JPS6124523A - モノクロ−ナル抗体の製造方法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体の製造方法Info
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- JPS6124523A JPS6124523A JP14585284A JP14585284A JPS6124523A JP S6124523 A JPS6124523 A JP S6124523A JP 14585284 A JP14585284 A JP 14585284A JP 14585284 A JP14585284 A JP 14585284A JP S6124523 A JPS6124523 A JP S6124523A
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- virus
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- antigen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（利用分野）
本発明は、モノクローナル抗体を製造する方法に関する
。更に詳しくは、チンパンジーに抗原を免疫することに
より、感作されたＢ−リンパ球を得、これを向リンパ性
ウィルスにより形質転換さ、 せることからなるモノ
クローナル抗体を製造する方法に関する。
。更に詳しくは、チンパンジーに抗原を免疫することに
より、感作されたＢ−リンパ球を得、これを向リンパ性
ウィルスにより形質転換さ、 せることからなるモノ
クローナル抗体を製造する方法に関する。
（従来技術）
最近のＩｎ Ｖｉｔｒｏにおけるモノクローナル抗体の
製造方法の発展は目ざましいものがあり、ヒトの悪性腫
瘍細胞の抗原性や抗原構造の分析および定義づけなどが
盛んに行われている。しかし、そのモノクローナル抗体
のほとんどがマウスの融合細胞で作られたものである。
製造方法の発展は目ざましいものがあり、ヒトの悪性腫
瘍細胞の抗原性や抗原構造の分析および定義づけなどが
盛んに行われている。しかし、そのモノクローナル抗体
のほとんどがマウスの融合細胞で作られたものである。
また、ヒト・モノクローナル抗体に関する報告もあるが
、ヒト・モノクローナル抗体では、製造できる抗体の特
異性に限度が見られ、ワクチンとして調製されていない
ような病原菌やるいはウィルスをヒトに接種して、その
免疫抗体を調製するようなことは人道上杵されない。
、ヒト・モノクローナル抗体では、製造できる抗体の特
異性に限度が見られ、ワクチンとして調製されていない
ような病原菌やるいはウィルスをヒトに接種して、その
免疫抗体を調製するようなことは人道上杵されない。
（本発明の目的）
本発明は、疾病の診断、予防、治療用として有用なヒト
以外の動物モノクローナル抗体を提供することを目的と
するものである。
以外の動物モノクローナル抗体を提供することを目的と
するものである。
かかる目的達成のために本発明者らは、種々研究を重ね
てきたところ、チンパンジーに抗原を免疫することによ
り、感作されたＢ−リンパ球を得、これを向リンパ性ウ
ィルスにより形質転換させることにより、モノクローナ
ル抗体を調製することに成功し、本発明を完成した。
てきたところ、チンパンジーに抗原を免疫することによ
り、感作されたＢ−リンパ球を得、これを向リンパ性ウ
ィルスにより形質転換させることにより、モノクローナ
ル抗体を調製することに成功し、本発明を完成した。
（発明の開示）
即ち、本発明は、チン穴ンジーに抗原を免疫することに
より感作されたＢ−リンパ球を向リンパ性ウィルスによ
り形質転換させることにより、増殖型のＢ−リンパ球を
得１、これを培養することによりモノクローナル抗体を
産生させることを特徴とするモノクローナル抗体の製造
方法よりなるものである。
より感作されたＢ−リンパ球を向リンパ性ウィルスによ
り形質転換させることにより、増殖型のＢ−リンパ球を
得１、これを培養することによりモノクローナル抗体を
産生させることを特徴とするモノクローナル抗体の製造
方法よりなるものである。
本発明は以下の一連の操作より構成される。
＋１１免疫原の鋼製
本発明で用いられる免疫原は、特に限定されない。例え
ば、各種病原菌、ウィルス、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ
、 ＨＢｅＡｇ 、 ＨＢｃＡｇ等）、非Ａ非Ｂ型肝炎
抗原、破傷風毒素、腫瘍細胞（例えばヒトの肺ガン、胃
ガン、悪性肉腫等の固形ガン、および白血病、リンパ腫
等の血液ガンなど）、インターフェロン、ウロキナーゼ
等が例示される。要するに、人体を用いての免疫が困難
なものほど好適である。
ば、各種病原菌、ウィルス、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ
