ES2274542T3 - Anticuerpos frente al receptor del interferon alfa/beta. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA EL LIGANDO QUE UNE EL COMPONENTE DEL RECEPTOR DE INTERFERONA AL ( BE , QUE SON CAPACES DE MODULAR SELECTIVAMENTE LA ACTIVIDAD DE VARIOS TIPOS DE INTERFERONA I.
Description
Anticuerpos frente al receptor del interferón
\alpha/\beta.
La presente invención se refiere a anticuerpos
dirigidos contra el componente de unión del ligando del receptor de
interferón \alpha/\beta que son capaces de modular
selectivamente la actividad de diversos interferones del tipo
I.
La Publicación de Patente Europea EP Nº 588.177
describe un receptor de IFN-\alpha soluble, que
tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 que se
identificaba mediante reticulación con
^{125}I-IFN-\alpha2 e
immuno-precipitación con anticuerpos monoclonales
anti-IFN-\alpha. Cuando se
obtienen a partir de suero, estas especies tenían un peso molecular
de 50 K. Se describe también la proteína de unión
IFN-\alpha de peso molecular 40.000 antes citada,
(en lo sucesivo "IFNAB-BP" ó
"IFNAB-BPII") obtenidas a partir de la orina
en un estado homogéneo y que tienen una secuencia que difiere de
cualquier otra proteína conocida. La IFNAB-BP se
une a y bloquea la actividad de una variedad de subtipos de
IFN-\alpha, así como también los de
IFN-\beta.
La Publicación de Patente Europea EP Nº 676.413
describe la clonación y secuenciación de dos moléculas de cDNA que
codifican los precursores de IFNAB-BP. Ambas se
obtienen probablemente del mismo gen, por ejemplo, mediante corte y
empalme alternativo. Se describe también la producción de dos
proteínas recombinantes, designadas como IFNAB-BPI
e IFNAB-BPII en mamíferos y otras células huésped.
Se describen también anticuerpos policlonales y monoclonales
dirigidos contra IFNAB-BP y útiles para bloquear el
receptor de IFN, para los ensayos inmunológicos y la
inmuno-purificación de las IFNAB-BPI
e IFNAB-BPII.
En la presente invención se describen dos grupos
de anticuerpos neutralizantes preparados frente a
IFNAB-BPII que se unen al receptor de interferón de
tipo I ó a células humanas. Un grupo de los anticuerpos es capaz de
bloquear la actividad tanto de los subtipos
IFN-\alpha como también la actividad de los
IFN-\beta. Otro grupo de los anticuerpos es capaz
de bloquear selectivamente la actividad de diversos subtipos de
interferón-\alpha en las células humanas, sin
afectar a la actividad del interferón-\beta. Así,
un grupo de dichos anticuerpos pude inhibir los efectos no deseados
de la IFN-\alpha con muy poco efecto sobre la
actividad de la IFN-\beta.
Los interferones del tipo I (IFNs)
(IFN-\alpha, IFN-\beta e
IFN-\omega constituyen una familia de citocinas
relacionadas estructuralmente, definidas usualmente por su capacidad
para conferir resistencia a las infecciones víricas. Se han
informado de muchas otras actividades biológicas de los IFNs del
tipo I, incluyendo la inhibición de la proliferación celular, la
inducción de antígenos clase I MHC y de otras diversas actividades
inmuno-reguladoras (1). La
IFN-\alpha y la IFN-\beta son
útiles en el tratamiento de diversas enfermedades víricas, que
incluyen la hepatitis-C (2,3) y las verrugas de
origen vírico (4,5), así como también de ciertas enfermedades
malignas tal como la leucemia de las células epiteliales (6), la
leucemia mieloide crónica (7) y el sarcoma de Kaposi (8).
La IFN-\alpha se detectó en
los sueros de diversos pacientes que tienen enfermedades
auto-inmunes tales como el lupus sistémico
eritematoso (9), así como también los pacientes de SIDA (10). La
IFN-\alpha estaba implicada en el progreso de la
diabetes juvenil (11). Además, la terapia con
IFN-\alpha se ha mostrado en algunos casos que da
lugar a efectos secundarios no deseados, que incluyen fiebre y
desódenes neurológicos (12). Por lo tanto existen situaciones
patológicas en las que la neutralización de la actividad de la
IFN-\alpha puede ser beneficiosa para el
paciente.
