛母細胞と
特異的に反応するため、毛母細胞の検出、精製はもちろ
ん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する
因子の解明に利用することができる。
特異的に反応するため、毛母細胞の検出、精製はもちろ
ん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する
因子の解明に利用することができる。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】実施例１ モノクローナル抗体及び産生ハ
イブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛母細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅ
ｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更して
調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１０
００ｕ／mlのディスパーゼで４℃、３時間処理した。ピ
ンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２％
コラゲナーゼ、１００μｇ／mlＤＮａｓｅＩを含むＰＢ
Ｓで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦＣＳを
加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイロンフ
ィルターに通し、１２００rpm 、１０分間の遠心にかけ
沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳに
懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを含むＰＢ
Ｓを入れたものに重層した。４００rpm 、１０分間遠心
した後、フィコールの上層を真皮ファイブロブラスト画
分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛母細胞画分
として回収した。毛母細胞画分については１０mlのＰＢ
Ｓを加えて再度フィコール分画を行った。回収されたそ
れぞれの画分に２０mlのＰＢＳを加えて懸濁後、１００
０rpm 、５分間の遠心を行い、ペレットを２．０×１０
6〜１０7細胞／mlとなるようにＰＢＳに懸濁した。
イブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛母細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅ
ｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更して
調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１０
００ｕ／mlのディスパーゼで４℃、３時間処理した。ピ
ンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２％
コラゲナーゼ、１００μｇ／mlＤＮａｓｅＩを含むＰＢ
Ｓで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦＣＳを
加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイロンフ
ィルターに通し、１２００rpm 、１０分間の遠心にかけ
沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳに
懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを含むＰＢ
Ｓを入れたものに重層した。４００rpm 、１０分間遠心
した後、フィコールの上層を真皮ファイブロブラスト画
分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛母細胞画分
として回収した。毛母細胞画分については１０mlのＰＢ
Ｓを加えて再度フィコール分画を行った。回収されたそ
れぞれの画分に２０mlのＰＢＳを加えて懸濁後、１００
０rpm 、５分間の遠心を行い、ペレットを２．０×１０
6〜１０7細胞／mlとなるようにＰＢＳに懸濁した。
【００２０】（２）ラットへの免疫 雌性Ｌｅｗｉｓラット（７もしくは８週齢）を用い次に
示す方法、スケジュールで免疫した。すなわち、初回免
疫として毛母細胞１．４×１０7個をＰＢＳに懸濁した
ものを腹腔内に投与した。２週間後にブースターとして
同様に腹腔内投与を行い、さらに１週間間隔で２度腹腔
内投与を行った。
示す方法、スケジュールで免疫した。すなわち、初回免
疫として毛母細胞１．４×１０7個をＰＢＳに懸濁した
ものを腹腔内に投与した。２週間後にブースターとして
同様に腹腔内投与を行い、さらに１週間間隔で２度腹腔
内投与を行った。
【００２１】（３）細胞融合 最終免疫から３日後、ラットから脾臓を取り出しＲＰＭ
Ｉ１６４０改変培地中でよくほぐした。これを１０００
rpm で１０分間の遠心にかけ、細胞を集め、再度同培地
で洗浄、遠心した。最終的に１０mlの同培地を加え、
５．０×１０8個の脾細胞浮遊液を得た。これに５．０
×１０7個のマウスＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１を混合
し、遠心した。細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄後、遠心して細胞を集めた。遠心管を激しく振とうさ
せながら１分間に３mlの５０％ポリエチレングリコール
を含むＰＢＳを加えた。さらに１分間振とうした後、３
０mlの無血清ＲＰＭＩ１６４０を５分間かけて振とうし
ながら徐々に加え反応を停止した。１０００rpm 、５分
間の遠心で回収した細胞を１００mlのＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．６×１０-5Ｍチミジンを含むＲＰＭＩ１６４０改変
培地）に懸濁し、９６穴マイクロカルチャープレートに
１ウェル当たり０．１mlずつ分注して３７℃、５％ＣＯ
2中で培養した。培養開始１０日後に抗体産生クローン
の選別を行い、１５日後に単クローン化を行った。単ク
ローン化は限界希釈法により行った。すなわち、フィー
ダー細胞としたマウスの胸腺細胞とハイブリドーマをそ
れぞれ１ウェル当たり５×１０5個、１個／１００μｌ