、 ＨＢｅＡｇ 、 ＨＢｃＡｇ等）、非Ａ非Ｂ型肝炎
抗原、破傷風毒素、腫瘍細胞（例えばヒトの肺ガン、胃
ガン、悪性肉腫等の固形ガン、および白血病、リンパ腫
等の血液ガンなど）、インターフェロン、ウロキナーゼ
等が例示される。要するに、人体を用いての免疫が困難
なものほど好適である。
免疫原は使用前に高度に精製されていることが好ましい
。
。
（２）免疫
動物としてはチンパンジーが用いられる。
免疫方法は公知の方法を用いればよい。例えば高度精製
した免疫原とフロイントの完全アジュバントの混合乳液
を作り、動物の皮下あるいは筋肉内に２〜３回注射免疫
後、採血を行う。
した免疫原とフロイントの完全アジュバントの混合乳液
を作り、動物の皮下あるいは筋肉内に２〜３回注射免疫
後、採血を行う。
（３）Ｂ−リンパ球の分離・回収
得られた血液からＢ−リンパ球を分離、回収するには、
フィコール・コンレイの比重遠心法（Ｊ。
フィコール・コンレイの比重遠心法（Ｊ。
Ｃｌ１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、 ２１．５ｕ
ｐｐ１．７７〜８９ （１９６Ｂ）〕等が用いられる。
ｐｐ１．７７〜８９ （１９６Ｂ）〕等が用いられる。
（４）形質転換
形質転換には向リンパ性ウィルス、たとえば、Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）が用いられ
る。当該ウィルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させる（Ｎａｔｕｒｅ、 ２６９．４２０〜４２２
（１９７７） ）ウィルスとして知られる。形質転換は
、例えば次の如くして行われる。Ｂ９５−８由来ＥＢウ
イルス（マイコプラスマ フリー Ｂ９５−８培地から
の上清としてうる）を用い、あらかじめ細胞転換可能量
のウィルスを調製する。この調製されたウィルスを回収
したＢ−リンパ球の培養系培地に適量滴下し、接触させ
る。Ｂ−リンパ球の培養は、たとえば３７℃、５％ｃｏ
２下でＲＰＭｌ １６４０ ＋１０〜２０％牛脂児血清
中で行う。
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス（ＥＢウィルス）が用いられ
る。当該ウィルスは正常細胞を増殖型の細胞に形質転換
させる（Ｎａｔｕｒｅ、 ２６９．４２０〜４２２
（１９７７） ）ウィルスとして知られる。形質転換は
、例えば次の如くして行われる。Ｂ９５−８由来ＥＢウ
イルス（マイコプラスマ フリー Ｂ９５−８培地から
の上清としてうる）を用い、あらかじめ細胞転換可能量
のウィルスを調製する。この調製されたウィルスを回収
したＢ−リンパ球の培養系培地に適量滴下し、接触させ
る。Ｂ−リンパ球の培養は、たとえば３７℃、５％ｃｏ
２下でＲＰＭｌ １６４０ ＋１０〜２０％牛脂児血清
中で行う。
（５）モノクローナル抗体産生細胞の選別抗体産生細胞
は、例えばＰＨＡ法（受身赤血球凝集分析法）、ＲＩＡ
法（放射免疫分析法）、ＥＩＡ法（酵素免疫分析法）、
マイクロサイトドキシシティテスト法（Ｍｉｃｒｏｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅ５ｔ）、螢光抗体法などに
よって追跡される。
は、例えばＰＨＡ法（受身赤血球凝集分析法）、ＲＩＡ
法（放射免疫分析法）、ＥＩＡ法（酵素免疫分析法）、
マイクロサイトドキシシティテスト法（Ｍｉｃｒｏｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔｅ５ｔ）、螢光抗体法などに
よって追跡される。
この細胞をクローン化するには、例えば限界希釈法、軟
寒天法などを用いる。
寒天法などを用いる。
かくして、クローニングされたモノクローナル抗体産生
細胞株を、例えば０．５％牛血清アルブミン含無血清培
地中で増殖させ、培地中に抗体を産生させる。
細胞株を、例えば０．５％牛血清アルブミン含無血清培
地中で増殖させ、培地中に抗体を産生させる。
（６）モノクローナル抗体の回収・精製産生じたモノク
ローナル抗体の回収は、例えば免疫原で固定化した担体
を用いて行う。しかし、これに限られるものではなく、
その他にも免疫グロブリンの回収、精製法として知られ
るものも利用できる。例えば、ＤＥＡＥ−イオン交換ク
ロマトグラフィー、硫安分画法、ポリエチレングリコー
ル分画法、透析法、遠心分離法、アフィニティクロマト
グラフィー、ゲル濾過法などが挙げられる。
ローナル抗体の回収は、例えば免疫原で固定化した担体
を用いて行う。しかし、これに限られるものではなく、
その他にも免疫グロブリンの回収、精製法として知られ
るものも利用できる。例えば、ＤＥＡＥ−イオン交換ク
ロマトグラフィー、硫安分画法、ポリエチレングリコー
ル分画法、透析法、遠心分離法、アフィニティクロマト
グラフィー、ゲル濾過法などが挙げられる。
