JPH02154696A - 新規キメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、ヒトのガン胎児抗原（ＣＥＡ）に高い特異性
および親和性を有するマウス／ヒトキメラモノクローナ
ル抗体、その誘導体、それら加俸および誘導体の調製方
法、前記抗体の重鎮および軽鎖をコードするＤＮＡ　、
前記ＤＮＡのｆｆ１ｍ方法、前記抗体を生産しそして分
泌する哺乳類細胞系、前記細胞系の調製方法、前記キメ
ラモノクローナル抗体およびそれらの誘導体のガン診断
および治療への利用、前記キメラモノクローナル抗体を
含むテストキット、並びに前記抗体を含む医薬５ＪＥＩ
　Ｗ物に関する。

〔従来の技術〕

免疫グロブリン（抗体）は、哺乳類の免疫機構において
重要な役割を果たす、これらはプラズマ細胞により生産
され、そしてジスルフィド結合により結ばれた２本の等
しい軽いポリペプチド鎖（Ｌ鎖）および２本の等しい重
いポリペプチド鎖（Ｈ鎖）、またはこの基本的な４本鎖
単位のポリマーから成る。軽鎖にはにまたはλのタイプ
があり、重鎖にはμ、δ、Ｔ、αまたはεのタイプがあ
る。重鎖は可変（Ｖ）領域および定常部（Ｃ）領域から
成る０個々の抗体に特異性を有し抗体種ごとにかなりの
配列相違性を示すＶｅＪｉ域は、比較的保存されている
部分、いわゆるフレームワータ領域（ＦＲｓ）によりフ
ランクされた、高可変部分、いわゆる高可変領域または
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）から成る。

抗体は二価性分子である。一方では、Ｈ鎖およびＬ鎖ポ
リペプチドのＮ端の可変セグメントが非常に特異的な且
つ独特な方法において共に関与して、抗原、即ち生体に
より外来物として認識されそして免疫応答を誘導する分
子、上の特定の化学的動因（エピトープ）に対してユニ
ークな親和性を有する三次元構造を形成する。そのよう
なエピトープは、低分子量の分子（ハブテン）または、
タンパク質、炭水化物および糖タンパク質のような巨大
分子の化学構造の一部、例えば細胞表面抗原であること
ができる。

免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のユニークな抗原結合特性
は、Ｂ細胞の分化初期、例えば胚形成期の間のＨ鎖およ
びＬ鎖ジャームライン（ｇｅｒｍｌ　１ｎｅ）遺伝子の
遺伝子組換えに起因する。即ち、数百〇Ｖ上セグメント
うちの１つが少数の連結セグメント（Ｊセグメント）の
うちの１つに連結し、Ｈ鎖遺伝子座の場合にはさらに多
様性セグメント（Ｄセグメント）にも連結して、特異的
な抗原結合特性を有する１つの１８分子をコードする、
全体的にユニークな隣接したＶ−（Ｄ）−Ｊ再配列遺伝
子セグメントを形成する。単純な遺伝子組換えにより起
きる抗体の多様性に加えて、■セグメント遺伝子とＪセ
グメント遺伝子が結合する所の正確な連結がわずかに変
化するであろう。連結反応は種々の塩基対間で起こり得
るし、そして組換え過程の間に付加的なヌクレオチドが
付加され得、ジャームラインにおいてコードされない幾
つかの種々のアミノ酸が可能なＶ−ＪまたはＤ−Ｊ結合
部位に挿入され得る。さらに、単一塩基の体細胞突然変
異もまたＩｇの多様性に寄与する。

ｒｇ分子の構造的特徴のもう１つの鍵は、免疫機構にお
ける分岐した生物学的経路を活性化するそれらの能力で
ある。これらのいわゆるエフェクター機能（相補的結合
、食作用の刺激、マスＨＥＩ胞による顆粒放出の引き金
）は、主としてＨ鎖ポリペプチドのカルボキシ末端の定
常部領域セグメントにあり、これが特定の免疫応答にお
ける抗体の役割を定める種々のＩｇクラス（ＴｇＡ、　
ＩｇＥ、　ＩｇＧ等）のちととなる。

ハイブリドーマ技法の発達は、所望の特異性のモノクロ
ーナル抗体を産生ずる連続細胞系、主としてネズミのハ
イブリドーマを生み出すことを可能にした。これは、生
物学的に重要な分子を同定し、単離しそして特徴づける
のに利用され得る。

しかしながら、生体内診断薬および治療薬としてのネズ
ミ由来のモノクローナル抗体の利用における主な制限は
、外来タンパク質としてのそれらの免疫原性、循環中の
それらの多少長い持続性、および損害を与える免疫複合
体の形成である。他方、ヒトのモノクローナル抗体での
処置も、ヒトのバイブリドーマ細胞系がめったに入手で
きず、−ａに不安定であり、そして十分な量において且
つほどほどのコストで適切な特異性のモノクローナル抗
体を製造できないため、限定される。

有望な改良は、組換えＤＮＡ技術を使うことによる免疫
グロブリン遺伝子の修飾である。免疫原性を減少せしめ
そして望ましくない免疫応答を回避せしめる１つのアプ
ローチは、例えば、ネズミのモノクローナル抗体の利点
および選択性を有しその上さらにヒト抗体の種特異性を
有するキメラ抗体の生産である。

キメラ遺伝子の組み立ておよびキメラ抗体の生産に適用
できる全ての方策は、組換えＤＮＡ技術の標準手順（Ｉ
ｇ遺伝子の同定および単離、クローン化された該遺伝子
のベクターへの挿入、永久細胞系中へのトランスフェク
ション、キメラタンパク質の発現）を包含する０組み合
わされる該遺伝子の由来および抗原特異的可変領域をコ
ードしている遺伝子の性質に依存して特定の問題が生じ
、そのため新たな且つ独創的な段階が、実行できる解決
策を発見するために要求される。

幾つかの研究グループは、キメラ抗体を操作することを
既に試みている。しかしながら彼らの研究口約は構想ア
プローチにおいて異なり、そしてその研究結果は該組換
え分子の性質および特徴に関してかなり異なっている。

幾つかの免疫グロブリンクラスのキメラ抗体は既に製造
されている。

Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　３１４．２６８
．　１９８５）　　は、Ｈ鎖が、ハプテンの４−ヒドロ
キシ−３−二）ｌ：１７エナセチルー（ＮＰ）に対し特
異的なマウス可変領域と融合されたヒトε定常部領域か
ら成る、キメラＩｇＥλ１抗体を記載している。酸キメ
ラ抗体の生産において使用された方策は、Ｈ鎖をコード
するキメラ遺伝子を作製し、そしてこのキメラＤＮＡセ
グメントをＪ５５８Ｌマウス細胞系に導入してその中で
発現されるキメラＨ１Ｊ（が内在性マウスＬ鎖と組み合
わされて完全なＩｇＥ分子が生産されるというものであ
る。

Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら（Ｎａｔｕｒｅ　３１２　６４３
．１９８４）は、抗−ＴＮＰマウスミエローマからのＨ
鎖およびＬ鎖の可変領域をヒトのμおよびに遺伝子それ
ぞれと連結させることに成功した。該キメラ遺伝子はミ
エローマ細胞にトランスフエクトされた。しかし、分泌
されたＩｇＭはもとのマウスｒｇ１はどには効果的でな
く、そして異なる結合特性を示した。

ヒトのＴ定常部遺伝子をネズミの可変部遺伝子と連結せ
しめることによるキメラ免疫グロブリンＧの生産は、様
々な著者により記載されている。

特許出願Ｗ０８？１０２６７１は、ウィルス抗原に結合
するキメラ抗体、特にヒト１Ｉｇ域とマウスミエローマ
ＣＲＬ　８０１７からの可変領域とから作製された、Ｂ
型肝炎表面抗原に結合するキメラ抗体を記載している。

その著者らは、Ｌｉｕら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　Ｌ　１．
　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　８４．３４３９．１９８７）が行ったように
、マウスのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｔ６を基にし
たマウス／ヒトのキメラ抗体も作製した。ＭＡｂ　Ｔ６
　（ＩｇＧ２ａ（に）〕は、種々のヒトのガン腫由来の
細胞の表面に見出される炭水化物抗原に結合する。前記
著者らは、ヒトの結腸ガン細胞系Ｃ−３３４７について
正確なデータを提供している。可変領域または定常部領
域のドメインをコードするｃＤＮＡモジュールを組換え
ることにより、ＭＡｂ　Ｔ６の７２ａおよびに定常部領
域がヒトのＴ１および人定常部領域により置換された。

ヒ１−のガンの表面抗原に向けられる別のキ、ノラモノ
クローナル抗体がＳａｈａｇａｎら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
１、　１３７１０６６、１９８６）により作製された。

彼らは、ネズミのハイプリドーマ細胞系Ｂ６，２のＩｇ
Ｇ　１抗体からの可変領域のエキノンをヒトのγｌ／に
遺伝子と融合させた。キメラＩｇについての結合特性は
ヒトの肺ガン細胞系Ａ３４９．Ｅ　１を用いて決定され
た。

Ｓｕｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　
８４．２１４．１９８７）は、マウスハイブリドーマ１
０８３−１７−Ａにより生産される抗−結腸直腸ガン（
ＡＣＲＣ）抗体のＨ鎖／Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮ
Ａ断片をヒトのｒ３／Ｃに領域と結合せしめた。

本発明の主題であるキメラＭＡｂは、ガン胎児抗原（Ｃ
ＥＡ）に対して向けられる。ＣＥＡは、１８０．０００
の分子量を有し内胚葉由来の消化器系上皮および胎児の
結腸の腺ガンにおいて見出される、免疫反応性の？ｊ［
雑な塘タンパク賞である。再発性の陽気または治療に対
する反応についてガン患者を連続的に診断および監視す
るためのＣＥＡイムノアッセイの役割は広く評価されそ
して文書で証明されている。上記の口約のために抗−Ｃ
ＥＡ抗体を利用することの主要な欠点の１つは、幾つか
の明らかに正常な成人組織に対するこれら試薬の交差反
応性であった。

抗血清が種々のタイプのガン並びにＣＥＡ関連抗原、例
えば非特異的交差反応性抗原ＮＣＡ　、腫瘍抽出された
ＣＥ＾関連抗原ＴＥＸ　、種々の正常糞便抗原（ＮＰＡ
１、　ＮＦＡ２）、胆汁の糖タンパク質１１並びに正常
の結腸粘膜、肺臓、肝臓、肺、汗腺、多形核白血球およ
び明らかに正常な個体の単球中に見出される他のもの（
総合的考察については、ＨｅｒｂｅｒｍａｎおよびＭｃ
ｌｎｔｉｒｅ、’　”Ｉｎ＋ｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉ
ｓ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　。

Ｖｏ１、９．　ｐａｒｔ　１．　Ｎ、Ｙ、、　１９７９
を参照のこと）と交差反応することを示した。これは、
前記抗血清がＣＥＡだけに特異的なエピトープ並びにＣ
ＥＡおよびＣＥＡ関連抗原上に存在するエピトープを認
識することを意味する；それは、ＣＥＡおよびＣＥＡ関
連抗原の遺伝子間の宙接な関連性並びにそれらの幾つか
の間のプレカーサー生成物の関連性をさらに示唆する。

ポリクローナル抗体（ウサギ、ヒツジ）がＣＥＡ中の１
０−１５の抗原部位を認識することが示唆されている（
Ｓｕｎｄｂｌａｄら、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏ１、　
Ｆｌｕｉｄｓ　２Ｃ４３５、１９７６）。そのエピトー
プは、ＣＥＡのペプチド成分上に優先的に存在し、そし
て強度にコンホメーション依存性であると思われる。モ
ノクローナル抗体を使って、ＣＥＡにおいて少なくとも
５つの異なるエピトープが検出された（Ｈｅｄｉｎら、
Ｍｏｌ。

Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．２３．１０５３．１９８６）　。

抗−ＣＥ＾モノクローナル抗体は、既にキメラ抗体の生
産に使用されている。特許出願ＥＰ　０１２５０２３に
おいて、ハイプリドーマ細胞系ＣＥＡ、６６−Ｅ３から
由来するＩｇｒｌ抗体が利用されている。該キメラ抗体
は、エピトープ特異性または交差反応性に関して特徴づ
けられておらず、また結合および阻害データもともに含
まれていない。その発明者らは、Ｄ　Ｎ　Ａ　断片のク
ローニングおよび該キメラ遺伝子の発現へのＥ、コリの
利用を記載している。しかしながら、原核細胞は機能的
な四足体の抗体の生合成のために必要な段階、例えば新
生ポリペプチド鎖の正確な折りたたみ、グリコジル化お
よび集合を提供しないということがよく確証されている
。

ＥＰ　Ｏ１２５０２３の発明者等は、その特許明細書の
手引きに従って調製した時、Ｅ、コリが共に生産する、
もとのマウス抗体のためのＩｇＧ　Ｈ鎖およびＬ鎖にお
いては、検出可能な抗体活性が全く認められないという
ことを記載している。その明細書は、哺乳類細胞をも包
含する多数の可能な宿主を挙げているが、これらの示唆
は例により実証されていない。前掲の特許出願における
キメラ抗体の生産への概念的アプローチは、それ故、組
換え遺伝子構成物の発現のだめの基盤を欠き、従って活
性なモノクローナル抗体の分泌のための基盤を欠いてい
る。

Ｃ発明の目的） 本発明の目的は、新規なキメラモノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂｓ）の作製であり、このＭＡｂｓは、・ネズミの可
変領域およびヒトの定常部領域の決定基を有し、 ・ヒトのガン胎児抗原に特異的に結合し、・免疫化され
た哺乳類細胞系において高レベルで生産され、 ・診断および療法の目的に利用され得る。

ＣＥＡ分子の複雑な抗原構造から考えて、望ましいキメ
ラ抗−ＣＥＡ　ＭＡｂは、次のような特徴を有するだろ
う： ＣＥＡに対する高親和性、 ・生体外および生体内の両方における、ＣＥＡを担持し
ているガン細胞への高い比率の結合性、・正常の組繊お
よび細胞への低い比率の結合性または非結合性。

Ｃ具体的な記載〕 本発明は、マウス由来の可変領域およびヒトの定常部領
域から成り、ヒトのガン胎児抗原（ＣＥＡ）を認識する
キメラモノクローナル抗体およびその誘導体に関する。

本発明は特に、非特異的交差反応性抗原ＮＣＡ、例えば
ＮＣＡｓａおよびＮＣＡ　ｑ　ｓ　（Ｂｕｃｈｅｇｇｅ
ｒら、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　３３．６４３．１９８４）上、胆汁の糖
タンパク賞上または顕粒球上に存在しないＣＥＡのエピ
トープを認識するキメラモノクローナル抗体およびその
誘導体に関する。

好ましいのは、ヒトＣＥＡに対して少なくとも２、ｌＸ
１０”リットル１モルの親和力を有するキメラモノクロ
ーナル抗体およびその誘導体である。

キメラモノクローナル抗体の生産のために、それぞれが
可変領域および定常部領域を含んで成るキメラ軽鎖およ
びキメラ重鎖が別々に作製され、それ数本明細書におい
ては各キメラ構成物の可変領域を特に重視することで区
別される。

本発明の好ましいキメラモノクローナル抗体およびその
誘導体は、弐Ｉの軽鎖可変領域を含んで成ることを特徴
とする。

上式中、ＦＲ，は２３−２８個の天然に存在するアミノ
酸を含んで成るポリペプチドであり、Ｆｌ？２は１４−
１６個の天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプ
チドであり、ＦＲ３は３０−３４個の天然に存在するア
ミノ酸を含んで成るポリペプチドであり、そしてＦＲ，
は９−１１個の天然に存在するアミノ酸を含んで成るポ
リペプチドであり、アミノ酸Ｃｙｓは酸化状態において
Ｓ−３架橋を形成していることがある。特に好ましいも
のは、フレームワーク領域ＦＲ＋、ＦＲｚ、　ＦＲ３お
よびＦＲ４のポリペプチド残基が好ましくは哺乳類、特
にネズミの抗体中に存在するものである弐Ｉの軽鎖可変
領域を含んで成る、キメラモノクローナル抗体およびそ
の誘導体である。

最も好ましいのは、ＦＲ，が次の式： ％式％ （式中、Ａは水素原子、アシル基、またはＡｌａ−Ｓｅ
ｔ−Ａｒｇ、　Ｓｅｒ−ＡｒｇもしくはＡｒｇ残基であ
り、特に水素原子である）のポリペプチド残基であり；
ＦＲ２が次の式： ％式％ のポリペプチド残基であり； Ｆｌ？３が次の式： ％式％ （：） のポリペプチド偕基であり；そして ＦＲ４が次の式： ％式％ のポリペプチド残基であり；そして アミノ酸Ｃｙｓが酸化状態においてＳ−３架橋を形成し
ていることがある、式■の軽鎖可変領域を含んで成る、
本発明に係るキメラモノクローナル抗体およびその誘導
体である。

本発明はまた、ＦＲ＋、　ＦＲＹ、　ＦＲ：ｌおよびＦ
Ｒ４がそれぞれ式ＩＡ、ＴＢ、ＩＣおよびＩＤのポリペ
プチド残基テあり、ＣＤＲＩＬ、　ＣＩＩＲ２Ｌおよび
ＣＤＲ３Ｌ　（７）外側の１個または複数の、例えば１
，２．３または４個の単＝アミノ酸が別のアミノ酸によ
り置き換えられており、そしてアミノ酸Ｃｙｓが酸化状
態においてＳ−５架橋を形成していることがある、式■
の軽鎖可変領域を含んで成る、キメラモノクローナル抗
体およびその誘導体に関する。

本発明の好ましいキメラモノクローナル抗体およびその
誘導体は、次の弐■の重鎖可変領域を含んで成ることを
特徴とする。

は酸化状態においてＳ−３架橋を形成していることがあ
る。特に好ましいのは、フレームワーク領域ＦＲＹ、　
ＦＲＹ、　ＦＲＩおよびＦＲｌのポリペプチド残基が好
ましくは哺乳類、特にネズミの抗体中に存在するもので
ある式■の重鎖可変領域を含んで成る、キメラモノクロ
ーナル抗体およびその誘導体である。

最も好ましいのは、ＦＲｓが次ノ式： ％式％ 上式中、ＦＲ，は３２−３６個の天然に存在するアミノ
酸を含んで成るポリペプチドであり、ＰＨ４は１４−１
６個の天然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプチ
ドであり、ＦＲ，ｔは３２−３４個の天然に存在するア
ミノ酸を含んで成るポリペプチドでありそしてＦＲ，は
１２−１４個の天然に存在するアミノ酸を含んで成るポ
リペプチドであり、そしてアミノ酸Ｃｙｓ（式中、Ｂは
水素原子またはアシル基であり、特に水素原子である）
のポリペプチド残基であり；ＦＲ，が次の式： ％式％ のポリペプチド残基であり； ＦＲ？が次の式： ％式％ のポリペプチド残基であり； ＦＲｏが次の式： ％式％ のポリペプチド残基であり：そして アミノ酸Ｃｙｓが酸化状態においてＳ−３架橋を形成し
ていることがある；式■の重鎮可変領域を含んで成る、
本発明に係るキメラモノクローナル抗体およびその誘導
体である。

本発明はまた、ＦＲ５、ＦＲ６，ＦＲ７およびＦＲ，が
それぞれ式ＩＩＡ、ＩＩＢ　、ｎｃおよびＩＩＤのポリ
ペプチド残基であり、ＣＤＲＩＨ，ＣＤＲ２ＨおよびＣ
ＤＲ３Ｈの外側の１個または複数個の、例えば１，２．
３または４個の単一アミノ酸が別のアミノ酸により置き
換えられており、そしてアミノ酸Ｃｙｓが酸化状態にお
いてＳ−３架橋を形成していることがある、式■の重鎮
可変領域を含んで成る、キメラモノクローナル抗体およ
びその誘導体に関する。

式ＩＡの軽鎖可変領域および式１１Ａの重鎖可変領域は
、アシル基、例えばホルミル基またはアルカノイル基、
例えばバルミトイル基、ミリストイル基または低級アル
カノイル基、例えばアセチル基またはプロピオニル基を
含んでいてもよい。

ｒｇ分子のクラスは、前に指摘したようにＨ鎖およびＬ
鎖の定常部領域により定義される。本発明のキメラモノ
クローナル抗体は、いずれの免疫グロブリンクラスのも
のであってもよく、即ちｔｇ＾、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、
　ＩｇＧまたはｒｇＭ　（７）もノテアッテモよい。本
発明に係る優先的なキメラモノクローナル抗体は、にま
たはλのヒト軽鎖可変領域、特ににの定常部領域、およ
びｒ１、ｒ２．γ３またはγ４のヒト重鎖可変領域、特
に１４の定常部領域を含んで成るクラスＧの免疫グロブ
リンである。

本発明は、前記の好ましい意味を有する式Ｉの軽鎖可変
領域（アミノ酸Ｃｙｓは酸化状態においてＳ＝Ｓ架橋を
形成していることがある）、軽鎖ヒト定常部領域に、前
記の好ましい意味を有する式■の重鎖可変領域（アミノ
酸Ｃｙｓは酸化状態においてＳ−８架橋を形成している
ことがある）および重鎮ヒト定常部領域Ｔ４を有する、
キメラモノクローナル抗体およびその誘導体に優先的に
関する。

本発明に係るキメラモノクローナル抗体の誘導体は、例
えば、ＣＥＡ分子の抗原決定基に対するそれらの特異性
を保有している断片、例えば−価のＦａｂ断片および二
価のＦ（ａｂ’　）ｚ断片、該キメラモノクローナル抗
体と酵素、蛍光マーカー、金属キレート、細胞増殖抑制
性物質または細胞毒性物質、アビジンビオチン等との接
合体、並びに放射能ラベル化抗体である。

