JPH03503117A - 免疫グロブリン結合性物質そのサブフラグメント、それらの製造方法、試薬キットおよび免疫グロブリン結合性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリン結合性物質そのサブフラグメント、それらの製造方法、試薬キッ トおよび免疫グロブリン結合性物質 この発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）結合性の、特にＩｇＭ結合性のクロストリ ジウム・バーフリンジエンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ ｓ）菌株、免疫グロブリン結合性タンパク質、そのサブフラグメント、および免 疫グロブリン結合性物質の製造方法に関する。

いくつかの細菌は免疫グロブリン結合性を示す。したがって、スタフィロコッカ ス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来のプロティ ンＡの、Ｆｃ領域を通じてＩｇＧと結合する性質は、免疫グロブリンの研究に価 値のある手段になった（米国特許３，８５０，７９８号）。ブドウ球菌由来の上 記の公知タンパク質に加えて、非免疫式にＩｇＧと結合する受容体もブドウ球菌 中に見出されている。このようなブドウ球菌の受容体は、精製され、強力な免疫 手段であることがわかっている。ＩｇＧ以外のクラスのＩｇと優先的に結合する 細菌受容体も、免疫学の研究には価値のあるものである。

ＩｇＡとＩｇＭに対する受容体は、特に種々の用途が見出されるであろう。Ｉｇ Ａと結合する細菌タンパク質が単離されているが、ＩｇＭ受容体はまだ報告され ていない。プロティンＡは、ＩｇＭとある種の反応性をもっているが、少数のＩ ｇＭ分子が結合するだけで、かつプロティンＡはＩｇＧと優先的に結合するので 、上記の反応は用途が著しく制限、され七いる。

ここにおいて多数の細菌菌株を、ＩｇＭと結合する性質についてスクリーニング した。その結果、嫌気性細菌であるクロストリジウム・バーフリンジエンスに属 するい（つかの菌株が、大きな割合のポリクロナールＩｇＭと結合しつるが、ポ リクローナルＩｇＧとはその小割合でしか結合できないことを示している。この 結合性は、Ｉｇ分子のＦ（ａｂ’）ｚ部分を通じて行われるようであるが、細菌 に結合する新しい種類のＩｇを示している。免疫グロブリン結合性物質を単離し た。

したがって、この発明は、免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）ｚ部分、特にＩｇＭの Ｆ（ａｂ’）ｚに結合する、５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で（ドデシル硫酸ナトリウム− ポリアクリルアミドゲル）の見掛けの分子量が約１６０ｋＤのタンパク質に関す る。またこの発明は、免疫グロブリンに結合する上記タンパク質のサブフラグメ ントに関する。

この発明によれば、免疫グロブリンと結合する、クロストリジウム・バーフリン ジェンスの菌株は、分析および分離に用いる免疫グロブリン結合性物質および特 にＩｇＭ結合性物質として用いることができる。また上記の微生物は、免疫グロ ブリンによる沈澱反応用の緩衝悲濁液に用いることができる。

免疫グロブリン結合性のクロストリジウム・バーフリンジエンスの菌株は、Ｉｇ ＭのＦ（ａｂ’）ｚ領域に結合するので、予想通り、強いリンパ球マイトジンと して作用する。またこの発明は該菌株のリンパ球マイトジェンとしての用途に関 する。

この発明は、特に、クロストリジウム・バーフリンジエンスに属する新しい菌株 Ｌ１５４０とＬ９５９３に関し、そのＬ１５４０は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍ ｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇｏｎｉｓｍｅｎ　（ＤＳＭ）に寄託番号 ＤＳＭ４３３１のもとに寄託されている。

増殖条件 菌株Ｌ１５４０（およびクロストリジウム・バーフリンジェンスに属する他の菌 株）は、標準の細菌学的方法を用いて嫌気性条件下、ＧＬＣブイヨン（Ｌａｂ　 Ｍ　Ｌｔｄ社、英国、サルホード）中で増殖させることができる。ＧＬＣブイヨ ン中３７℃で２４時間増殖させた後、細菌を、５．０００〜１０．０００ｇで３ ０分間遠心分離にかけることによって集菌し、リン酸緩衝塩類溶液“ＰＢＳＡ” 　（１２０ｍＭ　ＮａＣ１，３０ｍＭリン酸塩、０．０２％アジ化ナトリウム、 ｐＨ７，４）に１０％（Ｖ／Ｖ）の濃度で再懸濁させる。

