PT100195B - Anticorpos monoclonais quimericos e humanos que se ligam a epitopos de receptores de factor de crescimento da epiderme, seus vectores de expressao, processo de preparacao e composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Sector técnico da invenção

A invenção refere-se a novos anticorpos mohoclonais humanizados que compreendem uma sequência de consenso modif_i cada artificial, pelo menos da cadeia pesada das FR nas regiões variáveis duma imunoglobulina humana.

A invenção refere-se, além disso, a anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos que sao determinantes para os epitopos do factor de crescimento epidérmico. A invenção descreve a sequência de aminoácidos do sítio de ligaçao do antigénio de resposta para este receptor.

A invenção refere-se a composiçoes farmacêuticas que compreendem os mencionados anticorpos para fins de tratamento de tumores, como melanomas, gliomas ou carcinomas. Podem-se utilizar os referidos anticorpos também para as utilizações de diagnóstico em relação à localização e avaliaçao dos citados tumores in vitro ou in vivo.

A presente memória descritiva refere-se a diversos termos técnicos que sao neste contexto definidos como se segue:

Anticorpos humanizados’ significa anticorpos que compreendem as regiões de estrutura (FR) das regiões constantes e variáveis de aminoácidos, localizados nas cadeias leves e pesadas que derivam de seres humanos, enquanto as regiões hipervariáveis derivam de origens nao humanas.

Anticorpos quiméricos significam anticorpos que compreendem regiões variáveis e hipervariáveis que derivam de origens nao humanas, enquanto as regiões constantes derivam de origem humana.

FRs significa a região de estrutura de um anticorpo e encontram-se dentro das regiões variáveis. Nestas regiões ocorre uma certa alteraçao dos aminoácidos.

CDRs significa a determinação da complementaridade ou regiões hipervariáveis de um anticorpo e encontram-se dentro das regiões variaveis. As referidas regiões representam o local de ligaçao do antigénio específico e mostram uma imensa troca de aminoácidos. As CDRs sao, primariamente as responsáveis pela afinidade de ligaçao do antigénio,

A sequência de consenso significa uma sequência de aminoácido que ocorre de forma nao natural, como cadeia leve ou pesada das regiões·· variáveis e é utilizada como substituto para as regiões de cadeia pesada ou leve, nao humanas, originalmente presentes. A sequência de consenso é uma sequência sintética e, portanto, artificial da maior parte dos aminoácidos comuns duma classe distinta ou subclas. -se ou subgrupo de cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas humanas.

EGF e EGFR significam o factor de crescimento epidérmico e o seu receptor.

Regiões significa regiões variáveis de cadeia leve.

Regiões significa regiões var.iáveis de cadeia pesada.

Fundamentos da invenção;

Produziu-se o anticorpo monoclonal murino 425 (mAb 425) contra a linha de células de carcinoma humano e constatou-se que se ligava a um epitope de polipéptido no dominio externo do. receptor do factor de crescimento da epiderme humana (EGFR). Verificou-se que o mencionado anticorpo inibe a ligaçao do factor de crescimento da epiderme (EGF), tanto nos sitios EGFR com reduzida afinidade, como com grande afinidade (Murthy et al., 1987). Constata-se que uma expressão aper feiçoada do EGFR ocorre no tecido maligno a partir duma varie

dade de fontes, tornando o Mb 425 ⁰ possível agente para o diagnóstico e o tratamento terapêutico de tumóres humanos. D 3 facto, verificou-se que 0 anticorpo Mb 425 intervinha na-citótoxicidade in vitro e suprimia o crescimento das células do tumor das linhas de células derivadas- de carcinomas epideo móide e coiorectal in vitro (Bodeck et al., 1987). compro vou-se também que o anticorpo Mb 425 rotulado-cpm radio se ligava a xenotransplantes de gliomas malignos'humanos em.ratos (Takahashi et al., 198?)·

O factor de crescimento epidérmico liGF é uma hormo na de polipéptido que é mitogénieá para as células epidérmicas e epiteliais. Quando o factor BH? interaetua com as célu las sensíveis, ele liga-se aos receptores de membranas; os complexos de EGF receptor aglomeram-se e depois são intêrnalizados em vesículas endocitóticas. Este facto é o responsável pelo fenómeno de regulação baixa. 0 factOr BGJ?, ao ligar-se * suscita por indução uma actividade da quinase. de tirosina da molécula do receptor e induz à síntese do AD£h

O receptor do factor EGí* é uma glicoproteina de trans membrana,de cerca de 17O.OOO unidades Dalton (Qohen, 1982). Ê 0 produto de gene do proto-oncogene c-erb-B (downward, et al,, Bature, vol. 507, páginas 521-527» 1984). 0 receptor exls te em duas formas cinéticasí os assim chamados receptores de pequena afinidade e receptores de grande afinidade.

A linha de células do carcinoma A431 expressa abun dantes receptores do factor EGJ? nas suas superfícies celulares, e assim ela tem sido utilizada em muitos estudos para produzir anticorpos de receptores antí-EGB. Ho entanto, Os receptores na A431 diferem dos de Outros tipos de células nas estruturas de hidratos de carbono ligadas ao polipéptido. Assim, muitos anticorpos produzidos contra as membranas da A4J1 são dirigidos contra os hidratos de carbono que não são cómu;is

I

a todas as fonaas da molécula do receptor (por exemplo óclirel ber, 1983).

ix’

Outros anticorpos mencionais são reactivo© com a e tratura da proteína dos receptores do factor rO. Os mencionados anticorpos possuem uma variedade de propriedades’ depoi de se ligarem aos receptores EGf, presumivelmente dependente do troço particular da ligação da molécula do receptor e do isótopo do anticorpo. Alguns anticorpos imitam alguns dos ef tos do factor ÃG? (agonistos) e alguns inibem Os efeitos (an tagonistos).

