JPH05117164A - 治療薬を固形組織に補給するための方法および物質 - Google Patents

治療薬を固形組織に補給するための方法および物質

Info

Publication number
JPH05117164A
JPH05117164A JP4101629A JP10162992A JPH05117164A JP H05117164 A JPH05117164 A JP H05117164A JP 4101629 A JP4101629 A JP 4101629A JP 10162992 A JP10162992 A JP 10162992A JP H05117164 A JPH05117164 A JP H05117164A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding molecule
therapeutic agent
binding
chain
binding molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4101629A
Other languages
English (en)
Inventor
Tse Wen Chang
ウエン チヤン ツエ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tanox Inc
Original Assignee
Tanox Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tanox Inc filed Critical Tanox Inc
Publication of JPH05117164A publication Critical patent/JPH05117164A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 目標とする固形組織部位に治療薬を効果的に
補給するための手段を提供すること。 【構成】 互いに結合した２つの単鎖ＶH −ＶL 二官能
性結合分子であって、一方の鎖が固形組織に対して特異
的であり、他方の鎖が治療薬に対して特異的である結合
分子；循環血液中の結合分子と結合する除去物質；およ
び治療薬を含む、固形組織へ治療薬の運搬を促進するた
めの組成物を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、まず二官能性結合分
子が投与され、この結合分子が管外領域で最大濃度に達
した後、血流中及び管外領域中の結合分子の除去を助け
る除去物質を投与した後に治療薬を投与する、二官能性
２ドメイン結合分子を用いてある固形組織の部位に治療
薬を補給する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インビボで固形組織部位へ治療薬および
造影剤をいかに運搬するかに関して、多くの研究および
実験がなされてきた。こういった部位特異的運搬は、治
療薬または造影剤を複合させたモノクローナル抗体
（「ｍＡｂｓ」）で多く試みられてきた。これら免疫複
合体は、これらが持つインビボでの疾患または腫瘍部位
を特異的に標的とする能力のために、しばしば「魔法の
弾丸」と呼ばれている。
【０００３】免疫毒素はまた、ｍＡｂｓが、シュードモ
ナス属の菌体外毒素、リボソーム不活化タンパク質、リ
シン、ゲロニンおよびアメリカヤマゴボウの抗ウイルス
ペプチドを含む植物または細菌由来の毒素などの毒性物
質と複合した免疫複合体であって、広範な研究がなされ
てきた。さらに、金属キレー剤と複合したｍＡｂｓは、
その金属キレート剤が放射性同位体を運搬することが可
能であって、腫瘍の治療および造影の両面に使用されて
きた。
【０００４】免疫複合体、および特に免疫毒素は、固形
組織と他の領域における双方の腫瘍の治療に対して活発
な研究がなされてきた。腫瘍の除去または腫瘍塊の縮小
のための免疫毒素に関する臨床試験がなされてきた。こ
ういった試験は、ｍＡｂｓがリシンのＡ鎖または放射性
同位体と複合する免疫同位体に関して行われることが多
い。免疫毒素はまた、動物に移植された腫瘍中の悪性細
胞を除去するためにモデル動物でも研究されてきた。
【０００５】これらの研究は、 免疫毒素が固形腫瘍より
も白血病またはリンパ腫に有効性の高いことを示す。こ
の有効性の差異に関する考え得る一つの説明は、薬剤
が、血中またはリンパ組織における悪性細胞の方に、固
形腫瘍における悪性細胞より接近しやすい点にある。し
たがって、固形腫瘍中の悪性細胞は、それらを殺傷する
に足る量の毒素とは接触不可能といえる。さらに、毒素
が標的細胞と接触する際でも、極めて少量のみが細胞中
に入るので、固形腫瘍中のすべての細胞を殺傷する訳に
はいかない。
【０００６】悪性細胞に近接し、その細胞の殺傷を可能
とする量を増加させるために、免疫毒素の総投与量を増
加させることも当然可能である。しかし、抗体分子と複
合するために、免疫毒素の多くが生体の網内細胞に吸収
され、取り込まれる。この毒素は、これらの細胞を損傷
または破壊するであろう。特に、肝臓では大量の免疫毒
素が貪食細胞に至り、そこでは、その毒性のために、肝
臓およびその機能が損傷を受けることがある。
【０００７】免疫毒素に関して生じる問題は、一般的な
臨床試験において詳述されている。文献［S.A. et al.
“Therapeutic Monoclonal Antibodies" 編者 Borreba
eck,C.A. and Larrik, J.W. pp.127-141 (Stockton Pre
ss, New York 1990) ］参照。 Ｂリンパ腫を有する患者
が、放射性同位体の90Ｙ（イットリウム）と結合した抗
イディオタイプ抗体で治療された。この療法は極めて有
毒なので、免疫複合体の投与は、過剰の未標識抗イディ
オタイプ抗体とともに行われなければならない。しか
し、過剰の未標識抗イディオタイプ抗体は、腫瘍に会合
した抗原への結合に関して標識免疫複合体と拮抗したの
で、腫瘍細胞標的への免疫複合体の結合を阻害する結果
となった。
【０００８】類似の欠点は、ｍＡｂｓおよび放射性同位
体を含む免疫複合体が腫瘍の造影に使用される際に生じ
る。この免疫複合体は、肝臓、脾臓および循環血液中の
貪食細胞に結合し取り込まれる傾向がある。その免疫複
合体の抗体部分がこれらの細胞によって吸収されるから
である。これは、バックグラウンドの「ノイズ」を増加
させ、腫瘍の造影に干渉するとともに、これらすべての
器官で放射活性の毒性レベルをもたらし得る。
【０００９】いくつかのグループが、造影剤と結合した
ｍＡｂｓを用いたときに生じる主要な問題、すなわち、
造影剤がインビボで吸収され、抗体とともに除去される
とき生じる問題の解決策を試みてきた。あるグループ
は、ｍＡｂｓと造影剤を結合させる代わりに、造影剤に
結合しない両特異的抗体を最初に投与すべきことを示唆
している。この両特異的抗体は、標的となる腫瘍に対し
て一方の特異性をもち、ペプチドに複合したキレートに
対して他方の特異性をもつ。この両特異的抗体は腫瘍と
循環血液との間に分布し、高い腫瘍／バックグラウンド
比が得られるところで、標識キレートが投与される。抗
体に吸収されないキレートは、そのサイズが比較的小さ
いために、腎臓から急速に排泄される。この結果、バッ
クグラウンドのノイズが低くなる。文献［Monoclonal A
ntibodies in Immunoscintigraphy,編者 Chatal, J.F.,
pp.70-71 (CRC Press,Boca Raton Fa. 1989)］参照。
【００１０】もう一つのグループは、標的腫瘍に徐々に
拡散する抗体を投与し、次いで、過剰な循環抗体を除去
することについて検討している。この除去は、徐々に拡
散する血清タンパク質（ヒトのトランスフェリン）に共
有結合した抗原を用いて行われる。したがって、造影剤
のトレーサーを、小分子であって急速に拡散し迅速に除
去されるエピトープ誘導的二官能性キレートとして投与
する。また、これは、バックグラウンドの放射を低下さ
せ、造影を改良するように設計されている。文献［Dood
win, D.A. et al., J. Nuc. Med. 29:226-34(1988)］参
照。関連論文では、一方の特異性がキレートに対するも
のであって、他方の特異性が腫瘍部位抗原に対するもの
である、ＳＨ基に結合した２つのＦａｂ’断片のような
二官能性抗体を使用することが示唆されている。文献
［Doodwin, D.A. et al., J. Nuc.Med. 28:1358-62(198
7) ］参照。
【００１１】もう一つの関連論文では、抗体および標識
タンパク質（トランスフェリン）の注射、それに続く、
抗ヒトＩg Ｇ抗体および抗トランスフェリン抗体の注射
が示唆されている。第２抗体の注射は、過剰な標識トラ
ンスフェリンを除去すること、およびバックグラウンド
のノイズを低下させることに役立つ。文献［Doodwin,D.