の割合で分注した。３７℃、５％ＣＯ2で１週間培養
し、出現してきたコロニーを観察して単クローンのもの
を選択した。
Ｉ１６４０改変培地中でよくほぐした。これを１０００
rpm で１０分間の遠心にかけ、細胞を集め、再度同培地
で洗浄、遠心した。最終的に１０mlの同培地を加え、
５．０×１０8個の脾細胞浮遊液を得た。これに５．０
×１０7個のマウスＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１を混合
し、遠心した。細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄後、遠心して細胞を集めた。遠心管を激しく振とうさ
せながら１分間に３mlの５０％ポリエチレングリコール
を含むＰＢＳを加えた。さらに１分間振とうした後、３
０mlの無血清ＲＰＭＩ１６４０を５分間かけて振とうし
ながら徐々に加え反応を停止した。１０００rpm 、５分
間の遠心で回収した細胞を１００mlのＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．６×１０-5Ｍチミジンを含むＲＰＭＩ１６４０改変
培地）に懸濁し、９６穴マイクロカルチャープレートに
１ウェル当たり０．１mlずつ分注して３７℃、５％ＣＯ
2中で培養した。培養開始１０日後に抗体産生クローン
の選別を行い、１５日後に単クローン化を行った。単ク
ローン化は限界希釈法により行った。すなわち、フィー
ダー細胞としたマウスの胸腺細胞とハイブリドーマをそ
れぞれ１ウェル当たり５×１０5個、１個／１００μｌ
の割合で分注した。３７℃、５％ＣＯ2で１週間培養
し、出現してきたコロニーを観察して単クローンのもの
を選択した。
【００２２】（４）毛母・毛乳頭細胞相互作用を阻害す
る抗体を産生するハイブリドーマの選択とクローン化 抗毛母細胞モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選
択のために、まず培養上清中の抗体量をＥＬＩＳＡ法で
測定した。培養上清５０μｌをマイクロタイタープレー
トに分注し結合させた後、１％スキムミルクを含むＰＢ
Ｓを０．２ml加え１５分間以上静置しブロッキングを行
った。スクムミルク−ＰＢＳを除いた後、適当に希釈し
たビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ウサギ、ベクター
社、アメリカ）を加えて室温で１時間反応させた。これ
をＰＢＳＴで５回洗浄後、アビジン−ビオチン化ワサビ
ペルオキシダーゼ複合体５０μｌを加えて１５分間反応
させた。これをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ
（ＫＰＬ社、アメリカ）を加えて４１５nmにおける吸光
度の高いウェルを選択した。抗体産生ハイブリドーマの
中、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害するものは毛
母細胞・毛乳頭細胞共存培養系を用いて選択された。Ｅ
ＬＩＳＡ法によって抗体産生が確認され単クローン化さ
れたハイブリドーマは２４穴カルチャープレートを用い
１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で
培養した。ハイブリドーマが増殖してきたら（１〜２週
間後）遠心して細胞を集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、
無血清ＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で３日間培養を
続けた。遠心により培養上清を調製し、そのうちの０．
１mlを毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系に添加した。こ
の場合に用いる毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系は以下
のように調製した。（１）と同様の方法で調製した毛母
細胞画分と真皮ファイブロブラスト画分をそれぞれ２．
５×１０5細胞／ml、３．０×１０6細胞／mlとなるよう
に無血清Ｍ１９９培地に懸濁した。これらとコラーゲン
溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼ
ラチン）、２０mM ＨＥＰＥＳ、２．５mMＮａＯＨ、２
５mM重炭酸ナトリウム、Ｍ１９９培地を含む）を氷冷下
で表１の組成で混合した後、９６穴マイクロカルチャー
プレートに０．１mlずつ分注し、３０分間静置してゲル
化させた。ゲル化が終了したらＭ１９９培地又は培養上
清０．１mlを重層して３７℃、５％ ＣＯ2で培養した。
２日後、１ウェル当たり３７kBq トリチウム標識チミジ
ンを加え２時間標識した。培養上清０．１mlを除き０．
１mlの０．２％コラゲナーゼを加え３７℃でコラーゲン
を消化した。１２００rpm 、５分間の遠心にて細胞を回
収し０．２mlのＰＢＳで洗浄後、１７０μｌの１０％Ｔ
ＣＡを加えて４℃で放置する。２２００rpm １０分間の
遠心にて酸不溶画分を回収し２００μｌのＴＣＡで３回
洗浄した。沈澱を１５０μｌの２ＮＮａＯＨで可溶化し
２Ｎ ＨＣｌで中和した後液体シンチレーションカウン
ターを用いて取り込まれた放射活性を測定した。対照実
験と比べハイブリドーマの培養上清を添加することによ
り毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用が阻害されたものは６
種存在した（表２）。
る抗体を産生するハイブリドーマの選択とクローン化 抗毛母細胞モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選
択のために、まず培養上清中の抗体量をＥＬＩＳＡ法で
測定した。培養上清５０μｌをマイクロタイタープレー
トに分注し結合させた後、１％スキムミルクを含むＰＢ
Ｓを０．２ml加え１５分間以上静置しブロッキングを行
った。スクムミルク−ＰＢＳを除いた後、適当に希釈し
たビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ウサギ、ベクター
社、アメリカ）を加えて室温で１時間反応させた。これ
をＰＢＳＴで５回洗浄後、アビジン−ビオチン化ワサビ
ペルオキシダーゼ複合体５０μｌを加えて１５分間反応
させた。これをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ
（ＫＰＬ社、アメリカ）を加えて４１５nmにおける吸光
度の高いウェルを選択した。抗体産生ハイブリドーマの