Ο âehechOLi-’

A expressão dos receptores do factor teu estado implícita na progressão do desenvolvimento do tumor. Veri ficou-se que o gene pana os receptores é o aaâlogo celular d oncogeue virai nas aves (ollrich, 1984). Além disso,

-se uma associação entre as últimas fases do desenvolvimento do melanoma e cópias suplementares do cromossoma que transpõe ta o gene receptor (SOprOv/sisi et al., gomatic JJell and, ^oiecular Genetics, volume II, páginas 297-5^’2, 193J).

jevido ao facto de os receptores do factor ·Ο serem expressos numa vasta variedade de tumores sólidos, eles proporcionam um alvo apropriado paru a terapia contra os tumores. 2:0 entanto, existe na técnica uma necessidade dum anticorpo apropriado contra o receptor. HuitOs do^ anticorpos conhecidos têm propriedades que seriam projudíGiaic se fossem utilizados cOmo agentes anti-tumores. por exemplo, os anticor pos que imitam Os efeitos do factor rO poderiam estimular o desenvolvimento do tumor em vez de o deter. Outros anticorpo que se ligam sómente aos receptores d© pequena ou de grande afinidade poderiam ser eficazes duma forma não optimisada po: que o factor dGf podia ainda exercer o receptores não ligados. Ainda outros os receptores ão seu efeito através do anticorpos transformam pequena afinidade em recetores de grande

afinidade, que poderiam exacerbar o desenvolvimento do tumor em vez de o inibir. Assim, existe uma necessidade, na? técni ca, de um anticorpo contra o receptor do EGF que seria apropriado para a terapia contra os tumores.

Embora tenham sido usados os anticorpos murinos mAbs no tratamento terapêutico em seres suscitado uma resposta imune (Glorgi et et al.,1986). Para vencer este problema, humanos, eles têm al, 1983; Jaffers vários grupos têm tentado humanizar os anticorpos murinos. Isto pode envolver uma de duas abordagens. - Em primeiro lugar, os sectores da região murina, tanto para a cadeia leve, como para a cadeia pesada, podem ser substituídos pôr regiões constantes humanas. Tais anticorpos murino-humanos quiméricos têm sido construídos com êxito a partir de vários anticorpos murinos dirigidos contra os antigenios humanos associados aos tumores (Sun et al., 1987; Whittle et al. , 1987, Liu et al 1987; Gilles and Wesolowski 1990). Esta abordagem conserva o sítio da ligação do anticorpo murino, e·.· daí a afinidíi de do antigénio, enquanto confere funções de isótopo humano e efector.

Na segunda abordagem, apenas as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) das regiõesvariáveis do rato sao enxertadas em conjunto com as regiões da esfrutura humana (FRs), nao só das zonas variáveis de cadeia leve como também das de cadeia pesada (V^ e V^) . Pensa-se que esta téc_ nica irá transferir o troço maior e crítico do sítio de ligaçao do antigénio ao anticorpo humano (Jones et al., 1986).

enxerto da CDR tem sido realizado em vários monoclonais de animais roedores. (Jines et al., 1986; Reichmann et al., 1988; Veshocyen et al.,1988; Queen et al., 1989; Co et al., 1991; Grorman et al., 1991; Maeda et al.,1991; Temptert et al., 1991). Todos conservaram a sua capacidade de ligaçao ao antigénio, ainda que a afinidade geralmente fosse dimi

nuída. Na maior parte dos casos, julgou-se necessário alterar certos aminoácidos nos resíduos da estrutura humana (FRs). tanto os anticorpos dimericos como os anticorpos enxertados na CDR demonstraram ser superiores aos anticorpos do rato na clínica (Hale et al., 1988; Lo Buglio et al., 1989; Mathieson et al., 1990). Todavia, nao se conhece um ensinamento geral sobre quais os aminoácidos que devem ser mudados e isso nao é em qualquer caso, totalmente previsível.

A patente europeia EP 088 994 propoe a construção de vectores do ADn recombinantes compreendendo uma sequência de ADN que codifica um sector variável, duma cadeia leve ou pesada dum elemento específico da imunoglobulina para um ligando pre-determinado. 0 pedido de patente nao inclui as variações na sequência do sector variável.

A patente europeia EP 102 634 descreve a clonação e a expressão nos organismos bacterianos do hospedeiro, de genes que codificam a totalidade ou uma parte do polipéptido de cadeia pesada IgG humano, mas nao compreende as variações na sequência do polipéptido.

A patente europeia EP 239 400 propoe que se possam obter os anticorpos humanizados por substituição do sítio de ligaçao do antigénio (regiões hipervariáveis)'* de qualquer anticorpo humano mediante um sítio de ligaçao do antigénio dum ser nao humano, por exemplo um anticorpo dum rato ou duma ratazana, por processos genetecnológicos.

Assim, seguindo o referido ensinamento, podem-se produzir anticorpos humanos ou humanizados tendo sítios específicos de ligaçao ao antigénio, os quais nao eram acessí_ veis até agora nos anticorpos dos seres humanos.

Podem-se obter os anticorpos quiméricos substituindo nao apenas as regiões hipervariáveis do anticorpo (CDRs), mas toda a região variável das cadeias leves e das pesadas.

Os anticorpos quiméricos, todavia, podem ainda ser imunogéninicos. No entanto, os anticorpos quiméricos sao muito úteis para fins de diagnósticos e para optimização dos anticorpos humanizados.

