PT92412A - Processo para a preparacao de polipeptidos com actividade de ligacao a gonadotrofina de corion humano - Google Patents

Description

-2™ « 70 281 ΟΑ/2692-473

MEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente invento refere-se a polipéptidos com reactividade imune em relação à hCG, aos seus fragmentos de ligação a hCÔ, aos ácidos nucleicos que os codificam ou que contêm a sequência que os codifica, às células hospedeiras que contêm estes ácidos nucleicos e aos produtos farmacêuticos s reagentes imunológicos que contêm os referidos polipéptidos e/ou fragmentos.

Mos seres humanos, f r e q u e n t e mente pr od u tos adrni ni str ados à mulher, intervêm em um ou ma is para o controlo dos nascimentos, usam-se farmacêuticos, os quais são habitualmente

As substâncias activas, nestes produtos, processos biológicos que desempenham um papel na. reprodução. Já há. rnuitas décadas que os principais esteróides que influenciam a ovulação têm vindo a ser usados para este fim»

Durante a década passada., deu-se também atenção à influência. sobre outras fases cruciais do processo de especificamente, aos procesos nos quais a (gonadotrofina coriónica humana) tem um papel» reprodução e.

iCG uma hormona, glicoproteica a qual, inter alia, é segregada pelo tecido trofoblástico da placenta e que após ligação aos receptores da membrana específicos, estimula a. produção de hormonas esteróides» As hormonas esteróides produzidas (inter alia progesterona), são responsáveis pela manutenção da gravidez. A supressão da acção da hCG pode, assim, conduzir ao aborto da gravidez.

Tem-se tentato suprimir a acção da hCG por meio de métodos imunológicos. Com este fim, administra-se hCG que foi modificada de modo que se possa esperar uma reacção imunológica. Até à data esta abordagem não tem tido sucessos geralmente, verificou-se que a produção de anticorpos era demasiado baixa ou que faltava, aos anticorpos a. especificidade desejada para capturar suficientemente a hCG»

Por esta razão escolheu-se outra abordagem, com a. qual a concentração da hCG pode ser baixada com sucesso, por meio da administração de polipéptidos (tais como anticorpos) que reagem especificamente com a hCG. 70 281 QA/2692-478

Os anticorpos de ocorrência natural (imunoglofoinasj Ig) são diferenciados em vários tipos os quais têm, contudo, em comum possuírem todos, pelo menos duas regiões de ligação ao antigénio (Fab). Os tipos são diferenciados pelas diferenças nas restantes regiões (Fc) da proteína

Devem diferenciados. principalmente os seguintes tipos: igA, igD, IgE, IgG e IgM» dentro destas categorias distinguem-se frequentemente também outros sufo-tipos. ft estrutura da molécula de IgG e a estrutura fina, que serão discutidas a seguir, são apresentadas esquematicamente na Figura 1. As moléculas de anticorpo são constituídas por cadeias polipeptidicas leves e pesadas designadas por, respecti vamente, L e H. As regiões das cadeias polipeptidicas respectivas, que possuem grupos terminais amino, estão envolvidas na ligação específica de antigénios. Estas regiões são variáveis num grau significativo e são, de facto, únicas para cada anticorpo dirigido contra uma parte específica, (epítopo) de um antigénio. São designadas por, respectivamente, LFv e HFv e em conjunto formam a região Fv de uma molécula de anticorpo. As regiões das cadeias que possuem grupos terminais earboxilo são menos variáveis; i.e. apresentam apenas diferenças que são características dos vários tipos e sub-tipos, já mencionados acima. que se distinguem nos anticorpos, designadas por, respectivamente, LFc e HFc.

As regiões Fc dos tipos de anticorpos correspondentes a diferentes espécies animais, apresentam frequentemente diferenças apreciáveis na composição e sequência dos aminoácidos.