本発明の抗体接合体に利用される酵素は、例えば、西洋
ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレイン酸デヒ
ドロゲナーゼ、またはグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼである。

キメラ抗体と接合される蛍光マーカーは、フルオレセイ
ン、フルオロクロム、ローダミン等である。

そのような接合体においては、該抗体は直接的にまたは
スペーサーもしくはリンカ−基を介して、酵素または蛍
光マーカーと結合されている。

金属キレートについての例は、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰ
ＴＡ）、１．４，８．１１−テトラアザテトラデカン、
１，４．８．１１−テトラアザテトラデカン−１，４，
８，１１−テトラ酢酸、■−オキサー４゜７．１２．１
５−テトラアザヘプタデカン−４，７゜１２　、１５−
テトラ酢酸等である。キメラ抗体との結合に適用できる
細胞増殖抑制物質は、例えば、アルキル化する物質、例
えばメクロルエタミン、トリエチレンホスホラミド、シ
クロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル
、ブスルファン、メルフアランまたはトリアジクオン、
さらにニトロソウレア化合物、例えばカルムスチン、ロ
ムスチンまたはセムスチンである。使用される代謝拮抗
物質は、例えばメトトレキセート、メルカプトプリン、
シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、ま
たはフトラフルである。細胞増殖抑制物質のさらなる群
は、ビンブラスチンおよびビンクリスチン、並びに成る
種の抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノルビ
シン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、ミドマイシ
ン、ストレプトニグリン、ミドマイシンおよびプレオマ
イシンである。さらに適切な細胞増殖抑制物質は、例え
ば、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、Ｌ−アスパラ
ギナーゼ、ダカルバジン、ミドクン、エストラムスチン
、またはポドフィロトキシンである。さらなる細胞増殖
抑制剤は、ホルモン類またはホルモン拮抗物質、例えば
、コルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、プロゲ
スチン類、例えばヒドロキシプロゲステロンまたはメト
ロプロゲステロン、エストロゲン類、例えばジエチルス
チルベストロール、抗エストロゲン頚、例えばクモキシ
フェン、アンドロゲン類、例丸ばテストステロン、およ
びアロマターゼ■害物質、例えばアミノグルテチミドで
ある。

キメラモノクローナル抗体と細胞毒性物質との接合体は
、毒素そのまま又はそれから誘導されるＡ鎖のどちらか
を含む。抗体との結合に適する毒素は、特に、幾つかの
レクチン類、例えばりシンまたはアブリン、またはジフ
テリア毒素Ａ、等である。

放射能ラベル化キメラモノクローナル抗体は、例、ｔ　
ハ、放射性ノコウ素（１２３１、１２５１、１ｆｆｌ　
■）、イツトリウム（”Ｙ）、テクネチウム（”’Ｔｃ
）、等である。

本発明に係るキメラモノクローナル抗体およびその誘導
体は、それ自体既知である方法により調製され、その方
法は、そのようなキメラモノクローナル抗体を産生ずる
下記に定義されるような哺乳類細胞において既知の方法
に従って生体外または生体内で増殖せしめ、そして所望
であれば、生じたモノクローナル抗体をその誘導体に変
換することを特数とする。

生体外での増殖は、適当な培地、常用の標準的な培地、
例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ
）またはＲＰ？ｌ１１６４０培地中で行われ、これは所
望により哺乳類の血清、例えばウシ胎児血清、または微
量要素および増殖維持補足要素、例えば支持細胞、例え
ば正常のマウス腹腔滲出細胞、肺臓細胞、骨髄マクロフ
ァージ等により補充されている。

抗体産生細胞が下記に詳細に記載される選択マーカーを
保有している場合、過剰増殖している産生細胞から正常
細胞を保護するために、該培地は選択的培地、例えばＧ
４１８またはキサンチン、ヒポキサンチン／チミジンお
よびミコフェノール酸を含有する培地で補充されてもよ
い。

生体外における生産は、大量の所望の抗体を与えるため
にスケールアップすることが可能である。

組織培養条件下での哺乳類の細胞培養のための技術は当
業界において既知であり、そして例えばエアーリフト反
応器または連続撹拌反応器中での均一４４培養、または
例えば中空ファイバー中、ミクロカプセル中、アガロー
スミクロビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上に
固定化もしくは封入された細胞培養を包含する。

該細胞培養物の上清は、好ましくはエンザイムイムノア
ッセイ、例えばドツト−アッセイ、またはラジオイムノ
アッセイを用いて所望するモノクローナル抗体について
スクリーニングされる。

酸キメラモノクローナル抗体の単離のために、初めに培
養上清中の免疫グロブリンを例えば硫酸アンモニウムに
よる沈澱、ＰＥＧのような吸湿性物質に対する透析、選
択膜を通す濾過等により、濃縮する。必要および／また
は所望であれば、濃縮された該抗体を常用のクロマトグ
ラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィ−ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー
または（免疫−）アフィニティークロマトグラフィーに
より、精製する。

細胞を生体内で増殖せしめることにより、大量の所望す
るキメラモノクローナル抗体を得ることができる。この
ために、組織適合性および／または寛容性のｒｇ−産生
細胞系からの細胞クローンを同系の噛？Ｌ１に注入して
抗体産生腫瘍の発達を誘発する。所望により、注入前に
その哺乳類に炭化水素、特にブリスタン（テトラメチル
ペンタデカン）のような鉱油を与える。１−３週間後、
それら哺乳類の体液から該抗体を単離する。例えば、所
望するキメラモノクローナル抗体を産生するＢａ１ｂ／
ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞を、所望によりブリ
スタンのような炭化水素で前処理されているＢａｌ　ｂ
　／　ｃマウスに腹腔内注射し、そして８−１０日後、
これらの動物から腹水を取り出す。そこから、上記に与
えられた常法により該キメラモノクローナル抗体を単離
する。

ヒトのＣＥＡに対する特異性を保持しているキメラモノ
クローナル抗体の断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’
　）ｚ断片は、前述のようにして調製されたキメラモノ
クローナル抗体から、それ自体既知の方法により、例え
ば過当なＩｇをコードするエキノンの遺伝子操作により
、パパインもしくはペプシンのような酵素での消化によ
り、そして／または化学的還元によるジスルフィド粘合
の開裂により、得ることができる。

本発明のモノクローナル抗体の接合体は、当業界におい
て既知の方法により、例えば前述のようにして調製され
たモノクローナル抗体を縮合剤、例えばグルタルアルデ
ヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ。

Ｎ′−０−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイ
ミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−（３−（
２’−ピリジルジチオ）プロピオンオキシ〕スクシンイ
ミド、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドまたはその種の他のものと反応せしめ
ることにより、調製される。アビジンとの接合体も同様
にして調製される。ビオチンとの接合体は、例えばモノ
クローナル抗体をビオチンの活性エステル、例えばビオ
チンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応せ
しめることにより調製される。蛍光マーカーとの接合体
は、縮合剤、例えば上に挙げたものの存在下で、または
イソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソ
チオシアネートと反応せしめろことにより調製される。

本発明のキメラ抗体と細胞増殖抑制性／細胞毒性の物質
および金属キレートとの接合体も同様にして３ＩＩ　Ｍ
される。

ヨウ素（＋２：ＩＪ　、　１２Ｊ　、　Ｉｌｌ　ｌ）　
テ放射能うヘル化されたキメラモノクローナル抗体は、
それ自体既知のヨウ素化法により、例えば放射性のヨウ
化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムおよび化学的酸化
剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴもしく
はその他のもの、または酵素的酸化剤、例えばラクトペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコ
ースを用いて、本発明に係るモノクローナル抗体から得
られる。本発明に係るキメラモノクローナル抗体は、例
えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）−キ
レート化により、イツトリウム（”Ｙ）と結合される。

テクネチウム−９９ｍラベル化キメラ抗体は、リガンド
交換法により、例えば過テクネチウム酸塩（ＴｅＯ２−
）を第一スズイオン溶液で還元し、還元されたテクネチ
ウムをセファデックスカラム上にキレート化し、そして
このカラムに該抗体を通用することにより；または、直
接ラベル化技術により、例えば過テクネチウム酸塩、５
ｎＣｊ！２のような還元剤、フタル酸ナトリウム−カリ
ウム溶液のような緩衝溶液および該抗体をインキュベー
トすることにより、調製される。

本発明はまた、前述のヒ）　ＣＥＡに特異的なキメラモ
ノクローナル抗体の、ネズミの軽鎖可変領域および／ま
たはネズミの重鎮可変領域をコードする挿入部を含んで
成る組換えＤＮＡに関する。定義により、そのようなり
ＮＡは、コードしている一本鎖ＤＮＡ　、前記のコード
しているＤＮＡとそれに相補的なりＮＡとから成る二本
ｊＪ（ＤＮＡ　、またはそれらの相補的（−本！１）Ｄ
ＮＡそれだけを含んで成る。

特に本発明は、細胞系ＣＥ２５のゲノムＤＮＡから由来
する、ヒトＣＥＡに特異的なネズミ軽鎖可変領域をコー
ドする挿入部を含んで成る、組換えＤＮＡに関する。該
細胞系ＣＥ２５は、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの肺臓のＢリン
パ球とミエローマＰ３−ＮＳ２／ｌＡｇ４からの細胞と
の融合により生まれたものであり、そしてに軽鎖および
Ｔ１重鎖を有するネズミの抗−ＣＥＡ抗体を生産する。

好ましいのは、任意にイントロンを含有する、式■のポ
リペプチドをコードする挿入部、特にＦＲＹ。

ＦＲ，、ＦｌｈおよびＦＲ４がそれぞれ式ＩＡ、ＩＢ。

ＩＣおよびＩＤのポリペプチド残基であり任意にイント
ロンを含有する、式■のポリペプチドをコードする挿入
部である。

そのような好ましい組換えＤＮＡの一例は、下式の挿入
部を含んで成る組換えＤＮＡである。

＋２１ ＡＧλへｉ”−ＡＴＧＴＣττ丁Ｇτ、ＡＧＧＣＡ、Ａ
ＴＣＣＡＧＡＡτττＣＴＴＡＴ丁丁ＣττＧＣＴＡＡ
ＴＧｋ”スＴＣＴＣＣτＣＡ＋　４２０ ！ 丁 （ＨＩ） ！ Σ １０６９−１１０２　、１１４７−１１６７および１２
６３−１２９１位それぞれから外側の弐■のヌクレオチ
ド配列において１個または複数個、例えば１０個まで、
の単一のヌクレオチドが別のヌクレオチドにより置き換
られている式■の挿入体を含んで成る組換えＤＮＡもま
た好ましい。

特に本発明は、細胞系Ｃ［Ｅ２５のゲノムＤ　Ｎ　Ａか
ら由来する、ヒＩ−ＣＥＡに特異的なネズミの重鎮可変
領域をコードする挿入体を含んで成る、組換えＤＮＡに
も関する。

好ましいのは、任意にイントロンを含有する、式■のポ
リペプチドをコードする挿入部、特にＦＲｌ。

ＦＲ，、ＦＲ，およびＦＲ，がそれぞれ式ＩＩＡ、　Ｉ
ＩＢ　。

■ＣおよびＩＩＤのポリペプチド残基であり任意にイン
トロンを含有する、式ｎＡのポリペプチドをコードする
挿入部である。

そのような好ましい組換えＤＮＡの一例は、下式の挿入
部を含んで成る組換えＤＮＡである。

ＡＡＯＣＴＴＧＴＴＣＴＧτ丁ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧ
ＡＣＧＣＡＡＡＣＴ　ＡＡＡＣＴＧ、ＡＧＴＡ丁ＧＣＴ
ＧＡＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣ（ＩＶ） ５７５−５９５．６２９−６８０および７７６−８０５
位それぞれから外側の弐■のヌクレオチド配列において
１個または複数個、例えば１０個までの単一ヌクレオチ
ドが別のヌクレオチドにより置き換えられている弐■の
挿入部を含んで成る組換えＤＮＡもまた好ましい。

完全な四量体の免疫グロブリン分子の集合および活性な
抗体の発現のためには、軽鎖および重鎮の可変領域をコ
ードする組換えＤＮＡ挿入部が、対応する軽鎖および重
鎖の定常部領域をコードするＤＮＡと融合され、次いで
ハイブリッドベクター中に組み込まれ、そしてそれらハ
イブリッドベクターの助けで適当な宿主細胞中に移入さ
れる。

それ故、本発明は、ヒトの定常部領域にまたはλと融合
された、ヒトＣＥＡに特異的な軽鎖のネズミ可変領域を
コードする挿入部を含んで成る、徂換えＤＮＡにも関す
る。好ましいのは、ヒトの定常部領域にと融合された前
述の好ましいネズミの可変領域をコードする組換えＤＮ
Ａである。

同様に本発明は、ヒトの定常部領域γ、例えばγ１．γ
２．Ｔ３またはγ４と融合された、ヒトＣＥＡに特異的
な重鎮のネズミ可変領域をコードする挿入部を含んで成
る、組換えＤＮＡに関する。好ましいのは、ヒト定常部
領域Ｔ４と融合された前述のような好ましいネズミ可変
領域をコードする組換えＤＮＡである。

さらに本発明は、所望により発現の調節配列に連結され
た、前述のようなネズミ／ヒトキメラ軽鎖をコードする
挿入部および／または前述のようなネズミ／ヒトキメラ
重鎮をコードする挿入部、完全なレプリコン並びに１個
もしくは複数個の優性マーカー配列を含んで成る、ハイ
ブリッドベクターである担換えＤＮＡに関する。

前記マーカーは、該ベクターを保有する宿主の選択を可
能にする。選択マーカーは、重金属、例えば銅、抗生物
質、例えばＧ−４１８（ゲネテシン、ネオマイシン誘導
体）もしくはヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺
伝子、または宿主細胞の遺伝的損傷、例えばチミジンキ
ナーゼ、ヒボキサンチンホスホリルトランスフェラーゼ
、ジヒドロ葉酸レダクターゼ等の欠損を補完する遺伝子
を包含する。加えて、ハイブリッドベクターは、所望に
よりシグナル配列、構造遺伝子の挿入に利用できる１個
もしくは複数個の制限部位、エンハンサ−および／また
は発現調節配列を含有する。宿主の性質に応じて、非常
に様々な転写および翻訳の調節配列を使用することがで
きる。好ましいベクターは、哺乳類宿主に適するもので
あり、そしてウィルスの複製系、例えばシミアンウィル
ス４０（ＳＶ　４０）　、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ
）　、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ
）　、パボバウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）　、または
マウスおよびヒトのシミアンウィルス（ＣＭＶ）に基づ
くものである。また、該ベクターは、哺乳類の発現生成
物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン等からのプ
ロモーター、または正常に免疫グロブリン遺伝子配列と
組み合わされている生来のプロモーターおよび調節配列
を含んでいてもよい。エンハンサ−は、ウィルス起源、
例えばＳＶ４０のようなシミアンウィルス、ポリオーマ
ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルスもしくはモロニー肉腫ウ
ィルス由来のＤＮＡ配列、またはゲノム、特にネズミ起
源（マウスＩｇエンハンサ−）のＤＮＡ配列を転写−促
進する。複製開始点は、外来の複製開始点、例えばＳＶ
４０由来または他のウィルス源のものを包含するベクタ
ーの作製によるかまたは宿主細胞染色体の複製機構によ
るかどちらかで用意される。好ましいベクターの例は、
選択マーカーがＳＶ４０初期プロモーターの支配下に置
かれているようなｐＳＶ−ベクター由来のもの、特に、
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ遺伝子を担持しているｐｓＶ２ｇｐｔ　、およびホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子を担持しているｐＳＶ２ｎ
ｅｏ由来のものである。

軽鎖用および重鎖用のキメラ遺伝子構成物は、２つのベ
クターの助けをかりて、連続的にまたは同時に宿主細胞
に移入される。代わりに、重鎮および軽鎖の両方とも同
一のハイブリッドベクター中にクローン化されそして単
一の構成物として一段階法において宿主細胞中に取りこ
まれる。

所望のキメラモノクローナル抗体をコードする組換えＤ
ＮＡは、例えば、形質転換された宿主を培養することに
より、調製され得る。

特に、そのようなりＮＡは、　　− ａ）適当なハイブリドーマ細胞系からネズミのＤＮＡを
単離し、ＤＮＡプローブを使って、ヒトＣＥＡに対して
向けられるモノクローナル抗体の可変領域をコードする
所望のＤＮＡを選択し、ｂ）ゲノムライブラリーからヒ
トのＤＮＡを単離し、ＤＮＡプローブを使って、モノク
ローナル抗体の定常部領域をコードする所望のＤＮＡを
選択し、Ｃ）段階ａ）およびｂ）のＤＮＡを適当なハイ
ブリッドベクター中に組み込むことによりマウス／ヒト
のキメラ遺伝子を作製し、 ｄ）得られたハイブリッドベクターを受容宿主中に移入
せしめ、そして ｅ’）形質転換された宿主を選択および培養する、こと
により調製され得る。

前述の方法の段階ａ）に記載のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ
の単離または単離されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製
により得ることができる。ゲノムＤＮＡ構成物が遺伝子
の発現を促進するので、ゲノムＤＮＡの調製および利用
は好ましいものである。ハイブリドーマ細胞からのゲノ
ムＤＮＡは、当技術分野において既知の方法により単離
され、その方法は、例えばＴｒｉｔｏｎのような界面活
性剤の存在下で溶解せしめることによる細胞の破壊の段
階、例えばフェノールおよびｃｏｃｘｓ／イソアミルア
ルコールでの処理によるＤＮＡ抽出の段階、およびＤＮ
八−沈澱の段階を包含する。該ＤＮ＾を、便利には１種
または複数種の制限エンドヌクレアーゼ、例えばＸｂａ
　Ｉ　。

Ｂｇｌ　ＩＩ　、　ＥｃｏＲＩ　、旧ｎｄ　ＩＩＩ　＋
　Ｂａｍ）ｌ　Ｉにより断片化し、生じた断片を適当な
キャリヤー、例えばニトロセルロース膜上で複製し、そ
して下記により詳細に記載されるようにして着目のポリ
ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の存在について、
枠に再配列されたＨ鎖およびＬｇＩｇ遺伝子座の存在に
ついて、ＤＮＡブローフ゛でスクリーニングする。この
操作により、ＤＮＡ断片が重鎖のＶ、ＤおよびＪ領域並
びに軽鎖のＶおよびＪ　６Ｎ域それぞれ有する挿入部を
、もしあるならリーダー配列およびイントロンと一緒に
含有することがわかる。

前記の方法の段階ｂ）に記載のヒトゲノムＤＮＡは、適
当なヒトの組織、好ましくはヒトの胎盤またはヒトの胎
児肝細胞から、当技術分野において既知の方法に従って
単離される。確立された手順に従って、適当な制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばＨａｓ　ｍおよびＡｌｕ　Ｉで
の限定消化並びにλＣｈａｒｏｎファージ、例えばλＣ
ｈａｒｏｎ４ａへの組込みにより酸ゲノムＤＮＡからＤ
ＮＡライブラリーを作製する。そのゲノムＤＮＡライブ
ラリーを例えばニトロセルロース膜上で複製し、そして
ＤＮＡプローブを用いて着巨のＤＮＡ配列についてスク
リーニングする。

マウス可変領域またはヒト定常部領域のためのＤＮＡプ
ローブは、合成りＮＡ　、所望の免疫グロブリンをコー
ドするｍＲＮＡから誘導されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ−、また
は既知のヌクレオチド配列のゲノムＤＮＡもしくはＤＮ
Ａ！！Ｉｌｒ片であることができる。好ましくは、ゲノ
ムＤＮＡまたはＤＮＡ断片のプローブが使われる。Ｌ鎖
／Ｈｔ！の可変領域の再配列ｒｇ遺伝子座の検出用のプ
ローブとしては、隣接保存された可変領域または定常部
領域の既知のヌクレオチド配列のＤＮＡ断片が選択され
、これは該ＤＮＡの由来する哺乳類、例えばＢａ１ｂ／
ｃマウスにおけるＬ鎖／Ｈ鎖のＩｇ遺伝子座を構成して
いる。ヒ）　ＤＮＡ配列の検出用のネズミのＤＮＡプロ
ーブの利用は、ネズミとヒトのＤＮＡ間の配列相同性に
基づいている。

ＤＮＡプローブは、標準法を使って、適当な哺乳類の適
当な組繊、例えばＢａ１ｂ／ｃマウスの肝臓から単離し
、λバクテリオファージ中で分子クローニングしそして
適当なプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１２またはｐ
ｕｃ　１３中で適切なりＮＡ断片をサブクローニングし
、そしてクローン化されたＤＮＡ挿入体を回収／精製す
ることにより、精製される。

精製された該ｐ　Ｎ　Ａプローブは、ラベル化され、例
えばよく知られたニックトランスレーション法により放
射能ラベル化され、次いで添加剤、例えばカルシウムキ
レート剤、粘度Ｉｎ　ｆ’ｆｆ化合物、タンパク質、非
特異性ＤＮＡ等を含有する暖缶化塩類溶液中、選択的ハ
イブリダイゼーションに好ましい温度において、ヒトの
ＤＮＡライブラリーとハイブリダイズされる。

一断片が所望のＤＮＡ断片を含有することが同定された
ならば、不要なりＮＡを除くためこのＤＮＡ断片を操作
し、一端または両端を修飾し、そして介在配列の全部も
しくは一部またはその種のものを除去するために処理す
ることができる。

キメラ遺伝子を作製するための種々のＤＮＡ断片の連結
は、常用の技術に従って、例えば平滑または付着末端連
結、適当な粘着末端を用意するための制限酵素消化、適
当な場合粘着末端のフィルイン、望ましくない連結を回
避するだめのアルカリホスファターゼ処理、および適当
なりガーゼでの連結により行われる。