A. et al., J. Nuc. Med. 9:209-215(1984)］参照。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】可能な限り多量の結合
分子を標的組織に結合させたまま、造影剤の投与に先立
って結合分子を血管および管外領域から除去する方法に
ついては上記のどの論文にも記載されていない。毒素ま
たは治療薬を投与するとき、過剰な毒素が管外領域の結
合分子によって結合されず、損傷を引き起さないよう
に、管外領域（ならびに血管）から結合分子を除去する
ことが更に重要である。したがって、標的部位に対する
特異性と毒素／治療薬に対する特異性とをもつ二官能性
結合分子を最初に注射すると、標的部位に結合している
分子は可能な限り保持されねばならないが、結合せずに
循環血液または管外領域に存在する分子は除去されなけ
ればならない。また、除去は、結合分子が毒素／治療薬
を投与する前に標的部位から放出されない程度迅速に行
われなければならない。
【００１３】治療薬の結合分子による組織特異的補給に
よって、固形腫瘍を治療する有効な方法を設計する上で
多数の因子を考慮しなければならない。これらの因子と
して以下のようなものが挙げられる。 １）この方法で使用される、結合分子、治療薬および他
の物質の薬物動力学的特性。 ２）結合分子、治療薬および他の物質の除去経路（網内
系対腎臓）。 ３）毛細管内外への結合分子および治療薬の拡散速度。 ４）結合分子は細胞によって飲食作用を受けてはならな
い。 ５）標的細胞上での結合分子のオン／オフ時間 ６）治療薬に対する結合分子の親和性、ならびに結合分
子が治療薬を標的部位に補給する効率。 ７）リシンＡ鎖、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスペプ
チドなどの治療毒素が標的細胞に入って効果をもたらさ
ねばならないが、他の治療物質（および造影剤）の中に
は、有効に作用するために標的細胞に入る必要のないも
のもある。 ８）結合分子および治療薬の免疫原性および抗原性。 これらの因子は、有効な方法の設計を極めて複雑にす
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】この発明は、結合分子の
一方の特異性が標的部位にあり、他方の特異性が治療薬
にある、固形組織の標的部位に該治療薬を補給する二官
能性２ドメイン結合分子の使用を含む。治療薬は、結合
分子を投与して除去物質を投与した後、別途投与する。
【００１５】除去物質は、結合分子に対する抗体と複合
したリポソームであることが好ましい。この除去物質
は、管外領域に拡散し得ず、肝臓、脾臓および循環血液
中の貪食細胞によって迅速に除去される。これは循環血
液中に存在する結合分子に結合するので、循環血液から
結合分子を除去するに役立つ。除去の後、血管壁を介し
た結合分子の濃度差が生じ、管外領域の結合分子は血管
内に拡散する。
【００１６】除去物質は、結合分子が管外領域で最大濃
度に達した後可能な限り早急に投与すべきである。この
ような時に投与すれば、実質的量の結合分子が標的組織
部位から放出されてはいない。
【００１７】除去物質は少なくとも２回投与することが
好ましく、除去物質を２回目以降に投与するのは、循環
血液および管外領域中の結合分子が平衡状態に達した後
の時点である。除去物質の投与によって、管外領域と循
環血液中の両方において結合分子の大部分が有効に除去
されるので、循環血液および管外領域における結合分子
に比較して標的組織中の結合分子の比率が一層増加する
ことになろう。
【００１８】除去物質の最終投与後であって、除去物質
が循環血液から消失するに足る時間が経過した後に、治
療薬を投与すべきである。しかし、治療薬は実質的量の
結合分子が標的部位から放出される前に投与すべきであ
り、その結果、できるだけ大量の治療薬が標的部位で結
合分子によって結合されることになる。
【００１９】二官能性２ドメイン結合分子は、互いに結
合した、２つのＶH −ＶL 単鎖結合分子であることが好
ましい。国際出願第ＷＯ８８／０９３４４号に記載され
ているように、連結ペプチドを介してこれらを結合させ
ることができる。図２Ｄ参照。結合分子の１つ以上の結
合部位を認識する抗イディオタイプ抗体を含むように除
去物質を設計することが可能である。しかし、好ましい
実施態様では、除去物質に複合した抗体は、２つのＶH
−ＶL 単鎖結合分子間の結合領域に付随した抗原性構造
を認識したり、又は連結ペプチド自体を認識する。ある
いは、２つのＶH −ＶL 単鎖結合分子を連結するペプチ
ドはグリコシル化されており、非グリコシル化ペプチド
またはそれに結合したハプテンをもっていてもよい。非
グリコシル化ペプチドは、除去物質と会合した抗体によ
って特異的に認識される。
【００２０】効果を発揮するために細胞中に入らなけれ
ばならないこれら治療薬にとって、治療薬の細胞中への
侵入を防止するペプチドブロッカーをこれら治療薬に連
結させることも好ましい。このブロッカーは、結合分子
によって結合されていることが好ましい。
【００２１】こういった治療薬とブロッカーを連結させ
る好ましい手段は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５
３２に記載されたものなど、疎水性（親油性）ペプチド
リンカーを用いることである。また、ブロッカーと治療
薬との間に切断部位が存在しなければならず、その結
果、このブロッカーを切断することができ、治療薬が細
胞中に侵入可能となる。
【００２２】治療薬、リンカーおよびブロッカーの免疫
複合体は、網内系（ＲＥＳ）細胞による貪食を最小限に
抑えるために、小さくあるべきである。ブロッカーが結
合分子により標的部位に結合している間に、このブロッ
カーが切断されて放出されることが好ましい。疎水性
（親油性）リンカーは、細胞膜と混ざり合う傾向がある
ので、治療薬の細胞中への侵入を高める。
【００２３】したがって、この発明の好ましい態様で
は、３種類の異なった物質が３つの段階で導入される。
まず、一方の特異性が標的部位の抗原にあり、もう一方
の特異性が治療薬の抗原性部位にある二官能性２ドメイ
ン結合分子を投与し、標的部位に結合し、管外領域で最
大濃度に達することを可能とする時間放置する。管外領
域の結合分子の濃度は、腹腔から得られる液体試料中の
結合分子を測定することによってモニター可能である。
結合分子が管外領域で最大濃度に達すると、除去物質、
好ましくは抗体と結合したリポソームが投与されて、循
環血液から過剰な結合分子が除かれる。これによって、