Assim, anticorpos de outra espécie animal serão reconhecidos como estranhos imunológica. darão origem a uma reacção de rejeiçã<

Estudos recentes demonstraram que as próprias regiões Fv consistem em regiões rnais ou menos variáveis. As regiões altamente variáveis (hipervariáveis) são responsáveis especificamente pela ligação ao antigénio e são designadas por CDR (regiões determinantes de complementaridade)Em cada uma das cadeias existem três CDR, integradas nas chamadas FR ("regiões de estrutura"). Provavelmente, a função destas últimas "4~ 70 281 0Α/2692-478 é a de manter a estrutura espacial nas posições correctas cias CDR. As seis CDR da. região FV formam, em conjunto, o sítio de contacto total do anticorpo com o antigénio contra o qual é oií 3.gxdou

Tendo em vista o conhecimento pormenorizado, sumarizado anteriormente, cia. estrutura fina das moléculas de imunoglobulinas e das funçõ'es descritas para as várias sufo-estruturas é, em princípio, possível efectuar modificações intencionais nestas moléculas. As técnicas de ADN recombinante são, especificamente, muito adequadas para este fim e foram descritas várias aplicações práticas para as técnicas de manipulação genética deste tipo» 0 pedido de Patente Europeia 0 088 994 da Schering Corp. descreve vectores de expressão que contêm sequências de ADN que codificam fragmentos LFv ou HFv de uma imunoglobulina específica e a expressão de tais fragmentos de imumoglobulina em Escherichia coli (E. colí). fere-se inter alia ã cadeia, leve como da seus fragmentos Fv. podem, se desejado, anticorpo monoclonal anticorpo (chamado A EP 0 120 694 de Celltech Ltd» re expressão numa célula hospedeira, tanto da cadeia pesada, de uma imunoglobulina ou cios As imunoglobulinas preparadas deste modo consistir numa região Fv idêntica à de um específico e num fragmento Fe de outro imunoglobulina quimérica). A EP 0 125 023 cie Oenentech and City of Hope refere-se, tal como as duas publicações de patentes anteriores, ã expressão, numa célula hospedeira, de ADN que codifica um fragmento de imunoglobulina ou uma imunoglobulina quimérica. Aqui, a célula hospedeira é um microrganismo procariótico ou eucariótico.

Na EP 0 171 496 cia Research Development Corporation of Japan é descrita a preparação de anticorpos quiméricos com o auxílio de técnicas de ADN recombinante, nas quais, especificamente, a região Fc corresponde à de uma imunoglobulina não humana. A WQ 86/01533 de Celltech Ltd. é especificamente restringida de proteínas outra região â expressão em células de mamíferos imortalizadas, quiméricas com uma região de ligação ao antigénio e 70 281 0A/2692-478 de proteína, a qual pode ser por exemplo uma região Fc de outra imunoglobulina mas pode também ser (uma parte de) outra proteína (enzima por exemplo). A EP 0 029 400 de Winter descreve a preparação de anticorpos modificados nos quais pelo menos algumas das CDR da região Fv foram substituídas pelas

CDR cor r esponcle n tes outra imunoglobulina,, Por meio desta última, técnica (designada por "enxerto CDR") é possível transferir, por exemplo, CDR de imunoglobulina monoclonal de. ratinho para outra molécula, a qual é earacteristiea da imunoglobulina humana. 0 objectivo do presente invento é o de proporcionar polipéptidos (especialmente imunoglobulinas ou seus fragmentos) que possuam uma. afinidade específica particular em relação a hCG,

Os polipéptidos de acordo com o invento pode, em particular, ser empregues no reconhecimento específico da hCG em casos em que o risco de reacção cruzada dos polipéptidos com substâncias semelhantes á hCG é elevado. Isto refere-se especificamente à reacção cruzada com proteínas, tais como a hormona luteinizante humana (hLH) e à hormona estimuladora do folículo humana (hFSH), cada uma das quais, tal como a hCG, consiste em duas cadeias polipeptídicas, uma das quais (a cadeia a) é idêntica à da hCG e a outra (a cadeia β) apresenta uma homologia mais ou menos pronunciada com a. cadeia β da hCG»

