JPH02270898A

JPH02270898A - 抗ｈＣＧ抗体

Info

Publication number: JPH02270898A
Application number: JP1306394A
Authority: JP
Inventors: Wezenbeek Petrus Maria G F Van; ペトルス・マリア・ヘラルドウス・フランシスカス・フアン・ウエゼンベーク; Ebo Sybren Bos; エボ・シブレン・ボス
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1988-11-25
Filing date: 1989-11-24
Publication date: 1990-11-05
Also published as: ZA898883B; EP0370581A1; DK594189A; AU633284B2; AU4549789A; CA2003773A1; NZ231498A; CN1044103A; PT92412A; DK594189D0; FI895622A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ｈＣＧに対して免疫反応性を有づるポリペプ
チド、そのｈＣＧ結合フラグメント、これらを］−ドす
る核酸又はこれらを］−ド（る配列を含む核酸、これら
核酸を含有する宿主細胞、並びに該ポリペプチド及び／
又は該フラグメントを含有する医薬組成物及び免疫剤に
係わるものである。

ヒトに対する受胎調節（避妊）には薬剤がよく用いられ
、これらは通常女性に施用される。これら薬剤中の活性
物質は生殖においで重要な役割を司る生物学的過程の１
つ又はそれ以上のものに介入する。

過去数十片にわたって、上記目的のために主に用いられ
てきたのは排卵に影響を及ぼすステロイド類であった。

過去千年間の間に、生殖過程の他の重要な面、特に、ホ
ルモンである１１０Ｇ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）
が関与する過程に特異的に影響を与えることにも研究の
興味が注がれるようになってきた。ｈＣＧは糖タンパク
性ボルモンであって、特に胎盤の絨毛性組織から分泌さ
れ、そして、特異的な膜受容体に結合した後、ステロイ
ドホルモンの産生を刺激する。産生されたステロイド（
特にプロゲステロン）は妊娠状態を維持するＩｃめに必
要なものである。従って、ｈＣＧの作用が抑制されると
妊娠状態が中絶してしまうこととなる。

免疫学的手法によってこ、ｈＣＧの作用を抑制しようと
いう試みがなされた。この目的のために、免疫反応が期
待できるように修飾されたｈＣＧが投与されたが、この
方法で今日まで成功したものはない。即ち、一般に、抗
体産生量が少なすぎるか、又は抗体がｈＣＧを充分に捕
捉できる程度の所望の特異性を欠いていることが判った
。

更に同様の目的で、ｈＣＧど特ｙ４的に反応覆るポリペ
プチド（例えば抗体）を投与することによってｈＣＧＩ
度を連続的に低減させることのできる新たな別の試みが
最近なされた。

天然の抗体く免疫グロブリン：Ｉｇ）は種々のタイプに
分化するが、それらはすべて少なくとも二つの抗原結合
領域（Ｆａｂ）を有しているという点で共通している。

これらのタイプは該タンパクの残りの領域（、Ｆ　ｃ　
）に於ける違いによって分類される。主なものとしては
、ＩＯＡ、ＩＱＤ、ＴｏＥ；ＩＱＧ及びＩｏＭのタイプ
に分類され、更に、これら各タイプのカテゴリー内でサ
ブタイプがしばしば区別される。ＩＱＧ分子の構造及び
°以下に述べる微細構造は第１図に図式的に示すとおり
である。抗体分子は、軽鎖（ｌｉｇｈｔ）及び重鎖（ｈ
ｅａｖｙ）のポリペプチド鎖から成り、夫々、Ｌ及びＨ
と呼ばれる。アミン末端基を有する夫々のポリペプチド
鎖の領域は抗原の特異的結合に関与する。これらの領域
はかなりの程度可変性があり、実際、ある抗原の特異的
部分（エピトープ）に対して生起した各抗体毎に異なる
ユニークなものである。これら領域は、夫々、ＬＦｖ及
びＨＦ　ｖと呼ばれ、これらが−緒になって抗体分子の
Ｆｖ領領域形成する。６鎖のカルボキシル末端基を有す
る領域は可変性の程度が低い。即ら、すでに述べたよう
に、種々のタイプ及びザブタイプに特徴的である差異が
あるのみであって、抗体において識別づることかできる
。これらの領域は夫々ＬＦｃ及び１−ＩＦｃと呼ばれる
でいる。

種々の動物種の対応する抗体のタイプのＦＣ領域にはし
ばしばかなりの差異がアミノ酸組成及び配列に見ること
ができる。

従って、他の動物種由来の抗体は外来物どして認識され
免疫拒絶反応を引き起こすことになる。

最近の研究によっ−Ｃ，１”ｖ領域自体にも、Ｊ、り可
変性の高い領域とより可変性の低い領域があることが示
された。可変性の高い領域（超可変領ＩＩりは抗原結合
に特に関係していることが判り、ＣＤＲ’ｓ（相補性決
定領域）と呼ばれる。８鎮に３つのＣＤＲ’ｓが存在し
ており、いわゆるフレームワーク領域（Ｆ　Ｒ’ｓ＞内
に埋れている。ＦＲ’ｓの機能としては、おそら＜　Ｃ
Ｄ　Ｒ’ｓの正確な位置のための立体構造を維持するこ
とが考えられる。Ｆｖ領領域おける６つのＣＤ　Ｒ’ｓ
が共同して指向する抗原に対Ｊる抗体の全接触部位を形
成する。