中、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害するものは毛
母細胞・毛乳頭細胞共存培養系を用いて選択された。Ｅ
ＬＩＳＡ法によって抗体産生が確認され単クローン化さ
れたハイブリドーマは２４穴カルチャープレートを用い
１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で
培養した。ハイブリドーマが増殖してきたら（１〜２週
間後）遠心して細胞を集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、
無血清ＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で３日間培養を
続けた。遠心により培養上清を調製し、そのうちの０．
１mlを毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系に添加した。こ
の場合に用いる毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系は以下
のように調製した。（１）と同様の方法で調製した毛母
細胞画分と真皮ファイブロブラスト画分をそれぞれ２．
５×１０5細胞／ml、３．０×１０6細胞／mlとなるよう
に無血清Ｍ１９９培地に懸濁した。これらとコラーゲン
溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼ
ラチン）、２０mM ＨＥＰＥＳ、２．５mMＮａＯＨ、２
５mM重炭酸ナトリウム、Ｍ１９９培地を含む）を氷冷下
で表１の組成で混合した後、９６穴マイクロカルチャー
プレートに０．１mlずつ分注し、３０分間静置してゲル
化させた。ゲル化が終了したらＭ１９９培地又は培養上
清０．１mlを重層して３７℃、５％ ＣＯ2で培養した。
２日後、１ウェル当たり３７kBq トリチウム標識チミジ
ンを加え２時間標識した。培養上清０．１mlを除き０．
１mlの０．２％コラゲナーゼを加え３７℃でコラーゲン
を消化した。１２００rpm 、５分間の遠心にて細胞を回
収し０．２mlのＰＢＳで洗浄後、１７０μｌの１０％Ｔ
ＣＡを加えて４℃で放置する。２２００rpm １０分間の
遠心にて酸不溶画分を回収し２００μｌのＴＣＡで３回
洗浄した。沈澱を１５０μｌの２ＮＮａＯＨで可溶化し
２Ｎ ＨＣｌで中和した後液体シンチレーションカウン
ターを用いて取り込まれた放射活性を測定した。対照実
験と比べハイブリドーマの培養上清を添加することによ
り毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用が阻害されたものは６
種存在した（表２）。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】（５）モノクローナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００rp
m ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５０
％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に放
置して得られる沈澱を１００００rpm 、１０分間の遠心
によって回収した。沈澱は２０mMリン酸二水素カリウム
を含む２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）に溶解、透析
した。透析液は２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．１）で４
倍に希釈し、２０mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．６）にて平
衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社、アメリ
カ）に吸着させた。溶出は、リン酸二水素カリウムの２
５〜２５０mMの直線的濃度勾配によって行った。得られ
た抗体画分は限外濾過法によって濃縮した後、ＰＢＳ中
でスーパーロース６カラム（ファルマシア社、スウェー
デン）によってさらに精製された。溶出された抗体の分
子量から、得られたモノクローナル抗体はＩｇＧとＩｇ
Ｍの両タイプがあることが示された。
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００rp
m ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５０
％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に放
置して得られる沈澱を１００００rpm 、１０分間の遠心
によって回収した。沈澱は２０mMリン酸二水素カリウム
を含む２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）に溶解、透析
した。透析液は２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．１）で４
倍に希釈し、２０mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．６）にて平
衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社、アメリ
カ）に吸着させた。溶出は、リン酸二水素カリウムの２
５〜２５０mMの直線的濃度勾配によって行った。得られ
た抗体画分は限外濾過法によって濃縮した後、ＰＢＳ中
でスーパーロース６カラム（ファルマシア社、スウェー
デン）によってさらに精製された。溶出された抗体の分
子量から、得られたモノクローナル抗体はＩｇＧとＩｇ
Ｍの両タイプがあることが示された。
【００２６】実施例２ 毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用
を阻害するモノクローナル抗体を用いた組織染色法によ
る毛母細胞の検出 生後５日のマウスの皮膚をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド
（ミレス社、アメリカ）に包埋、凍結した。凍結ミクロ
トームを使って包埋した皮膚を１μｍの厚さに切り、ゼ
ラチンコートしたスライドガラスにのせた。２％パラホ
ルムアルデヒド、１０mMピクリン酸を含むＰＢＳ中４℃
１時間浸し切片をスライドガラスに固定した。固定後、
ＰＢＳで２回洗浄し、２％過酸化水素、２０％ＰＢＳ、
８０％メタノール中に３０分間浸し内因性のペルオキシ
ダーゼを除去した。ＰＢＳで３回洗浄した後無処理ウサ