Consequentemente, tentou-se encontrar anticorpos que fossem tolerados pelo corpo humano e que tivessem uma forte afinidade com a hCG, mas que se ligassem com as proteínas homólogas à. hCG num grau muito menor. Verificou-se, em particular, serem anticorpos adequados os polipéptidos que possuem uma ou mais das seguintes CDR» (i) ARQ-ALA-SER-QLU-SER-VAL-ASP-ASN-ASN-QLY-ILE-SER-PHE-MET- -ASN; (ii) ALA-ALA~SER-ILE~GLN~GLY~SER; (iii) eLN-eLN~ILE-LYS-6LU-VAL~PR0-PR0-THR3 (iv) ASP-TYR-ASN-ΜET-ΗIS; 70 231 OA/2692-478 (ν) TYR-ILE-TYR-PR0-TYR-SER-GLY-PR0-THR-8LY-TYR-ASN-QLN-ARe- :R; •PHE-ASN- (vi) GLU-6LY-ILE-PHE-TYR-THR-MET-ASP-TYR. É evidente que as CDR que funcionalmente correspondem ás CDR acima mencionadas s que diferem das CDR acima mencionadas por um ou mais aminoácidos terem sido substituídos ou clerivatizados, sem que isto resulte numa perturbação da estrutura espacial da CDR, são também adequados para esta finalidade.

Os polipêptidos de acordo com o invento podem conter uma ou mais das CDR acima mencionadas ou dos seus equivalentes funcionais, de preferência em conjunção com FR de ocorrência natural e/ou produzidas sinteticamente.

As sequências das regiões N-terminais, respectivaments, a cadeia leve e a cadeia pesada de um polipéptido de acordo com o invento, são mostradas nas Figuras 2 e 3, cujas regiões N~ “terminais formam em conjunto um fragmento de anticorpo de ligação a hCG (FhCQ). A sequência de nucleótidos que codifica, estes aminoácidos é também mostrada nestas Figuras. As CDR estão enquadradas na sequência de aminoácidos e na sequência de nucleótidos das Figuras 2 e 3.

Em lugar da. Fr apresentada nestas Figuras 2 e 3, podem também ser usadas outras FR de ocorrência natural ou sequências de aminoácidos, com a mesma função, produzidas a partir de FR de ocorrência natural. Estas serão, por exemplo, sequências que correspondam às FR dos anticorpos humanos.

Os fragmentos de anticorpo de ligação a hCQ, FhCG, podem ser usados como tais ou incorporados num polipéptido maior»

Com este fim, podem-se acoplar dois ou mais dos referidos polipéptidos FhCG - de preferência por meio de ligações covalentes mútuas ou por meio de um suporte» Outra possibilidade é a de ligar covalentemente (possivelmente via um chamado ligador) pelo menos um fragmento Fc de uma cadeia de anticorpo ao terminal C de um ou de ambos os fragmentos Fv„ 7 70 281 OA/2692-478

Também é possível que um ou ambos os fragmentos Fv sejam ligados, via o terminal C, a (partes de) outros polipéptidos, os quais, preferivelmente, não provocam uma reacção imunológica no organismo ao qual o polipéptido é administrado»

Ds acordo com o presente invento, os polipéptidos são preparados, por ímpio, com

auxílio de métodos de ADN recombinante. Com este fim. insere-se uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido pretendido, por processos conhecidos, num vector adequado para. transformação estável numa célula hospedeira escolhida, adquirindo esta célula, hospedeira a capacidade de produzir o referido polipéptido» Num vector deste tipo, a. sequência nucleotidica pretendida é incorporada, de tal modo que os elementos de controlo da sua expressão (sistemas de transcrição) lhe estão funcionalmente ligados» Simultaneamente, os referidos vectores podem conter elementos por meio dos quais se assegura a replicação da sus. parte funcionalmente relevante na célula hospedeira., Com este fim, o vector pode conter o seu próprio replicão, tal como a origem da replicação em E„ coli ou a origem de SV40 cie replicação, a qual pode ser usada no caso cie células eucarióticas. fts células eucarióticas podem ser também transformadas com um vector que se integre de forma estável no cromossoma da célula hospedeira»

As células hospedeiras que podem ser usadas são as células procarióticas e as células eucarióticas e, em particular, as células de mamíferos - de preferência, estas últimas, em vista do pós- acto de estas serem capazes também cie realizar tratamento