血管壁を隔てた結合分子の濃度差が生じる。管外領域の
結合分子は血管中に拡散する傾向があり、そこでまた、
結合分子は除去物質と結合することになる。
【００２４】除去物質は数回再導入されることが好まし
く、各導入は、結合分子が血管壁を隔てて平衡に達した
直後が好ましい。除去物質の各導入によって血管中の結
合分子が枯渇する。結合分子は除去物質と一度結合する
と、結合分子は極めて容易に急速にＲＥＳによって除去
されるからである。血管中で結合分子の濃度が低いと、
管外領域から血管中へ結合分子の拡散が生じ、その結
果、血管中および管外領域で結合分子濃度が連続的に低
下する。結合分子は治療薬の細胞毒素と複合していない
ので、ＲＥＳによる結合分子の取込みおよび除去が細胞
に毒性を与えることはない。
【００２５】次いで、治療薬が投与されるが、これは、
除去物質の最終投与の直後、およびいかなる有意量の結
合分子が標的部位から放出される前に行われることが好
ましい。この治療薬は治療薬に付随する抗原性部位に対
して一方の特異性を有する結合分子によって標的部位に
結合する。
【００２６】全工程が８時間以内に完了することが好ま
しい。これは、治療薬の投与前、結合分子の実質的量が
標的部位から放出するのを妨げるほどの短い時間であ
る。
【００２７】従来の免疫毒素療法では、抗体および毒素
からなる免疫毒素複合体は、標的細胞を殺すためには標
的細胞によって飲食作用を受けなければならない。この
発明の一つの重要な相違点は、この発明の二官能性２ド
メイン結合分子が標的細胞によって飲食作用を受けては
ならない点にある。この発明の結合分子が飲食作用を受
けると、これら結合分子は、治療薬が投与される際に治
療薬への結合に利用されなくなろう。
【００２８】二官能性２ドメイン結合分子は、これらの
分子が腫瘍関連抗原に対して１価しかもたず、抗原の架
橋を当然起こさないために、標的細胞による飲食作用を
受けない。一般に、架橋は飲食作用を誘導する。
【００２９】この発明の利点は、治療薬が投与された時
点で標的部位に存在する結合分子の量を最大にでき、そ
れによって、標的部位に到達する治療薬の量を最大にす
るという事実を含む。これは、小さな二官能性２ドメイ
ン結合分子の使用、ならびに適切な時期に除去物質およ
び治療薬を投与することによって達せられる。この小さ
な二官能性２ドメイン結合分子は、毛細血管を介して比
較的急速に拡散するため、有意な量の結合分子が標的部
位から放出されないうちに、除去物質の投与によって、
循環血液および管外領域の過剰な結合分子が有効に除去
される。その結果、網内細胞および循環血液中の他の細
胞に及ぶ毒性が少なくてすみ、肝臓の貪食細胞に及ぶ毒
性も少ない。これは、治療薬が標的部位に結合し、血中
を循環したり不所望の部位に吸収されることがないから
である。
【００３０】好ましい結合分子は以下の性質を有する。 １）標的部位の表面抗原に極めて高い親和性をもつ（Ｋ
a は約１×１０9mol-1以上）。 ２）治療薬に対して極めて高い親和性をもつ（Ｋa は約
１×１０9mol-1以上）。 ３）比較的大きな動力学的特性をもつ。すなわち、血管
中と管外領域との間における結合分子の平衡が比較的早
く達せられる（図１および２の「ｔev max 」時間が比較
的短い）。 ４）結合分子は、標的細胞の表面抗原に結合した後、標
的細胞による貪食作用をあまり受けない。
【００３１】国際出願ＷＯ８８／０９３４４に記載され
ているように、そして、図７で模式的に示されるよう
に、この発明において使用に適した二官能性２ドメイン
結合分子は、２つのＶH −ＶL 単鎖結合分子が互いに結
合したものである。図７の結合分子３０では、リンカー
３２は一方のＶH −ＶL 単鎖結合分子３４と他方のＶH
−ＶL 単鎖結合分子３６を結び付けている。
【００３２】単鎖のＶH −ＶL 結合分子（この発明にお
ける２つの単鎖結合分子とは異なる）は、抗体のＬ鎖お
よびＨ鎖のＦv 部分からなり、これらは一般に短いペプ
チド鎖で連結されている。米国特許第４，９４６，７７
８号参照。この発明では、２つのＶH −ＶL 単鎖結合分
子が互いに結合しているが、単一鎖の結合分子の一方
は、標的部位の抗原に特異的であって、もう一方は治療
薬に付随する抗原性部位に特異的である。
【００３３】互いに結合した２つのＶH −ＶL 単鎖結合
分子はこの発明にとって好ましい。その理由は、これら
の結合分子が更に大きな両特異的抗体または他の大きな
断片より急速に循環血液から除去される点、ならびにこ
れらの結合分子が毛細血管壁を容易に通過できる程度に
小さいので、除去物質の投与後であって結合分子の有意
量が標的部位から放出され得る前に結合分子の平衡状態
が急速に達せられる点にある。結合分子が平衡状態に達
するごとにさらなる除去物質が投与されるので、あらゆ
る未結合の結合分子が循環血液および管外領域から除去
される速度が高まる。
【００３４】２つのＶH −ＶL 単鎖結合分子を連結する
リンカーは、α- ヘリックスまたはβ−シート構造のペ
プチドであるべきではない。これらのペプチドは堅く、
特定の配向で２つの単鎖結合部位を保持しているため、
これによって結合に適した配向とならないこともある。
しかし、このリンカーは、互いに隔たった単一鎖結合部
位を保持しているべきであり、その結果、これらの結合
部位はお互いの結合を妨害しない。
【００３５】２つのＶH −ＶL 単鎖結合分子のための好
ましいリンカーは、小さな非同種の親水性ペプチド、好
ましくは約１０ないし約１５アミノ酸残基のペプチドで
ある。こういった非同種のリンカーは、除去物質と複合
した抗体に対する抗原性部位を与えることができる。
【００３６】ペプチドは、グリシンおよび／またはセリ
ン残基を主に含むものがより好ましく、グリシンおよび
セリン残基にグリコシル化配列が連なったものが最も好
ましい。１つのグリコシル化配列としてはＡｓｎ−Ｘ−
Ｙが挙げられる。ここで、「Ｘ」はほとんどのアミノ酸
であってよく、「Ｙ」はセリンまたはスレオニンであ
る。文献［Marshall, R.D., Glycoproteins p.679 (197
2)］参照。このペプチドがグリコシル化されている場
合、それは、免疫原性のない同種のペプチドであるこ
と、および抗原性ペプチドが糖鎖部分に結合しているこ
とが最も好ましい。
【００３７】グリシンまたはセリン残基が好ましいが、
それは、これらの残基が堅固でないペプチドに一般に付
随し、結合部位の配向を過度に制限することがないため
である。これらの残基は親水性ペプチドを形成し、生じ
た親水性によって、ＶH −ＶL 結合部位が互いに干渉し