ギ血清を切片の上にのせて室温で９０分間放置した。こ
の後、本発明抗体産生ハイブリドーマＨＦ１６、ＨＦ１
０５、ＨＦ１２３５の培養上清をのせ４℃で一昼夜反応
させた。ＰＢＳで５回洗浄後、実施例１の（４）と同様
にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビオチン
化ワサビペルオキシダーゼ複合体を用いて結合したモノ
クローナル抗体を検出した。ただし、発色はＡＢＴＳを
用いずにジアミノベンチジンを用いた。発色後、水道水
で洗浄しヘマトキシリン染色によって核を染色し、再度
水道水で洗浄した。スライドガラスを７０、８０、９
０、１００％エタノール及びキシレンに順次浸して脱水
しカナダバルサムで封入して組織標本として検鏡した。
抗体ＨＦ１６、ＨＦ１０５、ＨＦ１２３５は毛母細胞を
特異的に染色することが明らかになった。
を阻害するモノクローナル抗体を用いた組織染色法によ
る毛母細胞の検出 生後５日のマウスの皮膚をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド
（ミレス社、アメリカ）に包埋、凍結した。凍結ミクロ
トームを使って包埋した皮膚を１μｍの厚さに切り、ゼ
ラチンコートしたスライドガラスにのせた。２％パラホ
ルムアルデヒド、１０mMピクリン酸を含むＰＢＳ中４℃
１時間浸し切片をスライドガラスに固定した。固定後、
ＰＢＳで２回洗浄し、２％過酸化水素、２０％ＰＢＳ、
８０％メタノール中に３０分間浸し内因性のペルオキシ
ダーゼを除去した。ＰＢＳで３回洗浄した後無処理ウサ
ギ血清を切片の上にのせて室温で９０分間放置した。こ
の後、本発明抗体産生ハイブリドーマＨＦ１６、ＨＦ１
０５、ＨＦ１２３５の培養上清をのせ４℃で一昼夜反応
させた。ＰＢＳで５回洗浄後、実施例１の（４）と同様
にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビオチン
化ワサビペルオキシダーゼ複合体を用いて結合したモノ
クローナル抗体を検出した。ただし、発色はＡＢＴＳを
用いずにジアミノベンチジンを用いた。発色後、水道水
で洗浄しヘマトキシリン染色によって核を染色し、再度
水道水で洗浄した。スライドガラスを７０、８０、９
０、１００％エタノール及びキシレンに順次浸して脱水
しカナダバルサムで封入して組織標本として検鏡した。
抗体ＨＦ１６、ＨＦ１０５、ＨＦ１２３５は毛母細胞を
特異的に染色することが明らかになった。
【００２７】実施例３ 酵素免疫測定法による毛母細胞
表面抗原の検出 （１）毛母細胞吸着プレートの調製 実施例１の（１）と同様の方法で毛母細胞画分を調製す
る。細胞は１０6個／mlとなるようにＰＢＳ中に懸濁
し、０．１％グルタルアルデヒドであらかじめ処理して
おいた９６穴マイクロタイタープレートに０．１mlずつ
分注する。１１００rpm ５分間の遠心の後上清を除き
０．１mlの０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳを
加えて室温で３０分間放置して細胞をプレートに固定す
る。ＰＢＳで３回洗浄し１％スキムミルクを加え４℃で
一昼夜ブロッキングを行う。ブロッキング後使用するま
で−２０℃で保存する。
表面抗原の検出 （１）毛母細胞吸着プレートの調製 実施例１の（１）と同様の方法で毛母細胞画分を調製す
る。細胞は１０6個／mlとなるようにＰＢＳ中に懸濁
し、０．１％グルタルアルデヒドであらかじめ処理して
おいた９６穴マイクロタイタープレートに０．１mlずつ
分注する。１１００rpm ５分間の遠心の後上清を除き
０．１mlの０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳを
加えて室温で３０分間放置して細胞をプレートに固定す
る。ＰＢＳで３回洗浄し１％スキムミルクを加え４℃で
一昼夜ブロッキングを行う。ブロッキング後使用するま
で−２０℃で保存する。
【００２８】（２）表面抗原の検出 抗体産生ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
１６４０改変培地で培養し、遠心分離によって培養上清
を回収する。上清０．１mlを毛母細胞吸着プレートに加
え室温で１時間反応させる。未反応の抗体をＰＢＳＴに
よる５回の洗浄によって除いた後、実施例１の（４）と
同様にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビオ
チン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、ＡＢＴＳを
用いて本発明モノクローナル抗体の結合量を４１５nmの
吸光度によって測定した。その結果、対照実験と比較し
て１０クローン（ＨＦ１２、ＨＦ１７、ＨＦ４８、ＨＦ
４９、ＨＦ５７、ＨＦ１１９、ＨＦ１２７、ＨＦ１２
８、ＨＦ１３０、ＨＦ１９９）が有意な吸光度を示し
た。
１６４０改変培地で培養し、遠心分離によって培養上清
を回収する。上清０．１mlを毛母細胞吸着プレートに加
え室温で１時間反応させる。未反応の抗体をＰＢＳＴに
よる５回の洗浄によって除いた後、実施例１の（４）と
同様にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビオ
チン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、ＡＢＴＳを
用いて本発明モノクローナル抗体の結合量を４１５nmの
吸光度によって測定した。その結果、対照実験と比較し
て１０クローン（ＨＦ１２、ＨＦ１７、ＨＦ４８、ＨＦ
４９、ＨＦ５７、ＨＦ１１９、ＨＦ１２７、ＨＦ１２
８、ＨＦ１３０、ＨＦ１９９）が有意な吸光度を示し
た。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】毛包組織は、毛球部において間質系の細
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】この方法に使用する抗原である毛母細胞
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウス又はラットが好ましい。これらの皮膚を
適当なプロテアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで
使用するプロテーゼとしては、トリプシン等が用いられ
るが、ディスパーゼがより好ましい。得られた真皮は、
酵素処理、例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消
化し、次いでクッションを用いた遠心分離に付すことに