“ U <A tdução, tais como glieosilação e montagem, no polipéptido,

As células deste tipo, transformadas com um vector adequado, o qual contérn uma sequência nucleotidica codificando o polipéptido de acordo com o invento, podem ser cultivadas in vitro e sob condiçoes adequadas para produzirem e cie preferência segregarem, o polipéptido híbrido pretendido» Os sistemas de cultura e as condiçbes de cultura a serem utilizados para este fim dependem da célula hospedeira, escolhida» De preferência, as-condições serão escolhidas de tal modo que o polipéptido desejado seja segregado para o meio de cultura, a partir do qual pode 70 281 0Α/2692-478 ainda ser isolado, se apropriado»

Os polipéptidos de acordo com o invento podem ser usados para evitar a gravidez, mas podem também ser usados com outros fins terapêuticos, tais como no combate de coriocarcinomas e de outros tumores produtores de hCG. Os polipéptidos de ligação a hCS podem também ser usados em diagnóstico, tal como em diagnósticos in vivo (por exemplo na localização de tumores) e para diagnósticos in vitro, para detecção de hCG em fluidos corporais (sangue, soro, urina e semelhantes)»

Para fins terapêuticos os polipéptidos de acordo com o invento podem ser administrados incorporados num veículo terapeuticamente aceitável» Tal veículo, contém especificamente água e também possivelmente um composto tampão do pH, estabilizantes, antibióticos, hidratos de carbono, glicina, álcool benzilico e semelhantes.

Para combater coriocarcinomas, os polipéptidos de acordo com o invento podem ser administrados juntamente com, e possivelmente acoplados a , substâncias que podem inibir ou parar o desenvolvimento do tumor e/ou podem matar ou ajudar a matar as células do tumor» Com esta. finalidade os polipéptidos podem sei*, por exemplo, acoplados a substâncias citostáticas ou citotóxicas.

Mo caso do diagnóstico in vitro da. hC8, o polipêptido pode ser, por exemplo, ligado a uma partícula, a um suporte sólido ou a um marcador» EXEMPLO.......1

Este exemplo descreve a produção de um anticorpo híbrido, cujas partes variáveis (V) são originárias do ratinho e as partes constantes (C) de seres humanos. Construíram-se genes codificando tanto a cadeia leve como a pesada, com base no material hereditário cie ambas as espécies»

Os genes codificando os fragmentos variáveis foram isolados de urna linha de células de mieloma produtora de anti-hCG. 0 ARN foi isolado a partir destes e preparou-se o ADNc (Gubler, U., e Hoffmann, B.J., Gene 25, 263-269, 1983). Utilizando métodos de -9- 70 281 0A/2692-478 biologia molecular conhecidos (Maniatis, T., Fritsch, E.T. e Sambrook, J„, Molecular Gloning: a laboratory manual,, Colei Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1982), construiu-se urna biblioteca de ADNc no bacteriofago /tgtlO. Seleccionaram~se os clones por hibridação corn sondas, as quais eram derivadas da sequência de nucleótidos já conhecida de duas Μ., Y a m a waki K a t a o -N. e Mano, Y., Cell Leder, P., J, Biol. regiões constantes (ifj eu) (Honjo, T., Obata ka, Y., Katoaka. T., Kawakami, T., Takahashi, 18, 559-568, 1979» Max. E.E., Maizel, J.V. e

Chern, 256, 5116-5120, 1981).

As inserções d transferidas para o e clones obtidas deste modo foram bacteriofago M13 e determinou-se em seguida a sequência nucleotídica da região variável (cadeia L e H) usando o método didesoxi (Sanger, F., Nicklen, 8. e Coulson, A.R., Proc.Natl. Acad.Sci. EUA 74, 5463-5467, 1977) (Fig. 2 e 3 respectivamente). A partir desta sequência foi ainda possível derivar a. sequência, de aminoácidos e a posição das CDR«

Construiram-se genes H e L, híbridos, utilizando as sequências de nucleótidos destas regiões V e as das regiões C humana, publicadas anteriormente. A Figura 4 mostra a representação esquemática destes genes.