て結合を阻害することがないように、これらの部位を離
れたままの状態におかれることが助長される。グリコシ
ル化ペプチドが最も好ましいのは糖鎖がリンカーに対す
る親水性を更に増し、それによって、２つの結合ドメイ
ンが物理的に離れた状態におかれるためである。
【００３８】除去物質は、結合分子の他の部分に結合す
るよりもリンカーに結合することが好ましい。したがっ
て、図８で示される好ましい実施態様では、リンカー４
１の糖鎖４０部分が、ハプテンまたはアミノ酸約６ない
し１０残基からなる非同種のペプチド４２と複合してい
る。ペプチド４２は、除去物質に付随する抗体に対する
抗原性部位となる。
【００３９】好ましい除去物質は以下の性質を有する。 １）結合分子に特異性に結合し得る。 ２）循環血液中にとどまり、毛細血管の壁孔を介して拡
散せず、脾臓、肝臓およびリンパ組織へは拡散する以
外、管外領域または固形組織へは拡散しない。 ３）網内系によって急速に除去される。
【００４０】好ましい除去物質は、２つの二官能性結合
分子をつなぐペプチドに付随する抗原性部位に特異的な
抗体と複合したリポソームである。もっとも、これらの
抗体は、連結したＶH −ＶL 結合分子のいかなる部分に
特異的であってもよく、また、ＶH −ＶL 結合分子に対
する抗イディオタイプ抗体であってもよい。これらの抗
体はまた、デキストランまたはポリエチレングリコール
などの重合性物質と複合していてもよい。
【００４１】図１および２を参照にして、投与された結
合分子の薬物動力学を説明する。図１の曲線Ａは、循環
血液中の結合分子の濃度を示し、曲線Ｂは管外領域中の
濃度を示す。曲線Ａは、注射後、管外領域中へ結合分子
が拡散し、標的部位に結合するまでの時間を示すｔev
max までの急速な低下を表す。時間ｔev max の後、曲線
Ａはよりゆっくりと低下するが、これは、網内系、腎臓
および他の体細胞による結合分子の除去を示す。
【００４２】図１の曲線Ｂを参照にすると、管外領域の
結合分子濃度は、注射の後循環血液と管外領域との間で
平衡に達する時間ｔev max まで増加することがわかる。
【００４３】図２は、腫瘍と血液との間における結合分
子の分布動力学を示す。曲線Ａは、標的抗原に会合した
結合分子の量を示す。その量は、注射時からｔev max 時
まで急速に増加してから、その後徐々に減少するが、後
者の相は、結合分子が標的部位から放出される間の時間
を示す。曲線Ｂは、腫瘍／血液の濃度比を示す。この比
は、ｔev max 後の増加より注射時点からｔev max までの
方が若干急速であることがわかる。
【００４４】投与された結合分子がより小さい場合、動
力学的帰結は以下の通りである。 １）ｔev max までの時間がより短い。 ２）血液と管外領域との間の濃度差がより小さい。 ３）管外領域の結合分子の濃度がより高レベルに達し得
る。 ４）より多量の結合分子が標的部位に結合分子し得る。 ５）結合分子は、管外領域から循環血液により急速に拡
散する。これらの結果のすべては、好都合なものである
ため、好ましい結合分子は、互いに結合した２つのＶH
−ＶL 単鎖結合分子である。このように結合した単鎖結
合分子は、Ｆ（ａｂ’）2 断片などの多くの抗体断片よ
り小さく、抗体全体よりも小さい。
【００４５】除去物質の投与に関連して異なった時点で
見られる結合分子の除去を図３〜７に示す。図３は、管
外領域１２に囲まれた血管１０を模式的に示したもであ
って、管外領域１２は固形組織１４によって更に囲まれ
ている。固形組織１４上には腫瘍１６があり、これが結
合分子２０の標的部位である。肝臓１８は、血管１０と
流体を介して結合した状態で示されている。結合分子は
投与されて間もないので、まだ血管１０中にすべて存在
している。
【００４６】図４は、図３と同じであるが、しばらく経
過した後の図である。図４は、図１および図２のｔev
max を示すが、ここでは、管外領域１２および血管中１
０の内部との間で平衡状態となっていると同時に、結合
分子２０が管外領域１２で最大濃度に達している。ま
た、結合分子２０は、ほぼ最大レベルで標的部位に結合
している。結合分子２０の中には、吸収され肝臓１８に
よって取り込まれるものもある。
【００４７】図５は、除去物質が投与された後の状態を
示す。除去物質の作用の結果として、結合分子２０の血
中１０濃度は大きく減少している。毛細血管を介した結
合分子２０の拡散速度がＲＥＳによる除去物質の除去速
度より小さいため、結合分子２０の濃度は、血管１０中
よりも管外領域１２で高くなる。腫瘍１６に結合された
結合分子の量は、ほぼ最大レベルの状態にある。結合分
子２０のより多くが、肝臓１８に取り込まれている。
【００４８】図６は、結合分子の除去段階が実質的に完
了した後における状態を示す。血管中１０および管外領
域１２ににとどまっている結合分子２０はほとんどな
い。腫瘍１６によって結合された結合分子２０の量は、
図５の場合とほぼ同様のレベルに止まる。結合分子の放
出時間が、結合分子が血管１０中に拡散して除去される
のに必要な時間よりはるかに長いからである。肝臓１８
はより多量の結合分子２０を取込み、そのうちの一部を
消化してしまっている。この時が、治療薬を投与する最
適な時期である。
【００４９】除去物質は、循環血液中と管外領域の両者
において遊離の結合分子を除去するためのものなので、
結合分子がｔev max に達した直後に反復投与すべきであ
る。除去物質がｔev max 時間の約４〜５倍の全時間にわ
たって投与されるならば、より好ましい。
【００５０】除去段階全体の長さがｔev max 時間の４〜
５倍である好ましい態様では、結合分子のほぼすべてが
管外領域から血管に逆拡散され、除去物質に血管中で結
合される。しかし、こういった除去段階は、治療薬を投
与する前に標的部位から有意量の結合分子を除去させる
程度の長時間ではない。
【００５１】除去物質が反復投与されるか連続的に静注
されることが好ましい。ｔev max において結合分子の約
半分が管外領域にあり（平衡状態において）、次いで、
除去物質が４回（４×ｔev max ）投与された後であれ
ば、管外領域中の結合分子の残存量は、始めに投与され
た全結合分子の約１／２×（１／２）4 、すなわち約３
％となろう。
【００５２】Ｉg Ｇ全体、ならびにＦ（ａｂ’）2 断片
およびＦａｂ断片に関して入手し得る薬物動態データー
から、Ｉg Ｇ全体、Ｆ（ａｂ’）2 断片およびＦａｂ断
片の各ｔev max は、それぞれ約５０時間、２０時間およ
び１時間であることが推定される。文献［LoBuglio, A.