より毛母細胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッショ
ンとしてはパーコール、ショ糖などが用いられるが、特
にフィコールが好ましい。また、上記の方法以外にヒト
頭髪やその他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実
体顕微鏡下で毛乳頭細胞を除去した毛包を使用すること
もできる。
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウス又はラットが好ましい。これらの皮膚を
適当なプロテアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで
使用するプロテーゼとしては、トリプシン等が用いられ
るが、ディスパーゼがより好ましい。得られた真皮は、
酵素処理、例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消
化し、次いでクッションを用いた遠心分離に付すことに
より毛母細胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッショ
ンとしてはパーコール、ショ糖などが用いられるが、特
にフィコールが好ましい。また、上記の方法以外にヒト
頭髪やその他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実
体顕微鏡下で毛乳頭細胞を除去した毛包を使用すること
もできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】一方、骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒ
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット脾臓を
用いた場合はラット骨髄腫細胞を用いるのが望ましい
が、γグロブリンを全く合成しないラット由来の骨髄腫
細胞は未だ確立されていない。そのため、マウス由来の
骨髄腫細胞を使用するのが好ましい。
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット脾臓を
用いた場合はラット骨髄腫細胞を用いるのが望ましい
が、γグロブリンを全く合成しないラット由来の骨髄腫
細胞は未だ確立されていない。そのため、マウス由来の
骨髄腫細胞を使用するのが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】抗体産生ハイブリドーマは、毛母細胞・毛
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウス又はラットが好ましい。得られた毛母細胞を真
皮ファイブロブラスト画分共存下で細胞外基質を含むゲ
ル中で培養する。使用される基質としてはいずれでも良
いが、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好ま
しい。これに適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイ
ブリドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相
互作用を阻害するハイブリドーマを選択することによっ
て毛母細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。また、選択されたハイ
ブリドーマを単クローン化する方法としては、例えばフ
ィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法
に数度かけることにより行うことができる。
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウス又はラットが好ましい。得られた毛母細胞を真
皮ファイブロブラスト画分共存下で細胞外基質を含むゲ
ル中で培養する。使用される基質としてはいずれでも良
いが、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好ま
しい。これに適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイ
ブリドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相
互作用を阻害するハイブリドーマを選択することによっ
て毛母細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。また、選択されたハイ
ブリドーマを単クローン化する方法としては、例えばフ
ィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法
に数度かけることにより行うことができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】得られた単クローン化ハイブリドーマを用
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０５〜１０６個
／ｍｌの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改
変培地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが
増殖するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体
が産生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば
本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。得ら
れた培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのまま
でも使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換
クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗Ｉｇ
Ｇ抗体カラム等によって精製して用いることがより好ま
しい。
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０５〜１０６個
／ｍｌの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改