Os fragmentos variáveis foram restringidos tanto no lado 3’ como no lado 5’ com o auxilio de sítios de reconhecimento da enzima de restrição. Com este fim criou-se no lado 5’ um sítio de reconhecimento de enzima EcoRI, um pouco antes da posição do codão de iniciação AUC, por adição de ligadores EcoRI (posições nv^leotidicas 1-6 nas figuras 2 e 3). Mo lado 3’ usaram-se os sítios de reconhecimento já presentes, para as enzimas Sau3AI (56 nucleótidos antes do fim da região variável H) e Bani (22 nucleótidos antes do fim da região variável L). Os fragmentos EcoRI-Sau3AI e EcoRI-BanI obtidos, codificam virtualmente, a região variável completa do gene H e L, respectivamente. 0 gene codificando a região constante H é derivado de uma biblioteca de ADN de fígado fetal humano (Takahashi, N., Ne da, S,. , Obata, M., Nikaido, T., Nakai, S. e Honjo, T., Cell 29, 671- 10- 70 281 0Α/2692-478 '"•679, 1982). Escolheu-se o gene AJ^- 0 gene foi isolado como um 1ragmento de ADN Narl-Sphl de aproximadamente 2200 pares de °as®s. 0 sítio de reconhecimento NarI localiza-se na posição 20 do primeiro exão (CHI); o sítio de reconhecimento Sphl situa-se aproximadamente a 650 pares de bases do codão de paragem, de. modo que, com excepção das primeiras 20 bases, a sequência completa localiza-se neste fragmento de ADN. Além destes, localizam-se neste fragmento 3 intrões e o sinal de poliadenilação natural (Ellison, J. e Hood, L., Proc.Natl.Acad.Sci. EUA, 79, 1984-1988, 1982). 0 gene codificando a parte constante fC humana é preparado via síntese de oligonucleótidos como um fragmento Narl-BamHI de ol5 pares de bases. 0 sítio de reconhecimento de NarI é criado na posição 11 da parte C K codificante. Em adição, criou-se um sítio de reconhecimento Pst I a meio do comprimento do gene, em resultado do qual a síntese se pôde realizar em duas metades. Estes dois sítios de reconhecimento foram escolhidos de tal modo que a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nue1eóti dos(Hi eter, P. A,

Mac

Seidman, J.G., Maizel, J„v„ e Leder, P„, Cell 22, 197-207, 1980) não sofreu nenhumas modificações. Em comparação com a sequência de Hieter et al, introduziram-se outras bases em 4 posições, isto é na posição o44, T -> Q; 347, A -> Gs 473, C -> G e 476, A -> G (numeração de Hieter e col., acima). 0 sítio de reconhecimento de BarnHI na extremidade do fragmento sobrepõe-se parcialmente ao codão de paragem (5’-TAGQTfíTCC-3’). A síntese ê realizada em dois blocos de 5 e de 6 oligonucleótidos. Alguns dos oligonucleótidos de um bloco são preparados por síntese complementar e são ligados uns aos outros com o auxílio da enzima ADN ligase de T4 s inseridos no bacteriófago M13. Após verificação da sequência nucleotidica, os clois blocos são ligados um ao outro para formarem o fragmento CU NarI-BarnHI. A síntese dos oligonucleótidos realizou-se num sintetizador de ADN 31SA da Applied Biosystem.

Com a finalidade de ligar os dois fragmentos V e C, do gene H e cio gene L, um ao outro, escolheram-se fragmentos de ADN “11 — 70 281 ΟΑ/2692-478 (denominados ligadores na Figura 4) (Sau3AI-NarI e BanI-NarI, respectivamente), os quais codificavam os aninoácidos finais de V e (consecutivamente) os primeiros aminoácidos de C* Estes fragmentos de ABN foram de novo sintetizados quimicamente. 0 gene quimérico foi obtido acoplando os fragmentos V e C por meio do fragmento de ligação, o qual, para cada uma das cadeias, codificava a sequência de aminoácidos original dos fragmentos de cadeia correspondentes, relevantes, e além disso, tanto quanto possível, continha a sequência de bases original ("ligador" na. Figura. 4). Os fragmentos de ADN assim obtidos codificavam uma cadeia de imunoglobulina na qual a sequência de aminoácidos da região V é completamente derivada de ratinhos e a. região C de seres humanos» As sequências de nucleótidos são, como descrito acima, para as regiões V de ratinho e C de ser humano.,