これまで述べた免疫グロブリン分子の微細構造及び種々
の下部構造に帰因する機能に関づ−る種々の情報に基づ
き、これらの分子を意図的に修飾することは原理的に可
能である。特に、組換えＤＮＡ技術はこの目的に非常に
適しており、この種の遺伝子操作技術に関して多数の実
用応用例がすでに発表されている。

５Ｃｈｅｒｉｎ（ｌ　ｃｏｒｐ、名代の欧州特許公開用
０．０８８．９９４号には、特定の免疫グロブリンのＬ
ＦＶ又はＨＦｖＦｃフラグメントードするＤＮＡ配列を
含有する発現ベクター及び大胆菌内における該免疫グロ
ブリンフラグメントの発現が記載されている。

また、Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ　１．ｔｄ、名代の欧州特許０
，１２０，６９４号は、一つの宿主細胞内にお（プる免
疫グロブリンのＬ及びＨ両鏡又はそのＦＶノラグメン１
〜の発現について開示している。この方法で調製された
免疫グロブリンは、所望であるならば、特Ｗ的七ツクロ
ーナル抗体のＦｖ領領域同一のもの及びもう一つの別の
抗体由来のＦｃフラグメントから成るくいわゆるキメラ
免疫グロブリン）ようにすることも可能である。

Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＣ１ｔｙ　ｏｆ　Ｈｏｐｅ名儀
の名代特許０．１２５，０２３号は、上記二つの特許公
報と同様に、免疫グロブリンフラグメント又はキメラ免
疫グ（」プリンを］−ドするＤＮＡの宿主細胞内弁用に
ついて開示している。宿主細胞としては真核又は原核の
微生物を用いている。

Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐ
、　（Ｊａｐａｎ）名義の欧州特許第０．１７１，４９
６号には、組換えＤＮＡ技術によるキメラ抗体の調製が
記載されており、特にそのＦｃ領域は非ヒト免疫グロブ
リンのＦＣ領域に対応している。

Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ　Ｌ同１名代のＷｏ　８６１０１５３
３号は、無限増殖性哺乳動物細胞内における、抗原結合
領域ど別種のタンパク領域、例えばもう一つの免疫グロ
ブリンのＦｃ領域又は酵素とのキメラタンパクの発現に
関して記載している。

Ｗｉｎｔｅｒ名僅の欧州特許第０．０２９．４００号は
、Ｆｖ領領域少なくとも幾つかのＣＤＲ’Ｓがもう一つ
別の免疫グロブリンの対応するＣＤＲ’ｓと置換されて
いるような修飾抗体を開示している。この方法（ｒｃＤ
Ｒグラフディング」と呼ぶ）によって、例えばマウスモ
ノクローナル免疫グロブリンから使方のヒト免疫グロブ
リンに特徴的な分子にＣＤＲ’ｓを転移させることが可
能になる。

本発明の目的は、ｈＣＧに対して特賃的な親和力を有す
るポリペプチド（特に免疫グロブリンまたはその断片）
を提供することである。

本発明のポリペプチドは、特に、このポリペプチドとＩ
ＩｃＧに類似の物質との交叉反応の危険性が高い場合に
ｈＣＧを特異的に認識するために使用することができる
。これは特にヒト黄体形成ホルモン（ｈＬ！−（＞やヒ
ト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳ　ｌ−１）などのようなタ
ンパク質との交叉反応に関連する。これらのタンパク質
は、ｈＣＧと同様に、２本のポリペプチド鎖で構成され
ており、そのうちの１本（α鎖）はｈＣＧのα鎖と同一
であり、残りの１本（β鎖）はｈＣＧのβ鎖と多少強い
相同性を示す。

そこで、人体が許容でき、ｈＣＧに対して非常に強い親
和性を有するがｈＣＧと類似の同種タンバク質にはずっ
と弱くしか結合しない抗体を見出そうとした。特に、適
切な抗体は次のＣＤＲの１種以上を有するポリペプチド
であることが判明した。

（ｉ）　　　ＡＲＧ−ＡＬＡ−３ＥＲ−ＧＬＵ−８ＥＲ
Ｊ八Ｌ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−３
ＥＲ−ＰＨＥ−１４Ｅ丁−ＡＳＮ（１１）　八り八−Ａ
ＬＡ−３ＥＲ−１１゜Ｅ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−３［：Ｒ（
ｉｉｔ　）　ＧＬＮ−ＧＬＮ−ＴＬＥ−ＬＹＳ−ＧＬＵ
−ＶＡＬ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＴＨＲ（ｉｖ）　ＡＳＰ−
ＴＹＲ−ＡＳＮ−ＮＥＴ−１１１ｓ（ｖ）　　ＴＹＲ−
ＩＬＥ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−ＴＹＲ−３ＥＲ−ＧＬＹ−Ｐ
ＲＯ−ＴＨＲ−ＧＬＹ−ＴＹＲ−ＡＳＮ−ＧＬＮ−ＡＲ
Ｇ−ＰＨＥ−ＡＳＮ−３ＩＥＲ（ｖｉ）　ＧＬＵ−ＧＬ
Ｙ−ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＴＹＲ−ＴＨＲ−ＭＥＴ−＾５Ｐ
−ＴＹＲもちろん、機能的に上記ＣＤＲに相当するＣＩ
）Ｒであって、たとえば、上記ＣＤＲの特異的な空間構
造を乱すことなく１個以上のアミノ酸が置換されている
か又は誘導体化されている点で上記ＣＤＲとは異なるＣ
ＤＲも、同様に適している。