その細菌濃度は、小型遠心分離器（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　Ｍｏｄｅｌ　１５２゜ Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、　、米国、カリフォルニア 州、フユーラートン）のキャピラリー管中、　１０，０００　Ｘ　　ｇで５分間 、遠心分離することによって測定した。細菌は、８０℃で５分間熱処理すること によって安定化し、ＰＢＳＡ中で一度洗浄し、１０％の濃度でＰＢＳＡ中に再懸 濁させた。得られた細菌製剤はスー結−合活性を失うことなく数ケ月間、４℃で 貯蔵できる。

シー・バーフリンジエンスの菌株Ｌ１５４０は、シー・バーフリンジェンスの多 数の菌株の中から見出されたもので、これらの菌株は、スエーデン、ルンドのＵ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃ１ １ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにおける常用の臨床試料から単離され た。この菌株は、標準の細菌学的方法によってシー・バーフリンジエンスとして 確認された（Ｈｏｌｄｅｍａｎ　Ｌ、Ｖ、、　Ｃａｔｏ、　Ｅ、Ｐ、、およびＭ ｏｏｒｅ、　Ｗ、Ｅ、Ｃ，、１９７７年、　Ａｎａｅｒｏｂｅ　Ｌｏｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｐｏ１ｙｔｅｃｈｎ−ｉｃ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｉｔａ、−米国、バージニア州、ブラックスバーグ参照）。シー・バ ーフリンジェンスのすべての菌株は、嫌気性、グラフ陽性および胞子形成性の桿 菌である。

キャラクタリゼーションデータ Ｌ１５４０菌株を、グルコースを含有するペプトン酵母エキス（ＰＹＧ）または ＧＬＣブイヨン中で培養した場合、その培地をガスクロマトグラフィーで分析す ると、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸およびコハク酸が生成していることを示 す。この菌株は、フルクトース、グルコース、グリセリン、イノシトール、ラク トース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、デンプン、ス クロース、およびトレハロースを利用する。ミルク中でのカードの生成、肉の消 化、および溶血の二重領域の生成がある。広端部に狭窄を有する胞子があり、レ シチナーゼ反応は陽性である。この−菌株−４ｔＮＨ３とＨ，Ｓを産生ずる。

受容体構造体の熱およびタンパク質分解酵素に対する感受性 Ｌ１５４０の懸濁液を８０℃で１０分間加熱しても、そのＩｇＭとの結合性に影 響を与えなかった。またこの製剤は、４℃で６ケ月間保管後でＩｇＭとの結合性 を保持していた。ＴｇＭの結合性は、ペプシンもしくはトリプシンによる消化に よって影響はなかったが、パパインによる消化（４００ｇｇ／ｎｕ、ｐＨ８，０ ，３７℃で１時間）で１／１０で低下した。

またこの発明は、免疫グロブリン結合性物質の特にＩｇＭ結合性物質の製造方法 に関し、クロストリジウム・バーフリンジェンスに属する免疫グロブリン結合性 菌株を培地で培養し、培地を微生物から分離し、次いで、該物質を分離した培地 から回収するか、または分離した微生物を緩衝液に懸濁させて緩衝液から該物質 を回収することによって、該物質を、分離した微生物から回収することを特徴と する方法である。

クロストリジウム・バーフリンジェンスの適切な菌株として選択しつる菌株は、 実施例２に記載しである。Ｌ１５４０とＬ９５９３の菌株を使用するのが好まし い。培地としてはＧＬＣが好ましく、菌株は３７℃で２４時間増殖させるのが好 ましい。微生物は例えば約５．０００〜１０．０００ｇで約３０分間遠心分離す ることによって培地から分離することができ、前記物質は、アフィニティークロ マトグラフィー、好ましくはＩｇＭ−セファロース（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社、スエーデン）で、培地から回収される。また前記物質は、微生物を培地 から分離した後緩衝液に微生物を懸濁させることによって製造することができる 。好ましくは、遠心分離で得たベレットを、０．５Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ９， ０）に懸濁させ、３７℃で約５時間放置した後、前記物質を、上記のように微生 物から緩衝液を分離し特にアフィニティークロマトグラフィーで前記物質を緩衝 液から精製することによって回収する。