Poder-se-ia mostrar que a ’ afinidade dos ’ sítios de ligaçao ao antigénio pode ser influenciada por permuta selectiva de alguns aminoácidos isolados, dentro das regiões variáveis, que nao fazem parte directamente das CDR (Reichmann et al. (1988) ) .

A consequência disso, no caso pior, é que se pode perder completamente a afinidade de ligaçao do antigénio, se se trabalhar de acordo com o ensinamento da patente europeia EP' 239 400. Este facto poderia ser demonstrado pelos invent£ res da presente invenção, que nao conseguiram construir um anticorpo humanizado correspondente, o qual era dirigido aos epitopos do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF).

Portanto, deve-se considerar que o sucesso duma tal humanizaçao depende da constituição e da configuração das regiões variaveis utilizadas e das suas interacçoes com o correspondente sitio de ligaçao ao antigénio. Assim, nao é total, mente previsível se as modificações, ou quais, modificações sao necessárias dentro das regiões variáveis do anticorpo a fim de obter ou aperfeiçoar a ligaçao do antigénio ao anticor. po.

Sumário da Invenção

Consequentemente,a invenção tem o objectivo de proporcionar um anticorpo monoclonal humanizado, que é especialmente dirigido para o receptor EGF (=factor de crescimento epidérmico), compreendendo um local de ligaçao ao antigénio de origens nao humanas e as FR das regiões constantes e regiões variáveis de origens humanas, as quais estão numa forma que se possa conservar e restaurar a especificidade

do local de ligaçao.

Em especial, a invenção tem o objectivo de caracterizar as regiões hipervariáveis do sítio de ligaçao ao antigénio de um anticorpo contra o receptor da EGF e proporcionar estas CDR (=regiao hipervariável dum anticorpo) dentro de um anticorpo monoclonal humanizado, tal como foi definido anteriormente.

mencionado anticorpo e a sua variante quimérica podem ter um papel importanté como agente terapêutico ou de diagnóstico, a fim de combater tumores, tais como melanoma, glioma ou carcinoma.

Constatou-se que se podem obter facilmente anticorpos monoclonais humanizados específicos e eficazes por utilização duma sequência de consenso de, pelo menos, a cadeia pesada das regiões variaveis duma imunoglobulina humana. Em especial, todas essas sequências de consenso sao apropriadas quando têm uma boa identidade (pelo menos 60 a 70%, em especial 65 a 70%) em comparaçao com as regiões variáveis dos anticorpos originais nao humanos. Além disso, verificou-se que as citadas sequências de consenso têm que ser modificadas somente em extensão reduzida, algumas vezes muitas mais modificações têm que ser realizadas quando se utilizam as regiões variáveis dos anticorpos humanos que se formam naturalmente. Muitas vezes nao sao necessárias nenhumas modificações, ou sao necessárias somente algumas modificações na sequência do aminoácido, de acordo com a presente invenção, para se obter uma boa ligaçao específica do antigénio. Assim, apenas alguns aminoácidos devem ser substituídos quando se efectua uma perfeita ligaçao do receptor do EGF ao anticorpo humaniza do preferido de acordo com a invenção, enquanto neste caso, de acordo com os ensinamentos da patente europeia EP 239400, não se pode

- 11 obter nenhuma ligaçao.

As modificações que sao necesárias de acordo com a invenção podem ser indicadas por uma percentagem compreendi^ entre 0- a 10% ou de preferência entre 1 e 5%, em relaçao às trocas de aminoácidos.

Um anticorpo monoclonal humanizado de acordo com a invenção tem a seguinte vantagem:- uma sequência de consenso, que é uma sequência de acordo com o aparecimento muito comum dum aminoácido numa posição distinta duma cadeia de imunoglobulina humana, duma classe, subclasse ou subgrupo definidos, pode ser sintetizada como um todo ou uma parte, sem problemas. Nao existe nenhuma dependência do conhecimento pormenorizado ou da disponibilidade de certos anticorpos individuais, ou fragmentos de anticorpos. Isso significa que uma vasta gama de fragmentos de anticorpos, que ocorrem de forma individual e natural, pode ficar abrangida, pela formaçao de um número muito restrito de sequências de consenso, as quais são clonadas em correspondentes vectores de espressao. Uma sequência de consenso pode ser favoravel para a imunogenicidade, em comparaçao com as sequências naturais individuais, que sao conheci das como sendo, algumas vezes, epitopos para outros anticoí? pos (por exemplo, anti-corpos anti-idiotípicos).Embora se descreva somente uma forma de realizaçao preferida, apresenta-se um ensinamento geral principalmente a respeito da presente invenção. Nao é um mero acidente acerca do grande número de sequências possíveis, e combinações de sequências nas regiões variáveis e hipervariáveis, que o ensinamento em relaçao a sequência de consenso tenha conseguido construir um anticorpo humanizado dirigido para o receptor EGF.

Alem disso, verificou-se que as cadeias pesadas das

regiões variáveis proporcionam uma maior contribuição para o local de ligaçao do antigénio, do que as correspondentes cadeias leves. Portanto, nao é necessário modificar, da mesma maneira, a cadeia leve dum anticorpo humanizado que tem uma sequência de consenso. Este é um aspecto interessante, porque se sabe que as cadeias leves, em muitos anticorpos na turais, desempenham um papel mais importante do que o das co£ respondentes cadeias pesadas (veja-se Williams et al., 1990).

Finalmente, e acima de tudo, a invenção proporciona, pela primeira vez a caracterizaçao, a clonaçao e a amplificação, por meio de engenharia genética do sítio de ligaçao do antigénio de um anticorpo murino contra um receptor de EGF (Mab 425).