F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220-4224
(1989) ；Moblofsky, P.J. et al. Radiology 149:549-
555(1983); Larson, S.M. et al. Radiology 155:487-4
92(1985) ］参照。 この発明での使用に好都合な２つの
連結した単鎖のＶH −ＶL 結合分子は、 Ｆａｂ断片とほ
ぼ同じサイズであり、Ｆａｂ断片に類似の全体構造を有
する。したがって、これらの結合分子は、Ｆａｂ断片と
ほぼ同じ拡散速度およびｔev max を有するはずである。
好ましい結合分子ではｔev max が１時間である点に基づ
いて、結合分子、除去物質および治療薬の投与を完了す
るまでの全時間は約６時間である。
【００５３】二官能性Ｉg ＧまたはＦ（ａｂ’）2 断片
はこの発明での使用に好ましくない。それらの拡散速度
が小さく、それらのｔev max が大きいからである。循環
血液および管外領域の遊離の結合分子が除去物質によっ
て除去されるときまで（ｔev max 時間の数倍）には、有
意な量の結合分子が標的部位から放出されるであろう。
したがって、好ましい結合分子を用いた場合よりも、標
的部位に結合している治療薬の量は減少するであろう。
【００５４】除去物質は、結合分子が血管中に拡散する
よりもかなり大きな速度で循環血液から除去される。従
って、除去物質の各投与後、結合分子の循環血液中に存
在する量は回を追って減少する。したがって、一定時間
にわたって、除去物質を減少させなから投与することが
好ましい。なお、除去物質の各投与は、結合分子が血管
壁を介して平衡状態に達した後に行われる。あるいは、
除去物質を漸減用量で注入投与してもよい。
【００５５】治療薬は基本的に２つのタイプのものがあ
る。すなわち、細胞中に入らなければ効果がでないもの
と、その必要がないものである。後者のタイプには、腫
瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン１など、
細胞表面受容体上で作用するサイトカイン等の薬剤が含
まれる。細胞中に入らねばなない前者のタイプは、ゲロ
ニン、アブリン、リシンＡ鎖、シュードモナス属の菌体
外毒素、ジフテリア毒素、アメリカヤマゴボウの抗ウイ
ルスペプチド、トリカテクム（Tricathecums)など、植
物または微生物のリボソーム不活化毒素のような細胞障
害性または細胞溶解性物質、ならびに腫瘍原性タンパク
質の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡが含まれる。
【００５６】標的細胞に入らねばならないこれらの治療
薬は、化学的に修飾されて細胞中への侵入を容易にする
ことが好ましい。これらの薬剤は、公開された国際出願
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５３２に記載されたものなどの
膜混合剤(membrane blendingagent) と複合させ、次い
で、ブロッカーと複合させたものである。
【００５７】膜混合剤、ブロッカーおよび治療薬の複合
体４９の例を図９に模式的に示す。治療薬５０は膜混合
剤５２によってブロッカー５６に連結される。切断部位
５４が、ブロッカー５６に隣接した膜混合剤５２上にあ
る。
【００５８】ブロッカー５６は、これが切断される前
に、細胞中への膜混合剤５２の挿入を妨げる。ブロッカ
ー５６が部位５４で切断された後、膜混合剤５２は細胞
膜と混合してこれに挿入されるので、細胞中へ治療薬５
０の侵入を助けることになる。このように、治療薬５０
は、ブロッカー５６が切断された後にのみ、標的細胞に
侵入することができる。
【００５９】好ましい膜混合剤は、公開された国際出願
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５３２に記載されている。これ
は、膜融合ペプチド、長鎖の脂肪酸、または膜チャンネ
ル形成ペプチドであり得る。
【００６０】このブロッカーは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ
８９／０３５３２には、処理すべき特定細胞を標的とす
る抗体であることが好ましいと記載されている。この発
明では、ブロッカーとして抗体を使用する必要はない。
組織特異的な補給を達成するものは単鎖ＶH −ＶL 結合
分子であって、ブロッカーではないからである。実際、
抗体ブロッカーは、他のタイプのブロッカーより望まし
くない。抗体は、より強い抗原性があり、網内系によっ
て急速に除去される傾向があるためである。
【００６１】この発明の使用に適したブロッカーは、ハ
プテン、または結合分子のＶH −ＶL 結合部位の１つに
結合する小さな抗原性ペプチドである。このペプチド
は、同種のものであるべきではない。
【００６２】この発明で使用される好ましい細胞毒素は
リシンＡ鎖であって、これは、リボソーム不活化活性を
もつが、糖鎖への結合およびトランスローケイション活
性はもたない。後者の２つの活性はＢ鎖に存在する。長
鎖脂肪酸をリシンＡ鎖と複合させると、細胞培養におけ
る細胞障害活性を大きく昂進させることが可能である。
文献［Kabanov, A.V. et al. Protein Engineering 5:3
9-42(1989)］参照。 もう一つの好ましい細胞毒素は、細
胞認識領域を欠くがトランスローケーションとＡＤＰリ
ボシル化活性の双方を有する、修飾または端を切り取ら
れたシュードモナス属の菌体外毒素Ａ（単鎖タンパク
質）である。文献［Kondo, T. et al. J.Biol. Chem. 2
63:9470-9475(1988) ］参照。端を切り取られたシュー
ドモナス属の菌体外毒素Ａと、 膜混合剤およびブロッキ
ング剤とを複合させることによって、その毒素が不活性
の状態で標的部位に運ばれる。そして、一度ブロッキン
グ剤が標的部位で切断されると、細胞膜への親和性が高
められる。端を切り取られたシュードモナス属の菌体外
毒素はなおトランスローケーション活性を有するので、
この毒素は標的細胞中に入って細胞障害作用を発揮し得
る。
【００６３】この発明の方法は、循環血液およびリンパ
系外の組織に治療薬を標的とする上で極めて有効であ
る。治療薬に対して好ましい標的部位は固形腫瘍である
が、これらは特に従来の方法では効果的に治療しにく
い。この発明の方法によれば、結合分子の投与後、比較
的短時間で治療薬の投与が可能となるので、治療薬の効
果は最大となり、その投与量を最小とすることができ
る。そのため、腎臓および他の組織に及ぶ毒性が最小と
なる。さらに、治療薬は投与の時点で結合分子に複合し
ていないので、治療薬（結合分子より小さい）は腎臓に
よる除去が可能であって、さらに、肝臓および他の組織
への毒性を低下させることができる。
【００６４】この発明のもう一つの利点は、治療薬の有
効性が標的部位におけるその濃度のみに依存する点にあ
る。従来の免疫毒素は、それが標的細胞を殺傷する上で
効果を発揮するには、飲食作用を受けなければならな
い。これは、抗体および毒素を含む全構造体が飲食され
なければならないことを意味する。上記のように、抗体
が標的部位の抗原を架橋することができれば、飲食作用
はより起こりやすくなる。しかし、細胞表面上での腫瘍
関連抗原の密度が、細胞周期、抗原性のばらつきおよび
他の因子のために、細胞ごとに異なっていることは周知
である。したがって、従来の免疫毒素の有効性は、それ
が飲食作用を受ける程度に限定される。
【００６５】対照的に、この発明の治療薬は、効果を発
揮するに飲食作用を受ける必要がない。効果を発揮する
には細胞中に入らなければならない上記治療薬について
は、膜混合剤が治療薬の細胞への侵入を助ける。表面抗
原の架橋は必要でなく、したがって、治療薬の有効性
は、組織部位における特定細胞上の細胞表面抗原の利用
能に制限されるのではなく、その組織における表面抗原
の総量に制限される。本発明の種々の成分の製造方法の
実施例を以下に記載する。
【００６６】
【実施例】
実施例１：膜混合剤およびブロッカーと治療薬との複合
体の調製 この発明の分子複合体の形態で使用される好ましい治療
薬はリシンＡ鎖であって、これは、リボソーム不活化能
を有するが、リシン分子全体が有する細胞結合能はもた
ない。３成分の分子複合体の調製は、国際出願ＰＣＴ／
ＵＳ８９／０３５３２に記載されている。
【００６７】これら複合体を調製する上で、膜混合剤の
好ましい群は長鎖脂肪酸である。便宜上、炭素数１４、
１６または１８の脂肪酸、より好ましくは付加／置換反
応用の少なくとも１つの二重結合を有するものを使用す
ることができる。これら脂肪酸、すなわち、ミリストオ
レイン酸、パルミトオレイン酸およびオレイン酸は、す
べてＣ9 〜Ｃ10で二重結合を有し、Matreya, Inc. ［Pl
easant Gap, Pennsylvania］から購入することができ
る。この不飽和二重結合を付加／置換反応にかけて多く
のヘテロ二官能性架橋剤（試薬メーカー、例えば、Pier
ceChemical Co.から入手できる）の１つを取り込ませる