下記の実施例で得たデータは、Ｉｇの新しいタイプの非免疫結合性が、嫌気性細 菌のシー・バーフリンジェンスに属するある種の菌株に見出されることを示して いる。試験した菌株の１つであるＬ１５４０菌株は、特に高い結合性を有するの で特に重要である。この菌株のポリクローナルＩｇとの結合性は、Ｉｇの異なる クラスによって変動し、最高の結合性はＩｇＭで得られる。ポリクローナル１ｇ 製剤のＬ１５４０との結合性は、Ｉｇのサブユニットの数と実際に相関関係があ る。すなわち、結合可能な割合は、二量体のＩｇＭから二量体の分泌型ＩｇＡを 通じて単量体のＩｇＧと血清ＩｇＡになるにつれて減少する。この相関関係に対 する最も簡単な解釈は、全１ｇサブユニットは、細菌受容体に対して低い親和性 で結合しつる構造体を含有し、ｒｇ分子の結合活性は、サブユニットの数が増大 するにつれて増大するということのようである。凝集したＩｇＧがＬ１５４０菌 株と結合し、結合割合が凝集物の大きさが増大するにつれて増大するという知見 は、上記の解釈と一致するが、その解釈を証明してない。１ｇ中の結合性構造体 は、明らかにＦ（ａｂ’）ｘ領域に位置しているが、Ｉｇの細菌受容体に対する 結合性は、真の抗原抗体反応とは到底考えられない。なぜならば、ポリクローナ ルＩｇＭの少なくとも６０％といくつかの異なる骨髄腫タンパク質が細菌と結合 するからである。この結合性構造体のＦ（ａｂ’）ｚ領域内の位置は分かってい ないが、単離されたＨ鎖もしくはＬ鎖は結合を阻害しないという知見は、結合性 構造体が　′Ｈ鎖とＬ鎖の結合によって発生することを示している。

結合性構造体の生体内で起こりつる効果については、ＩｇＭのＦ（ａｂ’）を領 域に対する細菌の結合性によって、細菌がＢリンパ球の表面に結合できるかもし れないということに留意すべきｆ４る。この予測どおりに、予備実験の結果、Ｌ １５４０の菌株が強いリンパ球のマイトジェンであることを示している。

上記の新しい菌株の結合特性と、免疫グロブリン結合性物質の精製について、添 付図面を参照して以下の実施例で説明する。

図面の説明 第１図　２０種類の種の２０４の細菌菌株の、ヒトＩｇＭ（Ｋ）骨髄種タンパク 質と結合する性質。０内の数字は、各種について試験した菌株の数を示す。

第２図　各種の細菌濃度の、シー・バーフリンジェンス菌株Ｌ１５４０とＬ９５ ９３およびニス・アウレウス、カラアンＩに対するポリクローナル１ｇ製剤の結 合性。

第３図　ポリクローナルＩｇＭのシー・パーフリンジェンスＬ１５４０−に対す る一結合性の、各種Ｉｇ調製剤よる阻害。試験の感度を上げるために、これらの 実験では、材料と方法の項で述べるように、細胞濃度を１０’／　ｍβに低下さ せた。

第４図　各種分子量のＩｇＧ凝集体の、各種細菌濃度におけるシー・パーフリン ジエンスＬ１５４０との結合性。

第５図　凝集したＩｇＧのシー・バーフリンジエンスＬ１５４０との結合性に対 する、各種Ｉｇ調製剤よる阻害。この実験に用いたＩｇＧ凝集体は、分子量が約 １．３　ＸＩＯ’であった。

試験の感度を上げるために、材料と方法の項で述べるように、細菌濃度を１０’ ／　ｍＡまで下げた。

第６図　Ｌ１５４０菌株から精製した免疫グロブリン受容体のウェスタンプロッ ト分析。精製受容体を５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク リルアミドゲル）電気泳動法に付し、得られたタンパク質をＩ＋ｎｍｏｂｉｌｏ ｎ膜上に電気プロットを行い、この膜を放射能で標識をつけたＩｇＭでプローブ し、オートラジオグラフィに付した。そのオートラジオグラフを示す。