Como en el caso de otras citocinas, la
IFN-\alpha ejerce sus actividades biológicas
mediante su unión a un receptor de la superficie celular, que es
específico para todos los subtipos de IFN-\alpha,
así como también para las IFN-\beta (13). Se
identificó un receptor de la IFN-\alpha humana
(IFNAR) y se clonó a partir de células de Daudi (14). El receptor
clonado tiene un único dominio de transmembrana, un dominio
extracelular y uno intracelular. Cuando se expresa en células de
murina, este receptor confiere sensibilidad a la
IFN-\alphaB humana pero no significativamente a
otras especies de IFN-\alpha y de
IFN-\beta, lo que indica que componentes
adicionales pueden estar implicados en la respuesta a la
IFN-\beta y a diversos subtipos de
IFN-\alpha.
Otros diversos estudios indican que existen
componentes o subunidades receptoras adicionales implicados en la
unión de la IFN-\alpha e
IFN-\beta (15-17). Sin embargo, se
informó que el receptor ya descrito (14) está implicado en la unión
de todas las especies de IFN-\alpha y de
IFN-\beta (18). En verdad, un segundo componente
receptor, denominado receptor IFN-\alpha/\beta,
se identificó y se clonó recientemente (Publicación de Patente
Europea EP Nº 676.413 y referencia 19). Hemos demostrado que el
receptor IFN-\alpha/\beta cuyo dominio
extracelular tiene la misma secuencia que el
IFNAB-BPI es el componente principal de unión del
ligando del receptor de interferón tipo I. Además, el receptor de
interferón \alpha/\beta y el IFNAR cooperan en la unión del
ligando y forman un complejo ternario con el interferón tipo I sobre
la superficie celular (20).
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la
IFNAR y capaces de bloquear la actividad de los interferones del
tipo I de una manera no selectiva se describieron ya (21). Se
describió otro anticuerpo monoclonal, dirigido contra un componente
del receptor no identificado. Este anticuerpo bloqueaba la actividad
de los interferones del tipo I de una manera no selectiva (22).
La presente invención proporciona anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el receptor
IFN-\alpha/\beta que es el receptor común para
las IFN-\alpha e IFN-\beta.
Estos anticuerpos se unen a diversas formas del receptor que se
expresan bien sobre células humanas o como las formas solubles
IFNAB-BPI e
IFN-AB-BPII. Se desarrollaron dos
tipos de anticuerpos monoclonales neutralizantes. Un tipo exhibe un
elevado título cuando se usa para el bloqueo de la actividad
antivírica tanto de la IFN-\alpha como de la
IFN-\beta. El segundo tipo muestra
sorprendentemente un elevado título de bloqueo sólo con respecto a
la actividad antivírica de la IFN-\alpha,
mientras que tiene un título muy bajo con respecto a la actividad de
la IFN-\beta. Así los anticuerpos monoclonales
del tipo segundo de manera inesperada se pueden usar en una cierto
intervalo de concentración para bloquear selectivamente la
actividad de la IFN-\alpha mientras que la
actividad de la IFN-\beta no será afectada.
La presente invención proporciona también
anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra el receptor
IFN-\alpha/\beta expresado sobre las células
humanas, IFNAB-BPI e IFNAB-BPII. Los
anticuerpos monoclonales humanizados son moléculas de anticuerpo
híbridas de ratón-seres humanos en las que los
dominios variables se obtienen del anticuerpo del ratón mientras
que los dominios constantes son de origen humano.
La presente invención proporciona también
moléculas de DNA que codifican los anticuerpos monoclonales y los
anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra el receptor
IFN-\alpha/\beta, IFNAB-BOI e
IFNAB-BPII.
La invención proporciona además vehículos de
expresión replicables que contienen dichas moléculas de DNA,
huéspedes transformados por los mismos y proteínas producidas por
dichos huéspedes transformados. La expresión "moléculas de
DNA" incluye el DNA genómico, cDNA, DNA sintético y combinaciones
de los mismos.
La presente invención proporciona también
métodos para la preparación de células huéspedes capaces de la
produc-ción de anticuerpos monoclonales funcionales
y de anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra el
receptor IFN-\alpha/\beta,
IFNAB-BPI e IFNAB-BPII.
Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la
presente invención inhiben la actividad biológica del
interferón-\alpha humano en las células humanas
sin afectar a la actividad biológica del
interferón-\beta humano. La actividad biológica
se determinó mediante la evaluación cuantitativa del efecto
inhibitorio del anticuerpo cuando se ensaya en un ensayo de
inhibición del efecto citopático, que usa células WISH humanas y el
virus de la estomatitis vesicular.