また、これらを適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。
る。
精製抗体は、水溶液中に濃度調製後、適当な安定剤、賦
形剤を添加させ、要すれば除菌濾過を行い、凍結乾燥を
行い、常法に従って製剤化することができる。
形剤を添加させ、要すれば除菌濾過を行い、凍結乾燥を
行い、常法に従って製剤化することができる。
本発明によって得られる抗体、即ち、各種抗原に対する
チンパンジー・モノクローナル抗体は、対応する抗原の
検出のみならず、該抗原の関与する疾病の防御に用いる
ことができる。
チンパンジー・モノクローナル抗体は、対応する抗原の
検出のみならず、該抗原の関与する疾病の防御に用いる
ことができる。
さらに、かかる抗体は、既知の動物抗体に比して、ヒト
に対してより抗原性が低く、ヒトに投与しても免疫学的
により安全であることが期待される。
に対してより抗原性が低く、ヒトに投与しても免疫学的
により安全であることが期待される。
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を挙げる
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
１、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期のチンパンジー末梢血リンパ
球のトランスフォーメーション ｆｌ）培地 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ペニシリン１１００ｔ１／
ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、グルタミ
ン２１、炭酸水素ナトリウム１．６ｇ／ｌを加えた後、
二酸化炭素を吹き込み、ρ）１７．０〜７．４とし、牛
胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａ１ｆ Ｓｅｒｃｎｗ ：
Ｆ ＣＳ）を２０％となるように加えて使用した（以下
、培地Ａという）。
球のトランスフォーメーション ｆｌ）培地 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ペニシリン１１００ｔ１／
ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、グルタミ
ン２１、炭酸水素ナトリウム１．６ｇ／ｌを加えた後、
二酸化炭素を吹き込み、ρ）１７．０〜７．４とし、牛
胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａ１ｆ Ｓｅｒｃｎｗ ：
Ｆ ＣＳ）を２０％となるように加えて使用した（以下
、培地Ａという）。
＋２１ Ｅ Ｂウィルスの作製
ＥＢウィルスを産生ずるＢ９５−８細胞（ＰｒＬｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｒ
ｎｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ７０（ＩＬ １９０−
１９４ （１９７３） ）を３ Ｘｌ０５７ｍ＋の細
胞密度で、ＲＰＭＩ １６４（１＋ １０％ＦＣ３培地
を用いて７日間培養し、０．４５μｍのミリポアフィル
タ−で濾過した培養上清をウィルス液として用いた。ウ
ィルスの力価判定には、麿帯血のトランスフォーメーシ
ョンを利用したＴＤｓｏ／ｍ１を用いた。ウィルスは、
その力価が１０５７Ｄｓｏ／ｍ１以上のものを用いた。
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｒ
ｎｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ７０（ＩＬ １９０−
１９４ （１９７３） ）を３ Ｘｌ０５７ｍ＋の細
胞密度で、ＲＰＭＩ １６４（１＋ １０％ＦＣ３培地
を用いて７日間培養し、０．４５μｍのミリポアフィル
タ−で濾過した培養上清をウィルス液として用いた。ウ
ィルスの力価判定には、麿帯血のトランスフォーメーシ
ョンを利用したＴＤｓｏ／ｍ１を用いた。ウィルスは、
その力価が１０５７Ｄｓｏ／ｍ１以上のものを用いた。
（３）リンパ球の分離・回収
非Ａ非Ｂ型肝炎患者のプール血漿１ｍｌを健康な成雄チ
ンパンジーの筋肉内に投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎を発症さ
せた。ついで、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期になったチンパン
ジーのヘパリン加採血によって得た静脈血から、フィコ
ール−コンレイ比重遠心法（フィコール−コンレイの比
重１．０７７ ）で単核球を分取し、末梢血リンパ球を
分離した。上記の方法で末梢血１ｍｌ当り約１０６個の
末梢血リンパ球が分離される。