本発明のポリペプチドは、上記のＣＤＲまたは機能的に
それと等価なものを１種以上含有することができ、これ
を天然および／または合成のＦＲと共に含有するのが好
ましい。

本発明のポリペプチドのＬ鎖と１」鎖のＮ−末端領域の
配列をそれぞれ第２図ど第３図に示す。このＮ−末端領
域は一緒になってｈＣＧに結合づる抗体断片（ＦｈＣＧ
＞を形成する。これらのアミノ酸配列をコードしている
ヌクレオチド配列も第２図と第３図に示した。ＣＤＲは
第２図とＭ３図のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を枠
で囲って示しである。

第２図と第３図に示したＦＲの代わりに、他の天然のＦ
Ｒまたは天然のＦＲから生成する同じ機能をもったアミ
ノ酸配列も使用することができる。

たとえば、ヒト抗体のＦＲに相当する配列を使用できる
。

これらのｈＣＧ結合性抗体断片ＦｈＣＧはそのままで使
用することもできるし、より大きなポリペプチド中に組
込むこともできる。

このためには前記ＦｈＣＧポリペプチドの２種以上を互
いにカップリングさせることができ、これは相互の共有
結合かまたは支持体を介するのが好ましい。もうひとつ
の可能性としては、抗体鎖のＦＣ断片の少なくとも一部
を一方または両方のＦｖ断片のＣ−末端に（いわゆるリ
ンカ−を介して）共有結合させることがある。

また、一方または両方のＦｖ断片を、Ｃ−末端を介して
他のポリペプチド（またはその一部）にカップリングさ
せることも可能である。このようなポリペプチドは、こ
れを投与する生体に免疫反応を引き起こすことのないも
のが好ましい。

本発明のポリペプチドは、たとえば組換えＤＮＡ法を用
いて製造される。このためには、目的とするポリペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列を、選択した宿主
細胞の安定な形質転換に適したベクター中に公知の方法
で挿入する。この宿主細胞は当該ポリペプチドを産生ず
る能力を獲得する。この種のベクター中で、目的とする
ヌクレオチド配列は、その発現の制ａｌｌ　Ｉレメント
（転写系）が当該ヌクレオチド配列と機能的にくうまく
発現層るように）連結Ｊるように組み込まれる。

同時に、このベクターは、宿主細胞中でその機能的に関
連する部分の複製を確保するルメン１〜を含有すること
ができる。このためにベクター自身のレプリコン、たと
えばＥ、ｃＯ１ｉ中での複製開始点または・ＳＶ４０の
複製開始点を含有することができる。このような複製開
始点は真核細胞の場合に使用することができる。真核細
胞はまた、宿主細胞の染色体中に安定して組み込まれる
ベクターを用いて形質転換することもできる。

−１５＝使用することができる宿主細胞は原核細胞または真核細
胞であり、特に咄乳類の細胞でもよい、。

真核細胞はポリペプチドの翻訳後のプロセッシング（た
とえばグリコジル化および会合など）も行なうことがで
きるため好ましく使用される。

本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配
列を含有する適切なベクターで形質転換したこの種の宿
主細胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することができ、適切
な条件下で目的のハイブリッドポリペプチドを産生じ、
好ましくは分泌することができる。このために使用する
培養系と培養条件は選択した宿主細胞による。所望のポ
リペプチドが培地中に分泌されるような条件を選択する
のが好ましく、所望のポリペプチドは適宜この培地から
単離することができる。

本発明のポリペプチドは避妊の目的で使用することがで
きるが、他の治療用途、たとえば絨毛膜癌やその他のｈ
ＣＧ産生腫瘍の治療用にも使用できる。本発明のｈＣＧ
結合性ポリペプチドはまた診断用にも使用することがで
き、たとえば、　１ｎｖｉｖｏ診断（腫瘍の局在化の検
出など）および１ｎｖｉｔｒｏ診断（血液、血清、尿な
どの体液中のｈｃＧの検出など）に使用できる。

治療用の場合、本発明のポリペプチドは治療上許容し得
る担体中に配合して投与する。そのような担体は特に水
およびｐＨ緩衝用化合物、安定剤、抗生物質、炭水化物
、グリシン、ベンジルアルコールなどを含有する。

絨毛膜癌の治療の場合、本発明のポリペプチドは、腫瘍
の増殖を抑制または阻止できるか、および／または腫瘍
細胞を殺すかもしくはその助りとなることができるよう
な物質と共に投与することができ、これら物質とカップ
リングさせて使用することも可能である。このためには
、本発明のボリペブチドを、たとえば細胞増殖抑制性ま
たは細胞毒性の物質にカップリングさせることができる
。

ｈＣＧのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断の場合、本発明のｈＣＧ
結合性ポリペプチドは、たとえば粒子、固体支持体また
はマーカーに結合（固定化）することができる。