Com a finalidade de facilitar a inserção num vector de expressão, o sítio de reconhecimento Sphl do gene H foi modificado num sítio de reconhecimento de BamHl por uma adição de ligador, de modo que ambos os genes estão agora localizados num fragmento EcoRI-BamHI. 0 vector que é utilizado para expressão em células eucarióticas é largamente derivado de pKCR (0’Hare. K, , Benoist, C e Breathnach, R., Proc.Natl.Acad.Sci. EUA 78, 1527-1531, 1981). 0 vector, denominado .pKMS, está apresentado na Figura 5 e consiste nos seguintes elementos: a. promotor de m@talotionina-IIA humana (MT~IIA) a partir do qual tem lugar a transcrição do gene inserido (X, é gene H ou L). 0 promotor está localizado num fragmento Hind III - Ncol dfô 837 pares de bases (-764 e +73 em relação ao início da transcrição; Karen, M. eRichards, R.. I „ , Nature 299, 797-802, 1,982), cujo sítio de reconhecimento de Nlcol tinha, sido modificado para. um sítio EcoRI. Com este fim, primeiro removeu-se o sítio de reconhecimento de Ncol com o auxilio de enzima, nuclea.se de fragmento MT-IIA foi em se gui cia x SstI, tendo o lado SstI sido com nuclease de fei j! io do tipo :o MT-IIa f

inserido em M13mpll (HindiII x SstI -12- 70 281 0A/2692-478 "Mung" ), 0 fragmento MT-IIp, foi em seguida, isolado como fragmento EcoRI-Hind111-ADN a partir de M13mpllds-ADNs b , sequências melhoradas MuLV (E) e 3V 40, as quais $erst para. permitir que a transcrição seja tão elevada quanto possj veg π meIhorador retroviral é derivado a partir de LTR de Misi y consiste num fragmento de ADN Sau3AI-XbaI com 203 pares de (Van Beveren, C,, Rands, E., Chattopadhyay, S.K., Lowy, d p Verma, I.M., J. Virol. 41, 542-556, 1982). 0 fragmento de adm- -SV40 tem 326 pares de bases de comprimento e contem o promotor precoce (fragmento HindIII-PvulI derivado do plasmídeo PSV2CAT Gorman, C,M., Hoffat, L.F. e Howard, B.H., Molec.Cell.Biol. o 1044-1051, 1982), 0 sítio de reconhecimento de xbal cio melhorador MuLV estava originalmente ligado ao sítio de reconhecimento de EcoRI do pBR322 (sítio de reconhecimento ds EcoRI tornado "rombo" por digestão com nuclease de feijão do tipo "Mung"), 0 sítio de reconhecimento de HindIII do pBR322 foi então usado para ligação do promotor de modo que o fragmento "EeoRX"-HindIII com 29 pares de bases derivado de pBR322 fica localizado entre o melhorador MuLV e o promotor MT-0 único sitio de reconhecimento Ciai fica localizado neste fragmento. 0 sítio de reconhecimento SauIIIA do melhorador MuLV foi tornado rombo por enchimento com o auxílio de ADN polimerase 1 o ligada ao lado PvuII do promotor SV40j c, a parte (de codificação) final do gene da β-globina de coelho e o terrninaclor da transcrição de SV40 por meio dos quais os genes sem intrões (tais como o gene κ quimérico) são fornecidos com um intrão no ARN mensageiro primário e com um terminador; d, a sequência de pBR327 com o ponto de início de replieação de E, coli e o gene de resistência à ampicilina para replicação e selecção em E. coli, Os constituintes mencionado© em último lugar e também a região mencionada em c são derivados do maior fragmento BamHI-EcoRI do plasmídeo pKCR (G’Hare, K. , Benoist, C, e Breathnach, R. , Proc.Natl, Acad „Sci, EUA 78, 1527- -13- 70 281 0Α/2692-478 "*1531, 1981), com a condição de que a chamada "seqUf>. venenosa" do pBR322 tenha sido removida por troca com uma s v~9 j *,. homóloga do p8R327 e de que o exão de β-globina de codifj^. "&i° final, tenha sido largamente removido (pares de bases 112^, saídas : van Ooyen, A., van den Berg, J., Hantel, N, e Weis^^ C., Science 206, 337-344, 1979), Esta última alteraç30 f 'Il9,s