Poder-se-ia sintetizar oligonucleóticos correspori dentes, os quais codificam o citado sítio de ligaçao do antigénio a região variável dum anticorpo monoclonal humanizado ou quimérico. A invenção proporciona ainda correspondentes vectores de expressão eficazes, que podem ser utilizados para a transformaçao de adequadas células eucarióticas.

Assim, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal humanizado, correspondendo sítios de ligaçao ao antigénio (CDRs) de origen nao humana, e as FR das rpgioes variáveis e regiões constantes de cadeias leves e cadeias pesadas, de origem humana, caracterizado pelo facto de pelo menos as FR das regiões variáveis da cadeia pesada compreenderem uma sequência de consenso modificada de diferentes regiões va riáveis, duma diferente classe ou subgrupo, duma imunoglobuM na humana.

Em especial, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal humanizado, em que as FR da sequência de consenso tem uma homologia de pelo menos 70% em comparaçao com a sequência de aminoácido das FR da região variável do anticorpo nao-humano, das quais provêm os sítios de ligaçao do antigénio.

A invenção refere-se especialmente a um anticorpo monoclonal humanizado que tem as seguintes propriedades:

(a) a receptores de EGF humanos;

inibir a ligação do

EGF ao receptor de EGF;

(c) inibir a

EGF, do da quinase de tirosina EGF;

dependente do (d) inibir o crescimento das células sensíveis do crescimento apidérmica).

a um anticorpo monoclonal humanizado em que as regiões hipervariáveis do

A invenção refere-se particularmente s sítios de ligação do antigene compreendem as seguintes sequên cias de aminoácidos:

Cadeia leve:

CDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerODR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-ThriÇadeia pesada:

CDR-1 -Ser-lis-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-AsnTyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR- 3 - Arg-A sp- Tyr-A sp- Tyr-A sp-Gly-Arg- Tyr-PheAsp-TyrEm especial, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal humanizado, em que as FR dás regiões variáveis, que não estão relacionadas com os sítios de ligação do antigénio, compreendem a seguinte sequência de aminoácidos:

Cadeia leve:

Cadeia leve:

FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-AlaSer-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gli-Lys-Pro-Gly-Ala-Fro-Lys-Leu-Leu-Ile

TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-ThrAsp-Tyr(Phe,Trp,His)-Thr-Phe-Thr-Ile-Ser-Ser-Leu-GlnPro-Glu-Asp-Ile-Alà-Thr^-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-LysCadeia pesada:

FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-LysPro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-GlyTyr-Thr-Phe-Thr-(Ser)FR-2 -Trp-Val-Arg(His)-Gln-Ala-(Lys,His)-Pro-(Val)-Gly-GlnGly-Leu-Glu-Trp-Ile(Vai,Leu)-GlyFR-3 -Lys(Arg,His)-Ala(Val,Pro,Gly)-Thr-Met-Thr-Val(Ala,Pro, Gly)-Asp-Thr-Ser-Thr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu(Asn)-LeuSer-Ser-Leu-Ar g-Ser-Glu-Asp^-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cy s-AlaSerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser-, e -em que os •aminóac.ídós ^ colocados entre parênteses nestas listas sao alternativas.

A invenção refere-se especialmente a um anticorpo monoclonal humanizado em que as regiões constantes da cadeia pesada compreendem a sequência de aminoácidos duma cadeia gama-1, e as regiões constantes da cadeia leve compreendem a sequência de aminoácido duma cadeia-K duma imunoglobulina humana.

Em especial, a invenção refere-se a um anticorpo

monoclonal humanizado compreendendo um derivado duma sequência de aminoácido modificada por anulação, substituição, adi ção ou inversão do aminoácido dentro das regiões variáveis e das regiões constantes, em que se preserva a função biológica da ligaçao específica do antigénio,.

Além disso, a invenção diz respeito a um vector de expressão, adequado para a transformação de células hospedei ras, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência ds ADR que codifica as regiões variáveis e/ou constantes para a cadeia leve e/ou pesada duma anticorpo humanizado.

Além disso, a invenção referé-se a um anticorpo mo noclonal humanizado ou quimérico, compreendendo regiões hiper variáveis (CDRs) de locais de ligação do ãntigénio de origem murina e as FR das 'regiões variaveis de Origem humana ou origem murina, e regiões constantes de cadeias leves e pesadas de origem humana, caracterizado pelo facto de as regiões bipervariáveis compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos :

Cadeia leye:

C DR-1 - S e r- A1 a- S e r- S e r- V a 1- Thr- f y r-ivie t - TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-5 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-uis-Ile-Phe-Thr)

Cadeia pesada:

CDR-1 -Ser-dis-Trp-ket-nisCBR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-AsnCDK-5 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyr-, e em que as regiões constantes de cadeia pesada compreendem a sequência de aminoácido duma cadeia gama-1, e as regiões constantes da cadeia leve compreendem a sequência de aminoáci

do duma cadeia K duma imunoglobulina humana.

Em especial a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal humanizado de acordo com a reivindicação 12 em que as FR das regiões variáveis, que, nao estão relacionadas com os sítios de ligaçao do antigénio sao de origem humana e compreendem as seguintes sequências de aminoácidos:

Cadeia leve:

FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-7Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-AlaSer-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Pro-Lys-Leu-LeuIle-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-AspTyr-(Phe,Trp,His)-Thr-Phe-Thr-Ile-Ser-Ser-Leu-Gln-ProGlu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-LysCadeia pesada:

Fr-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-LysPro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-GLyTyr-Thr-Phe-Thr(Ser)FR-2 -Trp-Val-Arg(His)-Gln-Ala(Lys,His)-Pro(Vaiy-Gly-GlnGly-Leu-Glu-Trp-Ile-(Vai,Leu)-GlyFR-3 -Lys(Arg,His)-Ala(Val,Pro,Gly),-Thr-Met-Thr-Val(Ala,Pro, Gly)-Asp-Thr-Ser-Thr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu(Asn)-LeuSer-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-CysAla-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser-.