こともできる。この際、有機化学で日常的な手法が用い
られる。
【００６８】ブロッキング剤の１つの可能な群は、２，
４，６−トリニトロベンゼンおよびフェニルアルソネー
トなどのハプテンである。これらハプテンに対するモノ
クローナル抗体は、すでに生産されている。
【００６９】好ましい群のブロッキング剤はヒトに存在
する同種の抗原性エピトープを全くもたない、アミノ酸
残基約６ないし１０の短いペプチドである。これらペプ
チドは、血清および他の体液中でのプロテアーゼ消化に
抵抗性を示すものであるべきである。このアミノ酸配列
は、ヒトのペプチド配列との相同性を調べるために利用
可能なプログラムの１つ（例えば、Bechman Instrument
s からのMicro Genie（登録商標）を用いて決定するこ
ともできる。なお、このペプチド配列は近年蓄積された
データベースとして入手できる。動物もしくは昆虫また
は微生物起源のタンパク質由来のペプチドは、有力な選
択候補である。ある適切なペプチドの１つの特定例は、
ウサギＩg ＧのＣＨ2 ドメインからの８残基のアミノ酸
セグメント（残基＃３２４〜３３１、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）で
ある。これら８残基のアミノ酸のうち５または６残基
は、このセグメントと、ヒトＩg Ｇ1 、Ｉg Ｇ2 、Ｉg
Ｇ3 およびＩg Ｇ4 の相当するセグメントとの間で異な
る。
【００７０】使用される架橋剤に応じて、連結を助ける
ためにペプチドのＮまたはＣ末端にシステイン残基を付
加することができる。
【００７１】実施例２：ハプテンまたは短ペプチドに対
するモノクローナル抗体の調製 この発明では、ハプテンまたは短ペプチドに特異的なモ
ノクローナル抗体として、以下の２つのタイプがある。 （１）治療薬の分子複合体のブロッキング基に特異的な
モノクローナル抗体。これらのモノクローナル抗体を再
設計して、この発明の二官能性単鎖結合分子の１つの結
合領域を形成することができる。 （２）この発明の二官能性２ドメイン結合分子の連結ペ
プチド上の抗原性エピトープに特異的なモノクローナル
抗体。これらのモノクローナル抗体は、好ましくはリポ
ソームに取り込まれてこの発明の除去物質を形成する
か、他の大きな分子と複合して適切な除去物質を形成さ
せることができる。
【００７２】ハプテンまたは短いペプチドに特異的なモ
ノクローナル抗体は、文献［Kennett, R.H. et al.
(編), Monoclonal Antibodies, Hybridomas：A NewDime
nsionin Biological Analyses. pp.363-417(Plenum Pre
ss, New York 1980)、 またはHudson, L. and Hay, F.
C.(編), Practical Immunology 2nd ed.(Blackwell Sci
entific Publications, Boston 1980) ］に記載された
方法など、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を
作製するための通常の方法に従って調製することができ
る。
【００７３】これらのハンドブックに記載された手法に
従ってハプテンまたはペプチドを、キーホール・リンペ
ットのヘモシアニン（ＫＬＨ）などのタンパク担体にＫ
ＬＨ分子あたり複数のペプチド分子（ハプテン群）のあ
る比率で複合させることができる。最初の免疫化で完全
フロインドアジュバント中の複合体を腹腔内投与してか
ら、３〜４回の継続的免疫化で不完全フロインドアジュ
バント中の複合体を投与することによりマウスを免疫す
ることができる。免疫されたマウスの脾細胞とＳｐ２／
０ミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを作製する
ことができる。ハイブリドーマによって分泌された抗体
は、ニワトリのオボアルブミンなどの異種タンパク質に
結合したペプチドまたはハプテンとの反応性を調べるた
めにＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。
【００７４】実施例３：イムノリポソームの調製 リポソームを調製するため、およびリポソーム表面にＩ
g Ｇを複合させるためのさまざまな方法が確立されてき
た。例えば、文献［Ostro, M.J. ( 編), Liposomes: fr
om Biophysics to Therapeutics (Marcel Dekker, New
York, 1987) ］参照。リポソームを調製し、その表面に
Ｉg Ｇを複合させる１つの好ましい方法は、文献［Ishi
moto, Y. et al., J. Immunol. Met. 75, 351-360 (198
4)］に記載されている。 ジパルミトイルホスファチジル
コリン、コレステロールおよびホスファチジルエタノー
ルアミンから構成される多層リポソームを調製する。次
いで、精製Ｉg Ｇのモノクローナル抗体（またはその断
片）を、架橋剤のＮ−ヒドロキシサクシニミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネートによってホスフ
ァチジルエタノールアミンに結合させることができる。
リポソームへの抗体の結合は、複合抗体に対する第２抗
体と補体を処理する際のリポソームからの予め保持され
たマーカー（例えば、カルボキシ蛍光体）の放出によっ
て示すことができる。
【００７５】実施例４：単鎖ＶH −ＶL が２つ連結した
結合分子の作製 ＷＯ８８／０９３４４は、フレームワークおよび相補性
決定領域を単鎖ＶH −ＶL 結合分子にスプライスする手
順を開示している。特にこの文献の４７〜５１頁を参
照。この明細書に記載されているように、ＶH−ＶL 結
合分子をプラスミドｐＵＣ１８にクローニングして、大
腸菌中で発現させることができる。
【００７６】また、ＷＯ８８／０９３４４は、単鎖ＶH
−ＶL結合分子のためのリンカーの設計および作製の手
順を開示している。特にこの文献の５２〜５８頁を参
照。これは次いで完全な、連結された単鎖ＶH −ＶL 結
合分子を発現するために用いることができる。
【００７７】ＷＯ８８／０９３４４に記載されたものと
本質的に同一の手順を使用して、２つの単鎖ＶH −ＶL
結合分子を連結し、この発明の結合分子を作製すること
ができる。ＷＯ８８／０９３４４に記載されたように、
立体障害または結合部位の遮蔽を防ぐために各ＶH −Ｖ
L結合分子間で必要とされる所望の距離に基づいて、適
切な長さのペプチドリンカーを設計することができる。
ＷＯ８８／０９３４４はまた、リンカーおよび単鎖ＶH
−ＶL 結合分子をコードするヌクレオチドを調製する手
順も記載している。この発明の２つの単鎖ＶH −ＶL 結
合分子間のリンカーをコードするヌクレオチドを調製す
るために類似の手法を使用することができよう。
【００７８】腫瘍関連表面抗原に対する多様なモノクロ
ーナル抗体が、ヒトの膵癌および大腸直腸癌（例えば、
抗体１７−１Ａ）、卵巣癌（例えば、ＣＡ１２５に対す
る抗体）、肝癌（例えば、抗ＣＥＡ）、乳癌（例えば、
モノクローナル抗体７２．３）、黒色腫（例えば、ＨＭ
ＷＡ抗原に対する抗体４８．７）、並びに他の多くの腫
瘍に対するモノクローナル抗体が開発されてきた。これ
ら抗体の多くは、ヒト腫瘍の免疫療法の分野で周知であ
り、ヒトによる臨床試験で多数の研究がある。腫瘍組織
由来の細胞系も開発されてきた。ヌードマウスを使った
１つの非常に有用な動物モデルでは、ヒト腫瘍の細胞系
が、マウスに移植された場合、腫瘍に発展する。したが
って、ある有力候補の抗体または結合分子は、モデルマ
ウスで実験的に使用することができる。
【００７９】２つの結合ドメインをもつ単鎖結合分子を
構築するために、結合ドメインの一方をこれら抗腫瘍表
面抗原抗体の１つのＦｖに由来させることができる。他
方のドメインを上記の治療薬のブロッキング剤に特異的
な抗体のＦｖに由来させることができる。これら抗体の
ＶH およびＶL のクローニングおよび配列決定は分子生
物学の常套手法によって実施することができる。
【００８０】この発明の単鎖結合分子の２つの結合ドメ
イン間のリンカーの好ましい例の配列は、非同種のセグ
メントを含む。一例として以下のような配列が挙げられ
る。 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ 下線部の８残基のアミノ酸は、ウサギμ鎖のＣＨ３ドメ
イン中のセグメントである（＃３６２〜３６９）。８残
基のアミノ酸のうちの６個は、ヒトμ鎖で相当するセグ
メントとは異なっている。隣接するＧｌｙおよびＳｅｒ
残基は、全長を１４残基にまで延ばすためのものであ
る。この配列は、グリコシル化部位を含まないので、２
つの結合ドメイン及びリンカーをコードする全ＤＮＡを
大腸菌中で発現させることができる。
【００８１】他の好ましいリンカーはグリコシル化型で
ある。このペプチド部分はグリコシル化部位を含む。こ
のリンカーの一例として以下の配列が挙げられる。 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ この配列は、２つの潜在的Ｎグリコシル化部位（下線