Pi-, £ i O i efectuada por digestão parcial com as enzimas EcoRI e BglIJ ^ * sítios de reconhecimento estão presentes no gene da ,8-glob^ por enchimento das "extremidades peganhentas" com ADN polin-|CS..„„ 1,. As duas extremidades foram em seguida ligadas uma. à outr^

Removeu-se um segundo sítio de reconhecimento de

·· Ίν X presente no pKCR por enchimento com ADN polimerase, Duraiv '-e construção do pKMS posicionaram-se os seguintes elementos (v posições correctas) entre este sitio de reconhecimento de cheio e o sítio de reconhecimento c!e HindIII do promotor SV4Q» fragmento EcoRl-Clal-ADN (24 pares de base) derivado ^ pBR322; uma região do poli-ligador : fragmento HindII-HindIII-ADN πη pares de bases) derivado de M13mpl0.

Os genes H e L quiméricos foram, cada um, separadamente inseridos entre os sítios de cisão EcoRI e BamHI do pKMS„. Os plasmideos assim formados, denominados pKMS.H e pKMS.L, foram utilizados para transfectar células do ovário do criceto chinês (C!~!0„Kl; ATCC CCL-61) com o auxilio do processo de precipitação com fosfato de Ca (Wigler, M. , Pellicer, A„ Silverstein, S.,

Axel, R „ , Ur lauto, <3, e Chasin, L. , Proc.NatlAcad.. Sei, EUA 76, 1373-1376, 1979). Com esta finalidade utilizou-se uma mistura de ADN consistindo em 1.0,6 pg de pKMS.H, 8,2 pg de pKMS.L e 1,2 M.g de um plasmideo contendo o gene de resistência à neomicina s 0 gene MT-Χϊβ, proporcionando resistência, aos metais pesados (pA660, Colbêre-8arapin, F., Horodinceau, F. , Kourilsky, P . e Qarpin, A.C., J.Mol.Biol. 150, 1-14, 1981) com um fragmento

HindXXX-ADN de 3 Kpb contendo o gene MT-IIA humano (Karin, M, © Pichards, R,I„, Nature 299, 797-802, 1982) integrado no sítio de reconhecimento de HindIII. 48 horas após a. transfseção, iniciou·-·· -14- 70 281 QA/2692-478 “r$e a selecção, restaurando o melo de crescimento com ^ ^ G418 numa concentração de 0,8 mg/ml. Aproximadamer,;:e.. j ^ di depois iniciou-se um segundo procedimento de seleccão « " - · Com ssce tim, a população de células seleccioriada em relação k , - Presença do gene da neomicina foi dividida em cinco partes.. ' quais se adicionou meio de cultura em presença de ZnClo 50 , * mH e de um este meio efectua-se uma selecção de células que podem levar o _ M_ TT d ’w Π β IΊ 1 X 1 Cl a exprimir~se bem» Devido ao facto de os . , , i~*-***,inxcieQS de imunoglobulinas serem transfectados ao mesmo tempo realiza a selecção dos plasmideos e aumento da concentração de CdClg (1-5 wm). Por que se pi' ovav&lrnents serem integrados no mesmo sítio no ADN cromossómico, é provável que em células nas quais se verifica uma elevada expressão do gene MT™ os genes da imunoglobulina também sejam levados a exprimir™ "Sís o em, seguida testou-se o sobrenadants de uma população de células especificas, seleccionaclas com CcF'1.. em relação à p-> esença cie anticorpos quiméricos» Clonaram-se as células de uma. populaçao de células resistentes a Có*', que apresentavam a maior produção de anticorpos. 0 teste para detectar anticorpos baseia--st num EIA "sanduíche",, sendo a amostra introduzida numa cavidade cie uma placa de mi cr o titulação à qual se tinha ligado IgG anti-humana de cabra. Após lavagem, incubou-e a placa com a amostra, com um conjugado de soro de cabra contra j humana s com peroxidase de rábano picante. Detectou-se o acoplamenbto do anticorpo, ligado à enzimacavidade, após adições de substrato IMS, por meio de uma reacção colorida» Realizou-se um teste semelhante com hCG ligada à placa e com soro de cabra dirigido contra Ig humana acoplada a HRP, como conjugado» Em ambos os testes, as populações de células resistentes a (3418 eram posisitivas de modo reprodutível» Isto significa que as células CH0..K1, transfectadas com os plasmideos acima mencionados, são capazes de segregar uma proteína que consiste tanto num®, cadeia leve como numa pesada de imunoglobulina humana» Além disto a proteína pode ligas—se a hCG. EXEMPLO......2 0 segundo exemplo descreve a. construção de genes codificando “15™ 70 231 0Α/2692-478 um anticorpo híbrido, no qual apenas parte das regiões variáveis, i.. e„ das CluR, sao derivadas d© ratinho, ao passo que as Fr © as partes constantes são de origem humana,. As sequências d os genes de cadeia leve e pesada, variáveis, foram quimicamente sintetizadas. Os genes foram designados de tal modo que as regiões CDR são idênticas às sequências enquadradas nas Figuras 2 © o enquanto que as regiões FR são derivadas de um anticorpo humano chamado WEA (ΘοΓίχ, F. , s Frangione. 8.„ Proc., Natl. ftcad,. 3ci. EUA 80, 4837-4841, 1983),, As sequências de sinal são derivadas de sequências de consenso das famílias de genes νχγ e As cadeias do anticorpo WEA são representativas destas famílias, sintetizaram-se, e montaram-se em 9 secções, cinquenta e oito oligodesoxiribonucleótidos variando, em tamanho, de 25 a 43 nucleótidos. Os terminais 5* cios oligonucleótidos uma secção foram fosforilados em 5’ (com excepeão dos dois oligonucleótidos mais exteriores) desnaturação/renaturação e ligados em Mlómpll,, De todas as secções foram seleccionados elones de ADN PP por análise das sequências,. Os fragmentos de ADN foram purifioados por electroforese em poliacrilamida gel e ligados para. 'formar as sequências da região variável intactas. Realisou™ -se a construção dos genes da imunoglofoulina completos, a inserção num vector e a transfecção em células de ovário do enceto chinês, tal como descrito no exemplo anterior,,