Em especial, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal quimérico, em que as FR' das regioés variáveis- que não

estão relacionadas com o sítio de ligação do antigenio,, são ds origem murina e compreendem as seguintes sequências de amino ácidos:

Cadeia Ιθνθ:

Ffí-1 -Gln-Ile-Val-Leu-Th.r-Gln-Ser-rro-Ala-Ile-ivíet-Ser-AlaSer-rro-Gly-Glu-Lys-Val-Thr-jaíiet-Thr-CysFIí-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-Leu-LeuIle-TyrFr-3 -Gly-Val-Pro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr3er-Tyr-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Arg-!vxet-Glu-Ala-Glu-AspA1 a-A la- Thr- Tyr- Tyr- 0 y sFK-4 -Phe-Gly-Ser-Gly-T.hr- Lys-Leu-Glu- Ile-LysCadeia pesada:

FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Glh-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-LysPro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Leu-Ser-Oys-Lys-Ala-Ser-GlyTyr-Thr-Ph e- 1'h.rFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-IleGiy- ·.

FR-5 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-Thr-AlaTyr-met-Gln-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Ser-Glu-Asp-Ser-AlaVal-Tyr-Tyr-Oys-Ala-SerFlt-4 - Trp- Gly- Gin- Gly- Thr- Thr-Le u- Thr- Val-S er-S er-.

Além disso, a invenção refere-se a um vector de ex pressão adequado para a transformação de células hospedeiras, cara-.’terizado pelo facuo de compreender sequências de ADN que codificam as regiões variáveis e/ou constantes das cadeias le ve e/ou pesada .dum anticorpo monoclonal humanizado ou quimérico.

Além disso, a invenção refere-se a um processo para

a preparação dum anticorpo monoclonal humanizado, compreendeu do regiões hipervariáveis (ODRs) de sítios de ligação de antige. de origem não humana, e regiões variáveis (FRs) e regiões constantes das cadeias leve e pesada de origem humana por cultivo de células hospedeiras transformadas, num meio de cultura, e por purificação e isolamento das proteínas de anticorpos expressas, caracterizado pelo facto de se 'U (a) sintetizar ou sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótido, a qual codifica uma sequência de consenso de aminoácidos de diferentes regiões variáveis (FR-l até FR-4) duma cadeia pesada duma classe ou subgrupo duma imunoglobulina humana, em que a sequência de consenso utilizada tem uma bomologia de pelo menos 70% em comparação com a sequência de amiúoácido das FR das regiões variáveis do anticorpo não umano, do qual *

provêm os locais de ligação do antigénio, e em que a sequência de consenso é modificada por alterações de no má ximo 10% dos aminoácidos, a fim de preservar a capacidade de ligação do antigénio às regiões hipervariáveis;

(b) sintetizar ou sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótidos que codifica uma sequência de consenso de aminoácidos nas condições indicadas em (a) de diferentes regiões variáveis (FR-1 até KR-4) duma cadeia leve duma classe ou dum subgrupo duma imunoglobulina humana, ou, cojo alternativa, que codifica uma correspondeu te sequência de aminoácido que ocorre de forma natural;

(c) em cada caso sintetizar, ou sintetizar em parte, ou isolar uma sequência de oligonucleótido que codifica a sequência de aminoácido das regiões hipervariáveis (CDRs) da cadeia leve ou pesada, correspondentes às regiões hipervariáveis do anticorpo básico não humano;

(d) em cada caso sintetizar ou sintetizar parcialmente ou iso

lar uma sequência de oligonucleótido que codifica a sequência de aminoácido das regiões constantes (CDRs) da cadeia leve ôu da cadeia pesada duma imunoglobulina huma na;

(e) construir um ou mais vectores de expressão, compreendendo em cada caso pelo menos um promotor, uma origem de ré plicas e as sequências de ΑΏΜ de codificação de acordo com (a) até (d), em que as sequências ADB que codificam as cadeias leves e pesadas podem estar presentes em conjunto num ou, ãlternativamente, em dois ou mais diferentes vectores, e, finalmente, (f) transformar as células do hospedeiro com um ou mais dos vectores de expressão de acordo com (e).

hm especial, a invenção reporta-se a um processo em que se utilizam as sequências de ADIí que codificam as seguin tes sequências de aminoácidos, as quais representam as regiões hipervariáveis (ÇDRs)í

Cadeia leve;

03R-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-xáet-TyrODFí-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SenCDB- 5 -Gin-Gin-Trp-S er-Ser-His-Ile-Phe-ThrÇadeia pesada:

-GBPl- 1 -Ser-mi s- Tr p-Me t-Hi sGDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-Asn-GluLys-phe-hy s-S er0 52- 5 -Arg-A sp- Tyr-A sp- Tyr-A sp- Gly- Ar g- Tyr-Phe-A sp- Tyr-.