部）を含む。ＧｌｙおよびＳｅｒ残基は、リンカーの可
撓性および立体構造の柔軟性を増す。
【００８２】２つの結合ドメインおよびリンカーをコー
ドするＤＮＡは、ＣＨ０細胞系などの哺乳動物細胞中で
発現されるべきであり、そうすることによって、グリコ
シル化部位に糖鎖部分が付加される。免疫グロブリン遺
伝子の発現のためにＣＨ０細胞系で使用される１つの好
ましい発現系は、文献［Page, M.J. and Sydenham, M.
A. Bio/Technology 9:64-68 (1991) ］に記載された方
法である。
【００８３】以下のセクションでは、糖鎖部分に対する
ハプテンまたはペプチドの複合が記載されている。この
セクションで記載された８残基アミノ酸のペプチドを、
糖鎖部分への複合に使用することができる。
【００８４】実施例５：２つの連結単鎖ＶH −ＶL 結合
分子の糖鎖部分に対する抗原性ペプチドまたはハプテン
の複合 ２つの連結単鎖ＶH −ＶL 結合分子の糖鎖部分に抗原性
ペプチドまたはハプテンを複合させる好ましい方法は、
文献［O'Shannessy, D.J. et al., Immunol. Lett. 8:2
73-277(1984) およびRodwell, J.D. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA 83:2632-2636(1986) ］に記載され
た方法から採用される。 この原理は、 過ヨウ素酸ナトリ
ウム処理により糖鎖部分に反応性アルデヒドを生じさ
せ、 および二官能性連結基の反応性ヒドラジド基を複合
すべきハプテンまたはペプチドに連結させて、次いで２
つの反応体を結合させることである。この手法は、抗原
性ペプチドおよびハプテンを多数の異なったＩg Ｇおよ
びＩg Ｍモノクローナル抗体に複合させるために首尾よ
く応用されてきた。例えば、これらの技術は、インビボ
での腫瘍造影用免疫複合体を作製するために、Cytogen
Corp. によって使用されてきた。なお、この腫瘍造影用
免疫複合体は、現在ＦＤＡの承認審査中である。
【００８５】ここでの用語、表現および実施例は例示の
ためだけであって限定的ではない。そして、当該分野の
技術者には、単なる常套的実験法を使用することによっ
て、ここに記載されたこの発明の特定実施態様に対する
多くの均等物を認知されるであろうし、確認することが
可能である。こういったすべての均等物は特許請求の範
囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】結合分子の静注後、循環血液および管外領域中
における結合分子濃度の動力学を示す、時間に対する循
環血液中の結合分子濃度のプロットである。
【図２】結合分子の静注後、腫瘍部位および循環血液中
における結合分子濃度の動力学を示す。
【図３】管外領域によって囲まれ、その外側で固形組織
に接している血管の模式図である。固形組織上には腫瘍
がある。肝臓は血液と流体を介して接しているように模
式的に示されている。結合分子（血管中のドット）が投
与されている。
【図４】図３と同様の模式図であるが、結合分子が管外
領域で最大濃度に達した後の状態を示す。
【図５】図４と同様の模式図であるが、除去物質を投与
した後の状態を示す。
【図６】図５と同様の模式図であるが、結合分子の多く
が循環血液から除去された後の状態を示す。
【図７】この発明での使用に適した二官能性２ドメイン
結合分子の模式図である。
【図８】リンカー上のグリコシル化された鎖に結合した
抗原性ペプチドを有する、図７で示される二官能性２ド
メイン結合分子。
【図９】膜トランスロケーション剤とともにブロッカー
に結合した治療物質を有する、治療薬の好ましい１形態
を示す模式図。
【符号の説明】
１０ 血管 １２ 管外領域 １６ 腫瘍 ２０ 結合分子 ３４ １つのＶH −ＶL 単鎖結合ドメイン ５６ ブロッカー

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 互いに結合した２つの単鎖ＶH −ＶL 二
    官能性結合分子であって、一方の鎖が固形組織に対して
    特異的であり、他方の鎖が治療薬に対して特異的である
    結合分子；循環血液中の結合分子と結合する除去物質；
    および治療薬を含む、固形組織へ治療薬の運搬を促進す
    るための組成物。
  2. 【請求項２】 上記除去物質が結合分子に特異的な抗体
    と複合するリポソームである、請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 上記治療薬が、リシンＡ鎖、修飾された
    シュードモナス属の菌体外毒素Ａ（細胞結合ドメインを
    欠くが、トランスローケイションおよびＡＤＰリボシル
    化活性を有する）、ゲロニン、アブリン、ジフテリア毒
    素、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスペプチド、トリコ
    テシン（trichothecenes）並びに腫瘍壊死因子（「 ＴＮ
    Ｆ」 ）およびインターロイキン１を包含するサイトカイ
    ニンを包含する細胞障害性または細胞溶解性物質、なら
    びに腫瘍原性タンパク質の発現を阻害するアンチセンス
    ＲＮＡからなる群より選ばれる、請求項１記載の組成
    物。
  4. 【請求項４】 上記治療薬が、膜混合剤およびブロッカ
    ーと複合した、リシンＡ鎖または修飾されたシュードモ
    ナス属の菌体外毒素Ａである、請求項１記載の組成物。
  5. 【請求項５】 小さな非同種の親水性ペプチドによって
    互いに連結された２つの単鎖結合分子。
  6. 【請求項６】 リンカーがグリコシル化配列を有する、
    請求項５記載の連結された結合分子。
  7. 【請求項７】 リンカーがグリコシル化されている、請
    求項５記載の連結された結合分子。
  8. 【請求項８】 リンカーが好ましくは約１０ないし約１
    ５個のアミノ酸残基である、請求項５記載の連結された
    結合分子。
  9. 【請求項９】 リンカーの糖鎖部分が非同種であって抗
    原性のある非グリコシル化ペプチドに連結している、請
    求項８記載の連結された結合分子。
  10. 【請求項１０】 抗体が互いに連結した２つの単鎖ＶH
    −ＶL結合分子の間のリンカーに付随した抗原性部位に
    特異的である抗体が結合されたリポソーム。
  11. 【請求項１１】 上記抗原性部位が上記ペプチドリンカ
    ー上にある、請求項１０記載のリポソーム。
  12. 【請求項１２】 上記抗原性部位がリンカーの糖鎖部分
    に結合したペプチド鎖上にある、請求項１１記載のリポ
    ソーム。
  13. 【請求項１３】 一方の結合価が腫瘍関連抗原に対する
    ものであって、もう一方の結合価が膜トランスローケイ
    ション剤を介して治療薬に連結されているブロッカーに
    対するものである、 互いに結合した２つの単鎖ＶH −Ｖ
    L 二官能性結合分子。
JP4101629A 1991-03-27 1992-03-27 治療薬を固形組織に補給するための方法および物質 Pending JPH05117164A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67565491A 1991-03-27 1991-03-27
US07/675,654 1991-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05117164A true JPH05117164A (ja) 1993-05-14

Family

ID=24711439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4101629A Pending JPH05117164A (ja) 1991-03-27 1992-03-27 治療薬を固形組織に補給するための方法および物質

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0506124A1 (ja)
JP (1) JPH05117164A (ja)
AU (1) AU640863B2 (ja)
CA (1) CA2062582C (ja)
ZA (1) ZA922017B (ja)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869620A (en) * 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6146850A (en) * 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5621083A (en) 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US5837491A (en) * 1991-11-04 1998-11-17 Xoma Corporation Polynucleotides encoding gelonin sequences