De acuerdo con la Solicitud de Patente de Israel
Nº 106591, se aisló una proteína de unión
IFN-\alpha/\beta que tiene un peso molecular de
40.000 (BFNAB-BP) de la orina normal mediante dos
etapas de cromatografía. Las proteínas de la orina impuras se
cargaron sobre una columna que consiste en
IFN-\alpha/\beta unida a agarosa. La columna se
lavó para separar las proteínas no apropiadas y las proteínas unidas
se eluyeron a continuación a un pH bajo. A continuación las
proteínas eluidas se resolvieron mediante HPLC de exclusión por
tamaño para dar diversos picos de proteínas, una de los cuales se
caracterizaba por su capacidad para reaccionar específicamente con
^{125}IFN-\alpha2 y para bloquear la actividad
antivírica de IFN-\alpha y de
IFN-\beta. Esta proteína se caracterizó
posteriormente mediante el análisis de la microsecuencia terminal
en N. La secuencia que se obtiene se comparó con y se encontró que
era diferente a la del conocido receptor IFNAR (14). Ella era
también diferente de cualquier otra proteína conocida y no estaba
codificada por cualquier secuencia de DNA conocida, como se
determinó mediante su comparación con las bibliotecas de datos
Swissprot y Genebank, usando el programa FastA (23).
Se usaron preparaciones homogéneas de
IFNAB-BP de la orina como un inmunógeno para la
preparación de los anticuerpos.
El término "anticuerpo" significa que el
mismo incluye desde los anticuerpos policlonales, los anticuerpos
monoclonales (Mabs), los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos
anti-idiotípicos (anti-Id) a los
anticuerpos que pueden estar marcados en forma soluble o combinada,
así como también a las fracciones activas de los mismos
proporcionadas mediante cualquier técnica conocida, tal como, pero
no limitada a, la escisión enzimática, la síntesis de péptidos o
las técnicas recombinantes.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos obtenidas a partir de los
sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo
monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos específicos para los antígenos, la cual población
contiene sitios de unión con los epítopos (determinantes
antigénicos) sustancialmente similares. Se pueden obtener
anticuerpos monoclonales mediante los métodos conocidos por las
personas especializadas en la técnica. Véase, por ejemplo Kohler y
Milstein Nature 256:495-497 (1975); La Patente de
EE.UU. Nº 4.376.110; Ausuble y colaboradores, eds., Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley
Interscience, N. Y. (1987-1996); Harlow and Lane,
ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory
(1988); y Colligan y colaboradores, eds., Current Protocols in
Immunology, Greene Publishing Assoc and Wiley
Inter-science, N. Y. (1992-1996),
los contenidos de cuyas referencias se incorporan completamente en
la presente invención como referencia. Dichos anticuerpos pueden
ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE,
IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que
produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede
cultivar in vitro, in situ ó
in vivo. La producción de títulos elevados de anticuerpos monoclonales in vivo ó in situ hace que este sea el método de producción actualmente preferido.
in vivo. La producción de títulos elevados de anticuerpos monoclonales in vivo ó in situ hace que este sea el método de producción actualmente preferido.
Los anticuerpos quiméricos son porciones de
diferentes moléculas de las cuales se obtienen a partir de
diferentes especies animales, tales como aquellos que tienen la
región variable obtenida a partir de un anticuerpo monoclonal de un
roedor de la familia de los murinos y una región constante de
inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan
principalmente para reducir la inmunogenicidad en su aplicación y
para incrementar los rendimientos en su producción, por ejemplo,
cuando los anticuerpos monoclonales de murinos tienen rendimientos
más elevados a partir de los hibridomas pero una inmunogenicidad más
elevada en los seres humanos, de tal manera que se usan anticuerpos
monoclonales quiméricos de seres humanos/murinos. Los anticuerpos
quiméricos y los métodos para su producción se conocen en la
técnica (Cabilly y colabo-radores, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison y
colaboradores Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855 (1984); Boulianne y colaboradores,
Nature 312:643-646 (1984); Cabilly y colaboradores,
Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre
de 1984); Neuberger y colaboradores, Nature
314:268-270 (1985); Taniguchi y colaboradores,
Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de Febrero de
1985); Morrison y colaboradores; Solicitud de Patente Europea
173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Neuberger y colaboradores,
Solicitud de Patente PCT WO 8601533, (publicada el 13 de Marzo de
1986); Kudo y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 184187
(publicada el 11 de Junio de 1986); Morrison y colaboradores,
Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de
1986); Sahagan y colaboradores, J. Immunol.