実施例Ｉ Ｌ１５４０菌株を、４枚の血液寒天プレート上に画線し、３７℃で２４時間嫌気 的に培養した。各プレートから、重接種物を綿棒で集め、２５０ｎｌの滅菌ＧＬ Ｃブイヨンが入っている５０ＯＩＩＩβビンに接種するのに使用した。培養物は 、前記のように３７℃で２４時間嫌気的に培養し、次に細菌を遠心分離で集め、 ＰＢＳＡ中に再度懸濁させ、熱で不活性化した。これらの細菌をＪ−免疫グロー ブリン結合性を試験するのに用いた。

以下の実施例２〜５では、下記の材料と方法を用いた。

材料と方法 細菌菌株、培地および増殖条件 特にことわからない限り、結合性試験に用いた細菌菌株（第１図）は、ヒト起源 の常用臨床試験から単離され、標準法で分類した。ニス・アウレウスカラアンＩ 　ＣＮＣＩＣ８５３０）は、対照のプロティンＡ菌株として用いられ、ニス・エ ビデルミゾイス（Ｌ６０３）の菌株は、非結合性の対照菌株と−して用いター、 −結１合性を試験するために、細菌を下記の培地で増殖させた。ビー・カタハリ ス（Ｂ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ニス・アウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ ）、ニス・エビデルミゾイス（Ｓ。

ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、レンサ球菌、ジフテロイド桿菌、エム・フォーチュ イタム（Ｍ、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　　：　トッド−ヒユーイツトブイヨン； エイチ・インフルエン七（Ｈ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　：ヘミン、ＮＡＤおよ びＬ−ヒスチジン（各々ｌＯμｇ／ｍｌ２）を補充したブレーンハートインフュ ージョンブイヨン；イー・コリ（Ｅ、ＧｏＬＬ）、ケイ・ニューモニエ（Ｋ、　 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ビー・ミラビリス（Ｐ、　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）、ビ ー・エルジノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　：　トリプトンブイヨン； 嫌気性細菌：　ＧＬＣブイヨン（Ｌａｂ　Ｍ　Ｌｔｄ、　　ソルファード、英国 ）。３７℃で一夜培養した後、細菌を集めて、ＰＢＳＡＴ（０，１２Ｍ　Ｎａｃ ｌ、０．０３Ｍリン酸塩、０．０２％ＮａＮｉ、０．０５％ツイーン２０、ｐｉ （７，２）で２回洗浄し、ＰＢＳＡＴに再懸濁させて微生物数を１０９微生物／ ｍβにした。

免疫グロブリン製剤 使用した製剤はすべて、ヒト起源のものでとくにことわりのないかぎりポリクロ ーナルであった。ＩｇＧはＡＢ　Ｋａｂｉ社（ストックホルム、スエーデン）か ら購入したが、これは１％未満のＩｇＭを含有し、このことは、特異的な抗血清 を用いるロケット電気泳動法で測定した。ＩｇＭは、ＣａＩｂ１゜ｃｈｅｍ　Ａ Ｇ（ルツエルン、スイス）から購入したが、特にことわりがないかぎり、この１ ｇＭ製剤は、本願で報告した、ＩｇＭを用いる実験に用いた。ＩｇＭの第２の製 剤は、Ａ、　Ｇｒｕｂｂ博士のご吐息で頂いたものである。この製剤は、Ｕｌｔ ｒｏｇｅｌＡｃＡ２２（ＬＫＢ−ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ　ＡＢ社、ブロマ、スエー デン）を用いてゲル濾過法を繰り返し行って精製した。両者の１ｇＭ製剤は、１ ％未満のＩｇＧを含有していることがロケット電気泳動法で分かった。

ＩｇＧのＦｃ断片、Ｌ鎖（Ｋプラスλ）およびγＨ鎖は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 　ＡＧ社（ルツェルン、スイス）から購入した。ＩｇＧのＦ（ａｂ’）ｚ断片、 血清ＩｇＡおよび分泌性ＩｇＡは、ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ 米国ペンシルヴエニア州）から購入した。