実施例１本実施例テハ、可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）部分（Ｖ）が
マウスに由来し、不変部分（Ｃ）がヒトに由来するハイ
ブリッド抗体の製造について述べる。遺伝子は、双方の
種からの遺伝的材料に基づき、Ｌ鎖及びＨ鎖の両方につ
いてコードして構築した。

可変フラグメントをコードする遺伝子は抗ｈｃＧ生成骨
髄腫セルラインから単離した。ＲＮＡはこれ及び調製さ
れたｃＤ　Ｎ　Ａから単離した（　Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ
、及びＨｏｆｆｍａｎｎ、Ｂ、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ　２５
．２６３−２６９．１９８３）　。公知の分子生物学的
方法（Ｈａｎｉａｔ　ｉｓ。

■、、　Ｆｒ１ｔｓｈ、　Ｅ、Ｔ、及びＳａｍｂｒｏｏ
ｋ、Ｊ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　　：
　ａ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ
１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｏｒ　　＋−ａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８２）を用いて、ＣＤ　Ｎ
　Ａライブラリーをバクテリオファージにｇｔ１０中で
構築した。２つの不変領域（γ１及びに）の既知ヌクレ
オチド配列に由来するプローブでハイブリダイゼーショ
ンによりクローンを選択した（　Ｈｏｎｊｏ、　ｒ、　
、　０ｂａｔａ、　Ｈ，。

’ｖａｍａｗａｔｔ　ｉ−にａｔａｏｋａ、　Ｙ、　、
にａｔａｏｋａ、Ｔ、、　Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｔ、。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｎ、及びＮａｎｏ、Ｙ、、　ｃｅ
ｌ＋　１８．５５９−５６８゜１９７９；　Ｈａｘ、Ｅ
、Ｅ、、　Ｈａｉｚｅｌ、Ｊ、Ｖ　　及びＬｅｄｅｒ、
Ｐ、、　Ｊ、Ｂ１１１、Ｃｈｅｍ、　２５６．５１１６
−５１２０．１９８１）。

この方法で得られたクローンのインサートを、次いでバ
クテリオファージＭ１３に移し、その可変領域（Ｌ及び
Ｈ鎖）のヌクレオチド配列はジデオキシ法を用イテ決定
した（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎｔｃｋｌｅｎ、Ｓ。

及びＣｏｕｌｓｏｎ、八Ｒ，，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　７４゜５４６３−５４６
７、１９７７）　（各々第１図及び第２図）。この配列
から、さらにアミノ酸配列及びＣＤＲ’Ｓの位置を誘導
することが可能であった。

先にすでに報告されているこれらＶ領域とヒトＣ領域の
ヌクレオチド配列を用いることにより、ハイブリッド１
−（３Ｊ伝子及び］−遺伝子を構築した。

第４図はこれらの遺伝子の代表例を図示したものである
。

可変フラグメントは、制限酵素認識部位により、５′側
及び３′側の両方で切断される。この目的のために、酵
素ＥＣ０ＲＩに対する認識部位は、ＥＣＯＲニリンカー
を加えることにより、ＡＵＧ−開始コドンの位置の直前
の５′側に形成される（第２図及び第３図のヌクレオチ
ド位置１〜６）。

３′　−側については、酵素５ａｕ３ＡＩ（可変ｌ」領
域の末端の前５６ヌクレオチド）及び酵素３ａｎＴ（可
変１一領域の末端の前２２ヌクレオチド）に対してずで
に存在する認識部位を用いた。この方法で得られたＥｃ
ｏＲＩ−８ａｕ３Ａ丁及びＦｃｏＲＩ−Ｂａｎエフラグ
メントは、各々Ｈ遺伝子及びＬＭ仏子の可変領域をほぼ
完全にコードしＣいる。

不変］」領域をコードする遺伝子は、ヒト胎児の・　肝
臓ＤＮＡのライブラリーに由来する（Ｔａｋａｈａｓｈ
　＋　。

Ｎ、、　Ｎｅｄａ、Ｓ、、　０ｂａｔａ、Ｈ，、Ｎ１ｋ
ａｉｄｏ、Ｔ、、　Ｎａｋａｉ、Ｓ。

及びＨｏｎｊｏ、Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　２９，６７１−６
７９．１９８２＞　。Ａ　Ｔ２遺伝子を選んだ。この遺
伝子は、約２２００塩基対のＮａｒＩ−８ｐｈＩ　　Ｄ
ＮＡフラグメントとして単離された。ＮａｒＩＩ識部位
は第一エクソン（ｃｔ＋ｉ）の位置２０に位置し、５ｐ
ｈＩ認識部位は停止コドンから約６５０塩基対離れたど
ころに位置している。そこで、最初の２０塩基を除いて
は、ＣＩ配列は完全にこのＤＮＡフラグメント上に位置
している。さらに、３つのイントロン及び天然のポリア
デニン化シグナル（［１ｌｉｓｏｎ、Ｊ及びｆｆｏｏｄ
、　Ｌ、　、ρｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ八、　７９．１９８４−１
９８８．１９８２）はこのフラグメント上に位置する。