137:1066-1074 (1986); Robinson y colaboradores,
Publicación de Patente Internacional, WO 9702671 (publicada el 7 de
Mayo de 1987); Liu y colaboradores., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3439-3443 (1987); Sun y colaboradores Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better y
colaboradores, Science 240:1041-1043 (1988); y
Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, ver
anteriormente).
Un anticuerpo anti-idiotípico
(anti-Id) es un anticuerpo que reconoce los
determinantes singulares asociados generalmente con el sitio de
unión del antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id se puede
preparar mediante la inmunización de un animal de la misma especie
y mismo tipo genético (por ejemplo, una raza de ratón) como la
fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal para
el cual se está preparando un anti-Id. El animal
inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos
del anticuerpo inmunizante mediante la producción de un anticuerpo
para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo
anti-Id). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU.
Nº 4.699.880, que se incorpora en la presente invención en su
totalidad como referencia.
El anticuerpo anti-Id se puede
usar también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta
inmune en todavía otro animal, produciendo un denominado así
anticuerpo anti-anti-Id. El
anti-anti-Id puede ser
epítopicalmente idéntico al anticuerpo monoclonal original que
inducía el anti-Id. Así, mediante el uso de
anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un anticuerpo
monoclonal, es posible identificar otros clones que expresan
anticuerpos de idéntica especifidad.
De acuerdo con esto, los anticuerpos
monoclonales generados contra IFNAB-BPI,
IFNAB-BPII, y las proteínas relacionadas de la
presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos
anti-Id en animales adecuados, tales como los
ratones BALB/c. Las células del bazo de dichos ratones inmunizados
se usan para producir hibridomas anti-Id que
secretan anticuerpos monoclonales anti-Id. Además,
los anticuerpos monoclonales anti-Id se pueden
copular a un vehículo tal como la hemocianina de lapa perforada
(KLH) y se usan para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los
sueros de estos ratones contendrán anticuerpos
anti-anti-Id que tienen las
propiedades de unión del anticuerpo monoclonal original específicas
para un epítopo de IFNAB-BPI ó de
IFNAB-BPII.
Los anticuerpos monoclonales
anti-Id tienen así sus propios epítopos idiotípicos
ó "idiotopos" similares estructuralmente al epítopo que se
evalúa, tal como IFNAB-BPI ó
IFNAB-BPII.
Un anticuerpo se dice que es "capaz de
unión" a una molécula si él es capaz de reaccionar
específicamente con la molécula para de este modo unir la molécula
al anticuerpo. El término "epítopo" quiere significar que se
refiere a aquella parte de cualquier molécula capaz de estar unida
por un anticuerpo que puede ser reconocida también por ese
anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos"
consisten usualmente de agrupaciones superficiales químicamente
activas de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o
azúcares y tienen características estructurales tridimensionales
específicas así como también características de carga
específicas.
Un "antígeno" es una molécula o una parte
de una molécula capaz de estar unida mediante un anticuerpo que es
adicionalmente capaz de inducir a un animal a que produzca un
anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un
antígeno puede tener uno o más de un epítopo. La reacción específica
a la que se hizo referencia anteriormente significa que el antígeno
reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su
correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros
anticuerpos que pueden ser desarrollados por otros antígenos.
Los anticuerpos, útiles en la presente invención
se pueden usar para bloquear la actividad biológica de
sub-tipos de IFN-\alpha con poco
efecto sobre la actividad del
interferón-\beta.
La presente invención proporciona también
moléculas de DNA que codifican cualquiera de los anticuerpos de la
presente invención según se definieron anteriormente, vehículos de
expresión replicables que comprenden cualquiera de dichas moléculas
de DNA, células huésped transformadas con cualquiera de dichos
vehículos de expresión incluyendo células huésped procarióticas y
eucarióticas.
La invención incluye también un procedimiento
para la producción de cualquiera de los anticuerpos de la presente
invención mediante el cultivo de hibridomas de acuerdo con la
presente invención y la recuperación del anticuerpo monoclonal
secretado.
La invención incluye también un procedimiento
para la producción de cualquiera de los anticuerpos de la presente
invención mediante el cultivo de las células transformadas de
acuerdo con la presente invención y la recuperación del anticuerpo
secretado codificado por la molécula de DNA y el vehículo de
expresión dentro de dicha célula huésped transformado.