組換えＤＮＡの移入、例えばハイブリッドベクターの移
入、および形質転換細胞の選択は下記に記載されている
。

さらに、本発明は前記の組換えＤＮＡで形質転換された
宿主細胞、即ち所望するキメラ抗体の軽鎖をコードする
ＤＮＡおよび／または重鎮をコードするＤＮＡで形質転
換された宿主細胞に関する。

本発明の宿主細胞は、生体外で培養することができなけ
ればならず、且つ活性な抗体の生産に適する環境を提供
するためにより高度な真核生物由来のものでなければな
らない。なぜなら、機能的な四量体抗体分子の生合成は
、新生ポリペプチド鎖の正確な折りたたみ、グリコジル
化、および集合を必要とするからである。本発明に係る
適当な宿主の例は、哺乳類細胞、例えばＣＯ５−７細胞
、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、腋芽の肺細胞Ｌ−１３２、および特に
リンパ系起源の哺乳類細胞、例えばミエローマまたはリ
ンパ腫細胞、例えば５ｐ２１０細胞である。

ｓｐ　２１０　（ＡＴＣＣＣＩ？Ｌ　１５８１）は、よ
く特数づけられた、Ｉｇ非分泌性のマウス細胞系であり
、ミエローマＸ６３−Ａｇ３とマウス膵臓細胞との融合
から得られるものである。これらの宿主細胞は、２つの
別々のベクターの助けをかりてまたは上記に示したよう
な二重−構成物（Ｌ　１！　／　Ｈ鎖）ベクターを使う
ことにより取り込まれた、キメラＨ鎖遺伝子構成物のみ
で、Ｌ鎖遺伝子構成物のみで、またはその両方でトラン
スフェクトされる。特に好ましいのは、２つの別々のベ
クターの助けをかりて取り込まれた両方の遺伝子構成物
によりトランスフェクトされ、前述のようなＣＥＡに対
して親和性を有するキメラモノクローナル抗体を分泌す
る細胞、例えば細胞系ＥＦ■／　Ｔ　４Ｎａ　７５−７
５／Ｃｘ　Ｇａ５−６（ＣＨ３Ｓ−５−６と称する）の
細胞である。同じく特に好ましいのは、二重遺伝子構成
物ベクターの助けにより同時に取り込まれた両方の前記
遺伝子構成物でトランスフェクトされ、本発明のキメラ
モノクローナル抗体を分泌する細胞であり、例えば細胞
系ＥＦＩＸ−ｐＣＥ−Ｉｇ（Ｔ　４：Ｃｘ　）（ＣＦ２
−８−１３と称する）の細胞である。本発明の宿主細胞
のさらなる例は、どちらか一方の方向のＨ鎖およびＬ鎖
遺伝子構成物を含有し、該キメラモノクローナル抗体の
高レベルの発現を促進するだめの付加的なりＮＡ要素を
組み込んでいる同様の組換えプラスミドでトランスフェ
クトされた細胞である。

本発明の宿主細胞は、遺伝的に安定であり、−定な特異
性の本発明のキメラモノクローナル抗体を分泌し、そし
て解凍および再クローニングにより冷凍保存された培養
物から活性化され得る。

本発明は、前記のようなＣＥＡに特異性を有するキメラ
抗体を分泌する宿主細胞の調製方法にも関し、この方法
は適当な細胞を１つまたは２つのベクターを用いて、例
えばエレクトロポレーション、カルシウム処理、マイク
ロインジェクションまたはプロトプラスト融合により、
形質転換せしめることを特１枚とする。

ベクターは、ヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエ
チルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロー
ル、ポリエチレングリコール等の存在下でのトランスフ
ェクションにより、またはヘク９−Ｄｔ？Ａとリン酸カ
ルシウムとの共沈殿物としてのトランスフェクションに
より、哺乳類の細胞に導入される。さらに適当な方法は
、細胞核へのベクターＤＮＡの直接マイクロ・１°ン・
ジェクシコン、プロトプラスト融合およびエレクトロポ
レーション、即ち一次的に細胞膜の透過性を増加させる
短い電気パルスによるＤＮＡの導入を包含する。次なる
トランスフェクトされた細胞の選択は、発現ベクター中
に共有結合的に組り込まれているかまたは別々の存在と
して加えられている選択マーカーを使って行われ得る。

選択マーカーはミ抗生物質、例えばＧ−４１８（ゲネチ
シン、ネオマイシンＭｇ１体）またはヒグロマイシンに
対する耐性を付与する遺伝子、または宿主細胞の遺伝的
欠陥、例えばチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼ等の欠損を補完する遺伝子を包含する。

本発明に係るキメラモノクローナル抗体およびその誘導
体は、様々な用途において、特にガンの診断および療法
に利用される。

診断利用の一例は、特に生物学的流体中のヒトガン胎児
抗原の定性および定晋である。本発明のキメラモノクロ
ーナル抗体およびその誘導体は、抗原とモノクローナル
抗体との間の結合相互作用を利用するそれ自体既知のイ
ムノアッセイのいずれか、例えばラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）　、エンザイムリンクドイムノアッセイ、免
疫蛍光試験、ラテックス凝集反応または血球凝集反応に
おいて利用することができる。

ＲＩＡの既知の変法のいずれかを利用することもできる
０例えば均一相におけるＩ？ＩＡ　、固相ＲＩＡもしく
は不均一相ＲＩＡ、ＣＥＡの直接もしくは間接（競合的
）測定による単一ＲＩＡまたは二重（サンドインチ）Ｒ
ＩＡを利用できる。適当な担体、例えばミクロタイター
プレートまたは試験管のプラスチック表面、例えばポリ
スチレン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニルの表
面、ガラスもしくはプラスチックビーズ、濾紙、または
デキストラン、酢酸セルロースもしくはニトロセルロー
ス紙等を、単純吸着によりまたは所望により咳担体を例
えばグルグルアルデヒドもしくは臭化シアンで活性化し
た後に、ＣＥＡに対する抗体でコートし、そしてｘｓＩ
で放射能ラベル化された抗体の溶液およびテストｉ？＆
と共にインキュベートしくただし溶解された該抗体は担
体に結合した抗体よりもＣＥＡＯ別のエピトープを認識
する）、そして担体に結合した放射能を測定することに
よりＣＥＡの量を決定する、サンドイッチＲＩＡが好ま
しい。該サンドインチＲＩＡにおいて使われる２つの抗
体のうちの一方が本発明のキメラモノクローナル抗体で
あり、そしてもう一方が既知のモノクローナルもしくは
ポリクローナル抗−ＣＥＡ抗体または本発明に係るキメ
ラ抗体であり得る。

本発明に係るキメラモノクローナル抗体は、そのように
して又は酵素が接合された誘導体の形でエンザイムイム
ノアッセイにおいて使用され得る。

そのようなイムノアッセイは、酵素ラベル化された本発
明のキメラモノクローナル抗体の誘導体または本発明の
抗体のエピトープを認識および結合するそれ自体既知の
酵素ラベル化抗体を使う試験法を含む。

好ましいのは、ＲＩＡについて上述したごとき担体が抗
−ＣＥＡ抗体でコートされそしてＣＥＡを含むテスト）
容？ＦｌとインキュベートされるＥＬＩＳＡ（エンザイ
ムリンクドイムノソルベントアッセイ）である。

ＣＥＡの結合の後、ＣＥＡに対して向けられる第二抗体
が添加され、これが抗原−抗体複合体に結合する。ＣＥ
Ａの量は酵素−基質反応により測定される。

この試験において使われる抗体のうちの１つが本発明の
キメラモノクローナル抗体であり、もう１つは既知のモ
ノクローナルもしくはポリクローナル抗−ＣＥＡ抗体ま
たは本発明に係るキメラ抗体であることができる。ラベ
ル化抗体は、例えば、アルカリホスファターゼでラベル
化されたヤギの抗−ヒト　ＩｇＧ抗体である。

抗体を、ＣＥＡを含有するテスト溶液とそしである酵素
と接合された抗体の溶液とインキュベートし、溶解され
た抗体が担体に結合した抗体がｉ＝　２するよりも別の
ＣＥＡエピトープを認識するようなＥＬＩＳＡもまた好
ましい。このテストで使われる抗体のうちの１つが本発
明のキメラモノクローナル抗体であり、もう１つは既知
のモノクローナルまたはポリクローナル抗−ＣＥＡ抗体
である。

本発明はまた、ヒトＣＥＡに対するキメラモノクローナ
ル抗体および／またはその誘導体並びに所望により添加
剤を含む、と）ＣＥへの測定用テストキットに関する。

本発明に係るラジオイムノアッセイ用テストキットは、
例えば、適当な担体、凍結乾燥または濃縮されているこ
とがある１もしくは複数のモノクローナル抗体溶液、放
射能ラベル化モノクローナル抗体または放射能ラベル化
ヒ）　ＣＥＡの溶液、ヒトＣＥＡの標準液、緩衝液並び
に、所望により、非特異的吸着および凝集形成を防止す
るための界面活性剤、ピペット、反応容器、検を線およ
びその他を含む。該テストキットの１つまたは複数のモ
ノクローナル抗体が本発明のキメラモノクローナル抗体
である。

本発明に係るエンザイムイムノアッセイ用テストキ７）
は、例えば、適当な担体、凍結乾燥またはａ縮されてい
ることがある１もしくは複数のモノクローナル抗体溶液
、凍結乾燥または濃縮されていることがある、酵素ラベ
ル化モノクローナル抗体、酵素ラベル化ヒトＣＥＡ　、
ポリクローナル抗−ヒトＣＥＡ血清および／または抗−
ヒトＣＥＡ抗体を認識しそして結合する酵素ラベル化モ
ノクローナルもしくはポリクローナル抗体の溶液、固体
のまたは溶解された形態の酵素基質、ヒ）　ＣＥＡの標
準液、緩衝液、界面活性剤、ピペット、反応容器、検量
線、カラー目盛板およびその他を含む。該テストキット
のモノクローナル抗体のうちの１つまたは複数が本発明
のキメラモノクローナル抗体である。

加えて、それらの弱化された免疫原性に基づいて、本発
明のキメラモノクローナル抗体およびそれらの誘導体は
、療法において、血清病またはアナフィラキシ−ショッ
クのような拒絶免疫反応のない受身免疫用、腫瘍の位１
決定および生体内イメージング用、病的細胞の特異的処
置用、例えば細胞毒、免疫モジュレータ−もしくは、活
性剤の局所濃度が重要なファクターである池の医薬的に
活性な分子の部位特異的供給用、またはその他に有用で
ある。生体内イメージングのためには、該キメラ抗体は
放射能ラベル化されるか、または放射性核種、例えばヨ
ウ素、イツトリウム、テクネチウム等との金属キレート
錯体と接合され、そして最初のおよび転移の腫瘍を検出
するために放射線スキャン技法が使用される。このため
には、放射性抗体を例えば腹腔内に注射し、そして患者
を規則的間隔においてガンマイメージヤ−でスキャンす
る。　　ＣＥＡを発現しているＵ瘍は、他の組織よりも
多くの放射性抗体を取り込み、そしてガンマイメージン
グカメラによりはっきりと認識されるであろう。卓越的
には、＋３１１でラベル化されたモノクローナル抗体が
、体重１　ｋｇあたり１５〜３０μＣｉを示すように３
〜８汀の量において放射線スキャン用に使われる。ガン
の処置における生物致死活性のためには、該キメラ抗体
は前述したような細胞増殖抑制性のまたは細胞毒性の物
質、例えばリジンＡと接合された誘導体として、放射能
ラベル化誘導体として、でなければ生物致死性試薬を含
むリポソーム中に供給されて、使用される。哺乳類に対
する治療用量は、モノクローナル抗体それ自体について
は体重１　ｋｇあたり１　ｍｇ〜５■であり、そして細
胞毒性薬物との接合体については体重１ｋｇあたり０．
１　ｍｇ〜０．５■であり、これは患者の状態および投
与方式に依存する。また、該キメラ抗体は、生来の定常
部領域があるために、宿主免疫機構、例えば補体との組
合わせにおいて使用され得る。生体外では、本キメラ抗
体は細胞の混合物から特定のＣＥＡ提供細胞を除去する
ために補体と共に使用され得る。

本発明は、ＣＥＡに対し高い親和性を有する上述のよう
なキメラモノクローナル抗体またはその誘導体を含有す
る医薬調製物にも関する。該医薬調製物は、例えば、有
効量のキメラモノクローナル抗体またはその誘導体と一
緒にまたは混合して無機または有機の、固体または液体
の医薬上許容される担体を含む。

好ましいのは、非経口投与用の医薬調製物である。筋向
、皮下または静脈内投与用の調製物は、例えば、等張の
水溶液または懸濁液であり、所望により凍結乾燥または
濃縮された調製物から使用直前に調製される。該医薬調
製物は、滅菌されてもよくそして、例えば、該成分を保
存、安定化、湿潤化、乳化もしくは可溶化するための添
加剤、浸透圧の調節のための塩類、緩衝液および／また
は、粘度を調節する化合物、例えばカルボキシセルロー
スナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロリドンま
たはゼラチンを含有してもよい。それらは当業界におい
て既知の方法により、例えば常用の混合、溶解または凍
結乾燥法により調製され、そして約０．０１％〜約５０
％の活性成分を含む。

注射用の調製物は、当業界において既知の方法に従って
、処理され、アンプルまたはバイアル中に詰められ、そ
して無菌条件下で田封される。

下記の例は本発明を説明するものであり、決してその範
囲を限定するものではない。

死体解剖から得た結腸ガン肝転移物（死後６時間以内）
を塩溶液で抽出する。１容の組繊を３容の０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，４中４℃において５ｏｒｖａｌｌ　
Ｏｍｎｉｍｉｘｅｒにより８．　ＯＯＯｒｐｍで１０分
間ホモジナイズする。あらいホモジネートを、次いで４
°Ｃで１５分間８，０００ｇにおいて遠心する。その透
明な上清を、ＣＮＢｒ−活性化セファロースに結合され
た既知の抗−〇ＥＡモノクローナル抗体ＭＡｂ　３５お
よびＭＡｂｌ１５（Ｈａｓｋｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒａ５、　４３．３８５７゜１９８３　；　　Ｂｕｃｈ
ｅｇｇｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏ１、Ｌｅｔｔｅｒｓ　５．
８５＋１９８２）のプールから成る免疫吸着剤に適用す
る。

ＣＥＡは２Ｍアンモニウムチオシアネートで溶出される
。

１．２　　Ｂａ１ｂ　　ｃ？　　ス（７）生後２ケ月の
Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、塩溶液で抽出され精製されたＣ
ＥＡ　１５ｇを完全フロインドアジュバントで腹腔的注
射することにより免疫化する。

４力月後、完全フロインドアジュバントなしの同一塩溶
液ＣＥＡ調製吻１５　、５０および１５０躍から成る１
シリーズのブースター注射液を、それぞれ融合の５．４
および３日前に腹腔内に注入する。

１．３　　ｌ１と金 以前に記載された常法（Ｋｏｅｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５．１９７５）に従って、
免疫マウスの肺臓細胞１．５Ｘ１０”個およびマウスの
ミエローマＰ３−ＮＳ２／１＾ｇ４からの細胞１．５Ｘ
１０’個を使って細胞融合を行う、洗浄後、細胞を標準
のＤｕｌｂｅｃｃ。

最少必須培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｎｏ、０４２２５０１）　
４８−中に懸濁する。１融合あたり３Ｘ１０’個の正常
のマウス腹腔滲出細胞を支持細胞として添加する。該細
胞は、９６Ｘ０．５ｄのＣｏ５ｔａｒ　ｗｅｌｌ中に分
配され、標準のＨＡＴ選択培地中で３〜６週間の間、１
週間ごとに３回供給される。バイプリドーマ細胞の増で
培養液中で保存しそして再培養することができる。該細
胞は限定希釈法によりクローン化され、そしてプリスタ
ンを与えられたＢａ１ｂ／ｃマウス中に腹水を形成せし
めることにより増やされる。

細胞系ＣＥ２５　′、よバリのＩｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ
５ｔｅｕｒの「微生物国際寄託機関（Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅｄａ　Ｃｕ１ｔｕｒａｓｄｅ
　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）　Ｊに１９８７年１
２月１５日第１　７１９号のもとに寄託された。

ＣＥ２５ハイブリドーマ細胞（５Ｘ１０７個）を１７５
ｃ＋１１の組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ　３０２８
）中ＤＭＥＭ（Ｓｅｒｏｍｅｄ）　　＋１０％ＦＣＳ　
（Ｓｅｒｏｍｅｄ）　、　　１　ｍＭピルビン酸ナトリ
ウム（Ｓｅｒｏｍｅｄ）　、２ｍｉ’グルタミン（Ｓｅ
ｒｏｍｅｄ）、５０第２−メルカプトエタノールおよび
１００μｇ／戚のゲンタマイシン（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中
で空気および７．５％ＣＯ□の湿潤雰囲気下３７°Ｃで
懸濁培養において増殖させる。遠心により細胞を捕獲し
、液体窒素中で瞬間凍結させ、そしてきれいな滅菌法の
フタ付プラスチック試験管中−８０″Ｃでベレットとし
て凍結保存する。

凍結細胞を１０１ｄのＰＢＳ中に懸濁し、これにきれい
な滅菌法の１００戚プラスチツクビーカー中４°Ｃにお
いて９０戚の０．３Ｍショ糖、５ｎＭＭｇＣｊ２□。

０゜１％（ｗ　／　ｖ　）　Ｔｒｉ　ｔｏｎ−ＸＩＯｏ
、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，ｊ）　）を
添加する。混合により細胞を溶解せしめ、そして遠心（
１０分、１０．ＯＯＯｒｐｍ、　４°Ｃ１５ｏｒｖａｌ
ｌ　ＲＣ−５遠心機、５Ｓ−３４０−ター）により核を
回収する。上清を取り除き、そして核のベレットを４．
５ｄの７５ｍＭ　ＮａＣ１、２４ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐ
Ｈ８，０中に再懸濁する。蒸留水（１００ｕ１）、　Ｓ
Ｏ３（ｉ留水中の１０％（ｗ　／　ｖ　）溶液２５０Ｊ
］、およびプロティナーゼ溶液１００ｍ　（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ；　Ｎ留水中１０■／　ｍｌの溶液）を加え
そして穏やかに混合する。その混合物を３７°Ｃで一晩
インキユベートする。

その溶液を０°Ｃにおいて等量の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ！（ｐＨ８，０）で飽和された再蒸留フェノール
と混合することにより抽出する。遠心（１０，ＯＱＯｒ
ｐｍ、室温。

５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ−５遠心機、　５Ｓ−３４０−タ
ー）後、水相を回収しそして等量のＣＨＣ１、／イソア
ミルアルコールＣ２４７１，ｖ／ｖ）で２回抽出する。

１／１０容の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ、　ｐＨ５，０の添加に
続いて２容の無水エタノールの添加により室温でＤＮＡ
を沈澱させる。沈澱したＤＮＡをエタノール溶液から引
き上げ、１ｉのＴＥ授衝液中に入れ、そして４“Ｃで一
晩溶解させる。ＤＮ＾の収量は約０．５　ｍｇである。

Ｐａ−ＮＳ２／　ｌＡｇ４細胞系からのＤＮＡ　も同様
にして得られる。

Ｂａ１ｂ／ｃマウス腎組織からのＤＮＡの調製について
は、新鮮なマウスの腎臓を液体窒素中で瞬間凍結させ、
液体窒素の存在下きれいな滅菌法の乳棒および乳鉢で細
かい粉末にし、そして前記の手順に従って５Ｘ１０７細
胞に相当する量の組織からＤＮＡを抽出する。

ハイブリドーマＣＥ２５は、そのハイブリドーマの生産
のための融合相手として使用されるＰａ−Ｎ２／ｌＡｇ
４細胞由来のＨ鎖およびＬ鎖Ｉｇ遺伝子座を含む。Ｐ３
−Ｎ２／１Δｇ４細胞系は、ＭＯＰＣ−２１ミエローマ
細胞（Ｓｔｏｒｂら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５、　８．４６８１１９８０）から由来する。これら
の“′内因性パ再配列遺伝子剤は、次の手順によりＧＥ
２５−特異的再配列遺伝子と区別さ糺る。

３．１　１０−ブＴ）’（Ａ　　　の′　および　劃Ｂ
ａｌ　ｂ　／　ｃマウスのジャームラインのＨ鎖のＪ６
頁域ＤＮＡセグメントの検出に使用されるプローブＤＮ
Ａセグメントは、Ｂａｌ　ｂ　／　ｃマウスの肝臓ＤＮ
Ａの約１７５０ｂｐのＢａｌ　ＩＩ　／Ｘｂａ　Ｉセグ
メントであり、これは公表されたジャームラインのＨ１
ＪｆＩｇ座（Ｎｅｗｅｌｌら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９
．１１２８．１９８０　；　ＥＭＢＬデータベース登録
ＭＵＳ　ＩＧＣＤＯ７）のヌクレオチド１１８０−２８
８１位に相当する。

Ｂａｌ　ｂ　／　Ｃマウス系列のし鎖のＪ　ＲＴＪ域セ
グメントの検出に使用されるプローブＤＮＡセグメント
は、Ｂａ１ｂ／ｃ７ウス肝臓ＤＮＡの約２２４０ｂｐの
旧ｎｄｎｌ／Ｘｂａ　Ｉセグメントであり、これは公表
されたジャームラインのＬ鎖ｒｇ座（Ｍａｘら、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａ口、　Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ、７６、３４５０．３４５４．１９７９　；　Ｅ
ＭＢＬデータベース配列登録ＭＵＳＩＧ１（ＪＣ２）の
ヌクレオチド６５９−２９００位に相当する。