ンパンジーの筋肉内に投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎を発症さ
せた。ついで、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期になったチンパン
ジーのヘパリン加採血によって得た静脈血から、フィコ
ール−コンレイ比重遠心法（フィコール−コンレイの比
重１．０７７ ）で単核球を分取し、末梢血リンパ球を
分離した。上記の方法で末梢血１ｍｌ当り約１０６個の
末梢血リンパ球が分離される。
＋４１ Ｅ Ｂウィルスの吸着及び培養遠心により沈査
とした末梢血リンパ球１０６個当り１ｍｌのＥＢウィル
ス（１０５ＴＤｓｏ／ｍ１以上）を加え、３７℃で１時
間放置した。その後、遠心によりウィルス液を除き、培
地Ａを加え、細胞密度を調整し、平底マイクロタイター
プレートに０．１ｍｌずつ細胞を植えこんだ。４日後に
培地を０、Ｉｔｌ加え、以後４〜７日に１度培地の半量
交換を行った。植えこむ細胞数によって異なるが、平底
マイクロタイタープレートのウェル当り１０５個では、
７〜１０日で細胞が細胞集塊を形成し、活発に増殖して
くる。通常、ＥＢウィルスを吸着させた末梢血リンパ球
を、平底マイクロタイタープレートのウェル当り１０３
〜１０５個の細胞密度で植えこむ。
とした末梢血リンパ球１０６個当り１ｍｌのＥＢウィル
ス（１０５ＴＤｓｏ／ｍ１以上）を加え、３７℃で１時
間放置した。その後、遠心によりウィルス液を除き、培
地Ａを加え、細胞密度を調整し、平底マイクロタイター
プレートに０．１ｍｌずつ細胞を植えこんだ。４日後に
培地を０、Ｉｔｌ加え、以後４〜７日に１度培地の半量
交換を行った。植えこむ細胞数によって異なるが、平底
マイクロタイタープレートのウェル当り１０５個では、
７〜１０日で細胞が細胞集塊を形成し、活発に増殖して
くる。通常、ＥＢウィルスを吸着させた末梢血リンパ球
を、平底マイクロタイタープレートのウェル当り１０３
〜１０５個の細胞密度で植えこむ。
（５）培養上清中の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体の検出細胞
が増殖してきた後、培養上清を集め、螢光抗体法で抗体
価を測定した。その時期は植えこむ細胞数によって異な
るが、３週目から４週目に−かけて抗体活性陽性のウェ
ルが認められる。抗体陽性のウェルは、２４穴マルチウ
エルプレート、３５龍のシャーレ、６０ＩＩｍのシャー
レと培ｉｌを拡大し、トランスフオーム６週目からクロ
ーニングを行った。
が増殖してきた後、培養上清を集め、螢光抗体法で抗体
価を測定した。その時期は植えこむ細胞数によって異な
るが、３週目から４週目に−かけて抗体活性陽性のウェ
ルが認められる。抗体陽性のウェルは、２４穴マルチウ
エルプレート、３５龍のシャーレ、６０ＩＩｍのシャー
レと培ｉｌを拡大し、トランスフオーム６週目からクロ
ーニングを行った。
２、クローニング
限界希釈法により行った。
あらかじめ１，５００ Ｒａｄ以上照射したバーキット
リンパ腫細胞を、マイクロタイタープレートにウェル当
り２５，０００個植九０んだ。次に培地Ａで、１０．５
．２．５．１個１０．１ｍｌとなるように細胞を希釈し
、これをマイクロタイタープレートに０．１ｎ＋１ずつ
植えこみ培養した。４日後に培地Ａを０．１ｍｌ加え、
以後４〜７日に１度培地の半量交換を行った。
リンパ腫細胞を、マイクロタイタープレートにウェル当
り２５，０００個植九０んだ。次に培地Ａで、１０．５
．２．５．１個１０．１ｍｌとなるように細胞を希釈し
、これをマイクロタイタープレートに０．１ｎ＋１ずつ
植えこみ培養した。４日後に培地Ａを０．１ｍｌ加え、
以後４〜７日に１度培地の半量交換を行った。
培養開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが
形成され、クローン株を得た。
形成され、クローン株を得た。
３、抗体の回収・精製
上記クローン株を、０．５％牛血清アルブミン（８，５
Ａ ）台無血清培地（ＲＩ Ｔ Ｃ５５−９培地）中で
増殖させ、培養上清を集めた。この上清を限外濾過（分
子量３０万以下の分子を排除する）後、“５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−３００によるゲル濾過クロマトグラフィ
ー（０，２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９，０）で精製し、抗
体を得た。このチンパンジー型の精製抗体は、オフタロ
ニー法および免疫電気泳動法で、ＩｇＭ抗体に対応する
沈降線を示した。還元条件下°のＳＤＳ電気泳動分析で
は、ＩｇＭのＨ鎮と、Ｌ鎖に相当する２本のバンドが認
められた。
Ａ ）台無血清培地（ＲＩ Ｔ Ｃ５５−９培地）中で
増殖させ、培養上清を集めた。この上清を限外濾過（分