El DNA que codifica dichos anticuerpos y las
señales reguladoras de la transcripción y la traducción ligadas
operativamente, se inserta en los vectores eucarióticos que son
capaces de integrar las secuencias de genes deseadas dentro del
cromosoma de la célula huésped. Con el fin de ser capaces de
seleccionar las células que tienen integrado de manera estable el
DNA introducido dentro de sus cromosomas, se usan uno o más
marcadores que permiten la selección de las células huésped que
contienen el vector de expresión. El marcador puede convertir en
protótrofo a un huésped auxotrófo, y proporcionar resistencia a los
biocidas, por ejemplo, los antibióticos, o resistencia a los
metales pesados, tales como el cobre, o los semejantes. El gen
marcador que selecciona se puede dirigir bien directamente a las
secuencias de genes del DNA a ser expresadas, o ser introducido en
la misma célula mediante co-transfección. Pueden ser
también necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima
del mRNA de proteína de unión de cadena única. Estos elementos
pueden inducir señales de corte y empalme, así como también señales
de promotores de la transcripción, de potenciadores, y de
terminación (24).
Para los propósitos de la expresión de dichos
anticuerpos, sus fraccione o derivados activos, la molécula de DNA
a ser introducida dentro de la célula de elección se incorporará
preferiblemente dentro de un plásmido o vector viral capaz de
replicación autónoma en el huésped destinatario.
Los factores de importancia en la selección de
un plásmido o vector viral en particular incluyen: la facilidad con
la que las células destinatarias que contienen el vector puedan ser
reconocidas y seleccionadas de aquellas células destinatarias que
no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean
en un huésped en particular; y de si es deseable ser capaz de
"lanzar" el vector entre células huésped de diferentes
especies. Los vectores procarióticos preferidos incluyen plásmidos
tales como aquellos capaces de replicación en E. coli, por
ejemplo, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184 etc. (25); plásmidos de
bacilos tales como pC194, pC221, pT127, etc. (26); plásmidos
de
Streptomices que incluyen pIJ101 (27), bacteriófagos de Streptomices tales como IC31 (28) y plásmidos de
Pseudomonas (29, 30).
Streptomices que incluyen pIJ101 (27), bacteriófagos de Streptomices tales como IC31 (28) y plásmidos de
Pseudomonas (29, 30).
Los plásmidos eucarióticos preferidos incluyen
BPV, viruela vacuna, SV40, círculo de 2 micrómetros, etc. o sus
derivados. Dichos plásmidos se conocen bien en la técnica
(31-35).
Una vez que ha sido preparado el vector o
secuencia de DNA que contiene la(s) estructura(s) para
la expresión, el vector de expresión se puede introducir en una
célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de
medios adecuados, tales como por transformación, transfección,
lipofección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación,
precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa,
etc.
Las células huésped a usar en esta invención
pueden ser bien procarióticas o eucarióticas. Las células huésped
procarióticas preferidas incluyen bacterias tales como E.
coli, bacilos, Streptomices, Pseudomonas, Salmonela, etc. La
célula huésped procariótica más preferida es E. coli. Las
células huésped bacterianas de particular interés incluyen E.
coli K12 cepa 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC
31537), E. coli W3110 F-, lamba-, fototrópica (ATCC 27325)),
y otras enterobacterias tales como la Salmonela tifimurium, ó
Serratis marcescens y diversas especies de Pseudomonas. Bajo
tales condiciones, la proteína no será glucosilada. La célula
huésped procariótica debe ser compatible con las secuencias del
replicón y de control en el plásmido de expresión.
Las células huésped eucarióticas preferidas son
las células de los mamíferos, por ejemplo, las de seres humanos,
monos, ratones y las células del ovario de hámster chino (CHO),
debido a que ellas proporcionan modificaciones posteriores a la
traducción a las moléculas de proteína que incluyen el correcto
doblado, la formación correcta del enlace de disulfuro, así como
también la glucosilación en los sitios correctos. También las
células de levaduras y las células de insectos pueden realizar
modificaciones peptídicas con posterioridad a la traducción que
incluyen una elevada glucosilación de la manosa. Existen un cierto
número de estrategias de DNA recombinante que utilizan secuencias
promotoras fuertes y un número elevado de copias de plásmidos, que
se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en
las células de las levaduras y de los insectos. Las células de las
levaduras reconocen las secuencias conductoras sobre los productos
de genes de mamíferos clonados y secretan péptidos que contienen
las secuencias conductoras. Después de la introducción del vector,
las células huésped se hacen crecer en un medio selectivo, el cual
selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector.