変培地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが
増殖するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体
が産生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば
本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。得ら
れた培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのまま
でも使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換
クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗Ｉｇ
Ｇ抗体カラム等によって精製して用いることがより好ま
しい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】かくして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛母細胞と強く反応する
が、毛乳頭細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはラットＩｇＧとＩｇＭに属する
ものとマウスＩｇＧ１とＩｇＭに属するものとがある。
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛母細胞と強く反応する
が、毛乳頭細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはラットＩｇＧとＩｇＭに属する
ものとマウスＩｇＧ１とＩｇＭに属するものとがある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】本発明モノクローナル抗体を用いて通常の
免疫学的測定法を実施すれば、毛母細胞及びこの細胞に
存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出できる。
本発明モノクローナル抗体を適用することができる免疫
学的測定法としては特に限定されないが、例えば、スラ
イドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色法な
どが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒド、
ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定された組
織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応させ、結
合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラット又
は抗マウスイムノグロブリン抗体で検出することにより
行うことができる。これらの方法に使用される抗ラット
又は抗マウスイムノグロブリン抗体の標識は酵素の場
合、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ等があり、そのほかに金コロイドや
１２５Ｉ、３Ｈなどが挙げられる。
免疫学的測定法を実施すれば、毛母細胞及びこの細胞に
存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出できる。
本発明モノクローナル抗体を適用することができる免疫
学的測定法としては特に限定されないが、例えば、スラ
イドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色法な
どが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒド、
ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定された組
織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応させ、結
合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラット又
は抗マウスイムノグロブリン抗体で検出することにより
行うことができる。これらの方法に使用される抗ラット
又は抗マウスイムノグロブリン抗体の標識は酵素の場
合、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ等があり、そのほかに金コロイドや
１２５Ｉ、３Ｈなどが挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】実施例１ 抗マウス毛母細胞モノクローナ
ル抗体及び産生ハイブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛母細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅ
ｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更して
調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１０
００ｕ／ｍｌのディスパーゼで４℃、３時間処理した。
ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２
％コラゲナーゼ、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含
むＰＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦ
ＣＳを加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイ
ロンフィルターに通し、１２００ｒｐｍ、１０分間の遠
心にかけ沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞を
ＰＢＳに懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを
含むＰＢＳを入れたものに重層した。４００ｒｐｍ、１
０分間遠心した後、フィコールの上層を真皮ファイブロ
ブラスト画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛
母細胞画分として回収した。毛母細胞画分については１
０ｍｌのＰＢＳを加えて再度フィコール分画を行った。