ヒトに不変部分をコードする遺伝子は、オリゴヌクレオ
チド合成を経て３１５塩基対のＮａｒｌ：　−Ｂａｌｌ
）−ＩＩフラグメントどして調製される。Ｎａｒ工認識
部位は、Ｃ／ｃ部分をコードする位置１１で形成される
。さらに、ＰｓｔＩ認識部位は遺伝子の中ばで形成され
る。その結果、２つの半部分で合成しうる。これらの２
つの認識部位は、ヌクレオチド配列がコードするアミノ
酸配列（旧ｅｔｅｒ、　Ｐ、　Ａ、　。

Ｈａｘ、　Ｅ、Ｅ、、　　５ｅｉｄＩＩｌａｎ、Ｊ、Ｇ
、、　　Ｈａｉｚｅｌ、　Ｊ、Ｖ　　及びＬｅｄｅｒ、
Ｐ、、　Ｃｅ１ｌ　２２．１９７−２０７．１９８０）
が全く修飾されないように選ばれる。Ｈｉｅｔｅｒらの
配列と化較すると、他の塩基が４つの位置、リ−なわち
位置３４４、　Ｔ−＋Ｇ　；　　３４７．　Ａ→Ｇ；４
７３．ＣａＯ及び４７６、　Ａ＋Ｇ　（上記旧ｅｔｅｒ
らの文献での番号）に導入されている。

フラグメン１〜の末端の３ａｍＨＩＲ識部位は停止コド
ン（５°−ＴＡＧＧＴ八ＴＣＣへ３’）　Ｔ−一部重な
ッテいル。

５個及び６個のオリゴヌクレオチドの２つの１０ツクで
合成を行なう。１つのブロックからのオリゴヌクレオチ
ドのいくつかは、相補的合成（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ
ｒｙ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって調製され、酵素Ｔ
４−ＤＮＡ−リガーゼによりお互いに結合され、次いで
バクテリオファージＭ１３に挿入される。ヌクレオチド
配列をヂエックしたのち、双方のブロックをお互いに結
び合「てＮ　ａｒＩ　−Ｂ　ａｍＨＩＣにフラグメント
を形成する。オリゴヌクレオチドの合成は、アプライド
バイオシステム３１８ＡＤＮＡシンセサイザーにより行
なった。

（−１遺伝子とＬｍ伝子の双方の２つのＶ及びＣフラグ
メントをお互いに結合するために、■の最終アミノ酸及
び（連続して）Ｃの最初のアミノ酸をコードするＤＮＡ
フラグメント（第４図でリンカ−と記したもの）をデザ
インしたく各々、５ａｕ３ＡＩ−ＮａｒＩ及びＢａｎＩ
−ＮａｒＩ　）　。これらのＤＮＡフラグメントもまた
、化学的に合成した。２つの鎖の各々に対して、関連す
る各々の鎖フラグメントの元のアミノ酸配列をコードし
、さらにできる限り元の塩基配列を含む結合フラグメン
ト（ｌｉｎｋｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　　（第４図
における「リンカ−」）を軽で、■及びＣフラグメント
をカップリングすることによりキメラ遺伝子（ｃｈｉｍ
ｅｒｉｃｇｅｎｅ　）を得た。このようにして得られた
ＤＮＡフラグメントは、その■領域のアミノ酸配列が全
体としてマウスに由来し、Ｃ領域がヒトに由来する免疫
グロブリンをコードしでいる。上記のように、ヌクレオ
チド配列は、マウスＶ領域とヒトＣ領域についてのもの
である。

発現ベクターへの挿入を容易にするために、１」遺伝子
のｓｐｈ：Ｅｘ識部位をリンカ−に加えてＢａｍ１−（
Ｉ　認ｉ１部位へ修飾し、これにより、両方の遺伝子が
ＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント上に位置づ−るよ
うにした。

有核細胞中での発現のために用いるベクターは、殆どｐ
Ｋ　ＣＲに由来する（０°Ｈａｒｅ、に、、　Ｂｅｎｏ
ｉｓｔ。

ＣおよびＢｒｅａｔｈｎａｃｈ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、＾ｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ　７８．１５２７−１５
３１．１９８１）。

ｐＫＭｓと呼ぶベクターを第５図に示１゜これは、以下
のエレメントよりなっている。

ａ、挿入された遺伝子（Ｘ、Ｈ又はＬ遺伝子）の転写が
それから起るヒ（・メタロヂオニンーＩＩ。

プロモーター（ＭＴ−４Ａ）。このプロモーターは８３
７４２１対の１−ｆｉｎｄ−ＩＩＩ−Ｎｃｏ■フラグメ
ント（転写開始に関して−７６４及び＋７３　；　Ｋａ
ｒＯｎ。

Ｈ及び旧ｃｈａｒｄｓ、Ｒ，１，，Ｎａｔｕｒｅ　２９
９．７９７−８０２゜１９８２）上に位置し、そのＮｃ
ｏＩ認識部位はＥｃ。

ＲＩ部位に修飾されている。この目的のために、Ｎｃｏ
■認識部位を最初に、酵素Ｈｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレア
ーゼを用いて除去する。ＭＴ−−フラグメントを次いで
Ｍ　１３ｍｐ１１　（Ｈｉｎｄ　ｍ　ｘ　Ｓ　ｓｔＩ　
。