子量３０万以下の分子を排除する）後、“５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−３００によるゲル濾過クロマトグラフィ
ー（０，２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９，０）で精製し、抗
体を得た。このチンパンジー型の精製抗体は、オフタロ
ニー法および免疫電気泳動法で、ＩｇＭ抗体に対応する
沈降線を示した。還元条件下°のＳＤＳ電気泳動分析で
は、ＩｇＭのＨ鎮と、Ｌ鎖に相当する２本のバンドが認
められた。
実施例２
実施例１において、下記軟寒天法によりクローニングを
行った以外は実施例１と同様にして細胞株を得、ついで
精製抗体を得た。
行った以外は実施例１と同様にして細胞株を得、ついで
精製抗体を得た。
（軟寒天法）
支持層０．５％、接種層０．３％のアガロース（マリー
ン コロイズ社製：“シー プラーク”アガロース）を
含む培地Ａを用いる。細胞はプレート当り１００〜１０
，０００個植えこむ。培養開始後１０〜２０日で肉眼で
認められるコロニーが形成される。
ン コロイズ社製：“シー プラーク”アガロース）を
含む培地Ａを用いる。細胞はプレート当り１００〜１０
，０００個植えこむ。培養開始後１０〜２０日で肉眼で
認められるコロニーが形成される。
この時点で、パスツールピペットを用い７ コＯニーを
吸い上げ、あらかじめ０．１ｍｌの培地Ａを入れたマイ
クロタイタープレートに細胞を移して培養し、クローン
株を得る。
吸い上げ、あらかじめ０．１ｍｌの培地Ａを入れたマイ
クロタイタープレートに細胞を移して培養し、クローン
株を得る。
実施例３
１、Ｂ型肝炎ワクチン投与をしたチンパンジー末梢血リ
ンパ球のトランスフォーメーション＋１１培地及びＥＢ
ウィルスの調整は、実施例１に準じた。
ンパ球のトランスフォーメーション＋１１培地及びＥＢ
ウィルスの調整は、実施例１に準じた。
（２）リンパ球の分離・回収
免疫抗原としてＢ型肝炎ワクチン（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｂ Ｖａｃｃｉｎｅ （ＨＢワクチン））を使用した。
Ｂ Ｖａｃｃｉｎｅ （ＨＢワクチン））を使用した。
ＨＢワクチンは、ヒトのＦＩＢｓＡｇ陽性、ＨＢｅＡｇ
陰性の血りタを材料として高度精製及び加熱処理・ホル
マリン処理で不活化された調製品（株式会社ミドリ十字
製造）を用いた。詳細な製造方法は、Ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓＢ Ｖａｃｃｉｎｅ ＩＮＳＥＲＭ Ｓｙｎｐｏｓｉ
ｕｍ Ｎｏ、１８＋ ’Ｐ、５７〜６６に記載のとお
りである。用いたＨＢワクチンはタンパク量８０μｇ／
ｍｌアンプルで、力価はＲＰＨＡ値に１ ： １６，０
００ （アンチヘブセル、株式会社ミドリ十字製造）、
ＲＩＡ値１ ： １５，０００ （Ａｕ５ｔｒｉａＩｌ
−１２５、アボット社製造）、分子量２５．０００〜
３０．０００であった。
陰性の血りタを材料として高度精製及び加熱処理・ホル
マリン処理で不活化された調製品（株式会社ミドリ十字
製造）を用いた。詳細な製造方法は、Ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓＢ Ｖａｃｃｉｎｅ ＩＮＳＥＲＭ Ｓｙｎｐｏｓｉ
ｕｍ Ｎｏ、１８＋ ’Ｐ、５７〜６６に記載のとお
りである。用いたＨＢワクチンはタンパク量８０μｇ／
ｍｌアンプルで、力価はＲＰＨＡ値に１ ： １６，０
００ （アンチヘブセル、株式会社ミドリ十字製造）、
ＲＩＡ値１ ： １５，０００ （Ａｕ５ｔｒｉａＩｌ
−１２５、アボット社製造）、分子量２５．０００〜
３０．０００であった。
このＨＢワクチン２０μｇを健康な成雄チンパンジーの
筋肉内に注射免疫した。１０日間ごとに同量のＨＢワク
チンを筋肉内注射し、計４回チンパンジーに免疫を行っ
た後、チンパンジーの血清を採取し、ＰＨＡ法で抗−Ｈ
Ｂｓの力価を測定した。抗−ＨＢｓ力価が十分あがった
時点で、チンパンジーのリンパ球を、１００ｍ１の末梢
血液からフィコール−コンレイの比重遠心法を用いて単
離した。
筋肉内に注射免疫した。１０日間ごとに同量のＨＢワク
チンを筋肉内注射し、計４回チンパンジーに免疫を行っ
た後、チンパンジーの血清を採取し、ＰＨＡ法で抗−Ｈ
Ｂｓの力価を測定した。抗−ＨＢｓ力価が十分あがった
時点で、チンパンジーのリンパ球を、１００ｍ１の末梢
血液からフィコール−コンレイの比重遠心法を用いて単
離した。
＋３１８ Ｂウィルスの吸着及び培養は、実施例１に準
じた。
じた。
（４）培養上清中のＨＢｓ抗体の検出
細胞が増殖してきた後、培養上清を集め、ＰＨＡ法（ヘ
ブスゲンセル、株式会社ミドリ十字製造）でスクリーニ
ングした。抗体陽性のウェルは、２４穴マルチウエルプ
レート、３５鶴のシャーレ、６０ｍのシャーレと培養量
を拡大し、トランスフオーム６週日からクローニングを
行った。
ブスゲンセル、株式会社ミドリ十字製造）でスクリーニ