La expresión de la secuencia(s) del gen clonado da lugar a la
producción de dichos anticuerpos, a proteínas de fusión, o muteínas
o fracciones activas de las mismas. A continuación los anticuerpos
expresados se aíslan y se purifican mediante cualquier
procedimiento convencional que implica la extracción, precipitación,
cromatografía, electroforesis, o los semejantes, o mediante
cromatografía de afinidad.
La presente invención se refiere además a
composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo
farmacéuticamente aceptable de dicho anticuerpo de la
invención.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se preparan para su administración mediante mezcla de dichos
anticuerpos o de sus derivados, con vehículos y/o estabilizadores
y/o excipientes fisiológicamente aceptables, y se preparan en forma
de dosis, por ejemplo, mediante liofilización en viales de dosis. El
método de administración puede ser vía cualquier de los modos
aceptados de administración para agentes similares y dependerá del
estado a tratar, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, mediante inyección local o aplicación tópica, o de modo
continuo mediante infusión etc. La cantidad de compuesto activo a
administrar dependerá de la ruta de administración, la enfermedad a
tratar y del estado del paciente. La inyección local, por ejemplo,
requerirá una cantidad más baja de la proteína sobre una base del
peso corporal que la infusión intravenosa.
Dichos anticuerpos se usan para modular o
bloquear las actividades biológicas de diversos subtipos de
IFN-\alpha por ejemplo en la diabetes tipo I,
diversas enfermedades auto-inmunes, los rechazos de
transplante, SIDA y enfermedades similares, en las que existe una
expresión fuera de lo común de la IFN-\alpha, es
decir, dichos anticuerpos se pueden usar en cualquier estado en el
que se produce un exceso de IFN-\alpha de forma
endógena o se administra exógenamente.
De acuerdo con esto, dichos anticuerpos, los
anticuerpos humanizados, están indicados para el tratamiento de las
enfermedades auto-inmunes, para otras inflamaciones
en los mamíferos, para los tratamientos de la toxicidad producida
por la administración de interferón alfa o de interferón beta, para
la diabetes juvenil, para el lupus eritematoso y para el SIDA.
La invención se ilustrará ahora mediante los
Ejemplos siguientes no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones hembras Balb/C (de 3 meses) se
inyectaron en primer lugar con 2 \mug de IFNAB-BP
purificada en una emulsión de adyuvante de Freund completo, y tres
semanas más tarde, por vía subcutánea en adyuvante de Freund
incompleto. Se proporcionaron cinco inyecciones adicionales a
intervalos de 10 días, por vía subcutánea en PBS. Los sueros de
estos ratones hembras tenían un título de unión de 1:100.000 según
se determina mediante IsRIA (véase más adelante). Los antisueros
bloquearon la actividad vírica tanto de la
IFN-\alpha como de la IFN-\beta
según se determina mediante el siguiente procedimiento: Se incubaron
monocapas preformadas de células WISH humanas en placas de 96
pocillos durante 2 horas a 37ºC con diluciones dobles de antisuero
(o antcuerpo monoclonal). A continuación se añadió
IFN-\alpha2 ó IFN-\beta (10 U/ml
final; calibrada frente a estándares de NIH) a todos los pocillos y
las placas se incubaron adicionalmente durante 4 horas. A
continuación las células se infectaron con el virus de la
estomatitis vesicular (VSV) y se incubaron durante la noche hasta
que se notó un efecto citopático completo en los pocillos de control
que carecen de la IFN. El título de neutralización de los
anticuerpos en los pocillos que mostraban 50% de CPE se tomaba que
era de 9 unidades/ml. Por lo tanto, 1 unidad/ml de bloqueo es la
concentración de anticuerpo necesaria para bloquear la actividad de
1 U/ml de IFN bajo estas condiciones del ensayo. El suero de los
ratones inmunizados tenía un título de neutralización de 120.000
U/ml tanto para la IFN-\alpha como para la
IFN-\beta.