ＤＮＡプローブは、標準手順ＣＭａｎｉａｔｉｓら、’
Ｍｏ１ａｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ、、　１
９８２）を１吏って、λバクテリオファージ中でＢａ１
ｂ／ｃマウス肝臓ＤＮＡを分子クローニングし、ｐＵｃ
１２またはｐＵｃ１３プラスミドヘクター中で適切なり
ＮＡ断片をサブクローニングし、そしてクローン化され
たＤＮＡ挿入部を回収／精製することにより調製される
。

Ｄ　Ｎ　Ａプローブは、公表された標準手順（Ｒ４ｇｂ
ｙら、Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．１１３．２３７．１９７
７）を使って、α−ゴｚｐ−ｄＣＴＰ、大腸菌ＤＮＡボ
リメンーゼＩおよびＤＮａｓｅＩの存在下でのニックト
ランスレーションにより、精製ＤＮＡ断片３００ｎｇか
ら調製される。ラベル化°されたプローブＤＮＡは、１
０Ｘ０．５ｃｍの分離カラムおよび１５０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ！、、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（Ｗ／Ｖ）
ＳＤＳ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ！、、　ｐｌ！
７．５を含む溶出緩衝液を用いた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーにより
、取り込まれなかったラベルから分離される。

３．２　　　ＤＮへの゛ル＃″螢 例２に記載したようにして調製された（ａ）ＣＥ２５ハ
イブリドーマの生産において親の融合相手として使用さ
れるＰ３−ＮＳ２／１−Ａｇ４　ミエローマ；（ｂ　）
　ＣＥ２５ハイブリドーマ；および（Ｃ）　　Ｂａ１ｂ
／′Ｃマウス腎細胞；からのＤ徴試料（５μｇ）を、製
造業者により推奨される条件下において、制限酵素Ｘｂ
ａＩ、　ＢｇｌｌＩ、　ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ、
　Ｂａｍ１ｌＩ。

ＥｃｏＲｒまたは旧ｎｄ　ＩＩ［（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）を使って完全消化する。１０Ｘ２０Ｘ０．５ｃｍの
０．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｂｉｏｒａｄ、スタン
ダード低Ｍｒ）ゲル並びに、２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ−２
ナトリウム塩、９０ｍＭト’Ｊスー塩基および９０ｍＭ
ホウ酸（ｐＨ８，３）を含む電気泳動用緩衝液を使った
水平型アガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡ断片を分
離する。Ｈｉｎｄｌ［ＩまたはＥｃｏＲＩのどちらかで
消化されたλバクテリオファージの断片をプールし、公
表された手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ
　ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ、＋　１
９８２）を使って、ｄＮＴＰｓおよびα−”　Ｐ−ｄＮ
ＴＰｓの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて放射能ラベル化する
。これらには、前記アガロースゲルの別のレーンにおい
である範囲の既知のサイズのラベル化ＤＮＡマーカーを
提供することも含まれる。を気泳動によるＤＮＡ１１片
の分離後、次のような幾つかの重要でない変更を伴って
、公表されたサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏ１、９８．５０３＋　１９７５）を使って室
温でブロッティングすることによりニトロセルロース膜
にトランスファーせしめる。電気泳動後、過剰のアガロ
ースを該ゲルの端から切り落とし、その後それを０．２
５Ｍ　１ｉｔｕ：容ン夜５０ｏｍｌ中に室温で３０分間
浸し、続いて１．５　Ｍ　ＮａＣ！２０、５　Ｍ　Ｎａ
ＯＨ５００ｍ中に６０分間浸してＤＮＡを変性させる。

ゲルを蒸留水で簡単に洗い、次いで中和溶液（３Ｍ　Ｎ
ａＣ１，０，３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２．　ｐＨ７，５
）中に６０分間浸す０次に上に言及した公表された方法
により、３Ｍ　ＮａＣｊｌ！、　　０．３Ｍクエン酸ナ
トリウムを含む溶液（ｐＨ６，８）を使ってＤＮＡ断片
を一晩ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆
　５ｃｈｕｅｌ１、濾孔サイズ０．４５Ａ１）にトラン
スファーせしめる。フロノドされたＤＮＡ断片を含有す
るニトロセルロース膜を風乾し、そして減圧下８０　’
Ｃで２時間焼成する。焼成後、その膜を０．７５＞ｉ　
？１ａＣｆ　、０．０７５＞１クエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６，８）中に浸すことにより、過剰の乾燥塩を除去し
、その後に放射能でラベル化されたＤＮ＋１プローブと
ハイブリダイスさせる。

３．３　　　ＯＮヘハイブリダイゼーション例３．２に
記載したようにして調製されたニトロセルロースフィル
ターを、熱シールされたプラスチックバッグ中で、１０
％（ｗ　／　ｖ　）　ＳＯ５０，２ｍｌ。

５％（Ｗ／Ｖ）ピロリン酸ナトリウム０．４　ｍ１、１
８ゲージの注射針を通すことにより切断されたニシンの
精子ｏＮｎ（５ｍｇ／ｄ蒸留水）０．４ｄ。

Ｄｅｎｈａｒｄ　を溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　ＢＢＲ
Ｃ２３，６４Ｌ　１９６６　；２０ＸＳＥＴ　１１衝液
（３Ｍ　ＮａＣ１、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．４　Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ７，８）中の０．２％（
Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポ
リビニルピロリドン、０．０２％（ｗ　／　ｖ　）　Ｆ
ｔｃｏｌｌ−４００）　５　ｍｌおよび薄留水１４ｍ１
を含む、２０ｍ１のプレハイブリダイゼーション溶液中
６５°Ｃで４時間プレハイブリダイズする。

ＤＮＡハイブリダイゼーションコン吻は、１１０７ｃｐ
の放射能ラー、ル化Ｄ　Ｎ　Ａプローブ、上記のように
２ｍしたプレハ１゛ブリダ・ｆゼーシコン）容液１０戚
、および１０％ＣＷ　／　Ｖ　）硫酸デキストラン（Ｓ
ｉｇｍａ）を含む。その、゛昆合゛勿を１００’Ｃて２
０分間加熱してＤＮＡを変性させる。ハイブリダイゼー
ションのために、ブレハイフ′リダイゼーシコンン昆合
物を該プラスチックバッグから取り出して上記のハイブ
リダイゼーション混合物に置き換える。気泡を追い出し
た後、そのバッグを再びシールし、そして６５°Ｃで一
晩インキ仏ベートする。酸膜から非特異的結合ＤＮＡを
除去するために、ハイブリダイゼーション混合物と膜と
をプラスチックハックから取り出す。５　Ｘ５Ｓｃ、　
ｏ、　１％（Ｗ／Ｖ）ピロリン酸ナトリウム５００ｍｆ
を含む浴中に膜を入れ、そして６５°Ｃで１５分間洗浄
する。次いでその膜を、４　Ｘ５ＳＣ，３Ｘ５ＳＣ，２
Ｘ５ＳＣそして最後に１×ＳＳＣを含む５００ｍｆの溶
液〔全て０．１％（Ｗ／Ｖ）ピロリン酸ナトリウムを含
む〕中６５°Ｃで３０分間、順次洗浄する。その膜を風
乾し、きれいな薄いポリエチレンバッグ中にシールし、
そしてＫｏｄａｋＸ線フィルム（Ｘ−ｏｍａｔ、　ＴＭ
　ＡＲ）および像拡大スクリーンを使って一７０°Ｃで
３日間オートラジオグラフする。

その結果は下の第１表中に要句されそして第１図に図解
されている。

親の融合相手の細胞系Ｐ３−ＮＳ２／　ｌＡｇ４との比
較により、ＣＥ２５ハイブリドーマは２つの付加的な再
配列Ｈ鎖Ｉｇ遺伝子座および２つの付加的な再配列し鎖
Ｉｇ遺伝子座を含有する。これらを、マウスＩｇ特異的
ＤＮＡプローブを使ったサザンブロノトによりＸｂａ　
ｒ制限消化物において検出されたマウスのデノムＤ’＋
Ａ断片のサイズから、それぞれＨ２およびＨ８（第１Ｂ
図）並びにＨ２およびＨ２，５（第１Ａ図）と称する。

ニング ＣＥ２５ハイブリドーマＤＮＡ（５０ｇ）をＸｂａ　Ｉ
で完全消化し、同体積のＣｔｌＣｊ２３／再蒸留フェノ
ール（１：　１　、　ｖ　／ｖ　、　２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０で飽和されたもの）で抽出
し、続いて同体積のＣＩＩＣｊｌ！３で抽出して微量の
フェノールを除去する。０．１容の３ＭＮａ０Δｃ　（
ｐＨ５，０）および２．５容の一２０°Ｃの無水エタノ
ールの添加によりＤ　Ｎ　Ａを沈澱させる。

ＤＮＡペレットを回収し、１５０ｉのＴＥ緩衝液中に、
・容屏し、そしてＢｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４１Ｄ−ター用
のポリアロマ−試験管中でＴＥ覆衝液中１２、甑の５−
２４％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１勾配にかける。それを２５°
Ｃにおいて３７，０００ｒｐｍで４．５時間遠心し、下
から分画する。（ａ　）　１．５−２．５ｋｂの長さの
Ｄ　＋Ｊ　Ａ　ＩＬ’ｒ片および（ｂ）６．０−９．Ｏ
ｋｂの長さのＤＮＡ断片に相当するＤＮＡ画分（３００
ｍ）を収集し、プールし、そして２．５容の一２０″Ｃ
のエタノールで沈澱させる。プールした（ａ）および（
ｂ）画分からＤＮＡを遠心により回収し、真空下で乾燥
し、そしてそれぞれ５０　ｎｇ／　ｔｄおよび２００ｎ
ｇ／Ｉｌｌの濃度になるようにＴＥ緩衝液に溶解させる
。

前記の（ａ）および（ｂ）画分からのＤＮＡ試料（ＩＩ
！ｇ）を、５単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）の存在下において、１０ｍＭ　ＤＴＴ、　
　Ｉｎ＋Ｍ　ＡＴＩ’、　１０ｍＭＭｇＣｌ　２＋　２
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ７，６、を含む溶液５
．１中４°Ｃで一晩、λ−ＯｎｇＣ／　Ｘｂａ　Ｔ−消
化バクテリオファージＤＮＡアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ　Ｉｎｃ、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＵＳＡ）と連結
させる。Ｇｉｇａｐａｃｋ　’ＰＬＬ！Ｓ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎａ　Ｉｎｃ、’、　Ｓａｎ　Ｄｉｅ、Ｈｏ、　
［！Ｓへ）を使って連結混合物をパッケージソゲし、そ
して製造業者の指示に従って、ＮＺ−アミン増殖培地を
用いて大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）Ｋ１２／ＶＣＳ２５７
　ＣＮＺ　　７ミ１１０．４％（Ｗ／Ｖ）マルトース上
での増殖により調製〕上に、標準的な微生物操作法を使
って約２５０ｐｆｕ／ｃｆｆｌの密度にプレートする。

そのプレートを３７°Ｃで一晩インキユベートする。

Ｌ２およびＬ２．５の再配列し鎖Ｉｇ遺伝子座は、例３
．１に記載のニックトランスレーションでｆｆ２ｐ−ラ
ベル化されたマウスＬ鎖ＩｇＤＮＡプローブを使って、
ＢｅｎｏｎおよびＤａｖｉｓのハイブリダイゼーション
スクリーニング（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６．１８０．１
９７７）によりライブラリー（ａ）において検出される
。

ハイブリダイズしている陽性のプラークを、プラーク精
製し、無菌パスツールピペットの先端を使って恰い、そ
してそのファージをファージ緩衝液（１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，８ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈｚ０．　０．０１％（
Ｗ／Ｖ）ゼラチン、　　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　、
　ｐＨ７，５〕１　ｍｌ中に再懸濁する。０．４％（Ｗ
　／　Ｖ　）マルトースヲ補充したＮＺ−アミン培地中
で増殖した大腸凹に２３／ＶＣ５２５７の一晩培養物か
ら得た１００ｐ１体積の細胞に２０４のファージ懸濁液
を吸着せしめろことにより、ファージ溶菌体（１０戒）
を調製する。その混合物を５０ｍ１の滅菌済Ｆａｌｃｏ
ｎ試験管中で新鮮なＮＺ−アミン培地により１０戚に希
釈し、そして激しく振とうしなから３７°Ｃで一晩増殖
させる。

ＣｌＩＣｆｆ　３　（２０Ｊ　）を加え、そして３７°
Ｃで３０分間振とうを続ける。Ｂｌａｔｔｎｅｒらによ
り発明され公表された方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０２．
１２７９．１９７８）を使って、その溶菌体から組換え
バクテリオファージＤＮＡを調製する。最後のエタノー
ル沈澱の段階の後に得られたＤＮＡを１００ＪのＴＥ緩
衝液中に溶解する。

ファージＤＮＡの収量は約１００１！ｇである。

陽性にハイブリダイズしている組換バクテリオファージ
それぞれからのＤＮＡ試料（ｌＪｌｇ）を、制限エンド
ヌクレアーゼＸｂａ　ｒを使って完全消化する。消化さ
れた該組換ＤＮＡ試料を１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル
電気泳動により分析すると、Ｌ２遺伝子セグメントは、
約２ｋｂのＸｂａ　Ｉ制限断片として同定される。約２
．０ｋｂのＬ２遺伝子セグメントをアガロースゲルから
切り取り、フェノール／ＣＨＣｆ、抽出により精製し、
そしてエタノール沈澱により回収する。次に精製ＤＮＡ
断片を、Ｘｂａ　Ｔにより線状化されたｐＵｃ１２プラ
スミドクローニングベクター中にサブクローニングする
。全ての操作は、標準法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　１ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ’、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａ
ｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ、＋１９８２）であった。制限エ
ンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉ　＋Ｂｇｌｆｆ、Ｐｇ目、
　ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ旧を使ったこれらプラス
ミドサブクローンの制限地図から、クローン化されたＬ
２遺伝子セグメントの構造が、例３において記載したＣ
Ｅ２５ハイブリドーマＤＮＡのサザンプロットから推察
されるもとのゲノムのＬ２遺伝子のものと一致すること
が確証される。どちらかの方向でクローン化Ｌ２遺伝子
セグメントを含有するプラスミドをｐＣＥＡ−Ｌ２ａお
よびｐＣＥＡ−Ｌ２ｂと命名する。ｐＣＥＡ−Ｌ２ａの
制限地図は第１Ａ図に示される。

ライブラリー（ｂ）は、同じ方法を使うＨ８の再配列さ
れたＨ鎖Ｉｇ遺伝子セグメントの源として使用される。

Ｈ鎖遺伝子座についての組換えファージのスクリーニン
グは、例３．１に記載のＨ鎖に特異的な放射能ラベル化
ＤＮＡプローブとのノ＼イブリダイゼーシコンにより行
われる。陽性にハイブリダイズしている組換ファージを
プラーク精製し、ＤＮＡを単離しそして前述のようにＸ
ｂａ　Ｉで消化する。Ｈ８遺伝子配列は、Ｘｂａ　Ｉで
の消化に続く１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動に
よってクローニングベクターから分離された時、約８ｋ
ｂの制限フラグメントとして同定される。Ｓｉ　Ｈ８遺
伝子を、Ｘｂａ　Ｉでの消化により線状化されたプラス
ミドベクターｐＵｃ１２中に両方向においてサブクロー
ン化する。Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｐｓｔ　Ｉ　＋　）ｌｉｎ
ｄｎＩおよびＢａｍＨＩを使った該ＤＮＡサブクローン
の制限地図から、クローン化されたＨ８遺伝子の構造が
例３において記載のＨ鎖に特異的な放射能ラベル化ＤＮ
Ａプローブを使ったＣＥ２５ハイプリドーマＤＮＡのサ
ザンプロットから推察される、ゲノムのＨ８再配列Ｈｉ
頁Ｉｇ座のものと一至女することが確証される。

これらの）１８　ＤＮＡサブクローンをｐＨ８ａｌおよ
びｐ　Ｈ８ｂ　１と命名する。ｐＨ８ａｌのＸｂａ　Ｉ
挿入ＤＮＡ断片の制限地図は第１Ｂ図に示される。

ｐＣＥＡ−Ｈ２（ａまたはｂ）およびｐＨ８（ａｌまた
はｂｌ）中のＨ２およびＨ８遺伝子座のヌクレオチド配
列分析は、公表されたＳａｎｇｅｒのジデオキシヌクレ
オチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、７４　５４６
３．１９７７）をイ吏って行われる。適当な制限エンド
ヌクレアーゼを使って組換えプラスミドＤＮＡを切断し
、そして配列分析すべきＤＮＡ断片を１％（Ｗ／Ｖ）ゲ
ル電気泳動により回収する。次いで提供者の指示（４Ｈ
ＢｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ，Ｕ
Ｋ）を使って、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｍ１３クローニング
システムによりＭ１３バクテリオファージベクター中に
該ｏＮｘをクローン化し、そして配列分析する。

Ｌ２遺伝子セグメントは、５’　　　ＸｂａＩ制限部位
から、再配列されたＬｔｊｆ　　ｖ、ｒ４ｇ域の３′側
にある１３９５位のヌクレオチドまでが配列決定される
。

そのヌクレオチド配列は、弐■において与えられるもの
である。

このデータから、この領域中のクローン化されたＨ２遺
伝子の制限地図（第１Ａ図）が確証され、そしてＬ鎖の
リーダーペプチド（該配列中の７３３位でメチオニンに
より始まるもの）のＮ端残基をコードしている最初のエ
キノンの配列、介在配列（７８１−９８７位のヌクレオ
チド）、並びに前記リーダーペプチドの残りおよびＶ　
−Ｊ　４　’ｎＭ域にあるプロリン残基で終わる再配列
されたＨ２の■領域のコード配列（９８Ｂ−１２８４位
のヌクレオチド）が明らかになる。　１２８５−１３９
５位のヌクレオチドは、既知のマウスに鎖Ｉｇジャーム
ライン配列（ＥＭＢＬデータバンク配列登録ＭＵＳＩＧ
ＫＪＣ２の１７２５−１８３６位の間）に−致する。６
８０−１２８４位のヌクレオチドは、既知のマウスジャ
ームラインのし鎖のＶ　５Ｍ域（Ｈ７，Ｐｅｃｈ　ラ、
Ｎａｔｕｒｅ」■、　６６８．１９８１）に、該■領域
コード配列中７個の相違（これは、体細胞突然変異によ
り生じるのかもしれない）を除いて一致する。このデー
ターから、該リーダーペプチド、３つのフレームワーク
領域およびフレーム間のＶ−Ｊ４連結を包含する相補性
決定領ｈｉｃＤＲＬｓｌ−３Ｃｌ０６９−１１０２位、
１１４７−１１６７位、１２６３　１２９１位のヌクレ
オチド残基）を含む再配列されたＨ２のＬ鎖遺伝子のア
ミノ酸コード配列が明らかになる。

Ｈ８のＨ鎖遺伝子セグメントは、内部の旧ｎｄｌｌｌ制
限部位から、再配列されたＨ鎖のＶ　−Ｄ　−Ｊ　ＴＪ
ｉ域の３′側に位置する８５７位のヌクレオチドまでが
配列分析される。そのヌクレオチド配列は弐■において
与えられるものである。

このデーターから、Ｈ８遺伝子のこの領域の制限地図（
第１Ｂ図）が確証され、そしてリーダーペプチドのＮ端
の１６個のアミノ酸残基をコードする最初のエキノンの
配列（配列中３３２位においてメチオニンで始まるもの
）、介在配列（３６８−４７３位のヌクレオチド）、並
びに前記リーダーペプチドの残部およびセリン残基まで
のＨＢＶｊ項域のコード配列（４７４−８４４位のヌク
レオチド）が明らかにされるｏ　　７９７−８５７位の
ヌクレオチド残基は、ＨｉＪポリペプチドのＪ領域の予
想されたコード配列に影言を及ぼす３つのヌクレオチド
の相這を除いてマウスＨ，Ｊｆｇジャームライン配列（
ＥＭＢＬデークバンク配列登録ＭｔｉＳＩＧＣＤＯＯ７
）と一致する。Ｓシ配列の最初の７９６個のヌクレオチ
ド残基は、ＧｅｎｂａｎｋＮＢＲＰまたはＥ　ＦＩ　Ｂ
　Ｌライブラリーにおいて入手可能な配列データの探索
から予想されるような既知のマウスＨ鎖のＶ　６Ｍ域と
相同であるが同一ではない。

この配列データから、前記リーダーペプチド、３つのフ
レームワーク領域およびＣＤＲＩｓｌ−３（５７５−５
９５位、６２９−６８０位、７７６−８０５位のヌクレ
オチド）を包含するアミノ酸コード配列、ＨＩＭの多様
性（Ｄ）セグメントの由来（マウスのＨｆＡ　Ｉ　ｇジ
ャームライン座のＤＳＰ　２．３　、　ＤＳＰ　２．４
またはＤＳＰ２．６のいずれから由来するか）、並びに
ハイブリドーマＣＥ２５の再配列Ｈ８のＨ鎖遺伝子のフ
レーム間のＶ−Ｄ−Ｊ　４連結が明らかにされる。