この５ｓｔＩ側はＨｕｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼでダ
イジェストして［平滑（末端）に（ｂｌｕｎｔ）Ｊされ
ている）に挿入する。次に、ＭＴ−ＩＩ。フラグメント
をＭ　１３ｍｐＨ−ｄｓ−Ｄ　Ｎ　ＡがらＥ　ＣＯＲＩ
　−ＨｌｎｄＩ［ｌ−ＤＮＡフラグメントとして単一１
する。

ｂ、転写をできる限り効率よく行うことを可能とするＭ
ｕＬＶ（Ｅ）−及び５Ｖ４０−エンハンサ−配列。この
し１〜ロウイルスエンハンザーはＭｕ　ＬＶのＬＴＲに
由来し、５ａｕ３ＡＩ　−ＸｂａＩ　　ＤＮＡフラグメ
ントのザイズとして２０３１基対のものよりなる（　Ｖ
ａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ、　Ｃ１，Ｒａｎｄｓ。

Ｅ、、　Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ、Ｓ、に、、Ｌｏ
ｗｙ、Ｄ、Ｒ，及びＶｅｒｍａ。

１、Ｈ，、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４１．５４２−５５６．
１９８２）　、　５Ｖ４０−ＤＮＡフラグメントは３２
６塩基対の長さであリ、初期プロモーター（プラスミド
ｐＳ　Ｖ　２ＣＡＴ由来のＨｉｎｄ　Ｉ［［−ＰｖｕＩ
Ｉフラグメント、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｈｏｆｆａ
ｔ、Ｌ、Ｆ、及びｌｌｏｗａｒｄ、　Ｂ、　Ｉｆ、　。

Ｈｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．　Ｂ！Ｏｆ、　２．１０４４−
１０５１．１９８２）を含む。Ｍｕ　ＬＶ−エンハンザ
−のＸｂａ工！識部位は、初めｐＢ　Ｒ３２２のＥＣ０
ＲＩ認識部位に結合された（ＥｃｏＲＩｍ識部位はＨｕ
ｎｇ　Ｂｅａｎヌクレアーゼでダイジェストすることに
より［平滑〈末端）ニシタ）。ｌ）Ｂ　Ｒ３２２のＨｉ
ｎｄＩ［［Ｉ識部位は、次いでＭＴ−Ｉ［［。プロモー
ターの付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　）に使用し、Ｉ）
Ｂ　Ｒ３２２由来の２９塩基対のｒＥｃｏＲＩＪ　−Ｈ
１ｎｄＩｆｆ７ラグメントがＭ　ｕ　Ｌ　Ｖエンハンザ
−とＭＴ−ＩＩＩ八プへ１−一ターの間に位置するよう
にした。独特のＣ１ａＩ認識部位はこのフラグメント上
に位置している。

ＭｕＬＶエンハンサ−のｓａｕｍＡ認識部位はＤＮＡポ
リメラーゼＩを用いて充填（ｆｉｌｌｉｎ（１）するこ
とにより平滑（末端）にし、ＳＶ４０プロモーターのｐ
ｖｕｌに何着させた。

Ｃ，ウサギβ−グロビン遺伝子の最終（コード）部分及
びその無イントロン遺伝子（例えばキメラに一遺伝子）
を用いるＳＶ４０転写ターミネータ−は、−次メッセン
ジャーＲＮ　Ａ　Ｊ二のイントロン及びターミネータ−
と共にもたらされる。

ｄ、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１ｔ）中での複製及び選択のため
の大腸菌複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を有す
るＩ）Ｂ　Ｒ３２７配列。最後に述べた構成要素及びＣ
で述べた領域もまたプラスミドｐＫＣＲの最大のＢａｍ
ＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント（０’１ｌａｒｅ、に
、、　Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ，及びｅｒｅａｔｈｎａｃｈ
。

Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、　ＵＳ
Ａ　７８．１５２７−１５３１゜１９８１　）に由来す
る。ただし、υ１わゆるｐＢＲ３２２の［毒配列（ｐｏ
ｉｓｏｎｏｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）ＪはｐＢ　Ｒ３２
７の相同領域で置き換えることにより除かれてお一’２
８− リ、最終コードのβ−グロビン−エクソンは大部分除去
されている（塩基対１１２２−１１９６　：　ｖａｎＯ
ｏｙｅｎ、Ａ、、　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ、Ｊ、　
Ｍａｎｔｅｌ、Ｎ、及びＷｅｔｓｓｎ＋ａｎｎ、Ｃ，、
５ｃｉｅｎｃｅ　２０６．３３７−３４４．１９７９）
。