Claims (7)

1. -16” 70 281 0Α/2692-478 rftvINPIC A......£......0_E......S 1 - Processo para a preparação de um polipéptido com actívidade de ligação a hCG (gonadotrofina do corion humano), caractôrixado por se produzirem um ou mais dos seguintes fragmentos (i) arq-ala- -SER- -GLU- -SER-VAL- -ASP~ •ASN-ASN· -GLY-ILE· -SER- -PHE- "ΉΙ” T -ASNÍ5 c i i ) ALA--ALA- -SER- -ILE- -GLN-GLY- -SER, (III) QLN-GLN* «“[f -LYS- -GLU-VAL- -PRO PRO-THR (iv) ASP-TYR- -fiSKl· -MET- -his; C v) TYR-ILE- ~TYR" "PR0- -TYR-SER- -GLY- PRO-THR “GLY-TYR- “ASM- -GLN- -ARG ~PHE~ASN~SERS C vi) glu-qly-ile-phe-tyr-thr-met-asp-tyr. « se integrarem estes fragmentos num polipéptido maior nas posições conformacionais correctas.
2. 2 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos fragmentos serem produzidos sinteticamente,,
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado P°r os fragmentos serem produzidos usando técnicas de ADN recombinante.
4. 4 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações Pr©cedentes, caracterizado por se produzir um polipéptido maior '•ísanclo técnicas de ADIM recombinante.
5. 5 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações um ou 3, caracterizado por se produzir sinteticament Polipéptido maior.
6. 6 ~ Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações ant er X ΟΓ SS „ Pei o menos- i:.r ê s regiõe '•"'S £ r u 0 Uí iâ j w r.·. m v. * a veis ê regiões v Atáveis é um fragmento de acordo com a reivindicação 1„ -17- 0A/2692-478
7. 7 - Processo para a preparação de um polipêptido com actividade de ligação a hCQ, caracterizado por compreender os seguintes passoss par: a com a) clonar num vector uma sequência de ADN que codifica um polipêptido de acordo com a reivindicação í, em conjunte elementos de controlo de expressão adequados; b) expressar o vector numa célula hospedeira, e c) produzir e isolar o polipêptido com actividade ds ligação a hC6* .isboa. 2-f. fr,u Por AKZO N V