A continuación los refuerzos finales de
IFNAB-BP purificada se proporcionaron por vía
intraperitoneal 4 y 3 días antes de la fusión. La fusión se efectuó
usando una línea celular de mieloma NSO/1 y linfocitos preparados a
partir tanto de los ganglios del bazo como de los linfáticos del
ratón inmunizado como compuesto asociado de la fusión. Las células
fusionadas se distribuyeron en placas de 96 pocillos y se
seleccionaron los hibridomas en DMEL suplementada con medio de
cultivo HAT y 15% de suero de caballo.
\vskip1.000000\baselineskip
El rastreo de los hibridomas que producen
anticuerpos monoclonales
anti-IFNAB-BP se efectuó como sigue:
Los sobrenadantes hibridomas se ensayaron para determinar la
presencia de anticuerpos
anti-IFNAB-BP mediante un ensayo
radioinmunológico (sRIA) en fase sólida invertida como sigue. Placas
de micro-valoración de PVC (Dynatech
Labora-tories, Alejandría, VA) se revistieron con
anticuerpos F(ab)2 de suero anti-ratón
de cabra purificado por afinidad (Jackson Labs., USA) (10
\mug/ml, 100 \mul/pocillo). Después de la incubación durante la
noche a 4ºC las placas se lavaron dos veces con PBS que contiene BSA
(albúmina de suero bobino) (0,5%) y Tween 20 (0,05%) y se
bloquearon en la disolución de lavado durante al menos 2 horas a
37ºC. Se añadieron los sobrenadantes del cultivo de hibridoma (100
\mul/pocillo y las placas se incubaron durante 4 horas a 37ºC. A
continuación las placas se lavaron tres veces con la disolución de
lavado y se añadió
^{125}I-IFNAB-BP (100 \mul, 105
cpm) para una posterior incubación de 16 horas a 4ºC. Las placas se
lavaron 3 veces y se cortaron los pocillos individuales y se
contaron en un contador gamma. Las muestras que proporcionan cuentas
que eran al menos 5 veces más elevadas que el valor de control
negativo se consideraron positivas (Tabla I). Se seleccionaron
todos los clones positivos y se subclonaron. Los subclones
individuales se inyectaron en ratones Balb/C que habían sido
sensibilizados con pristano para la producción de ascitis. Se
aislaron las inmunoglobulinas de los fluidos ascíticos mediante
precipitación con sulfato de amonio (saturación del 50%). Los
isótopos de los anticuerpos se definieron mediante el uso de un
estuche de ELISA (ensayo inmunoenzimático) disponible comercialmente
(Amersham, UK).
Los diversos anticuerpos monoclonales, bien como
sobrenadantes de hibridoma, sobrenadantes de hibridoma concentrados,
fluidos ascíticos o las inmunoglobulinas de los fluidos ascíticos
se ensayaron posteriormente para determinar su capacidad para
bloquear el receptor e impedir la actividad antiviral de
IFN-\alpha2 y de IFN-\beta como
se describió anteriormente para el suero de los ratones inmunizados.
Los resultados se muestran en la Tabla I. Así se encontró que los
anticuerpos monoclonales 16.3, 53.2 y 392.1 bloquean la actividad
antiviral tanto de IFN-\alpha2 como de
IFN-\beta con títulos comparables, mientras que el
título de los anticuerpos monoclonales 35.9, 51.44 y 234.14 frente
a IFN-\alpha2 se encontró inesperadamente que era
significativamente más elevado que su título frente a
IFN-\beta. Así los anticuerpos monoclonales 35.9,
51.44 y 234.14 se pueden usar en un cierto intervalo de
concentración para bloquear selectivamente la actividad de
IFN-\alpha mientras que no se afectará la
actividad de IFN-\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Placas de micro-valoración
(Dynatech o Maxisorb, bNunc) se revistieron con anticuerpo
monoclonal anti-IFNAB-BP durante la
noche a 4ºC. El primer revestimiento se puede hacer bien con
anticuerpo monoclonal Nº 46.10 (fracción Ig, 120 \mul/pocillo, 10
\mug/ml en PBS). El anticuerpo monoclonal Nº 46.10 se describe en
la Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 676.413.