：ＨｆｆｒａｙおよびＲｏｕ６ｅｏｎにより記載さ’Ｃ
したＬｉＣ１／尿素法（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｌ
Ｍ、　３０３．１９８０）をＬｅＭｅｕｒら（Ｃｅｌｌ
　２３．５６１．１９８１）により改良されたようにし
て使って、全ＲＮ　Ａを抽出する。例２に記載したよう
にしてＣＥ２５ハイブリドーマ細胞（５×１０７個）を
増殖および調製する。細胞ペレットを５　ｍｌのＬｉ（
／！／尿素（３Ｍ、Ｌｉ（／！、６Ｍ尿素、２００Ｈ／
　ｒｎｉ　ヘパリン、０．１％ＳＯＳ、　ＩＱｍＭ　　
Ｎａ０Ａｃ、　ｐＨ５，０）の入った試験管中で直接解
凍する。その後の段階は公表された方法の中に記載され
たものである。この方法で約５０μｇの全細胞性ＲＮＡ
が得られる。最後の精製物を７０％（Ｖ／Ｖ）エタノー
ル下既知の濃度で一８０°Ｃにおいて保存する。

５．２　　　　　　たＨ　およびＬ　　　ｒ　　ｍＲＮ
ＡのヌＣＥ２５ハイブリドーマからのｍＲＮＡのヌクレ
オチドシーケンシングは、放射能ラベル化された特異的
なオリゴヌクレオチドプライマーを利用して全細胞性Ｒ
ＮＡＬ’ｌ製吻において直接行われる。これらのプライ
マーオリゴヌクレオチドｉよ、公表された方法（Ｒｉｎ
ｋら、１Ｊｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５、１２．６３６９
＋　　１９８４）　　を使って化学的に合成される。

（ａ）マウスのＣに一含［ｍＲＮＡのシーケンシングは
、　ＨＯ−５’　−ｄＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡ
ＧＴＴＧＧ−３’　−ＯＨの組成の特異的なオリゴヌク
レオチドプライマーを使って行われる。この配列は、公
表されたマウスＣにコード配列（Ａ　ｌ　ｔｅｎｂｕｒ
ｇｅｒら、Ｎｕｃ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅ３゜９９７Ｌ　１
９８１）の３−１２番目のコドンと相補的である。

（ｂ）マウスＩｇＧ１特異的ｍＲＮＡのシーケンシング
は、ＨＯ−５’−ｄＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧバＣ−
３’−ＯＨの組成の特異的なオリゴヌクレオチドプライ
マーを使って行われる。この配列は、マウスｒＢｉのＨ
鎖コード配列（Ｈｏｎｊｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａ
ｃａｄ、５ｃｉｊｆｌＬ５５！Ｌ１９７９　’）のＣＨ
Ｉドメインの７−１１番目のコドンと相補的である。

前記の両オリゴヌクトオチドはともに、γ−”　Ｐ　−
ＡＴＰ　（１ｍｅｒｓｈａｍ　）の存在下Ｔ４−ポリヌ
クレオチドキナーゼ＜Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）を（吏
って、５′端において２　Ｘ　１０６ｄｐｍ／　ｐｍｏ
ｌｅの比活性に放射能ラベル化される。ラベル化および
、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）
クロマトグラフィーを用いる取り込まれなかったＴ　−
”Ｐ−ＡＴＰからの放射能ラベル化オリゴヌクレオチド
の分離は、公表された手順（Ｑｕら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５、１１．５９０３．１９８３）を使って行わ
れる。

配列分析用に、エタノール下で保存されたＲＮＡ試料（
２５ｇ）を、エッペンドルフ遠心機を使って４°Ｃで３
０分間遠心し、そして１０　’ｄｐｍの５′端一ラベル
化ブライマーを含むＴＥ緩衝液中に再懸濁する。この混
合物を最終体積５Ｉ１１になるように、ＩＩのアニーリ
ング用緩ａｉ液、５単位の逆転写酵素（Ｇｅｎｏｆｉｔ
　ＳＡ、　Ｇｅｎｅｖａ）、１　ｔｔｌのｄＮＴＰ混合
物、および蒸留水中のｄｄＡＴＰ　（２００団）、　ｄ
ａｃＴＰ（１００オ）。

ｄｄＣＴＰ　（８０オ）またはｄｄＴＴＰ　（２００ｍ
　）ン容液のいずれか１ｔｌ！（以上全てＡＩ！ｌｅｒ
ｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋υにより）を
含む５×１磁のエソペンドルフ試験管中にアリコートに
分ける。５番目の反応試験管はｄｄＮＴＰｓを含まず、
ｍＲＮＡの完全性をモニターするのに（吏われる。）゛
ライマー＜ａ）については３７°Ｃで３０分間またはプ
ライマー（ｂ）については４２゛Ｃで３０分間、反応混
合物をインキュベートする。緩衝液および混合物は次の
ものであるニブライマー（ａ）用のアニーリング緩衝ｔ
Ｆ１　：　６０ｍＭンｊｇｃｆ！ｚ、　　０．４７ｖ丁
　ＭＣＩ！、　　　０．　５　　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１１
Ｃｊ２　、　　ｐＨ８，３；プライマー（ｂ）用のアニ
ーリング緩衝液：　６０ｍＭＭｇ１！ｚ　、　　０．６
　Ｍ　ＮａＣｌ！、、　０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ
ｐ）＋８、３　；　ｄＮＴＰ混合物：蒸留水中２ｍＭ濃
度の各ｄＮＴＰ。

ただし特定のシーケンシング反応において使われるｄｄ
ＮＴＰに対応するｄＮＴＰはｏ、　５　ｍＭ濃度で使わ
れる。

シーケンシング反応を、各試験管に蒸留水２０μ！およ
び０．６　Ｍ　ＮａＯＨ３０１１１を添加することによ
り止める。３７°Ｃでの一晩のインキュベーションによ
りＲＮＡを加水分解する。反応混合物を３Ｍ酢酸８、４
　ｊｌ！の添加により中和し、そして０．３　Ｍ　Ｎａ
０Ａｃ。

ｐＨ５，０の存在下２．５容の無水エタノールの添加に
よりＤＮＡを沈澱させる。そのＤＮＡベレントを６０°
Ｃの空気中で乾燥し、そしてシーケンス用染色混合物２
ｐ！中に再懸濁し、標準的な材料および方法（Ｓａｎｇ
ｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｅ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉユｈ５
４６３，１９７７）を使って、６％ポリアクリルアミド
／尿素のＤ７１Ａシーケンス用ゲル上で電気泳動する。

マウスハイプリドーマＣＥ２５において特異的に発現さ
れるＬｔＪｊｍＲＮＡの配列は次のようである。

該配列は３′→５′方向に書かれており、これはＣＥ２
５ハイプリドーマＤＮＡから単離され、クローン化され
そして配列分析されたＬＺＬ鎖ｒｇ遺伝子の１１６６−
１３２２位のヌクレオチドの部分と相補的である（例４
６３参照）。

マウスハイブリドーマＣＥ２５において一特異的に発現
されるＨ鎖ｍＲＮＡの配列は次のようである：該配列は
３′→５′方向に書かれており、そしてこれはＣＥ２５
ハイブリドーマＤＮＡから単離され、クローン化されそ
して配列決定された）１８Ｈ１ｌ（Ｉ　ｇ遺伝子の６１
８−８３９位のヌクレオチドの部分と相補的である（例
４．３参照）それは、プライマー結合部位と相補的な配
列を含まない。

ＣＥ２５ハイブリドーマ細胞ま７二ばＰ　ＬＪ　−ＩＴ
　ｓ２　／　Ｉ　Ａ　ｏ　”＋がらの全細胞ＲＮＡを例
５に記載したようにして調製する。保存用に使用したエ
タノールがらＲＮＡ試料（２５および５０ｑ）を遠心に
より回収し、その後、２．５Ｍホルムアルデヒド、５０
％（ｖ　／　ｖ　）ホルムアミド′、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
　、４０％（ｗ／ｖ）ショ糖、５０ｍＭγ−モル承りノ
プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）　ｐｆｌ　７．　Ｏｌ
並びに電気泳動の進行状況をモニターするためにマーカ
ー色素として使用される０、５％（ｗ／ｖ）キシレンシ
アツールおよび０．５％（Ｗ／Ｖ）ブロモクレゾールグ
リーンを含有する２０Ｉｌ！の溶液中に再懸濁する。混
合した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　２．２　Ｍホルムア
ルデヒド、５０ｍＭ　ＭＯＰＳ。

ｐＨ７，０を含む電気泳動用緩衝液を使って、１％（ｗ
　／　ｖ　）アガロースゲルに試料を負荷する。ゲルは
使用前に３０分間プレ電気泳動しである。

電気泳動後、余分なアガロースをゲルの両端から切り捨
て、次いで２０×βＳ６緩衝液中に５分間浸す。標準的
なノーザンブロント法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、’Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｈｏｕｒ、　＋’ｉ、Ｙ、＋
　１９８２）により、ＲＮＡをニトロセルロース膜にト
ランスファーする。−晩のトランスファー後、その膜を
風乾しそして真空下８０“Ｃで２時間焼成する。ハイブ
リダイゼーション前にその膜を、５０％（Ｖ／Ｖ）ホル
ムアミド、５ｘ５５ご緩衝液、５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ
溶液（例３．３に記！り　、１０＋ｎＭ　ＥＤＴＡ　　
、　０．１％（ｗ　／　ｖ　）ＳＯＳ、５０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐｌ＋６．８）および２　ｍｌの切断され
たニシン精子ＤＮＡ　（５ｍｇ／　ａｌｌ蒸留水）を含
む２０ｍ２の溶液中でプレハイブリダイズする。インキ
ュベーションは、熱シールされたプラスチックバッグ中
４２゛Ｃで８時間行われる。ハイブリダイゼーションの
ために、そのプレハイブリダイゼーション混合物をプラ
スチックバッグから取り出し、そしてプレハイブリダイ
ゼーション溶液と同じであるが但し５　Ｘ　Ｄｅｎｈａ
ｒｄ　を溶液の代わりに２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ？８’／
夜およびニックトランスレーションによりｔｚｐ−ラベ
ル化され変性されたハイブリダイゼーション用プローブ
ＤＮＡを含む、ハイブリダイゼーション溶液と入れ換え
る。再配列されたＬ２のＩｇＬ鎖遺伝子セグメントに対
して特異的な放射能ラベル化ＤＮＡプローブは、プラス
ミドｐＣＥＡ−Ｌ２ａ（第１Ａ図および第３図）である
。再配列されたＨ８のＩｇ１１鎖遺伝子セグメントに対
して特異的な放射能ラベル化ＤＮＡプローブは、プラス
ミドｐＨ８ａｌ（第１Ｂ図）である、ニックトランスレ
ーションされたプローブＤＮＡの調製ゆ、例３．１に記
載されている。４２°Ｃでの１６時間のハイブリダイゼ
ーション後、その膜をプラスチックバッグから取り出し
、そしてＤＮＡプローブを含まないハイブリダイゼーシ
ョン混合物中４２°Ｃで１時間２回洗浄し、次に２　×
’ｉ、５６．０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ中４２°Ｃで１
回、続いて０．１×坏と、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中
室温で２回洗浄する。次にその膜を風乾し、薄いプラス
チックバッグ中に入れ、そして像拡大スクリーンを使っ
て一７０゛ＣにおいてＫｏｄａｋχ−ｏｍａｔ　ＴＭ　
ＡＲ診断フィルムにさらす。

ノーザンプロット分析の結果は第２図に示され公表され
た方法（Ｌａｗｎら、Ｃｅ１ｌユ５．１１５７．１９７
８）を使って、制限エンドヌクレアーゼ１ｌａｅＩＩＩ
およびＡｌｕ　Ｉによるヒト胎児の肝臓ＤＮＡの限定消
化により、λバクテリオファージベクターＣｈａｒｏｎ
　４ａにおいてヒトＤＮＡライブラリーを作製する。約
１×１０６個の別々の組換えファージを大腸菌（Ｌ並旦
）に１２／８０３上にプレートし、そして下記のように
して、核酸のハイブリダイゼーションにより、ヒトＣに
Ｌ鎖配列の存在およびヒ）Ｉｇγ４］（鎖配列の存在に
ついてスクリーニングする。

７．２　　ヒトＣに−ＡＤＮＡセグメントのニックトラ
ンスレーションで３２ｐ−ラベル化すれたマウスＩｇＬ
鎖のＤＮＡプローブは、例３．１に記載したものに従っ
て調製され、そして例４．２に記載の方法を使って組換
ファージをスクリーニングするのに使用される。公表さ
れた標準法（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　対
ルエ１２７９．１９７８）を使って、プラーク精製され
た明らかにハイブリダイズしているプラークからＤＮＡ
を単離する。こうして、ヒトＣにコードセグメントを含
む２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡ断片を単離し、そ
してＥｃｏＲ■で線状化されたプラスミドベクターｐＢ
Ｒ３２２中に両方の配向においてサブクローニングする
。これらプラスミドをそれぞれｐＤＡ１３ｂおよびｐＤ
Ａ１４ａと命名する。ｐＤＡ１４ａの制限地図を作製し
、そしてそれを第３図に示す。

７．３　　ヒト　４ＦＩ−ＤＮＡセグメン　のマウスγ
２ｂ遺伝子座のＸｂａＩ／Ｈｈａｌ断片に相当する、ニ
ックトランスレーションで２２　ｐ　−ラベル化された
マウスＩ　ｇ　Ｇ　１１鎖のＤＮＡプローブは、以前に
記載されたように（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅ１ｌ　
２９　６７１゜１９８２　）組換ファージをスクリーニ
ングするのに用いられている。１つのＤＮＡクローン（
＄１８８）は、制限マツピングおよびＭａｘａｍ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ｉＬ５６０．１９７７）を用いる
ヌクレオチド配列分析により決定すると、ヒ）ｒ４遺伝
子座を含有する。配列分析されたクローン＃１８８の部
分は、発表されたヒトγ４遺伝子の２７−９８位のヌク
レオチド（ＥＭＢＬデータベース配列登録ＨＵＭＩＧＣ
Ｄ２）のものと正確に一致する。ｒ４遺伝子座の４つの
エキノンを含む、３　ｋｂの旧ｎｄ　ｍ　／　ＥｃａＲ
Ｉ　　ＤＮＡ制限断片を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｅｃ
ｏＲＩで切断したプラスミドベクター　ｐＵｃ１２中に
サブクローン化する。できたプラスミドをｐｒ４／１と
命名する。ｐ　ｒ　４　／　１中のＨｉｎｄ１１１部位
は、Ｂａｌ　ｂ　／　ｃマウスＤＮＡの１４遺伝子座中
に見出される（ＥＭＢＬデータベース配列登録ＨＵＭ　
ＩＧＣＤ２の１位のヌクレオチドＨＥｌｌｉｓｏｎら、
ＤＮＡ上、　１１．１９８１）。ＥｃｏＲＴ部位は、ク
ローン驕１８８の末端のＣｈａｒｏｎ　４ａλバクテリ
オフアージクローニングベクター中のＥｃｏＲＩクロー
ニング部位から由来する。ｐγ４／１の制限地図は第４
図に示される。

狙主：マウス　ヒ　　　４・に　キメ−−ＣＥＡマウス
／ヒトキメラ抗−ＣＥＡＨ鎖およびし鎖遺伝子それぞれ
を担持するキメラ構成物を作製し、そして次に下記（例
８および９）に記載の２つの発現ベクターの助けをかり
て宿主細胞に移入せし、める。

他に言わない限り、実験手順はＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍ
ｏ１ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ、＋　１
９８２）により記載されたものである。

マウスＬｔ４ＩｇのＩＩＩＮＡ転写のエンハンサ−を含
有する約４７５ｂｐのＡｌｕ　Ｉ　　ＤＮＡ制限断片（
Ｐｉｃａｒｄおよび５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　３０７．８０．１９８４；　Ｂａｌ　ｂ／Ｃマウス
のＬ鎖Ｉｇ遺伝子座の３６９１−４１６４位のヌクレオ
チド、ＥＭＢＬデータベース配列登録ＭＵＳＩＧＫＪＣ
２）を、制限エンドヌクレアーゼＳｍａ　Ｉで線状化さ
れたｐＵｃ１２プラスミドベクター中に平滑末端連結に
よりクローン化する。連結されたＤＮＡを受容能のある
（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）　Ｅ、　　コリ　Ｋ１２／８０
３中に形質転換せしめ、そして５　Ｑ　４ｇ　／　ｒｒ
ｌｌのアンピシリンを含む栄養寒天（Ｏｘｏｉｄ）プレ
ート上で一晩増蒼させた後に選択する。可能なりＮＡ挿
入部の２つの配向のうち、第３図に示された制限地図の
プラスミドｐＥＬ２２を保有するクローンを選択する。

ｐＥＬ２２は、マウスのゲノムと同じ配向において４７
５ｂｐのマウスＡｌｕ　Ｉ　　ＤＮＡ断片を含み、その
３′端がｐＵｃ１２ベクター中のＥｃｏＲＩ部位と隣接
している。その配向は、例４．３に記載のＳａｎｇｅｒ
シーケンシングプロトコールを用いるヌクレオチドシー
ケンシングにより、プラスミドＤＮＡ分子の直接シーケ
ンシングのための変法（ＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ
、　ＤＮＡ　４．１６５．１９８５）を使って決定され
る。使用されるシーケンス用ブライマーはＡｎｅｒｓｈ
ａｍの逆シーケンス用プライマーである。（クローニン
グおよびシーケンシングハンドブック、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ，ＵＫ）　。

８．２　　キメ−Ｌ　　’　　　　　　ＣＥＡ−ＣにＧ
ａｐＣＥＡ−ＣにＧａの作製スキームは、第３図に示さ
れる。プラスミドｐＤＡ１４ａ　（例７．２）およびプ
ラスミドｐＥ１２２　（例日、１）を制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲ■で完全消化する−　１）ＤＡ１４ａの
２．．５ｋｂのＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片挿入部を１％（
Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動によりベクター配列か
ら分離し、そし、てフェノール／ＣＨＣｌ５抽出後エタ
ノール沈澱により回収する（例３．２）。等モル量のＥ
ｃｏＲＩ−切断ｐＥＬ２２およびＩ）ＤＡ１４ａの２．
５ｋｂのＤＮＡ挿入部を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使って４°Ｃで一晩一緒に連結し
、これを使って受容能のあるＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２
／８０３を形質転換せしめる。５０ｎ／ｄのアンピシリ
ンを含む栄養寒天プレート上にプレートしそして３７゛
Ｃで一晩インキエベートすることにより、アンピシリン
耐性コロニーを選択する。単一のコロニーを選択しそし
て、Ｉｓｈ−１１ｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５、９．２９８９．１
９８１）により記載された方法に従って５蔵のミニ培養
物からプラスミドＤＮＡを調製する。ｐＥＬ２２の転写
エンハンサー含有要素に関する２、　５　ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ　断片の方向を決定するために、制限エンドヌクレ
アーゼＸｂａ　Ｉによる組換えプラスミドの消化が使用
される。望ましい方向においてこれら断片を含有するク
ローンをｐＫＹ１４ａと称するｔ　Ｉ）ＫＹ１４ａのＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉで部分消化し
、フェノール／Ｃ）ＩＣｆ、で抽出し、そしてエタノー
ル沈澱により回収する。回収後、該ＤＮ八をｄＮＴＰｓ
の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）により処理して、Ｘｂａ　Ｉ−切断
ＤＮＡ末端にフィル−イン反応を行い、受容能のある（
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）　Ｅ。

Ｃｏ１１　Ｋ１２／８０３中に形質転換せしめ、そして
前述したようにして個々のアンピシリン耐性クローンか
らプラスミドＤＮＡの微量調製を行う。ｔｌｉｎｄ　Ｉ
Ｉ［＋ＸｂａＩを使った末端消化による組換えプラスミ
ドの制限マツピングは、第３図中央カッコで示される位
置に欠失したＸｂａ　Ｉ制限部位を有する組換えプラス
ミドを同定するために使用される。

ｐχａ５．５の完全なりＮＡ挿入部（約３ｋｂ）を、該
プラスミドのＥｃｏＲＩでの部分消化、続いてＳａｌ　
Ｉでの完全消化、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳
動によるベクターＤＮＡ配列からの分離、次いで前述し
たようなフェノール／ＣＨＣ１ｘ抽出およびエタノール
沈澱により単離する。ｐＣＥＡ−Ｌ２ａの約２ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩ　／　Ｓａｌ　Ｉでの末端
消化の後に同様に回収される。回収された両Ｄ　Ｎ　Ａ
断片を定量する。真核のプラスミドベクターｐＳＶ２ｇ
ｐ　ｔ（ＭｕｌｌｉｇｅｎおよびＢｅｒｇ、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２０９．１４２２．１９！３０）をＥｃｏＲＩ
で完全消化し、そしてＤＮＡを同様にフェノール／ＣＨ
Ｃｆ□で抽出し、エタノール沈澱後に回収し、そして定
量する。等モル世のＥｃｏＲＩ−切断ｐｓＶ２ｇＦＩｔ
、　ｐＣＥＡ−Ｌ２ａの２ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　Ｓａ
ｌ　　ＩマウスＤＮＡ断片、およびｐＸｂａ５．５の３
ｋｂのＳａｌ　Ｉ　／ＢｃｏＲＩマウスＤＮＡ断片を、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の存在
下３部分連結反応において連結する。前述のようにして
組換えプラスミドを再び選択し、そして正しい方向で該
ＤＮＡ断片を有するものを制限マツピングにより特徴づ
ける。ｐＣＥＡ−ＣにＧａと命名された１つの組換え体
は、第３図に示される方向において前記両断片を含有す
る。

ｐＳＶ２ｇｐｔ由来の選択マーカー遺伝子（ｇｐｌおよ
びマウス／ヒトキメラＬ　ｔ＊　Ｉ　ｇ遺伝子は、同じ
転写方間を有する。

Ｂａ１ｂ／ｃマウスのゲノムからの１．６ｋｂのＨｉｎ
ｄｍ　／　ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡセグメント（１９６３
−３５５９位のヌクレオチド；　ＥＭＢＬデータバンク
配列登録ＭＵＳ　Ｉ’ＧＣＤＯ７）をｄＮＴＰｓの存在
下ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片（Ｂｏｅｈｒ　
ｉｎｇｅｒ）で処理し、平滑末端化された二本鎖のＤＮ
Ａ分子を生じさせる。ｔｇＤＮＡをフェノール／Ｃｌ１
（／！３で抽出し、そしてエタノール沈澱後回収する。