この後者は、β−グロビン遺伝子中にその認識部位が存
在する酵素ＥＣ０ＲＩ及びＢｇｌＩＩで部分的にダイジ
ェストし、ＤＮＡ−ポリメラーゼ■で［粘着性末端（ｓ
ｔｉｃｋｙ　ｅｎｄｓ）ｊを充填することにより達成さ
れた。次に、二つの末端を互いに結合した。ｌ）Ｋ　Ｃ
Ｒ中に存在する第二のＥＣ０ＲＩ認識部位はＤＮＡポリ
メラーゼで充填して除去した。ｐＫＭＳの構築の間に、
以下の要素はこの充填された（ｆｉｌｌｅｄ）　Ｅｃｏ
ＲＩ認識部位及びＳＶ４０プロモーターの１−（ｉｎｄ
Ｉ［ｌＩ識部位の間に（正しい配列で）配置されたニー１）ＢＲ３２２由来（７）ＥＣＯＲＩ（充ＩＥ）　−
Ｃ１ａＩ　−ＤＮ△フラグメント（２４塩基対）：一ポリリンカー領域：　Ｍ　１３ｍｐ１０由来の＠　ｉ
ｎｄ　ｆｆ　−Ｈ１ｎｃｊ　Ｉ［［−Ｄ　ＮＡフラグメ
ント（１１塩基対）。

キメラＨ遺伝子及びＬ遺伝子は各々別個にｐ　Ｋ　ＨＳ
のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩ分割（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ
）部位の間に挿入された。ｐＫＨ３，Ｈ及びｐＫＨ３，
Ｌと呼ぶ、このようにして形成されたプラスミドは、リ
ン酸カルシウム析出法（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｈ，、Ｐｅ１ｌ
ｉｃｅｒ、Ａ、。

５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、Ｓ、、＾ｘｅｌ、Ｒ，，Ｕｒ
ｌａｕｂ、Ｇ、及びＣｈａＳｉｎ。

Ｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　７６、１３７３−１３７６゜１９７９）を用いて
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＩＩＯ，に１　
：　ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）をトランスフェクトするた
めに使用される。この目的のために、１０．６埒のｐＫ
Ｈ３，Ｈ１８，２ＮのｐＫＨ３，Ｌ及び、１ｌｉｎｄｎ
ｌ認識部位に組込まれたヒトＭＴ−ｎＡ遺伝子（Ｋａｒ
ｉｎ、Ｈ。

及び旧ｃｈａｒｄｓ、Ｒ，１，，Ｎａｔｕｒｅ　２９９
．７９７−８０２．１９８２）を含む３ｋｂｐのＨｉｎ
ｄ　ｍ　−Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを有するネオマイシ
ン耐性遺伝子と重金属に対＝　３０− する耐性を与えるＭＴ−ＴＩ、、１仏子を含むプラスミ
ド１．２　ｔａ　（ｐＡＧ６ｏ、　Ｃｏ１ｂｅｒｅ　−
Ｇａｒａｐｉｎ、　Ｆ、　。

Ｈｏｒｏｃｌｉｎｃｃａｕ、　Ｆ、、　Ｋｏｕｒｉｌｓ
ｋｙ、Ｐ及びＧａｒｐｉｎ、ＡＣ，、Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、　１５０．１−１４．７９８１）とからなるＤＮ
Ａ混合物を用いた。トランスフェクションの４８時間後
、成育培地を０．８Ｉｎｇ／ｄ！ｍ度の＋０４１８培地
に新しくすることにより選択（５ｃｌｅｃｔｉｏｎ）を
開始した。約１４日後、第二の選択プロセスを開始した
。この目的のために、ネオマイシン遺伝子の存在につい
て選択した細胞集団（ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
）を５つの部分に分割し、そこへ５０＋＋＋ＨＺｎＣ１
！２及び漸増量のｃｄＱ！２（１〜５加）の存在する成
育培地を加えに０この方法により、ＭＴ−ＩｆＡＩ伝子
を発現さぜうる細胞の選択が十分に起こる。免疫グロブ
リンプラスミドは同時に選択プラスミドとしてトランス
フェクトされ、また恐らく染色体ＤＮＡ中の同じ部位に
組込まれるために、ＭＴ−ＩＩヶ遺伝子が効率良く発現
する細胞内で、免疫グロビン遺伝子もまた十分に発現す
るようになると思われる。Ｃｄ２＋で選択された特定の
細胞集団の上清を、次いでキメラ抗体の存在について試
験した。

最高の抗体製造を示すＣｄ２＋耐性細胞集団からの細胞
をクローン化した。抗体を検出する試験は［サンドイッ
チＪＥＩＡに基づいて行ない、試料はヤギ抗ヒトＩｇＧ
を付着したミクロ滴定プレート（ｌｉｃｒＯｔｉｔｒｅ
　ｐｌａｔｅ）のウェルに導入した。洗浄後、試料を入
れたプレートを、ヒトｊ及び西洋わさびのペルオキシダ
ーゼに対するヤギ血清の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
と共にインキュベートした。酵素結合抗体のウェルへの
カップリングは基質ＴＭＢの添加後、染色反応により検
出した。同様の試験を、プレートに結合したｈＣＧ及び
、複合体としてトＩＲＰにカップリングしたヒトＩＱに
対するヤギ血清について行なった。Ｇ４１８−耐性細胞
集団は、＝　３２　＝両方の試験において、再坦性良く陽性であった。

このことは、上述のプラスミドでトランスフＩクトした
ＣＨＯ，に１細胞は、ｌ−ヒト免疫グロブリン鎖ど１」
ヒト免疫グロブリン鎖の双方からなるタンパク質を分泌
しうろことを意味している。さらに、このタンパク質は
ｈＣＧに結合することができる。