結合性試験（第１図）と阻害性試験（第３図）に用いた骨髄腫ＩｇＭの製剤は、 マクログロブリン血症の患者の血清から単離した。用いた血清は、高濃度のモノ クローナル骨髄腫成分を含有していたのが、バックグランドＩｇＧの濃度は低下 していた。骨髄腫ＩｇＭは、０．６％アガロース中でゾーン空気−泳一動法（− Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、　Ｂ、、Ｇ、、　　”Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃ ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　”　、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ、 　　Ｉｎｖｅｓｔ、、　２９巻、（５ｕｐｐ１．１２４）、７頁、１９７２年： この文献は本願に援用する）と次いでゲル濾過法で精製した。

放射能標識 特にことわらないかぎり、タンパク質類は、改変ラクトペルオキシダーゼ法（Ｍ ｙｈｒｅ、　Ｅ、　Ｂ、およびＰ、　Ｋｕｕｓｅｌａ、’Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ 　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｔｏ　ｇｒｏｕｐ　Ａ、　Ｃ：、　ａ ｎｄ　Ｇ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ”　、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ 、４０巻、２９頁、　　１９８３年：この文献は本願に援用する）を用いて、無 担体＋ｚｓＩで標識をつけた。遊離の未反応の同位元素を、ＰＢＳＡＴに対して エクステンシーブ透析で除去した。標識をつけたタンパク質をさらにゲル濾過法 で精製し、適正な分子量に対応する両分を集め、結合性の実験に使用した。標識 をつけた製剤（比活性：約４ｍＣ１／ｍｇタンパク質）を４℃で保管し１ケ月以 内に使用した。

結合性の検定 検定はすべて、室温で、プラスチック管を用いて行った、２５ｕＡのＰＢＳＡＴ 中に２〜５ｎｇ（約１０’ｃｐｍ）の放射能標識をつけたタンパク質を含有する 二重試料を、　２００μａＰＢＳＡＴ中に懸濁させた２　Ｘ　１０”の細菌と混 合した。６０分間培養した後、各管に２ｍｇのＰＢＳＡＴを添加し、細菌を遠心 分離した（２０００Ｘｇ、１５分間）。上澄み液を排棄し、ベレットの放射能を ガンーマガウンターで測定した。結合した量は、付加した放射能の百分率で示す 。

非結合細胞で記録された非特異的捕捉量（５％未満）を推定した。

いくつかの実験では、各種の細菌菌株の結合性を、培養混合物中の試験細菌の数 を変えて試験した（第２図と第４図）。これらの実験において、試験細菌を、非 結合性細菌の懸濁液（濃度１０”／　ｍｇ　）で希釈し、混合物中の細菌の合計 数を一定に保持した。使用した非結合性菌株は、すべてニス・エビデルミゾイス し６０３である。

放射能標識をつけたＩｇＧ凝集体の製造１、０ｍｇのＩｇＧ（０，０５Ｍのリン 酸緩衝液ｐＨ７，５の１５０μｆｆに溶解）に、クロラミン−Ｔ法（Ｇｒｅｅｎ ｗｏｏｄ、　Ｆ、Ｃ，、Ｗ、　Ｍ、　ＨｕｎｔｅｒおよびＪ、　Ｓ、　Ｇｌｏｖ ｅｒ、　　”Ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ”’ｌ−１ａｂｅｌｌｅｄ 　ｈｕｍａｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆ ｉｃ　ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　”　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、８９巻 、１１４頁、　１９６３年この文献は本願に援用する）で、１．０ｍＣ１の１２ ８工を用いて放射能標識をつけた。０．１５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５に対して エクステンシーブ透析を行った後、Ａｖｒａｍｅａｓ法（Ａｖｒａｍｅａｓ、　 Ｓ、　”　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ 　ｗｉｔｈ　ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、　ＩＪｓｅｏｆ　ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ、　ａ ｎｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、　　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　６ 巻、４３頁、　　１９６９年）で凝集させた。すなわち、製剤（容積３２０ｕ　 Ｉ２）を、０．１％グルタルジアルデヒドの３０μ２と混合し、室温で２０時間 培養した。（Ｌ−ＬＭ”Ｌ−リシン含有ＰＢＳＡＴ３００　ｕβを添加して反応 を終結させた。凝集中沈澱は精製しなかった。凝集体を大きさによって分画する ために、セファロース４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、アップサラ、スエーデン ）の校正をされたカラムに入れた。このカラムを、０．１ＭＬ−リシン含有ＰＢ ＳＡＴで溶離し、画分を放射能について検定した。凝集したＩｇＧは、空隙容量 （Ｖｏ）から単量体ＩｇＧの位置までにわたる広幅のピーク中に存在していた。