Em especial, a invenção relaciona-se com um proeejs so em que as sequências do ADK são utilizadas codificando as

seguintes sequências de aminoácidos, as quais representam as FR das regiões variáveis:

Cadeia leve:

FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-AlaSer-Vai-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-CysF R - 2 - Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Pro-Lys-Leu-Leu-ne-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-ThrAsp-Tyr-(Phr,Trp,His)-Thr-Phe-Thr-Ile-Ser-Ser-Leu-Glnpro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-LysCadeia pesada:

FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-LysPro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-GlyTyr-Thr-Phe-Thr-(Ser)FR-2 -Trp-Val-Arg(His)-Gln-Ala(Lys,His)-Pro(Val)-Gly-GlnGly-Leu-Glu-Trp-Ile(Val,Leu)-GlyFR-3 -Lys(Arg,His)-Ala(Val,Pro,Gly)-Thr-Met-Thr-Val(Ala,Pro, Gly)-Asp-Thr-Ser-Thr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu-(Asn)-LeuSer-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-CysAla-SerFR-4- -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser-.

Além disso, a invenção refere-se a um processo para a preparaçao de um anticorpo monoclonal quimérico tendo a função biologica de se ligar a epitopos do receptor de EGF, compreendendo as regiões hipervariáveis (CDRs) de sítios de ligaçao de antigénio e as FR das regiões variáveis de origem murina, e regiões constantes das cadeias leves e pesadas de ori gem humana, por cultura de células de hospedeiro transforma21 -

das, num meio de cultura, e purificação e isolamento das pro teínas de anticorpos expressos, caracterizado pelo facto de se transformar as células de hospedeiro com vectores de expras são.

Além disso, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal quimérico ou humanizado.

A invenção refere-se ainda às utilizações dum anti corpo humanizado ou quimérico para a fabricação dum medicamen to para tratamento de tumores.

Finalmente, a invenção refere-se à utilização dum anticorpo humanizado ou quimérico para a localização no diagnóstico e para a avaliação do desenvolvimento do tumor.

Para resumir, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que compreende uma sequência de consenso de regiões variáveis duma cadeia pesada duma classe ou dum subgrupo de im.unoglobulinãs humanas .

As memórias descritivas completas de todos os pedi dos de patente, patente-s e publicações mencionados no texto anterior e a seguir, e a Memória descritiva· do correspondente pedido do patente Europeia 9·1 103 389.2 depositado em 6 de Março de 1991 sao aqui incorporados mediante referência.

Microrganísmos e plasmidos utilizados na invenção (a) pKVL '4-25 (=uCMV-RV^b 425-K) depositado em 1 de Fevereiro de 1991 de acordo com o Tratado de Budapeste na Colectãnea Alemã de Microrganismos (DSM) sob o número de depósi to DSM 8340. A expressão vector contém as sequências das regiões hipervariáveis (COR) do anticorpo murino 425 θ as FR da re. giao variável e da região constante (K) · da cadeia leve do anticor po humanizado. R significa reestruturado.

(b) pRVH 425 (= HCMV-RVjj 425-$) depositado em 1 de Fevereiro de 1991, de acordo com o tratado de Budapeste na Colectânea Alema de Microrganismos (DSM) com o número de depósito DSM 6339. A expressão vector contém as sequências das regiões hipervariáveis do (CDR) anticorpo murino 425 e as FR da região variável e da região constante (gama-1) da cadeia pesada do anticorpo humanizado. R representa reformulado.

(c) pCVL 425 (=HCMV-CV^425-K) depositado em 1 de Fevereiro de 1991 de acordo com o tratado de Budapeste na Colectânea Alema de Microrganismos (DSM).sob o n^s de depsito DSM 6338. A expressão vector compreende as sequências das regiões variáveis e hipervariáveis da cadeia leve do anticorpo murino 4 £5 e as regiões constantes (K) da cadeia leve da imunoglobulina humana gama-1. C significa quimérico .

(d) pCVH 425 (=HCMV-CV^ 425 $) depositado em 1 de Fevereiro de 1991 de acordo com o tratado de Budapeste na Colectânea Alema de Microrganismos (DSM) com o n⁹. de depósito DSM 6337. A expressão vector compreende as sequências das FR e as regiões hípervariáveis (CDR) da cadeia leve da região variável, do anticorpo murino 425 e a região constante da cadeia leve da imunoglobulina gama-1. C. representa a expressão quimérico.

(e) linha de células do hibridoma 425, depositado em 26 de Janeiro de 1988 de acordo com o Tratado de Budapeste, nà American Type Culture Collection (ATTC), sob o n⁹, de depósito HB 9629. A linha de células produz o anticorpo murino 425, o qual se destina ao receptor EGF.

Outros materiais biológicos

Outros microrganismos, linhas de células, plasmídos, promotores, marcadores de resistência, origens de réplicas ou

outros fragmentos de vectores que são mencionados no pedido de patente estão disponíveis no comércio ou doutra forma, de um modo geral» Na medida em que não for citado em contrário no pedido de patente, eles são referidos sómente como exempl e não'são essenciais de acordo com a invenção, e podem ser substituídos por outros instrumentos e materiais biológicos,

3S respectivamente♦

Utilizam-se preferencialmente os.hospedeiros bacte rianos para a amplificação das correspondentes sequências de ADN. Bxemplos dos tais citados hospedeiros são; coli ou Bacillus.

As células encarionticas como GOS origem 8740)*-, ou CHO (ovário de criceto chinês) células ou leveduras, por exemplo, são preferidas a fim de produzir os anticorpos huma nizados e quiméricos de acordo com a invenção» Preferem-se as células 008 c CnO.

Processos gerais de.produção

As técnicas que são essenciais de acordo com a in. venção estão descritas com pormenores na memória descritiva.

Outras técnicas que não estão descritas com porme-

nores muito correspondem aos processos-modelo conhecidos, que são familiares a um técnico especialista nesta área, oa ©1 as estão descritas mais pormenorizadamente nas citadas referências e pedidos de patente e na literatura técnica fundamentaL.