回収されたそれぞれの画分に２０ｍｌのＰＢＳを加えて
懸濁後、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、ペレッ
トを２．０×１０６〜１０７細胞／ｍｌとなるようにＰ
ＢＳに懸濁した。
ル抗体及び産生ハイブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛母細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ
ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅ
ｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更して
調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１０
００ｕ／ｍｌのディスパーゼで４℃、３時間処理した。
ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２
％コラゲナーゼ、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含
むＰＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦ
ＣＳを加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイ
ロンフィルターに通し、１２００ｒｐｍ、１０分間の遠
心にかけ沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞を
ＰＢＳに懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを
含むＰＢＳを入れたものに重層した。４００ｒｐｍ、１
０分間遠心した後、フィコールの上層を真皮ファイブロ
ブラスト画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛
母細胞画分として回収した。毛母細胞画分については１
０ｍｌのＰＢＳを加えて再度フィコール分画を行った。
回収されたそれぞれの画分に２０ｍｌのＰＢＳを加えて
懸濁後、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、ペレッ
トを２．０×１０６〜１０７細胞／ｍｌとなるようにＰ
ＢＳに懸濁した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【表２】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】（５）ラット抗マウス毛母細胞モノクロー
ナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００ｒ
ｐｍ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５
０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に
放置して得られる沈澱を１００００ｒｐｍ、１０分間の
遠心によって回収した。沈澱は２０ｍＭリン酸二水素カ
リウムを含む２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解、透析した。透析液は２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ５．１）で４倍に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ５．６）にて平衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．
ベーカー社、アメリカ）に吸着させた。溶出は、リン酸
二水素カリウムの２５〜２５０ｍＭの直線的濃度勾配に
よって行った。得られた抗体画分は限外濾過法によって
濃縮した後、ＰＢＳ中でスーパーロース６カラム（ファ
ルマシア社、スウェーデン）によってさらに精製され
た。溶出された抗体の分子量から、得られたモノクロー
ナル抗体はＩｇＧとＩｇＭの両タイプがあることが示さ
れた（表２）。
ナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００ｒ
ｐｍ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５
０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に
放置して得られる沈澱を１００００ｒｐｍ、１０分間の
遠心によって回収した。沈澱は２０ｍＭリン酸二水素カ
リウムを含む２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解、透析した。透析液は２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ５．１）で４倍に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ５．６）にて平衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．
ベーカー社、アメリカ）に吸着させた。溶出は、リン酸
二水素カリウムの２５〜２５０ｍＭの直線的濃度勾配に
よって行った。得られた抗体画分は限外濾過法によって
濃縮した後、ＰＢＳ中でスーパーロース６カラム（ファ
ルマシア社、スウェーデン）によってさらに精製され
た。溶出された抗体の分子量から、得られたモノクロー
ナル抗体はＩｇＧとＩｇＭの両タイプがあることが示さ
れた（表２）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】（２）表面抗原の検出 抗体産生ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
１６４０改変培地で培養し、遠心分離によって培養上清
を回収する。上清０．１ｍｌを毛母細胞吸着プレートに
加え室温で１時間反応させる。未反応の抗体をＰＢＳＴ
による５回の洗浄によって除いた後、実施例１の（４）
と同様にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビ
オチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、ＡＢＴＳ
を用いて本発明モノクローナル抗体の結合量を４１５ｎ
ｍの吸光度によって測定した。その結果、対照実験と比