二本鎖の旧ｎｄｌ［Ｉ　ＤＮＡリンカ−を、Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の存在下における
連結により付加せしめ、そして抽出／沈澱操作を繰り返
す。

次いで該ＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩ
ＩＩ＋ＸｂａＩで処理し、そして生じた２つのＸｂａ　
／ＨｉｎｄｌＩ［断片のうち小さい方（約６７０ｂｐ）
を、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動によりもう
一方のものから分離した後に単離する。例８．２に記載
した手順を使って１．この断片をＸｂａＬ’　Ｈｉ　ｎ
ｄ　ｌｌｌ−切断ｐＵｃ１３プラスミドベクター中にク
ローニングする。ｐＤＡ４　（第４図）と称する生じた
プラスミドは、マウスＨ鎖Ｉｇの転写エンハンサ−を含
有する。

８．４　　キメ−Ｈ’　　／７ｌ−７（ＣＥＡ−−４＞
１ａ）ＥＣＯＲＩ　＋１Ｉｉｎｄ　ＩＩ［での切断の後
、アガロースゲル電気泳動／フェノール−ＣＨＣｆ□抽
出／エタノール沈澱により、ｐＤＡ４のマウスＩｇエン
ハンサー含有断片を回収する。ｐγ４／１の約３ｋｂの
ＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩｒ　ＤＮＡ挿入部も同様に単
離する。この２断片を、ＥｃｏＲＩでの消化により線状
化されたｐＢＩ？３２２プラスミドベクターと連結する
。Ｅ、コリに１２／８０３中への形質転換の後、形質転
換体を選択し、そしてプラスミドＤＮＡの微量調製を行
う。ＥｃｏＲＩ　。

ＨｉｎｄＩ［［およびＰｓｔｌを使った制限マツピング
は、希望するＤＮＡ断片を含有する組換えクローンの同
定を導く。これらのクローンのうちの１つをｐＤＡ１６
ａ（第４図）と命名する。制限エンドヌクレアーゼＸｂ
ａ　ＩおよびＥｃｏＲＩを使った末端消化、次いでアガ
ロースゲル電気泳動／フェノール−ＣＨＣｊ！３抽出／
エタノール？ｉ　ＢＯ後、ｐＤＡ１６ａの約３．７ｋｂ
の挿入［ＩＮＡ断片を回収する。Ｈ８遺伝子の再配列さ
れたｖ−ｏ−Ｊ４　Ｈ５Ｈ＜セグメントを含有する、ｐ
Ｈ８ａｌの約１．７ｋｂのＥｃｏＲｒ　／χｂａｌ断片
も同様シニ精型する。これら２断片を定量し、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の存在下、Ｅｃ
ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで線状化されたｐＳＶ２
ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　＆　ＢｅｒｇＪ、Ｍｏ１．
八ｐｐ、Ｇｅｎｅｔ、１．３２７．１９１３２）との等
モル蚤での三部分連結反応において連結せしめる。大腸
菌に１２／８０３中に形質転換せしめ、前述のようにし
て組換え体を選択し、そしてＥｃｏＲＩ、　ＨｉｎｄＩ
Ｉ１、　ＰｓｔｌおよびＸｂａ　Ｉを使った制限マツピ
ングにより特徴づける。希望とする方向に該ＤＮＡ断片
を有する組換え体をｐＣＥＡ−γ４Ｎａと命名する。こ
のプラスミドにおいては、ベクター１）ＳＶ２ｎｅｏ由
来の選択マーカー遺伝子（ｎｅｏ）がマウス／ヒトキメ
ラＨ鎖Ｉｇ遺伝子と同じ転写方向を有する。

■豆：マウス１ンバ、 におシるマウス　ヒト Ｓ　Ｐ　２　／　Ｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１．ＪＬ）は、
よく特徴づ２すられたリンパ系起源のマウス細胞系であ
る。それは、ミエローマＭＯＰＣ−２１のサプラインで
あるミエローマＸ６３−Ａｇ１３とマウス肺臓細胞との
融合から得られた細胞系のＩｇ非分）泌変異株である（
ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｊｅｉｎ、　Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｏ１、β、　５１Ｌ　１９７６　；Ｓｈｕ
ｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２７６、２７０．１９７８
）。例２に記載した補充ＤＭＥＭ培地中で増殖された５
ｐ２１０を５０戒の滅菌済試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０
７０）中での穏やかな遠心（１３０ｇ　、　４°Ｃ）に
より捕獲し、そして４°ＣにおいてＰＢＳ−ＣＭ　（Ｓ
ｅｒｏｍｅｄ　）巾約ｌＸｌ０”細胞＠／ｄの濃度に洗
浄／再Ｑｉする。細胞を氷上に３０分間維持する。

キメラＨ鎖Ｉｇ遺伝子調製物（ｐＣＥＡ−ｒ　４Ｎａ）
のトランスフェクションは、Ｔ　Ｅ　４％街液液５０４
中スーパーコイルｐＣＥＡ−ｒ　４Ｎａ　ＤＮＡ　２０
　ｔｔｇを氷上で滅菌済プラスチック製試験管中のＰＢ
Ｓ−ＣＭ　２００．Ｊ中の１×１０７個のＳ　ｐ　２　
／　Ｏ細胞に添加することにより行われる。該細胞をＴ
Ａ　７５０電気トランスフエクシジン装Ｋ　（Ｋｒｕａ
５５　ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ、　　Ｗ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）の筒に入れ、そして使用前に咳装＝の筒の中に滅
菌済の水冷ＰＢＳ−叶を注入することにより予め冷却さ
れた、該製造業者により提供された円筒形のエレクトロ
ボレーションチャンバーヲ使って３５００　Ｖ／　ｃｍ
の成る電気パルスに１０μｓ間さらす。細胞をきれいな
滅菌済の凍結用試験管（Ｎｕｎｃ）中に追い出し、そし
て氷上で１０分間維持し、その後、増殖培地（上記参照
）で希釈後さらに２０分間室温でインキュベートする。

次いで細胞を、１５％ｐｃｓ　。

１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋　１０ｍＭ　１ｌｅｐｅ
５、　　１ｍＭグルタミン、　１００　ｕ　Ｍゲンタマ
イシン（Ｇｉｂｃｏ）、　５ｎｇ／緘インスリン＋５ｎ
ｇ／ｍｆ）ランスフェリン＋５ｐｇ／　ｍｌセレニウム
（ＣＲ−ＩＴＳプレミックス、Ｃｏ１１ａｂｏｒａ−ｔ
ｉｖｅ　Ｒｅ５、Ｉｎｃ、）、　５６ｕｇ／ｍ１葉酸（
Ｓｅｒｏｍｅｄ）　＋　３６ｔｉｇ／ｄＬ−アスパラギ
ン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および１１６趨／ｄＬ−ア
ルギニン塩酸塩（Ｃａ　ｌ　ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）を含有
するＤＭＥＭ増殖培地ｌｄ中で約ｌＸｌ０’細胞数／ウ
エルの細胞密度になるように２つの４８ウ工ル組織培養
クラスター（Ｃｏｓ　ｔａｒ）中の９６ウエルに分配す
る。７．５％ＣＯ□を含む湿潤雰囲気中３７°Ｃで４８
時間インキｘ　＜−ジョン（ｌｌｅｒａａｕｓ　Ｃｙｔ
ｏｐｅｒｍインキュベーター）した後、１■／雁のＧ４
１８−スルフェート（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、　Ｇｉｂｃ
ｏ　０６６−１８１１）の添加により、トランスフェク
トされた細胞を選択する。

培地および薬剤を２日毎に交換する。例９．２に記載し
た゛ドツト°”分析法を使って、１４日後に該細胞をヒ
ト■ｇＧの発現についてスクリーニングする。

キメラＨ鎖遺伝子構成物だけでトランスフェクトされた
Ｓ　ｐ　２　／　Ｏ細胞の培地中にｒｇのＨ鎖タンパク
質は全く検出されないと思われる。何故なら、Ｈ鎖はＬ
鎖と一緒になった後でのみ分泌されるが、Ｓ　ｐ　２　
／　Ｏ細胞は機能的なＨ鎖ポリペプチドを含まないから
である。キメラＩｇＨ鎖遺伝子ｐＣＥＡ−γ４Ｎａでト
ランスフェクトされた細胞りこおける紺ｊおａ辺−Ｈ鎖
ポリペプチドの発現は次のようにして確認される。トラ
ンスフェクト細胞（”Ｘｌ０５）を穏やかな遠心により
培地から収集し、ＰＢＳで洗）争し、そして１０バのＨ
ｚＯに再、４層する。細胞をドライアイス中での凍結お
よび３７°ＣでのＡ”４　？３にの３回の繰返しにより
破壊する。細胞破片を室温における５、０００ｇでの遠
心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆ　
ｕｇｅ　）により取り除く。酢酸セルロース膜（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ、　）ｌＡＷＡＧ＋濾孔サイズ０．４５μ
ｍ）上へ上清試料（ＩＯＩｌｌ）をドツトすることによ
る、Ｔｏｗｂｉｎ＆　Ｇｏｒｄｏｎにより記載された方
法により、細胞内の重鎮の発現を分析する。その膜をＲ
ｒＡ−緩衝液（ＰＢＳ中のＩ％ＢＳＡ（Ｆｌｕｋａ　Ｆ
ｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、　０５４８０ＬＯ０２％ＮａＮｉ
　（Ｍｅｒｃｋ）、　ｏ、　１％フェノールレッド（Ｓ
ｅｒｏｍｅｄ）　）中３７°Ｃで２０分間インキュベー
トすることにより、非特異的結合をブロックした後、Ｐ
ＢＳ中で洗浄し、そしてＲＩＡ−緩マＪｉ）夜中１　：
　１０００の希釈度でヤギの抗ヒトＩｇＧ　（アルカリ
ホスファクーゼでラベル化されているもの、Ｔａｇｏ　
）を含有する発色用血清中３７゛Ｃで２特開インキユベ
ートする。その膜をＰＢＳ中で６回、次に水中で６回）
先浄し、その後、使用直前に調製した次の２つの溶液：
（ａ）水中１’　＊　／　ｒｄのＦａｓｔ　Ｂｌｕｅ　
Ｂ塩（Ｆｌｕｋａ４４６６０）、　　Ｃｂ　）　６０ｒ
ｎＭホウ酸賎衝淑ｐ！１９．７中１ｍｇ／　ｍｌの２−
ナフチルホスフェート−ナトリウム塩（Ｆｌｕｋａ　、
　７１１００）　；の１：１混合物かろ成る基質緩衝液
中室温で１５分間インキュベートする。メタノール：酢
酸：水（５：１：５．ｖ／ｖ）中でその膜をインキュベ
ートすることにより反応を止める。アルカリホスファタ
ーｆ活性を意味する強く呈色したシグナルを与えるもの
（即ち高レベルの細胞内ヒ）　ＩｇＧ重鎖の発現）に相
当する種々の細胞をクローン化する。いくつかのそのよ
うなりローン化細胞系から、キメラＬ鎖遺伝子構成プラ
スミドｐＣＥＡ−Ｃｘ　Ｇａでの二巡目のトランスフェ
クション用に１つ（ＥＦ■／　ｒ　４’、Ｊａ７５−７
５）を選択する。

９．３　　キメ−Ｌ　　Ｉ　　　　　　ＣＥＡ−ＣにＧ
ａでのン 例９．２に従って調製されたＥＦ■／　ｒ　４Ｎａ７５
−７５またはいずれかの他の細胞系は、例２に記載の培
地中で増殖させることにより増やされる。穏やかな遠心
により約ｌＸｌ０’個の細胞を収集し、そして氷上で２
００４のＰＢＳ−口中に洗浄／懸濁する。次いで１０硝
のスーパーコイルｐＣＥへ−ＣにＧａ　ＯＮＡヲ（吏っ
て細胞区をトランスフェクトし、そして例９．２に記載
した方法を使ってトランスフェクシントを組繊培養クラ
スター中にプレートする。６０時間増殖後、０．１２５
ｎ／戚のミコフェノール酸（Ｃａｌ−ｂｉｏｃｈｅｍ＋
　４７５９１３＋　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓから）、２５０ＩＩｇ／ｒｎ１のキサンチン、お
よびヒボキサンチン／チミジン（ＨＴ、　５０倍濃縮液
、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　６２３０９１）の１＝４５
希釈液を含む増殖培地を使って、トランスフェクトされ
た細胞を選択する。ミコフェノール酸の濃度は、次に続
く１４日間の増殖期間内で０．５μｇ　／　ｍｌまで増
加され、）ｆＴおよびキサンチンの量は一定に維持され
る。この期間の後、組織培養クラスターからの細胞培養
物を、例９．４に記載のようにして、分泌されたヒト　
ＩｇＧについて分析する。

平底のミクロ−ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ、
　Ｄｙｎａｔｅｃｈ。

Ｍ１２９Ａ）を、４　’Ｃでの一晩のインキュベーショ
ンにより１μｇ／ウェルのヤギの抗−ヒトに抗体（Ｔａ
ｇ。

０６０４０１　）または５００ｎｇ／ウェルの精製ヒト
ガン胎児抗原（Ｔａ２０５．　ローザンヌ大学、生化学
部のＪ、Ｐ。

Ｍａｃｈ＠Ｆｔより提供）のどちらかでコートする。Ｐ
ＢＳで洗浄した後、給温チャンバー中３７°Ｃにおいて
２０分間ＲＩＡ−緩衝液（例９．２）とインキュベート
し、次にＰＢＳで洗浄することにより、非特異的結合を
ブロックする。細胞の上清（５０μりを加えそして３７
°Ｃで２時間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後
、ＴＥ緩衝液中で、推薦される希釈度（１：　１０００
）のアルカリホスファクーゼでラベル化されたヤギの抗
−ヒトＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ、　９０２００２）を使っ
て、結合したキメラ抗体を発色させる。プレートを３７
°Ｃで２時間インキュへ−１・する。そのプレートをＰ
ＢＳで数回洗浄した後、基質用緩衝液（）ＩｚＯ８００
成、ジェタノールアミン９７戒、ＥＨＣｆ　１３０ｍ２
．ＮａＮｚ　２００ｍ、ｇ、　ＭｇＣｆｆ　２　・６Ｈ
ｚ０２００ｍｇｐｌ＋は９．７に言用整）１０ｄ中２当
量のホスファターゼ’Ｓ　質（Ｐ−ニトロフェニルホス
フェート、Ｓｉｇｍａ。

１０４Ｒ）から成る基質緩衝液１５０μ！を添加する。

３７°Ｃでの１５分間のインキュベーションの後、託し
た。

ＣＨ３Ｓ−５−６により分泌されるキメラ抗体（γ４；
に）の量の定量のために、幾つかのヒト１８Ｇ４にミエ
ローマ［５タンパク質（Ｄｒ、Ｆ、５ｋｖａｒｉ１、　
　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　Ｂｅｒｎａにより）を（吏用する。この
テストによれば、該ｌ−ランシスェクトーマＣＥ７５−
５−６は、増茄６日後、培地に１４／ｄのキメラ抗体を
分泌する。

定する。高レベルの分泌されたヒ）　ＩｇＧを有する平
行したウェルからの生存可能な細胞をクローン化する。

幾つかのそのようなりローンのうちの１つをＥＦ■／　
ｒ　４Ｎａ７５−７５／Ｃ＋（Ｇａ５−６（ＣＥ−７５
−５−６と呼称する）と命名し、これを、パリのパスツ
ール・インスツルメンツの微生物国際寄託機関“Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”に
寄託番号第１−７２０号のもとに１９８７年１２月１５
日寄マウス／ヒトキメラ抗−ＧＥＡのＨ鎖およびＬ　１
Ｎ遺伝子をそれぞれ含有するキメラ構成物を作製し、こ
れを、次の例１０および１１に記載するようにして、キ
メラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子を含んで成る単一のベクター
の助けをかりて宿主細胞中に移入させる。特に示さない
限り、実験の手順はＭａｎｉａｔｉｓらにより記載され
たものである（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ１″、　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎ、Ｙ、。

１９８２　）　　。

ｐＬＣＥＡ／１４Ａ（Ｗａｌｆｉｅｌｄら、Ｎｕｃ１、
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５、８＋４６８９、１９８０）から２
ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　／　Ｘｍｎ　Ｉ断片および１．．１
　ｋｂのＸｉｎ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ断片をを離するこ
とにより、該ジャームラインの配列からマウスＣＰ：遺
伝子を除去する。このプラスミドは、７．０ｋｂのＢａ
ｍ１ｌ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ制服断片上に、Ｊ２逮結セ
グメントにおいて再配列されたマウスＮＳ２　Ｃに軽鎖
遺伝子を含む。この断片は、Ｗａｌｆｉｅｌｄら（前掲
）により記載されたＭＯＰＣ２１／ＭＳ−１ｎ由来の７
．０ｋｂのＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片と等価である。

３．９ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片の正確な配列は
、ＥＭＢＬデータベース登録ＭＵＳＩＩ、ＫＪＣ２中の
２３６８−６２５８位のヌクレオチドにより与えられる
。

ＰｓｔｌおよびＢａｎ＋ＨＩで二重に消化されたベクタ
ｐＵｃ１２中へのこれら２つの断片のクローニングで、
９Ｍ１ΔＣにと命名された組換えプラスミドが生じる。

生じたクローン化断片は、Ｊ５連結セグメントの２６８
ｂｐ下流のＰｓｔ１部位で始まるマウスの免疫グロブリ
ンＬ鎖遺伝子座から該Ｐｓｔｆ部位の３８８４ｂｐ下流
のＢａｍ　１部位までのジャームライン配列を含む。下
記のヌクレオチド位置；ヨ、このＰｓｔｒ＞２識部位の
最初の塩基に基づいて表示されている。該断片は、それ
のもとの生殖細胞系列配置中ノ１５４２−１６６６位に
マウスＩｇＣにエンハンサ−配列を包含する。マウスＣ
にコード領域は、２０２１位と２７５４位との間が、こ
の位置に存在するＸｍｎ　Ｔ部位を使って除去されてお
り、除去されたＣに遺伝子の接合部位にＸｍｎ　１部位
が再度作製されている。

全Ｐｓｔ　Ｉ　／　Ｂａｍ　Ｔ断片は３１５２ｂｐであ
り、そしてクローニングのために２０１７−２０２６位
において除去されたマウスＣに遺伝子のＸｎ＋ｎ　Ｉ部
位の所にユニクＸｍｎ　Ｉ部位を有する。９Ｍ１ΔＣに
の制限地図は第５図に示される。

ヒトＣｘコード配列を、２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／　Ｅ
ｃｏｌ？■断片を含有しその中に約３２０ｂｐのヒトＣ
ｘコード領域が位置するプラスミドｐＢＲ３２２組換え
体のプラスミドＩ）ＤＡ１４ａから単離する。このプラ
スミドは例７．２に記載されており、そして制限酵素地
図は第３図および第５図に示される。７２４ｂｐのＳｐ
ｈ　ｒ／’Ｈｈａｌ断片を精製巳、そして３′突出末端
をＴ４バクテリオファージのＤＮＡ−ポリメラーゼで平
滑末端にする。咳断片はヒ）ＣＫ遺（立子コー（′配列
の１０６ｂｐ５’側で始まりそして２９６ｂｐ３　’側
に及ぶ。

それはヒトＣに遺伝子コード配列の１７７ｂｐ３’側シ
こあるポリアデニル化部位も包含する。

９Ｍ１ΔＣｇは、２つのＸｍｎ　Ｉ部位を含み、１つは
、除去されたマウスＣに配列の接続部位に、そしてもう
１つは、アンピシリンに対する耐性を付与するｐＵｃ１
２由来のβ−ラクタマーゼコード配列中に含有する。９
Ｍ１ΔＣには部分的にアンピシリン耐性である。９Ｍ１
ΔＣにをＸｍｎ　Ｉで部分消化し、そして線状形のもの
をゲル−精製する。この物質の５０％がβ−ラクタマー
ゼコード配列中のＸｍｎ　１部位で制限消化され、５０
％が要求されるかってのマウスＣにの位置で制限消化さ
れる。

ヒトＣに断片の第ｌＸｍｎ１部位中への挿入は、機能的
β−ラクタマーゼ遺伝子を持たない祖換えプラスミドを
もたらし、よって組換え体だけがヒトＣに断片をかって
のマウスＣに領域の位置に含有することがわかる。２つ
の配向が可能である。

制限エンドヌクレアーゼＡｖａ　Ｕを用いた組換えブ、
ラスミドの制限分析により、Ｎ一端がマウスエンハンザ
−領域に最も近い、正しい配向；こおいてヒトＣに断片
を含有するプラスミドを単離する。このプラスミドをｐ
ＭＩＨｕｃに一１ａと命名する。

マウスＣＥＡの軽鎖配列をＭｉ換えプラスミドρＣＥＡ
−Ｌ２ａから単離する。このプラスミドは、マウス抗−
ＣＥＡ　Ｌ鎖の機能的可変部分をコードする１゜９ｋｂ
のＸｂａ　Ｉ　／　Ｘｂａ　Ｉ断片を含み、そして前に
記載されている（例４．２）。制限地図は第１Ａ図、第
３図および第６図に示される。

部分的Ｘｂａ　Ｉ消化に続いて完全ＥｃｏＲ■消化によ
り、１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉ　ＩＪＲ
片上においてマウス抗−ＣＥＡ軽鎖可変セグメントを単
１補する。この断片は、ｐＵｃ１２ポリリンカー由来の
余分の２４ｂｐを有し、ＢａｍＨＩ　、　　Ｓｍａ　Ｉ
およびＳａｃ　Ｉの制限部位を含む。これら部位はマウ
スの抗−ＣＥＡ可変可変−コード領域′側にある。最後
のゲノム構成物において、それらは組換え断片と発現ベ
クターとの接合位置にある。