ングした。抗体陽性のウェルは、２４穴マルチウエルプ
レート、３５鶴のシャーレ、６０ｍのシャーレと培養量
を拡大し、トランスフオーム６週日からクローニングを
行った。
２、クローニング
クローニングは限界希釈法により、実施例１に準じて行
った。
った。
３、抗体の回収・精製
上記クローン株を０．５％ＢＳＡ含無血清培地（ＲＩ
ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上清を集めた。
ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上清を集めた。
この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように
加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％ＮａＣ１液を
加え、熔解させた後、さらに硫酸アンモニウムを４０％
濃度となるように加え沈澱画分を分取した。この沈澱画
分をなるべく少量の０．９％ＮａＣｌ液で熔解させた後
、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液として透析した
。透析終了後、この溶液を再び抗生胎児血清抗体（ウサ
ギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂカラムに通
した後、ＤＥＡＥ −Ｃｅｌ Ｉｕｌｏｆ ｉｎｅカラ
ムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％ＮａＣ１液を
加え、熔解させた後、さらに硫酸アンモニウムを４０％
濃度となるように加え沈澱画分を分取した。この沈澱画
分をなるべく少量の０．９％ＮａＣｌ液で熔解させた後
、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液として透析した
。透析終了後、この溶液を再び抗生胎児血清抗体（ウサ
ギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂカラムに通
した後、ＤＥＡＥ −Ｃｅｌ Ｉｕｌｏｆ ｉｎｅカラ
ムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
ＤＥＡＦ！−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅクロマトグラフィ
ーの最初のピーク部分を精製抗−ＨＢｓモノクローナル
抗体とした。
ーの最初のピーク部分を精製抗−ＨＢｓモノクローナル
抗体とした。
Claims (1)
- チンパンジーに抗原を免疫することにより感作されたＢ
−リンパ球を向リンパ性ウィルスにより形質転換させる
ことを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14585284A JPS6124523A (ja) | 1984-07-12 | 1984-07-12 | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14585284A JPS6124523A (ja) | 1984-07-12 | 1984-07-12 | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6124523A true JPS6124523A (ja) | 1986-02-03 |
Family
ID=15394577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14585284A Pending JPS6124523A (ja) | 1984-07-12 | 1984-07-12 | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6124523A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006076640A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies that bind or neutralize hepatitis b virus |
-
1984
- 1984-07-12 JP JP14585284A patent/JPS6124523A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006076640A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies that bind or neutralize hepatitis b virus |
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