各種分子量に対応する画分を結合性検定に用いた。

実施例２ ＩｇＭのクロストリジウム・バーフリンジェンスに対する結合性 最初の実験で、好気性細菌と嫌気性細菌の２０種類の種の２０４の細菌菌株を、 Ｉｇｌ、ｌ骨髄腫タンパク質と結合する性能について試験した。第１図に示すよ うに、結合性は、スタヒロコツカス・アウスレスとフロストリラジウム・パーフ リンジェンスに対してのみ観察された。ニス・アウレウスに属する菌株はすべて 高い結合性を示したが、シー・バーフリンジェンスに属する各種菌株に対する結 合性は、高度に結合するものから全く結合しないものまで変化があった。第２の ＩｇＭ骨髄腫タンパク質との結合性試験では、ニス・アウレウスに属する菌株に ついては結合性が観察されなかったことを除いて非常に類似した結果が得られた （データは記載していない）。第１の骨髄腫タンパク質のニス・アウレウスと− の結合性は、恐ら（プロティンＡが原因と思われる。このプロティンＡは少数の ＩｇＭ骨髄腫タンパク質と結合することが知られている。

実施例３ ＩｇＭ、　ＩｇＧおよびＩｇＡとの結合性についての、シー・バーフリンジエン スの各種菌株の比較 シー・パーフリンジェンスの各種菌株を、ＩｇＭ、　ＩｇＧおよびＩｇＡとの結 合性についてより詳細に比較した。骨髄腫タンパク質の異常な性質によって起こ ることがある思わぬ困難を避けるために、これらの実験と、これに続くすべての 実験は、特にことわりがない限り、ポリクローナルＩｇ製剤で行った。細菌数を 減少させながら一定量のＩｇＭもしくはＩｇＧとの結合性を試験する実験で、シ ー、パーフリンジエンスの菌株を比較した。２種の菌株の試験結果を第２Ａ図と 第２Ｂ図に示し、ニス・アウレウス力ウアンエ、すなわち標準のプロティンＡ菌 株についての同様の実験についての比較データを第２Ｃ図に示す。ＩｇＭの結合 性については、シー・パーフリンジェンスの両方の菌株はともに、最高の細菌濃 度で、大きな割合のポリクローナルＩｇＭと結合するが、細菌の数が減少すると 菌株Ｌ９５９３の結合性は強く低下し、一方菌株Ｌ１５４０の結合性はほとんど 変化していないことは明らかである。この差は結合速度の差によるものではない 。その理由は、さらに培養を行っても結合したＩｇの割合は増加しなかったから である（データは記載せず）。この種の実験によって、Ｌ１５４０菌株が本願で 試験したシー・パーフリンジェンスの他のどの菌株よりも多量のＩｇＭと結合す ることが分かった。ポリクローナルＩｇＭの２種類の製剤によって事実上同一の 結果が得られた。

また両方のシー・バーフリンジェンス菌株は、ポリクローナルＩｇＧとも結合で きるが、結合割合は、ＩｇＭよりはるかに小さい（第２Ａ図と第２Ｂ図）。予想 したように、逆の結果がニス・アウレウス・カラアンＩに起こっている（第２ｃ 図）。この試験で用いたシー・バーフリンジェンスの他のすべての菌株について もＩｇＧとの結合性を試験したが、いずれの場合も、結合したＩｇＧの割合はＬ １５４０菌株より高かった。全菌株にわたって、ＩｇＧとの結合性はＩｇＭとの 結合性と実際に相関性があったが、これは、両クラスの免疫グロブリンが、各菌 株の同じ細菌表面構造体に結合することを示唆している（データ記載せず）。