その１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉ断片を、
マウスＩｇＣｒ：エンハンサ−およびヒトＣにツー１名
り戊を含む、前述のｐＭｌ）１ｕ（：　ｘ−１ａからの
３．８ｋｂのＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片と連結させる。

クローニングのために、それをＰｓｔＩ部位の１８ｂｐ
下流のＸｂａＴ部位およびｐＵｃ１２ポリリンカー（こ
れは該ＢａｍＨ１部位の下流に１８ｂｐを付加する）中
のＥｃｏＲＩ部位を使って、Ｓｍａ　［およびＳａｃ　
Ｉ制限部位を包含するＸｂａ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片
として単離する。それらのポリリンカー配列は、組換え
断片と発現ベクターとの第二接合位置にある。

前記の２つの断片を結合し、そしてＥｃｏＲＩで制限消
化された発現ベクターｐｓＶ２ｇｐｊ中に３部分連結に
おいてクローニングする。ｇｐｔ遺伝子に関する該断片
の２つの配向物は、ｇｐｔおよびマウス可変部位抗−Ｃ
ＥＡ−ヒトＣにが共に同じ方向（配向物ａ）または反対
の方向（配向物ｂ）のどちらかにおいて単離される。２
つの配向物とも、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌｌ
ｒおよびＰｓＬＩを用いた二重消化により同定される。

それらをｐＭｃｅａＣに一１ａおよびｐＭｃｅａＣに一
１ｂ　と命名する。それらのＤＮＡ１入部は、もとのツ
ウスゲ２２ムの配置において、マウス可変部抗−ＣＥＡ
−ヒトＣに定常部の免疫グロブリンＬ鎖の全コード領域
を含有する。該断片を、約５．７ｋｂの単一のＥｃｏＲ
Ｉ　／ＥｃｏＲＩ断片として回収する。

１０．３　　キメラＨ’　　−（ＣＥＡ−４Ｎａ）例８
．３および８．４に記載したようにして、キメラＨ鎖遺
伝子ｐＣＥＡ−γ４Ｎａを作製する。

マウス抗−ＣＥＡ−ヒト定常部のキメラ軽鎖および重鎖
Ｉｇ遺伝子は共に、単一のＥｃｏＲＩ　／　ＥｃｏＲｒ
断片上に含まれ、該軽鎖遺伝子はｐＭｃｅａＣに−１８
中の５．７ｋｂの断片上、該重鎮遺伝子はｐＣＥＡ−γ
４Ｎａ中の５．３ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　ＥｃｏＲＩ断
片上に含まれる。該軽鎖および重鎖のＥｃｏＲＩ　／Ｅ
ｃｏＲＩ断片を接合しそしてその接合位置のＥｃｏＲｒ
部位を消滅させることにより、マウス／ヒト（γ４；χ
）抗−ＣＥＡ１４ｉおよびＬ　鎖ｒ　ｇ遺伝子のための
全コード配列およびＪＮｎ配列が１つの１１．０ｋｂの
ＥｃｏＲＩ　／’ＥＣＯＲＩ　ＩＦ１片上にある、二重
Δ伝子構成物が作製される。

ｐＭｃｅａＣｘ　−１ａ　８よびｐＣＥＡ−７４Ｎａを
ＥｃｏＲＩで限定消化し、続いて大腸菌のＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大断片（フレノウ断片）で５′突出端をフィ
ルインする。線状形の各プラスミドをゲル精製し、続い
て制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌおよびＨｐａ　Ｉ
で二重消化する。これによりｐＳＶ２ｇｐ　ｔまたはｐ
ＳＶ２ｎｅ。

ベクターそれぞれからキメラ断片が遊離される。

何故なら、）Ｉｐａ　（制限部位は前記の２つのベクタ
ー中だけに存在するからである。各断片のＥｃｏＲ（５
′末端のうち１つだけが平滑末端である。他のものは“
粘着性″の５’　−ＥｃｏＲＩ突出端を残している。Ｔ
４バクテリオファージを用いて、その２つの断片を１：
１の比において接合して連鎖状分子を形成せしめる。あ
る数の軽鎖断片が１本の重鎮断片の平滑末端と連結され
る。ＥｃｏＲＩで゛の完全ｃ肯化は、ある数の１１．０
ｋｂのＥｃｏＲｌ　／ＥｃｏＲｌ　断片を生じ、その１
／３が、重鎮のマウス／ヒト（γ４；χ）キメラ抗−Ｃ
ＥＡ断片に結合した軽鎖である。

洩り２７′３は、推定上クローン化できない重鎮−重鎖
および軽鎖−軽鎖の二量体から成る。

約１１．０ｋｂのＥｃｏｌ？　Ｉ　／　ＥｃｏＲｒ断片
のゲル精製、続いてＥｃｏＲＩで消化されたｐＳＶ２ｇ
ｐ　ｔまたはｐＳＶ２ｎｅ。

発現ベクター中へのクローニング、および受容能のある
大腸菌に１２／８０３の形質転換は、多数の組換えプラ
スミドをもたらす。にれらを、プラスミドｐＣＥＡ−Ｌ
２ａ　（例４．２）から単離された、マウスの抗−ＣＥ
Ａ可変部軽鎖配列をコードする１、９ｋｂのＸｂａ１／
Ｘｂａｌ断片とのコロニーハイブリダイゼーションによ
りスクリーニングする。陽性のコロニーからＤＮＡを調
製し、そして重鎮および軽鎖のマウス／ヒト（Ｔ４；に
）キメラ抗−ＣＥＡ　ＤＮＡ片を共に有する組換えプラ
スミドを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　、　Ｘ
ｍｎ　ＩおよびＰｓｔｌを使った制限酵素分析により同
定する。この方法で１つの組換えプラスミドが得られ、
これをｐＣＥＡ　（Ｈ＋Ｌ）　２ｎｅｏと命名する。そ
の抗−ＣＥＡ重鎖および軽鎖キメラ断片は、反対の転写
方向に配ヱされている。抗−ＣＥＡ重鎖断片は、ρ５Ｖ
２ｎｅｏ中のｎａｏ遺伝子と同じ転写方向である。抗−
ＣＥＡＬ瑣キメラ断片とＨ慎キメラ断片との接合位置の
ＥｃｏＲ１部位は消去されるが、平滑化された２つのＥ
ｃｏＲ１部位の結合により作られるような、予想される
Ｘｍｎ　１部位は存在しない。

この二重キメラ遺伝子構成物から、マウス／ヒト（Ｔ４
；に）抗−ＣＥＡ　Ｌ鎖およびＨ鎖コード配列並びに調
節配列が約１１．Ｏｋｂの単一のＥｃｏＲＩ／　Ｅｃｏ
Ｒ■断片として単離される。　　ｐＣＥＡ（Ｈ＋Ｌ）２
ｎｅｏの制限地図は第６図に示される。

マウス／ヒト（γ４；に）キメラ抗−ＣＥＡ　Ｉｇ遺伝
子二重構成物ｐｃＥＡ　（Ｈ＋Ｌ）　２ｎｅｏのトラン
スフェクションは、ｐｃＥＡ　（Ｈ＋Ｌ）　２ｎｅｏか
らの約１１．０ｋｂの単一のＥｃｏＲＩ／　ＥｃｏＲＩ
断片上へのマウス／ヒ！−（ｒ４；に）抗−ＣＥＡ　Ｈ
鎖およびＬ鎖の単離により達成される。この断片１５躇
を、ＥｃｏＲＩで線状化されたｐｓＶ２ｎｅｏ　１．５
　ｐｇとＴＥｉ衝液５０！！！中で混合し、次に、マウ
ス／ヒト（Ｔ４；に）キ、４うを冗−ＣＥへの単一のＩ
ｇ遺伝子構成物について例９に記載したのと全く同様に
して、５ｐ２１０マウスリンパ系細胞にトランスフェク
トさせる。

ネオマイシン耐性についての選択、抗体の検出およびト
ランスフェクトされた細胞において分泌されたＩｇＧレ
ベルの測定は、例９．２および９．３それぞれに記載し
たのと全く同様にして行われる。

こうして１クローンの細胞系を単離し、そして該キメラ
モノクローナル抗体の高い発現レベルについて選択し、
これをＥＦＩＸ−ｐＣＥＡ−Ｉｇ−（ｒ　４　；　Ｃに
）４−８−１３　（ＣＥ４−８−１３と称する）と命名
し、１９８８年１１月２２日にパリのＩｎ５ｔｉｔｕｔ
　Ｐａ５ｔｅｕｒの”　Ｃｏ　ｌ　ｌｅｃ　ｔ　１ｏｎ
Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃ１ｕｔｕｒｅｓ　ｄｅ　
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ”に第１−８１８号の
もとに寄託した。

形質転換体ＣＥ４−８−１３は、例９．４に記載した方
法により測定すると、６日間増殖後に１０μｇ／ｄのキ
メラ抗体を培地中に分泌する。

ｌｕ：＝キメーモノクローナル士−の４５うづけ該キメ
ラモノクローナル抗体（Ｔ４；に〕のＣＥＡへの結合は
、キメラ抗体の選択について例９．４に記載されたＥＬ
ＩＳＡ試験により測定される。

細胞系ＣＥ４−８−１３により分泌されたキメラ抗−Ｃ
ＥＡＭＡｂでは、該試験において０．１の光学濃度を与
えるためには、なくともＦ３ｎｇ／ｍｌの該ＭＡｂを必
要とする（第７図）。競合試験用には、精Ｗ　ＣＥＡ抗
原およびＣＥ２５ハイフ′リドーマから生ずるマウスの
１１１水からの精製ｒｇ画分を使用する。使われる方法
は、公表された手順（Ｖｏｌｌｅｒら、”Ｍａｎｎｕａ
ｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”１
９７６、５０６）に基づく。ＥＬＩＳＡ試験における該
キメラ抗体の精製ＣＥＡへの結合は、可溶性のＣＥＡに
より又は精製されたネズミのＣＥ２５抗体でもどちらで
も阻害される。分泌されるキメラモノクローナル抗体の
９９％以上が、固定化されたＣＥＡ抗Ａ抗原上着され得
る。ヤギの抗−マウスＩｇＧ＋　（アルカリホスファタ
ーゼでラベル化）を使って発色せしめると、観のＣＥ２
５／＼イブリドーマはネズミの（Ｔ１；に）抗体を生産
する一方、ＣＨ３Ｓ−５−６およびＣ２０−８−１３は
生、垣しない。

上記の免疫学的試験は、細胞系ＣＥ７５−５−６および
Ｃ２０−８−１３により分泌される抗体が、（ａ）ＣＥ
Ａ抗原に結合する； （ｂ）ヒト定常部領域（γ４；に）決定因子を所有し且
つマウス起源の対応する決定因子を欠く；（ｃ　）　Ｃ
Ｅ２５ハイブリドーマから生産される、対するネズミの
抗体により阻害される； （ｄ）それらの結合が可溶性ＣＥＡにより阻害さるので
、ＣＥＡ抗原に特異的に結合する；（ｅ）前記のキメラ
Ｈ１Ｍ及びＬ鎖Ｉｇ１ｊｔ伝子を含有する形質転換体に
おいて高レベルで生産される（ＣＨ３Ｓ−５−６により
３　ｔ！ｇ／　ｍｌ　；　Ｃ２０−８−１３により１０
ｎ／ｍｌ）　　； ことを証明する。

例１３ニー　　　ｔム　　　のためのキメ−モノクロ１
３．１　　試ｍ釦底 該キメラモノクローナル抗体を合成している前記のよう
な細胞系を、充填法ベツドカラムのガラスピーズ上で増
殖させる。二〇カラム用のプレ培養物は、次のようにし
て８用型される二４つのコンフルエントな１７５ｄの組
繊培養フラスコからの細胞を、１つのＮｕｎｃステープ
ラ−に摂取するのに使用する。付着性細胞層を、同体積
のトリプシン溶液（Ｇｉｂｃｏ、　　０．５　ｇ　／　
１　）およびＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、　１　：５
０００　）で作られたトリプシン／Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液
ですすぐことにより、粘着細胞を該フラスコから引き離
す、４Ｘ１０’個の細胞を、改良条件化ＤＭＥＭ培地（
ＤＭＥＭ＠＊ａ　＝　１　ｍＭピルビン酸ナトリウム、
２ｍＭグルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール
、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび、他に指示されていなけ
れば１０％ＦＣＳ、を含有するＤＭＥＭ）　４００　ｄ
中に懸濁する。新たなりＭＥＭ−ｄを加えることにより
その懸濁液の体積を５００ｄに合せる。５００ｄの細胞
懸濁液をＮｕｎｃステープラ−に移し、そして１０％Ｃ
Ｏ□を含む空気雰囲気中３７°Ｃでインキニベートする
。接種４日後、７日後および１０日後に追加の培地（３
×５００ｄ）を添加する。接種１４日後、細胞を捕獲し
、そして充填法ペンドリアクターに接種するの液を該ス
テープラ−に添加し、そして全細胞層をこの溶液に浸す
。フリーのトリプシン／　Ｖｅｒｓｅｎｓ溶液を流しだ
し、そして細胞層を、残っているトリプシン／Ｖｅｒｓ
ｅｎｅ溶液に５分間接触させておく。

５００ｄの条件化培地をその細胞に戻す。該ステープラ
−を徹底的に振ることにより、該細胞を分離させる。さ
らに１．５２の条件化培地を該ステープラ−に加え、そ
して全細胞懸濁液を充填法ベツドリアクターに移す。そ
のリアクターは、直径２皿のホウ珪酸塩を詰めた１０ｆ
ｆｉの円筒形ガラス容器から成る。培地を４５　ｆ／ｈ
の速度で、外圧ポンプにより該リアクターを通して循環
させる。循環している培地の溶解酸素濃度およびｐＨは
測定されそして連続して調節される。１０％飽和以上の
最少溶解酸素レベルを維持するのに純粋酸素が使われ、
そしてｐＨを７．０〜７．３に調節するのにはＣＯ□お
よびＩＮ　、ＪａＯＨが使われる。核リアクター中の１
゛夜体および外の循環液の体積は５！である。その系は
水浴中３７°Ｃに維持されている。接種後、１０％血清
含有ＤＭＥＭ培地中で細胞を増殖させる。培地中のグル
コースのレベルがＩｇ／ｆ以下に落ちたらすぐに、培地
の連続交換を２Ｉ！、７日の速度で開始する。溶解酸素
レベルが２０％に減少したら、供給培地中の血清濃度を
１．２５％に下げる。２日後、交換の割合を１１／日に
する。翌日、さらに５Ｉ！日の最大値に達するまで、交
換の割合を増やす。

この時点以降、キメラ抗体の単離および精製のために外
を流れる培地を収集する。

１３．２　　キメ−モノクローナル　　の　　および■ Ｍｉｎｉｔａｎの限外濾過系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃ
ｏｒｐ、、　Ｂｅｄ−ｆｏｒｄ、　Ｍａ５５、）を使っ
て、０．１　ａｍのカセットフィルター（ＶＶＬＰＯＭ
Ｐ０４タイプ、Ｍ　ｉ　ｌ　１１ｐｏｒｅ）を通して該
培地を′濾過する。３０，０００ｉ１Ｗカツトオフのフ
ィルターカセット（ＰＴＴＫＯＭＰ０４タイプ、ＭｉＬ
ｌｉｐｏｒｅ）を付けたＭｉｎｉｔａｎの限外濾過系を
使ってその濾液を１０倍に濃縮する。次いで濃縮された
保持物を１．５Ｍグリシンおよび３ＭＮａＣ１の最終濃
度までグリシンおよびＮａＣｆ−を添加することにより
プロティンＡセファロース上でのクロマトグラフィー用
に調製する。培地濃縮物をプロティンＡセファロースＣ
Ｌ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　
Ｓｗｅｄｅｎ）を含むカラムに通した後、非結合の物質
を結合緩衝液（１，５Ｍグリシン、３Ｍ　Ｎａ（／！、
　ＮａＯＨでｐＨ８，９に調整）でカラムから洗い落と
し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａアプリケーションノート
（セパレーション・ニュースＶｏ１．１３゜漱５）に記
載されたようにして、５Ｍ　ＮａＯＨ’？？ｐＨ３、０
、４，０、５，０および６．０に調整された１００ｍＭ
クエン酸から成るｐｌ＋低下用の段階的勾配を使ってカ
ラムから溶出させる。ｐＨ４，０で溶出するキメラ抗体
の最高の濃度をＥＬＩＳＡ試験により決定する。

例１４：アルカ！ホスフ　　−ゼによるキメーモグルタ
ルアルデヒド（０，２％Ｖ　／　Ｖ　）を使うＶｏｌｌ
ｅｒらの標準法（Ｂｕｌ１、　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔ
ｈ　Ｏｒｇａｎ＋５３＋５５、１９７６）に従って、１
．４　ｄのＰＢＳ中の１．４■のキメラモノクローナル
抗体を、５ｍｇのアルカリホスファターゼＣ５ｉｇ　ｍ
　ａ　Ｐ　６７７４　＋　■−Ｔタイプ）を含む溶液と
２時間カップリングする。その接合体を１ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２　ｚ、　１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ：＋を
含む５戒の０．０５Ｍｌ−リス緩衝液（ｐＨ８，０）中
に移す。その溶液は４°Ｃの暗室中に保存される。

１４．２　　分五王皿 ポリプロピレンのミクロタイタープレート（Ｄｙｎａ　
ｔｅｃｈ）を、緩衝液ｐＨ８，６（０，０２％アジ化ナ
トリウムを含む炭酸塩緩衝化０．９％塩類溶液）中の細
胞系Ｃ１１！７５−５−６またはＣ２０−８−１３によ
り分泌されるキメラモノクローナル抗体の溶液１５０μ
ｌで３７°Ｃにて２時間に渡って、そして４°Ｃにて一
晩コートする。そのプレートをＰＢＳで５回洗い、そし
てまだ残存しているタンパク質反応性の部位を緩衝液ｐ
Ｈ７，４（ＰＢＳ中の０．２％ゼラチンおよび０．２％
ＮａＮ＋）２５０Ｉとの３７°Ｃにおける１ｈ時間のイ
ンキュベーシヨンにより飽和する。このようにしてコー
トされたプレートは、この緩衝液中４°Ｃにて数日間保
存できる。

テスト溶液または精製ヒＩ−ＣＥＡを含有する標準液の
希釈シリーズ５０４、緩衝ｉ！ｐＨ７，４５０４および
緩衝液ｐＨ７，４で１：１００に希釈された、キメラ抗
体（例１４．１）よりも別のＣＥＡ−エピトープを認識
するホスファターゼラベル化モノクローナル抗−ＣＥＡ
抗体ＭＡｂ　、３５（Ｈａｓｋｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５、　４３＋３８５７、１９８３）の溶液５０ｍ
を混合し、そしてミクロタイタープレート中で３７°Ｃ
において２時間および４°Ｃにおいて３０分間インキュ
ベートする。

該プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いでｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート溶液（１０％ジェタノー／Ｌ／７ミ
ン緩衝液中１　ｍｇ／ｍｌ　、　０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ
！、ｚ　、　ｐＨ９、８）１５０Ｉｌｌと３７°Ｃにて
３０分間インキュベートする。４０５ｎｍにおける光学
濃度を測定することにより、放出されたｐ−ニトロフェ
ノールの量を決定し、これは結合した酵素ホスファター
ゼの量に比例し、そしてテスト溶液中のヒトＣＥＡＯ量
に逆比例する。

テストはまた、細胞系ＣＥ７５−５−６またはＣＨ２−
８−１３により分泌された酵素ラベル化キメラモノクロ
ーナル抗体を使いそして別のＣＥＡ−エピトープを該キ
メラ抗体よりも認識するモノクローナル抗−ＣＥＡ抗体
ＭＡｂ　３５でミクロタイタープレートをコーティング
することによって行なわれ得る。

１４．３　　ＥＬＩＳＡ　　−ス　キ・・ト例１４．２
に記載の分析用のテストキットは次のものを含む。

ポリプロピレンミクロタイタープレート、２０ｍ１・・
・炭酸塩緩衝化塩溶液（０，９％ＮａＣｌ　。

０．４２％ＮａＨＣＯ３，０，００７２％ＮａｚＣＯ＋
、０．０２％ＮａＮ＋）中の、細胞系ＣＥ７５−５−６
またはＣＨ２−８−１３により分泌されたキメラモノク
ローナル抗−ＣＥＡ抗体（１０ｐｇ／ｍ１）、１　ｍ（
１・−・・−）リス緩衝液（０−０５Ｍ　＋　　１　ｍ
Ｍ　ＭｇＣＩ−ｚ、１％ＢＳＡ、　　０．０２％ＮａＮ
、　ｐＨ５、　Ｏ）中の、該キメラ抗体よりも別のＣＥ
Ａ−エピトープを認識するアルカリホスファターゼ結合
モノクローナル抗−ＣＥＡ抗体（Ｑ、　３　ｍｇ抗体／
ｄ）、 ３００ｄ−ＰＢＳ。

３００ｄ・・・緩衝液ｐＨ７，４（ＰＢＳ中０．２％ゼ
ラチンおよび０．２％ＮａＮ：＋）。

５０雁・・・ジェタノールアミン緩衝液（１０％、０．
５ｍＭ　ＭｇＣＱ　２ＩＯ，０２％ＮａＮ１．ＨＣｊ２
でｐＨ８，９に調整）中の２−ニトロフェニルホスフェ
ート（１■／戚）、 検量線、 カラー目盛板、 指導書。