実施例２この２番目の実施例では、可変領域すなわちＣＤＲの一
部のみがマウス由来であり、ＦＲと定常部はヒト由来で
あるハイブリッド抗体をコードしている遺伝子の構築に
ついて説明する。可変のＨ鎖と１−鎖の遺伝子配列は化
学合成されている。これらの遺伝子をＣＤＲ領域が第２
図と第３図の枠で囲った配列と同じになるように設計し
た。−方ＦＲ領域はＷＥＡというヒト抗体由来である（
Ｇｏｎｉ、　　ｒ、、　ａｎｄ　Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ、
Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

３ｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．４８３７−４８４１．１９
８３）。シグナル配列はＶ　およびＶ　　遺伝子ｆａｍ
ｉｌｙの共通配列に由ｘＴ　　　　　　　　ＩＩＩ［［来する。ＷＥＡ抗体抗体口れらのｆａｍｉｌｙの代表で
ある。ヌクレオチド数が２５〜４８個の大きさのオーリ
ボデオキシリボヌクレオチドを５８個合成し、９つのセ
クションに組み立てた。１つのセクションのオリゴヌク
レオチドの５°−末端を５゛−リン酸化しくただし、最
外端のオリゴヌクレオチド２つは除く）、アニーリング
し、Ｍ　１３ｍａｌＩＲＦに連結した。

すべてのセクションからのＤＮＡクローンを選択して配
列決定した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動でＤＮＡ
断片を精製し、連結して完全な可変領域の配列を形成し
た。完全な免疫グロブリン遺伝子の構築、ベクターへの
挿入、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞のトランスフェクションは前の実施例に記載したよう
にして行なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩＯＧ分子の構造を示す概略図である。第２図および第３図は、それぞれ、本発明のポリペプチ
ドのＬ鎖およびＨ鎖のＮ−末端領域のアミノ酸とヌクレ
オチドの配列図である。第４図は、実施例１に記載したハイブリッドＨおよびＬ
鎖遺伝子の構造の概略図である。第５図は、実施例１に記載したベクターｐＫＭＳの概略
説明図である。代理人弁理士　力行　　山　　　武Ｌ’Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　”　
　　　　　　　　−〇−一　　　　　　　　　　Ｎ　　
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　　　　Ｉ−μ Φ　　　　　　の　　　　　　ぐ龜　　　　　　ｃＩ′）ｃｒ：　　　　　　　ααＯ＞
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Ｊ　　　　　　　　Ｊ＜Ｅｅｌ　　　　工■Ｎ　　Ｌ）
　　　ＣＤぐ　龜 ■へ　　Φ円トＣｎ２　　１−　　　ＬａＪ。くト　　　　　　　　　　　　　　ロ＋−＋　ａ　　　　Ｃｌ）　　　　　　ＬＬＩ　１−Ｊ
　）−”工　ＣＥ　　＋−’フ ω　　　　　　＜（＜Ｌ）　　　　　　　　　ＯＯ′） α　　α　　−Ｆｃｕｃり　　　＞　　　工←　　」 ω　　←　　乙　　口（）−■ °　　°鴫２　　　　　　　　戸　　　　　　　く」ぐ　　　　　
　」　　　　　　　　」υロ　　　　　　　　■　　　
　　　　（Ｌ）　０　　　　　　　　　　　　　　Ｌ）
　ＯＣり　０円　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　「〕のへ　　　　　　　　　　　　　　（」つ　
　　　　＜ｔつ　　　　　（ぐＣ１’）　　　　　　　
α　　　　　　α　　　　　　ロ　　　　ωα＞（エ　
　　エＯα〇　−ω■ Ｊ　　　　１−）−＜Ｃ−ψ （ζ　　　　　　　（←

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ｈＣＧに対する結合活性を有し、少なくとも以下
に示すポリペプチドフラグメントの一つを含有すること
を特徴とするポリペプチド：（ｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｉｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｖ）【遺伝子配列があります】；（ｖ）【遺伝子配列があります】；（ｖｉ）【遺伝子配列があります】。
（２）免疫グロブリン鎖の少なくとも一つの領域を、い
わゆるフレームワーク領域と相互に結合している抗原結
合ドメインと共に含み、以下のポリペプチドフラグメン
トの一つを含む少なくとも一つの抗原結合ドメインを含
むことを特徴とするポリペプチド：（ｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｉｉ）【遺伝子配列があります】；（ｉｖ）【遺伝子配列があります】；（ｖ）【遺伝子配列があります】；（ｖｉ）【遺伝子配列があります】。
（３）請求項１又は２記載のポリペプチドをコードする
ことを特徴とするＤＮＡ配列。
（４）一領域が請求項１又は２記載のポリペプチドをコ
ードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
（５）請求項４記載のヌクレオチド配列を含有すること
を特徴とする組換えＤＮＡ。
（６）発現調節要素の制御下に、請求項４記載のＤＮＡ
配列を含有する発現ベクター。。
（７）請求項４記載の発現ベクターによって形質転換さ
れ、請求項１記載のポリペプチドを産生し得る宿主細胞
。
（８）請求項１又は２記載のポリペプチドを含有する医
薬組成物。
（９）請求項１又は２記載のポリペプチドを含有する診
断又は治療用免疫剤。
（１０）不溶性支持体、粒子、マーカー又は細胞毒性物
質に結合していることを特徴とする請求項９記載の免疫
剤。