上記２種のシー・バーフリンジエンス菌株、Ｌ１５４０とＬ９５９３を、より詳 細な特性決定を行うために選択して用いた。Ｌ１５４０菌株で得た結果だけを以 下に述べるが、Ｌ９５９３菌株によって、すべての場合に定性的に同様な結果が 得られた。ＴｇＭと結合しないシー・パーフリンジエンスのひとつの菌株を常に 対照として用いたが、この菌株はどの場合も結合性は認められなかった。

ＩｇＡの結合性。

第２Ｄ図に示すように、Ｌ１５４０菌株はポリクローナルＩｇＡと結合すること ができる。第２Ａ図と比較すると、血清ＩｇＡ（単量体）の結合性は。ＩｇＧと 類似しているが、分泌性ＩｇＡ（二量体）の結合性は、ＩｇＧとＩｇＭの中間で あることが分かる（このパターンは、ＩｇＡ、　ＩｇＧおよびＩｇＭの結合性を 同じ実験で試験した場合、繰り返し認められた）。ポリクローナルＩｇのＬ１５ ４０菌株との結合性は、Ｉｇ中のサブユニットの数に明らかに相関性がある。す なわち、結合可能な割合が、二量体のＩｇＭから、二量体の分泌性ＩｇＡを通じ て、単量体のＩｇＧと血清ＩｇＡにむかって低下する。

実施例４　阻害性の試験 上記データの最も単純な解釈は、シー・バーフリンジェンスＬ１５４０の単一の レセプターが、各種のクラスのＩｇ分子と結合できるということである。この問 題は、標識を付けたポリクローナルＩｇＭのＬ１５４０菌株との結合を阻害する 性能について、各種の免疫グロブリンを試験する阻害性実験でさらに分析した。

結合の阻害性は、５０μβの標識をつけたタンパク質と５０μβの阻害剤（公知 のタンパク質濃度）とを混合して試験した。両製剤ともにＰＢＳＡＴで希釈した 。次に細菌（２００μβ）を添加し、続いて、検定を上記のようにして実施した 。

阻害性試験の感度を上げるために、結合細菌の濃度を上記の結合性検定に比べて １／１００に下げた。しかし試験混合物中の合計細菌数は、非結合性のＬ６０３ 細菌の懸濁液中の結合細菌を希釈することによって変化しないように保持した。

第３Ａ図に示すように、ＩｇＭの結合性は、ポリクローナルＩｇＭとポリクロー ナルＩｇＧの両者ならびにＩｇＭ骨髄腫タンバク質によって完全に阻害すること ができた。ポリクローナルＩｇＧの結合性を、同じ３種のＩｇで阻害させた場合 同様の結果が得られた。さらに、ポリクローナルＩｇＡと、ＩｇＧもしくはＩｇ ＭのＬ１５４０菌株との結合性を阻害することができた（データは記載せず）。

これらの結果は、ＩｇＧ、　ＩｇＭおよびＩｇＡが１つの同じ受容体構造体に結 合するということを明確に示している。

実施例５　免疫グロブリンの断片の結合性免疫グロブリンのシー・バーフリンジ ェンスＬ１５４０との結合性をさらに特徴づけるために、この菌株のＦ（ａｂ’ ）ｚ断片およびＦｃ断片との結合性を試験した（第２Ｅ図）。この試験にはＩｇ Ｇ由来の断片を用いた。第２Ａ図と比べてみると、Ｆ（ａｂ’）ｚ断片のＬ１５ ４０との結合性は全ＩｇＧのそれと類似しているが、Ｆｃ断片は結合しないこと が分かる。それ故に、結合性は、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）ｚ領域で起こっているよ うである。この結論は阻害性の実験によって裏付けられている。すなわち、Ｉｇ Ｇの結合性は、Ｆ（ａｂ’）２断片によって有効に阻害されたが、Ｆｃ断片では 阻害されなかった（データ記載せず）。同じ２つのＩｇＧ断片も、ＩｇＭの結合 を阻害する性質について試験した（第３Ｂ図）。Ｆ（ａｂ’）ｚ断片だけが有効 な阻害剤であったが、このことは、結合の方式がＩｇＭとＩｇＧについて類似し ているという前記結論と一致している。