劃」」−二　　　ロア　　・・言、＋１例１３に従って
調製されたキメラモノクローナル抗体１２０ｍｇを生理
的食塩水５　ｍｆｌ中に溶かす。その溶液を細菌フィル
ターに通し、そしてその濾液を無菌条件下でアンプルに
詰める。そのアンプルを好ましくは冷凍庫中、例えば−
２０°Ｃで保存する。

【図面の簡単な説明】

制限部位の記号：　　Ａ−Ａｌｕ　Ｉ　、　Ｂ−Ｂａｍ
ＨＩ　、　Ｂｇ−ＢｇｌＵ＋　Ｅ−ＥｃｏＲＩ、　Ｈ−
）１ｉｎｄｌＩ［、Ｈｈ−Ｈｈａ１、　Ｐ−ＰｓｔＩ＋
５ａ−Ｓａｔ　Ｉ　＋　５ｐ−５ｐｈ　ｒ　、　Ｘ−Ｘ
ｂａ　Ｉ　＋　Ｘｍ−Ｘｍｎ　Ｉ■＝可変領域のＩｇ遺
伝子セグメント Ｊ：連結セグメント Ｄ：多様性セグメント Ｌ：リーダー配列 わくで囲まれた部分は、再配列されたＶｆｉＮ域および
それのリーダーペプチドコードセグメントの位置（黒ぬ
りの部分）、並びにＪセグメントの位置（白ぬきの部分
）を示している。 玉工皿 （Ａ）Ｇ　：　Ｊセグメントの位置およびＪ　ｊＪ［域
プローブの由来を示す、マウスＬ鎖ｒｇ遺伝子座の生殖
細胞系列の配置。 （Ｅ）　　：ＣＥ２５ハイプリドーマＤＮＡのサザンプ
ロット分析により検出することのできない、クローン化
されたＨ８遺伝子中のＥｃｏＲＩ部位。 】じ口」 ノーザンプロット分析（例６）によるＣＥ２５ハイプリ
ドーマ細胞中のＨ２およびＨ８特異的ｍＲＮＡ転写物の
検出。 （ａ）Ｈ２のし鎖遺伝子セグメントを使った場合 （ｂ）Ｈ８のＨ鎖遺伝子セグメントを使った場合 Ｐ３−ＮＳ２／ｌＡｇ４−細胞ＲＮＡ　（ＮＳ　）およ
びＣＥ２５ハイブリドーマ−細胞ＲＮＡ　（ＣＨ３Ｓ　
）それぞれ２５鱈および５０羅のＲＮＡプロット。 玉１区 マウス／ヒトキメラム鎖遺伝子ｐＣＥＡ−ＣにＧａの作
製スキーム（例８．１および８．２　）　。 記号二上記参照。 Ｈ２およびＨ２，５：サザンプロット分析（例３）から
推定されるＣＥ２５ハイブリドーマ−特異的再配列し鎖
Ｉｇ遺伝子の制限酵素地図。 プラスミドｐｃＥへ−Ｌ２ａ　：　Ｌ　２遺伝子のクロ
ーン化セグメント。 （Ｂ）Ｇ：Ｊセグメントの位置およびＪ領域プローブの
由来を示す、マウスＨ鎖Ｉｇ遺伝子座の生殖細胞系列の
配置。 Ｈ２およびＨ８：サザンブロソト分析（例３）から推定
されるＣＥ２５ハイブリドーマ−特異的再配列Ｈ鎖ｒｇ
遺伝子の制限酵素地図。 プラスミドｐｔ（８ａｌは図示されていないが、ｐＣＥ
ＡＬ２ａと同様にして作製されそしてＨ８遺伝子のＸｂ
ａｌ／Ｘｂａｌセグメントを含有する。 箪土皿 マウス／ヒトキメラド鎖遺伝子ｐＣＢＡ−ｒ　４Ｎａの
作製スキーム（例８．３および８．４）。 記号：上記参照。 第１皿 ｐＭＩＨｕｃ　ｘ−１ａの作製スキーム（例１０．１お
よび１０．２）。 記号：上記参照；括弧内にある制限部位は、種々のクロ
ーニング操作の間に除去される。 凪１皿 マウス／ヒト（Ｔ４；に）抗−ＣＥＡのＨＩＭおよびＬ
鎖Ｉｇ遺伝子の両方を担持しているキメラニ重構成物ｐ
ＣＥＡ　（Ｈ＋Ｌ）　２ｎｅｏの作製スキーム。 記号二上記参照；括弧内にある制限部位は種々のクロー
ニング操作の間に除去される。 星１０ ＣＨ２−８−１３により分泌されたキメラモノクローナ
ル抗体のＣＥＡへの結合。 ＯＤ：光学濃度。 啓−一二性 ｐ ＤＲ 塩基対 相補性決定領域 ｄＮＴＰ ＮＴＰ ＭＥＭ ジデオキシリボヌクレオチド三リン 酸（Ｎ＝アデニン、シトシン、グア ニン、またはチミン） デオキシリボヌクレオチド三リン酸 （Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニ ンまたはチミン） Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地 （ＤｕｌｂｅｃｃｏおよびＶｏｇＬ、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ。 皿、　１６７、１９５４） ＴＴ ＥＤＴＡ Ｃ５ ＥＰＥＳ ｉ（ＡＴ ）ＩＴ Ｉｇ ｂ ０ＰＳ ＮＺ−アミン ＢＳ ＢＳ−ＣＭ ＩＡ ＤＳ ジチオトレイトール エチレンジアミン四酢酸 ウシ胎児血清 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ ン−Ｎ’−２’　−エタンスルホン酸 ヒボキサンチン／アミノプテリン／ チミジン ヒポキサンチン／チミジン 免疫グロブリン キロ塩基（対） γ−モルホリノプロパシスルホン酸 ＮＺ−アミン（Ｌｏｇ／　ｊ２）　；Ｎａ（／！　（５
ｇ／ｆ）；酵母抽出物（５ｇ／Ｃ Ｄｌｆｃｏ）　；カザミノ酸（Ｉｇ／ｊ！。 Ｄｉｒｃｏ）　；　Ｍｇ５Ｏａ　　＋　ＩＨｔＯ（２ｇ
　／　１２　）　。 ＮａＯＨでｐＨ７，５に調整 リン酸緩衝化塩溶液 ＭｇＣｆ、およびＣａＣ１ｚの無いＰＢＳラジオイムノ
アッセイ ドデシル硫酸ナトリウム ０ＸＳＥＴ ５Ｃ ＴＥ緩衝液 Ｔｒｉｓ ３　Ｍ　　ＮａＣｌ１．２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．４　
ＭＴｒｉｓ−ｔｉｃ　ｌ　、　　ｐＨ７，８０，１５Ｍ
　ＮａＣｊ！、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム １ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
、　ｐＨ８，０トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、マウス由来の可変領域およびヒトの定常部領域から
   成り、ヒトのガン胎児抗原（ＣＥＡ）を認識するキメラ
   モノクローナル抗体、並びにその誘導体。 ２、非特異的交差反応性抗原ＮＣＡ＿５＿５およびＮＣ
   Ａ＿９＿５上、胆汁の糖タンパク質上、または顆粒球上
   に存在しないＣＥＡのエピトープを認識する、請求項１
   に記載のキメラモノクローナル抗体およびその誘導体。 ３、ヒトＣＥＡに対して少なくとも２．１×１０＾１＾
   ０リットル／モルの親和力を有する、請求項１または２
   に記載のキメラモノクローナル抗体。 ４、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （上式中、ＦＲ＿１は２３−２８個の天然に存在するア
   ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ＿２
   は１４−１６個の天然に存在するアミノ酸を含んで成る
   ポリペプチド残基であり、ＦＲ＿３は３０−３４個の天
   然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプチド残基で
   あり、そしてＦＲ＿４は９−１１個の天然に存在するア
   ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ここでア
   ミノ酸Ｃｙｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成して
   いることがある）の軽鎖可変領域を含んで成る、請求項
   １、２または３に記載のキメラモノクローナル抗体およ
   びその誘導体。 ５、前記フレームワーク領域ＦＲ＿１、ＦＲ＿２、ＦＲ
   ＿３およびＦＲ＿４が好ましくはネズミの抗体中に存在
   するものである式 I の軽鎖可変領域を含んで成る、請
   求項１−４のいずれか一項に記載のキメラモノクローナ
   ル抗体およびその誘導体。 ６、ＦＲ＿１が式 I Ａ： 【遺伝子配列があります】（ I Ａ） （上式中、Ａは水素原子、アシル基、またはＡｌａ−Ｓ
   ｅｒ−Ａｒｇ、Ｓｅｒ−ＡｒｇもしくはＡｒｇ残基であ
   る）のポリペプチド残基であり、 ＦＲ＿２が式 I Ｂ： 【遺伝子配列があります】（ I Ｂ） のポリペプチド残基であり、 ＦＲ＿３が式 I Ｃ： 【遺伝子配列があります】（ I Ｃ） のポリペプチド残基であり、 ＦＲ＿４が式 I Ｄ： 【遺伝子配列があります】（ I Ｄ） のポリペプチド残基であり、そして 上式中のアミノ酸Ｃｙｓが酸化状態においてＳ−Ｓ架橋
   を形成していることがある、式 I の軽鎖可変領域を含
   んで成る、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ
   モノクローナル抗体およびその誘導体。 ７、ＦＲ＿１、ＦＲ＿２、ＦＲ＿３およびＦＲ＿４がそ
   れぞれ式 I Ａ、 I Ｂ、 I Ｃおよび I Ｄのポリペプチ
   ド残基であり、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３
   Ｌの外側において１または複数個の単一アミノ酸が別の
   アミノ酸に置き換えられておりそしてアミノ酸Ｃｙｓが
   酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることがある
   、式 I の軽鎖可変領域を含んで成る、請求項４に記載
   のキメラモノクローナル抗体およびその誘導体。 ８、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （上式中、ＦＲ＿５は３２−３６個の天然に存在するア
   ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ＿６
   は１４−１６個の天然に存在するアミノ酸を含んで成る
   ポリペプチド残基であり、ＦＲ＿７は３２−３４個の天
   然に存在するアミノ酸を含んで成るポリペプチド残基で
   ありそしてＦＲ＿８は１２−１４個の天然に存在するア
   ミノ酸を含んで成るポリペプチドであり、ただしアミノ
   酸Ｃｙｓは酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成している
   ことがある）の重鎖可変領域を含んで成る、請求項１〜
   ８のいずれか一項に記載のキメラモノクローナル抗体お
   よびその誘導体。 ９、前記フレームワーク領域ＦＲ＿５、ＦＲ＿６、ＦＲ
   ＿７およびＦＲ＿８が好ましくはネズミの抗体中に存在
   するものである、式IIの重鎖可変領域を含んで成る、請
   求項１〜８のいずれか一項に記載のキメラモノクローナ
   ル抗体およびその誘導体。 １０、ＦＲ＿５が式IIＡ： 【遺伝子配列があります】（IIＡ） （式中、Ｂは水素原子またはアシル基である）のポリペ
   プチド残基であり、 ＦＲ＿６が式IIＢ： 【遺伝子配列があります】（IIＢ） のポリペプチド残基であり、 ＦＲ＿７が式IIＣ： 【遺伝子配列があります】（IIＣ） のポリペプチド残基であり、 ＦＲ＿８が式IIＤ： 【遺伝子配列があります】（IIＤ） のポリペプチド残基であり、そして アミノ酸Ｃｙｓが酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成し
   ていることがある、式IIＡの重鎖可変領域を含んで成る
   、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラモノクロ
   ーナル抗体およびその誘導体。 １１、ＦＲ＿５、ＦＲ＿６、ＦＲ＿７およびＦＲ＿８が
   それぞれ式IIＡ、IIＢ、IIＣおよびIIＤのポリペプチド
   残基であり、ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈ
   領域の外側において１または複数の単一アミノ酸が別の
   アミノ酸で置き換えられており、そしてアミノ酸Ｃｙｓ
   が酸化状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることがあ
   る、式IIＡの重鎖可変領域を含んで成る、請求項８に記
   載のキメラモノクローナル抗体およびその誘導体。 １２、軽鎖ヒト定常部領域κまたはλを含んで成る、請
   求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラモノクロー
   ナル抗体およびその誘導体。 １３、重鎖ヒト定常部領域γ１、γ２、γ３またはγ４
   を含んで成る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の
   キメラモノクローナル抗体およびその誘導体。 １４、軽鎖ヒト定常部領域κおよび重鎖ヒト定常部領域
   γ４を含んで成る、請求項１〜１３のいずれか一項に記
   載のキメラモノクローナル抗体およびその誘導体。 １５、ＦＲ＿１、ＦＲ＿２、ＦＲ＿３およびＦＲ＿４が
   それぞれ式 I Ａ、 I Ｂ、 I Ｃおよび I Ｄのポリペプ
   チド残基でありそしてアミノ酸Ｃｙｓが酸化状態におい
   てＳ−Ｓ架橋を形成していることがある式 I の軽鎖可
   変領域、並びにＦＲ＿５、ＦＲ＿６、ＦＲ＿７およびＦ
   Ｒ＿８がそれぞれ式IIＡ、IIＢ、IIＣおよびIIＤのポリ
   ペプチド残基でありそして式中のアミノ酸Ｃｙｓが酸化
   状態においてＳ−Ｓ架橋を形成していることがある式I
   Iの重鎮可変領域を有する、請求項１〜１４のいずれか
   一項に記載のキメラモノクローナル抗体およびその誘導
   体。 １６、フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか
   一項に記載のキメラモノクローナル抗体の誘導体。 １７、酵素、蛍光マーカー、金属キレート、細胞増殖抑
   制性物質もしくは細胞毒性物質、アビジンビオチンまた
   はその他との接合体である、請求項１〜１５のいずれか
   一項に記載のキメラモノクローナル抗体の誘導体。 １８、放射能でラベル化されている、請求項１〜１５の
   いずれか一項に記載のキメラモノクローナル抗体の誘導
   体。 １９、前記キメラモノクローナル抗体を生産する哺乳類
   細胞を生体外で増殖せしめそして所望であれば生じたキ
   メラモノクローナル抗体をその誘導体に変換することを
   特徴とする、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗
   体およびその誘導体の調製方法。 ２０、前記キメラモノクローナル抗体を生産する哺乳類
   細胞を生体内で増殖せしめそして所望であれば生じたキ
   メラモノクローナル抗体をその誘導体に変換することを
   特徴とする、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗
   体およびその誘導体の調製方法。 ２１、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体の軽
   鎖ネズミ可変領域および／または重鎖ネズミ可変領域を
   コードする挿入部を含んで成る、組換えＤＮＡ。 ２２、細胞系ＣＥ２５のゲノムＤＮＡから由来しヒトＣ
   ＥＡに特異的な軽鎖ネズミ可変領域をコードする挿入部
   を含んで成る、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。 ２３、式 I のポリペプチドをコードする挿入部を含ん
   で成り、イントロンを含有することがある、請求項２１
   または２２に記載の組換えＤＮＡ。 ２４、ＦＲ＿１、ＦＲ＿２、ＦＲ＿３およびＦＲ＿４が
   それぞれ式 I Ａ、 I Ｂ、 I Ｃおよび I Ｄのポリペプ
   チドをコードする挿入部を含んで成り、イントロンを含
   有することがある、請求項２１〜２３のいずれか一項に
   記載の組換えＤＮＡ。 ２５、次の式： 【遺伝子配列があります】（III） の挿入部を含んで成る、請求項２１〜２４のいずれか一
   項に記載の組換えＤＮＡ。 ２６、１０６９−１１０２位、１１４７−１１６７位お
   よび１２６３−１２９１位の外側の式IIIのヌクレオチ
   ド配列において、１または複数の単一ヌクレオチドが別
   のヌクレオチドで置き換えられている式IIIの挿入部を
   含んで成る、請求項２３に記載の組換えＤＮＡ。 ２７、細胞系ＣＥ２５のゲノムＤＮＡから由来しヒトＣ
   ＥＡに特異的な重鎖ネズミ可変領域をコードする挿入体
   を含んで成る、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。 ２８、式IIのポリペプチドをコードし所望によりイント
   ロンを含む挿入部を含んで成る、請求項２１または２２
   に記載の組換えＤＮＡ。 ２９、ＦＲ＿５、ＦＲ＿６、ＦＲ＿７およびＦＲ＿８が
   それぞれ式IIＡ、IIＢ、IIＣおよびIIＤのポリペプチド
   残基をコードしており所望によりイントロンを含む挿入
   部を含んで成る、請求項２１、２７または２８に記載の
   組換えＤＮＡ。 ３０、次の式： 【遺伝子配列があります】（IV） の挿入部を含んで成る、請求項２１、２７〜２９のいず
   れか一項に記載の組換えＤＮＡ。 ３１、５７５−５９５位、６２９−６８０位および７７
   ６−８０５位それぞれの外側の式IVのヌクレオチド配列
   において１または複数の単一ヌクレオチドが別のヌクレ
   オチドにより置き換えられている式IVの挿入部を含んで
   成る、請求項２８に記載の組換えＤＮＡ。 ３２、ヒト定常部領域κまたはλと融合した軽鎖ネズミ
   可変領域をコードする挿入部を含んで成る、請求項２１
   に記載の組換えＤＮＡ。 ３３、ヒト定常部領域κと融合した式IIIの挿入部を含
   んで成る、請求項３２に記載の組換えＤＮＡ。 ３４、ヒト定常部領域γ１、γ２，γ３またはγ４と融
   合した重鎖ネズミ可変領域をコードする挿入部を含んで
   成る、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。 ３５、ヒト定常部領域γ４と融合した式IVの挿入部を含
   んで成る、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ。 ３６、所望により発現調節配列に連結された、請求項３
   ２に記載のネズミ／ヒトキメラ軽鎖をコードする挿入部
   および／または請求項３４に記載のネズミ／ヒトキメラ
   重鎖をコードする挿入部、完全なレプリコン並びに１ま
   たは複数の優性マーカーを含んで成るハイブリッドベク
   ターである、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。 ３７、所望により発現調節配列に連結された、請求項３
   ３に記載のネズミ／ヒトキメラ軽鎖、および／または請
   求項３５に記載のネズミ／ヒトキメラ重鎖、完全なレプ
   リコン並びに１または複数の優性マーカーを含んで成る
   ハイブリッドベクターである、請求項２１に記載の組換
   えＤＮＡ。 ３８、哺乳類細胞に適する請求項３６または３７に記載
   のハイブリッドベクターである組換えＤＮＡ３９、該ベ
   クターがプラスミドｐＳＶ由来である、請求項３６、３
   ７または３８に記載のハイブリッドベクターである組換
   えＤＮＡ。 ４０、該ベクターがプラスミドｐＳＶ２ｐｇｔまたはプ
   ラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ由来である、請求項３９に記載
   のハイブリッドベクターである組換えＤＮＡ。 ４１、形質転換された宿主を培養することを含んで成る
   、請求項２１に記載の組換えＤＮＡの調製方法。 ４２、次の段階： ａ）適当なハイブリドーマ細胞系からネズミのＤＮＡを
   単離し、ヒトＣＥＡに対して向けられるモノクローナル
   抗体の可変領域をコードしている所望のＤＮＡを、ＤＮ
   Ａプローブを使って選択し；ｂ）ゲノムライブラリーか
   らヒトＤＮＡを単離し、モノクローナル抗体の定常部領
   域を、ＤＮＡプローブを使って選択し； ｃ）段階ａ）およびｂ）のＤＮＡを適当なハイブリッド
   ベクター中に組み込むことにより、マウス／ヒトキメラ
   遺伝子を作製し； ｄ）得られたハイブリッドベクターを受容体宿主中に移
   入せしめ；そして ｅ）形質転換された宿主を選択しそして培養する； を含んで成る、請求項４１に記載の方法。 ４３、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の組換え
   ＤＮＡにより形質転換されている宿主細胞。 ４４、リンパ系由来の哺乳類細胞である、請求項４３に
   記載の宿主細胞。 ４５、Ｉｇ−非分泌性のマウスハイブリドーマ細胞系Ｓ
   ｐ２／Ｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）由来の細胞である
   、請求項４３に記載の宿主細胞。 ４６、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の１つま
   たは２つのベクターにより形質転換されている、請求項
   ４３〜４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。 ４７、細胞系ＥＦVIII／γ４Ｎａ７５−７５／ＣκＧａ
   ５−６（ＣＥ７５−５−６）の細胞である、請求項４６
   に記載の宿主細胞。 ４８、細胞系ＥＦIX−ｐＣＥＡ−Ｉｇ−（γ４：Ｃκ）
   （ＣＥ４−８−１３）の細胞である、請求項４６に記載
   の宿主細胞。 ４９、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体を分
   泌することを特徴とする、請求項４３に記載の宿主細胞
   。 ５０、適当な細胞をエレクトロポレーション、カルシウ
   ム処理、マイクロインジェクションまたはプロトプラス
   ト融合により、１または２つのベクターで形質転換する
   ことを特徴とする、請求項４３または４９に記載の宿主
   細胞の調製方法。 ５１、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体のガ
   ンの診断および療法への利用方法。 ５２、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体およ
   びその誘導体の、ヒトＣＥＡの定性および定量への利用
   方法。 ５３、ラジオイムノアッセイまたはエンザイムイムノア
   ッセイにおける、請求項５１に記載のキメラモノクロー
   ナル抗体およびその誘導体利用方法。 ５４、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体およ
   び／またはその誘導体並びに、所望により他のモノクロ
   ーナルもしくはポリクローナル抗体および／または添加
   剤を含有する、ヒトＣＥＡの定性および定量のためのテ
   ストキット。 ５５、請求項１に記載のキメラモノクローナル抗体また
   はその誘導体を含有する医薬組成物。