較して１０クローン（ＨＦ１２、ＨＦ１７、ＨＦ４８、
ＨＦ４９、ＨＦ５７、ＨＦ１１９、ＨＦ１２７、ＨＦ１
２８、ＨＦ１３０、ＨＦ１９９）が有意な吸光度を示し
た。実施例４ 抗ラット毛母細胞モノクローナル抗体及
び産生ハイブリドーマの確立生後３〜１０日齢のＳＤラ
ットより実施例１の（１）に述べた方法により毛母細胞
画分を調製し、抗原として用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス
１匹当たり１０８細胞の毛母細胞を投与した。適当な期
間をおいて同様に抗原投与を４〜５回繰り返した。最終
免疫後、実施例１と同様に脾臓細胞とマウス骨髄腫とを
細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを得た。抗ラット
毛母細胞モノクローナル抗体のスクリーニングも実施例
１と同様の方法で行ったが、毛母細胞・毛乳頭細胞共存
培養はＳＤラット由来の細胞を用いて行った。その結
果、２種類（ＲＨＦ２１−Ｇ４、ＲＨＦ２３−Ｄ５）の
抗ラット毛母細胞ハイブリドーマの産生するモノクロー
ナル抗体が有意に毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害
した。これらのモノクローナル抗体のサブクラスは、そ
れぞれＩｇＧ１、ＩｇＭであった（表２）
１６４０改変培地で培養し、遠心分離によって培養上清
を回収する。上清０．１ｍｌを毛母細胞吸着プレートに
加え室温で１時間反応させる。未反応の抗体をＰＢＳＴ
による５回の洗浄によって除いた後、実施例１の（４）
と同様にビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体、アビジン−ビ
オチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、ＡＢＴＳ
を用いて本発明モノクローナル抗体の結合量を４１５ｎ
ｍの吸光度によって測定した。その結果、対照実験と比
較して１０クローン（ＨＦ１２、ＨＦ１７、ＨＦ４８、
ＨＦ４９、ＨＦ５７、ＨＦ１１９、ＨＦ１２７、ＨＦ１
２８、ＨＦ１３０、ＨＦ１９９）が有意な吸光度を示し
た。実施例４ 抗ラット毛母細胞モノクローナル抗体及
び産生ハイブリドーマの確立生後３〜１０日齢のＳＤラ
ットより実施例１の（１）に述べた方法により毛母細胞
画分を調製し、抗原として用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス
１匹当たり１０８細胞の毛母細胞を投与した。適当な期
間をおいて同様に抗原投与を４〜５回繰り返した。最終
免疫後、実施例１と同様に脾臓細胞とマウス骨髄腫とを
細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを得た。抗ラット
毛母細胞モノクローナル抗体のスクリーニングも実施例
１と同様の方法で行ったが、毛母細胞・毛乳頭細胞共存
培養はＳＤラット由来の細胞を用いて行った。その結
果、２種類（ＲＨＦ２１−Ｇ４、ＲＨＦ２３−Ｄ５）の
抗ラット毛母細胞ハイブリドーマの産生するモノクロー
ナル抗体が有意に毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害
した。これらのモノクローナル抗体のサブクラスは、そ
れぞれＩｇＧ１、ＩｇＭであった（表２）
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 毛母細胞に特異的なモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 毛母細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生
細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞により産生さ
れるものである請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 毛母細胞に特異的なモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 毛母細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生
細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により得られるも
のである請求項３記載のハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026633A JPH05219981A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026633A JPH05219981A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219981A true JPH05219981A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12198858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4026633A Pending JPH05219981A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05219981A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0653440A1 (en) * | 1993-11-12 | 1995-05-17 | Research Development Corporation Of Japan | Monoclonal antibodies against hair follicle, hybridomas producing them |
-
1992
- 1992-02-13 JP JP4026633A patent/JPH05219981A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0653440A1 (en) * | 1993-11-12 | 1995-05-17 | Research Development Corporation Of Japan | Monoclonal antibodies against hair follicle, hybridomas producing them |
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