Alternativamente, el anticuerpo monoclonal Nº
117.7 se puede usar para el primer revestimiento. Las placas se
lavaron con PBS que contiene BSA (0,5%), Tween 20 (0,05%) y
NaN_{3} (0,02%) (disolución de bloqueo) y se bloquearon en la
misma disolución durante la noche a 37ºC. Las muestras ensayadas se
diluyeron en serie dos veces (comenzando con 1:4) en la disolución
de bloqueo que contiene 0,1% de NP40 y NaCl 0,65 M y se añadieron a
los pocillos (100 \mul/pocillo) durante 4 horas a 37ºC. A
continuación las placas se lavaron 3 veces con PBS que contiene
0,5% de Tween 20 (PBS/Tween) seguido de la adición de anticuerpo
monoclonal tratado con biotina Nº 234.14 (1:1000 en disolución de
bloqueo pero sin NaN_{3}, 100 \mul/pocillo) para su posterior
incubación durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces
con PBS/Tween (100 \mul/pocillo), y se añadió un conjugado de
Streptavidin-peroxidasa de raíz de rábano rusticano
(Jackson Labs, 1:10.000 en PBS/Tween (100 \mul/pocillo) durante 2
horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con
PBS/Tween y se desarrolló el color mediante la adición a cada
pocillo de 100 ml de una disolución recientemente preparada de ABTS
(ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico),
Sigma, 10 mg; 6,4 mg de H_{2}O; 2,2 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2
M; 1,4 ml de ácido cítrico 0,2 M, 1 \mul de H_{2}O_{2}) como
un substrato. Se desarrolla el color durante 30 minutos, y la
reacción se puede parar mediante la adición de 100 \mul/pocillo
de ácido cítrico 0,2 M. El límite inferior de detección de este
ensayo era de 30 pg/ml.
La descripción precedente de las realizaciones
específicas revela la naturaleza general de la invención de modo
que otras personas pueden, mediante la aplicación del conocimiento
actual, modificar y/o adaptar fácilmente a diversas aplicaciones
dichas realizaciones específicas sin separarse del concepto
genérico, y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones se
deben entender que están comprendidas dentro del significado y de
la gama de equivalentes de las realizaciones descritas. Se debe
entender que la fraseología o terminología empleada en la presente
invención es para el propósito de su descripción y no de su
limitación.
Los hibridomas 46.10, 117.7 y 234.14 se
depositaron en el Instituto Pasteur (CNCM) bajo los números de
depósito I-1697, I-1698, e
I-1699, respectivamente, el 23 de Abril de 1996.
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Claims (14)
1. Un anticuerpo designado NUR 2 117.7,
que se expresa mediante el hibridoma que se depositó en el
Instituto Pasteur bajo el número de acceso I-1698 el
23 de Abril de 1996.
2. Un anticuerpo designado NUR 2 234.14,
que se expresa mediante el hibridoma que se depositó en el
Instituto Pasteur bajo el número de acceso I-1699 el
23 de Abril de 1996.
3. Un anticuerpo monoclonal y humanizado
que comprende el dominio variable del anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 y un dominio constante de inmunoglobulina
humana.
4. Una molécula de DNA que comprende un
segmento de DNA que codifica el anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. La molécula de DNA de acuerdo con la
reivindicación 4, que es una molécula de DNA recombinante.
6. La molécula de DNA de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5, en la que dicho segmento de DNA que codifica
el anticuerpo está unido operativamente a las señales reguladoras de
la transcripción y de la traducción.
7. Un vector de expresión que comprende
una molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación
6.
8. Una célula huésped capaz de expresar
un anticuerpo, en la que dicha célula huésped transporta un vector
de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un método de producir un anticuerpo
mediante el cultivo de la célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 8, y la expresión del anticuerpo.
10. Una composición farmacéutica para la
modulación o el bloqueo de la actividad biológica de
IFN-\alpha, que comprende el anticuerpo de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Uso del anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de
una composición farmacéutica para la modulación o el bloqueo de la
actividad biológica de IFN-\alpha.
12. Un hibridoma que expresa el anticuerpo
de acuerdo con la reivindicación 1, que se designa NUR 2 117.7 y
que se depositó en el Instituto Pasteur bajo el número de acceso
I-1698 el 23 de Abril de 1996.
13. Un hibridoma que expresa el anticuerpo
de acuerdo con la reivindicación 2, que se designa NUR 2 234.14 y
que se depositó en el Instituto Pasteur bajo el número de acceso
I-1699 el 23 de Abril de 1996.
14. Un estuche (kit) para la realización
de un ensayo ELISA de IFNAB-BPI y/o
IFNAB-BPII que comprende placas de microvaloración
comerciales provistas con un primer revestimiento de un anticuerpo
monoclonal producido mediante el hibridoma de acuerdo con la
reivindicación 12, y un segundo revestimiento de un anticuerpo
monoclonal producido mediante el hibridoma de acuerdo con la
reivindicación 13.
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