分離したＨ　１１とＬ鎖も、Ｌ１５４０菌株との結合性および阻害性の両方の実 験で試験した。ポリクローナルγ鎖もしくはポリクローナルＬ鎖（にプラスλ） にうちては結合性はみとめられず、またこれらのタンパク質のいずれも、全Ｉｇ Ｇもしくは全ＩｇＭの結合を阻害できなかった（データは記載せず）。このこと は、分子のＦ（ａｂ’）ｚ部分内の結合性構造体は、Ｈ鎖とＬ　ＳＩ４が結合し ている時にのみ存在するということを示唆している。

実施例６　免疫グロブリン結合性物質の精製この方法は、受容体構造体が、ｐＨ が高いときに細菌から放出されるということに基づいている。各々２５０ｍρづ つのＧＬＣブイヨンを入れた８個の５００ｍρビンにＬ１５４０菌株を接種し、 嫌気性条件下、３７℃で２４時間培養した。細菌を遠心分離で集菌し、ＰＢＳで ２回洗浄し、８０℃で５分間、熱不活性化処理を行い、もう一度ＰＢＳで洗浄し 、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９，０）に１０％（Ｖ／Ｖ）濃度で再懸濁させた 。得られた懸濁液（４０ｍＩ２）を、３７℃で５時間培養した。次に細菌を遠心 分離で除き、上澄み液を、ＩｇＭ−セファロース（５ｍＩ２；　１ｍｇＩｇＭ／ 　ｒｎρ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーに付した。このセファロ ースを１０００ｍβのＰＢＳで洗浄し、次に３Ｍ　ＫＳＣＮで溶離した。溶出液 （６＋ｎｌ２）を１ｍρに濃縮し、プローブとして放射能で標識したＩｇＭを用 いて、ウェスタンプロット法（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｔ、　５ｔａｃｈｅｌｉｎ およびＪ、　Ｇｏｒｄｏｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　７６巻、　４３５０頁、　　 １９７９年、この方法は本願に援用する）で分析した（第６図）。得られた免疫 グロブリン受容体は、約１６０ｋＤの見掛けの分子量を有する。ＩｇＭ骨髄種タ ンパク質をプローブとして用いた場合、類似の結果が得られた。シー・パーフリ ンジェンスの非結合性菌株を同じ方式で分析したところ、ＩｇＭ結合性物質は見 出されなかった。これらのデータは、第６図に見られるバンドが実際にＬ１５４ ０菌株の免疫グロブリン受容体によるものなので、その受容体が精製されたこと を示している。

綿金１今争 ＦＩＧ、６ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル）上 で約１６０ｋＤの見掛け分子量を有し、免疫グロブリンの特にＩｇＭのＦ（ａｂ ′）２部分に結合することを特徴とするタンパク質。 ２．請求の範囲第１項のタンパク質のサブフラグメント３．クロストリジウム・ パーフリンジェンスに属する免疫のグロブリン結合性菌株を培地で培養し、微生 物を培地から分離して緩衝液に懸濁させ、次いで免疫グロブリン結合性物質を培 地および／または緩衝液から回収することを特徴とする、免疫グロブリン結合性 物質およびそのサブユニットの製造方法。 ４．菌株をＧＬＣ培地で培養することを特徴とする請求の範囲３項記載の方法。 ５．免疫グロブリン結合性物質をアフィニティークロマトグラフィーで回収する ことを特徴とする請求の範囲第３項または第４項記載の方法。 ６．アフィニティークロマトクラフィーがＩｇＭ−セファロースで行われること を特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。 ７．免疫グロブリン結合性のリンパ球マイトジエン物質として用いられるクロス トリジウム・パーフリンジェンス菌株。 ８．ＩｇＭ結合性のすなわちＩｇＭ沈澱性物質として用いられる請求の範囲第７ 項記載のクロストリジウム・パーフリンジェンス菌株。 ９．Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍ１ｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ ｍｅｎに寄託番号４３３１で寄託されているクロストリジウム・パーフリンジェ ンスＬ１５４０。 １０．請求の範囲第１〜２項のいずれか１つに記載のタンパク質またはサブフラ グメントまたは請求の範囲第７〜９項のいずれか１つに記載の微生物からなるこ とを特徴とする、免疫グロブリンと結合させ、分離してこれを同定するための試 薬キット。