US6025165A (en) * 1991-11-25 2000-02-15 Enzon, Inc. Methods for producing multivalent antigen-binding proteins
GB9200415D0 (en) * 1992-01-09 1992-02-26 Bagshawe Kenneth D Inactivation of cytotoxic drugs
GB9200417D0 (en) * 1992-01-09 1992-02-26 Bagshawe Kenneth D Cytotoxic drug therapy
US6329507B1 (en) * 1992-08-21 2001-12-11 The Dow Chemical Company Dimer and multimer forms of single chain polypeptides
SG41929A1 (en) * 1992-09-25 1997-08-15 Commw Scient Ind Res Org Target binding polypeptide
CA2126967A1 (en) * 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
WO1994012520A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
DE69327229T2 (de) * 1992-12-11 2000-03-30 The Dow Chemical Co., Midland Multivalente einkettige Antikörper
AU6912294A (en) * 1993-05-12 1994-12-12 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US7445802B2 (en) 2000-12-26 2008-11-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Site-specific in situ generation of allicin using a targeted alliinase delivery system for the treatment of cancers, tumors, infectious diseases and other allicin-sensitive diseases
EP1293514B1 (en) * 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
WO2014041544A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Immunoparticles and methods of generating and using same
US9580486B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-28 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of T-regulatory cells
IL283764B2 (en) 2015-04-10 2024-01-01 Amgen Inc Interleukin for the expansion of myotonic control T-2 cells
EP4434516A2 (en) 2016-07-18 2024-09-25 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Modular platform for targeted therapeutics

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60501906A (ja) * 1983-07-29 1985-11-07 ゴ−ルデンバ−グ，ミルトン　デ−ビツド 腫瘍または感染性病変の治療用組成物
JPH02500329A (ja) * 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60501906A (ja) * 1983-07-29 1985-11-07 ゴ−ルデンバ−グ，ミルトン　デ−ビツド 腫瘍または感染性病変の治療用組成物
JPH02500329A (ja) * 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
CA2062582A1 (en) 1992-09-28
EP0506124A1 (en) 1992-09-30
CA2062582C (en) 1996-03-26
ZA922017B (en) 1993-03-31
AU640863B2 (en) 1993-09-02
AU1299292A (en) 1992-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH05117164A (ja) 治療薬を固形組織に補給するための方法および物質
JP4318752B2 (ja) 抗エンドグリンモノクローナル抗体および抗血管新生治療におけるその使用
Pai et al. Treatment of advanced solid tumors with immunotoxin LMB–1: an antibody linked to Pseudomonas exotoxin
RU2656161C1 (ru) Анти-неr2 антитело и его конъюгат
JP3589459B2 (ja) 生物応答調節物質の新規な抗体運送システム
Pietersz et al. Antibody-targeted drugs for the therapy of cancer
JP4576005B2 (ja) 腫瘍および炎症性疾患を選択的に治療するために用いられる、壊死を引き起こす物質と、壊死により活性化される物質との組み合わせ
US5034223A (en) Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
JPH0588686B2 (ja)
JP2002544173A (ja) 抗ｃｄ２２抗体を用いたｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法
JPH07509444A (ja) トランスフェリンセレプター特異的抗体−神経薬又は診断薬複合体の製造法
US6190660B1 (en) Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
USRE38008E1 (en) Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
US20070042447A1 (en) Use of anti-ferritin monoclonal antibodies in the treatment of some cancers (divisional)
Yang et al. Pharmacokinetics and mechanism of action of a doxorubicin-monoclonal antibody 9.2. 27 conjugate directed to a human melanoma proteoglycan
JPH11507389A (ja) 毒素を用いた腫瘍の治療用ワクチン
AU616161B2 (en) Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
WO1991007437A2 (en) Improved cd-30 antibodies and fragments thereof
JP2608272B2 (ja) ターゲツテイング剤として有用な抗体及びそれを合体した結合体
US6685930B1 (en) Methods and substances for recruiting therapeutic agents to solid tumors
Ceriani et al. Biological activity of two humanized antibodies against two different breast cancer antigens and comparison to their original murine forms
Oldham et al. Individually specified drug immunoconjugates in cancer treatment
JPH05500953A (ja) 免疫共役体およびその代謝物の非標的保持量を減少させる方法
BANKERT Development and use of monoclonal antibodies in the treatment of cancer
WO2023048231A1 (ja) 腫瘍細胞を死滅させるための医薬