Breve descrição das Figuras:

Figura 1,- Penresentações esquemáticas dos vectores utilizados na expressão dos anticorpos humanos reestruturados e quiméricos» listão marcados Os sítios de restrição utilizados na construção dos plasmídos de expressão. As sequências de codificação das regiões variáveis estão representadas por

caixas escuras, as regiões constantes estão representadas pop

caixas claras, o promotor de HCMV e activador por caixas tracejadas e o fragmento de nucléótido proveniente do plasmído pSVneo pelas caixas ponteadas. As direcçÕes da transcrição estão representadas pelas setas.

Figura 2.- As sequências de aminoácido e o nucleótido do Vp 425 é Vy 425 AD® e como ê clonado para o pUCIS. Os aminoácidos que contiihuem para a sequência principal estão sublinhados e os CDRs'estão indicados por parênteses» Os sítios de separação entre as regiões variáveis e as regiões constantes e^tão também assinalados. Os primários de POH anteriores e posteriores e os seus sítios de recozimento, utilizados na construção do código de genes para os anticorpos quiméricos, estão ilustrados* .Figura 3. - As sequências de aminoácidos e nucleétidos do fragmento dé gene sintetizado que codificam o V_;;, a ' 425 humano re estruturado.. A sequência principal está sublinha da e os resíduos que contribuem para as CDKs estão entre parênteses· das sequências de aminoácido humanas reestruturadas 425*

Figura, 4.- Comparação das regiões variáveis do rato e 0 painel A mostra as sequências do rato V_T> (V_T425) e humanas reestruturadas V^s (KV^ a 425 θ BV^ as sequências do rato V- (V^ 425) e V_Hs (BVg a 425, BV_hc 425, HV^d 425, 425, SV 425 e BV_wi 425). As FRs e aminoácidos são numerados de acordo et al. (1987).

b 425)· 0 painel B mostra humanas reestruturadas RV_He 425, 425,

ODFs ectão indicadas. Ôa com o processo de Kabat

Figura.. 5·- Modelo molecular das regiões variáveis do rato MAb 425*

Figura 6,- Detecçao da ligação a BGFB por isLISA. Em saiou-se a actividade de ligação ao antigene em diluições de

camadas sobrenadantes de células COS transfectadas e registou-se como densidade óptica em 450 nm em relação à concentração de IgG (quantificado por ELISA, veja-se Materiais and Methods (materiais e métodos). Todas as versões das regiões V„ humanas reestruturadas foram cori transfectadas com RV^a 425 e estão representadas como se segue: RV_Ra 425 A, RV_Rb 425 ¢, RV c ‘425 Δ. , RV_Rd 425 RV_He 425 α , RV_Hf 425 ® , RV_H9 425 □ , RV_Rh 425 O, e RV_Hi 425 © , RV_TTb 425 co-transf ectados com RV_rb 425 está π L representado como . Uma co~transfecção dos genes quiméricos 425 e V_R 425 estão representados como φ.

A Figura 7. - Competição para ligação ao antigénio. O painel A mostra a competição entre o anticorpo 425 de rato marcado e (1) o anticorpo ( + ) 425 de rato não marcado e (2) o anticorpo (·) 425 quimérico, produzido pelas células COS depois da cotransfecção com o HCMV-CV 425-K e HCMV-C_U 425-gama-l. 0 painel B mostra a competição entre o anticorpo 425 de rato marcado e (1) o anticorpo (+) 425 de rato não marcado e (2) os anticorpos (425 humanos reestruturados produzidos pelas células COS após a co-transfecção com o HCMV-RV_L a 425-K e HCMV-RV_Ri 425-gama-l (O), e com HCMV-RV^a 425-K e HCMV-RV_Hi 425-gama-l (Q). Em cada caso, o eixo horizontal repnesenta a concentração de inibidores (ng/ml). O eixo vertical representa a percentagem de inibição da ligação.

Figura 8. - Um exame dos efeitos de diferentes regiões V_r Jj humanas reestruturadas sobre a· ligação do antigénio. 0 painel A mostra a ligação do antigénio por anticorpos humanos reestruturados, produzidos nas células COS transfectadas .com HCMV-CV_L 425-K e HCMV-CH_R 425-gama-l (·), HCMV-RV^a 425-K e HCMV-RV_H 425-gama-l (□), HCMV-RV^ 425-K e HCMV-RV_Hg 425-gama-l ( ) , HCMV-RV_L a 425-K e HCMV-RV_He 425-gama-l ( Á ) e HCMV-RV_Lb 425-K e HCMV-RV_Rc 425-gama-l ( 4 ) · O painel B mostra a competição para a ligação ao antigénio entre o anticorpo 425 de rato marcado e (1) o anticorpo ( + ) 425 de rato não marcado e (2) os anticorpos 425 humanos reestruturados, produzidos na

células COS co-transfectadas com HCMV-V_ra 425-K e HCMV-V_ug J-J rl

425-gama-l (O) e com HCMV-V_rb 425-K e HCMV-V_TTg 425-gama-l L H

()· No painel A, o eixo vertical representa a densidade óptica em 450 nm (Οϋ^^θ) e o eixo horizontal representa a concentração de IgG (g/ml). No painel B, o eixo horizontal representa a concentração de agente inibidor (g/ml) e o eixo vertical representa a percentagem de inibição de ligação.

Figura 9.Painel A:- Análise dos anticorpos Mab 425 reestruturados (pistas 1, 2), quiméricos (pista 3) e murinos (pista 4) por SDS-PAGE em condições não redutoras (a) e em condições redutoras (b) . Anticorpos reestruturados (pistas 7, 8), quiméricos (pista 9) e murinos (pista 10). As pistas 5, 6, 11 e 12 são marcadores MW.

Painel B:- Purificação por filtração do gel do Mab 425 reestruturado em Superose 12. O pico 2 representa o IgG.

Figura 10- Ligação competitiva de anticorpos Mab 425 murinos, quiméricos e reestruturados ao receptor de EGF (EGFR). O eixo vertical representa a proporção de anticorpos ligados (MAb) para anticorpos totais (MAb) em percentagem (% ligados/total). O eixo horizontal representa a concentração de anticorpos (mole/1 [hog]).

V significa Mab 425 murino significa Mab 425 quimérico φ, significam Mab 425 reestruturado.

Figura 11- Competição da EGF e anticorpos para o receptor de EGF. O eixo vertical .representa a percentagem de anticorpos ligados em relação ao total de anticorpos (% ligados/total) (MAb). O eixo horizontal representa a concentração de anticorpos (mole/1 [hog]).

Q significa Mab 425 murino , 5^·, q significam Mab 425 reestruturado Descrição pormenorizada

Clonação e sequenciação de genes de região variável de MAb

425:-

Ba síntese do ADNc e da clonação utilizando o primário de cadeia IC, retiram-se 300 a 400 colónias, preferivelmente, para selecção. Da síntese do ADNc e da clonação com utilização do primário gama-2a, tómam-s© d© preferência 200 a 300 colónias para selecção. Após a selecção por hibriclização utilizando os dois respectivos primários de clonação, 20 a 30 colónias de cadeia leve e .10 a 20 colónias de cadeia pe sada dão sinais fortes. Isola-se o plasmído Λ.ΏΙΙ das menciona das colónias e analisa-se pelos usuais digestos de enzimas de restrição disponíveis no comércio, para determinar o tamanho são sequenciados nas duas M13 universais e de sequenciados, um codi outros parecem codifi dos clones V.. codifiΆ dos insertos de ADKc. Os clones que parecem ter insertos de 400-500 bp ou 5CC-600bp para a clonação de e V^, respecti vamente, são seleccionadas como candidatos para a sequenciacão, frês clones V» e três clones V, fitas usando primários de sequenciação reversão, Doç três possíveis clones fica uma região variável completa e Os car os péptidos não relacionados. Dois cam as regiões V_r. idênticos, .enquanto os outros parecem codi ficar a região T._: com o intrão entre a sequência principal e a 33-1 ainda presente. Além do intrão, o terceiro clone V₇ l'Ã contém a sequência de códificação idêntica à dos dois primei clones. para verificar a sequência da região V^, mais três clones ADbc contendo insertos de tamanho apropriado são seΛ, rOs quenciados. Dois destes clones dão sequências clone V^. 0 terceiro clone é uma sequência de ADN não relacionada. Nos clones sequenciados, nem todos da sequência do primário original estão presentes. A extensão.das anulações varia de cio ne para clone* As referidas anulações, que ocorrem provavelmente durante a síntese do ADNc e a clonação podem diminuir a eficiência dá selecção dá colónia.

C-s genes V_T e V„ para o anticorpo monoclonal mAb

Aj li

425 são ilustrados na Figura 2. As sequências de aminoácidos

das regiões e 425 sao comparadas com outras regiões variáveis do rato na base de dados segundo Kabat (Kabat et-al., 1987). Pode-se classificar a região no subgrupo IV ou VI da região variável da cadeia K do rato. Dentro das FRs, a região 425 tem cerca de 86% de identidade com a sequência de consenso para o subgrupo IV K do rato e cerca de 89% de identidade com o subgrupo VI. o segmento JK4. 0 exame da região

parece utilizar

revela uma identidade de cerca de 98% com as FRs da sequência de consenso para o sub grupo II (B) da cadeia pesada do rato.

A escolha correcta duma classe ou dum subgrupo apropriado (a) de imunoglobulina humana depende da extensão da identidade com a cadeia original,mente presente no anticorpo nao humano. A identidade da sequência de consenso deduzida, de acordo com a presente invenção, deve ser superior a 65-70% em comparaçao com a sequência de cadeia original nao humana.

Preferem-se as sequências de consenso de cadeias pesadas, em especial, contudo, a sequência de consenso do subgrupo 1 humano de cadeia pesada. Todavia, para os outros anticorpos sao adequadas as sequências de consenso de outras cadeias pesadas humanas. As sequências de consenso’ preferidas são modificadas. A possivel troca de aminoácidos esta compreendida entre 0 e 10% de acordo com a invenção, de preferência entre 5 e 10%.

Construção e expressão do anticorpo 425 quimérico:

Antes de se poder utilizar os ADNc, que codificam as regiões e Vjj , na construção do anticorpo 425 quimérico, é necessário introduzir varias modificações nas extremidades 5' e 3'. Isto compreende a introdução de sítios de enzima de restrição apropriados, de forma que as sequências de codifica, çao da região variável podem ser convenientemente subclonadas nos vectores de expressão de HCMV. É necessário recriar os sítios de divisão do doador nas regiões de flanco 3', de

As

forma que as regiões variáveis sejam cortadas correctamente e de forma suficiente para se «obter as regiões constantes.

regiões de flanco 5* são também modificadas para compreenderem -uma sequência que produz sítios eficazes de iniciação pa ra a translação de.ríbossomas encariéticos (Kozak, 198?)·

..stas modificações são introduzidas usando-se os primários 103«. Os primários utilizados estão indicados na Ta bela 1. ' fabeja 1 - Oligonucleétidc^ utilizados para a clonação do AílRc’, construção de genes quiméricos e mutagénese. As secções sublinhadas indicam as bases que recozem. para ori

ginar a	estrutura humana.
Eumero	Sequência	Descrição -
1.	5 '-CTAGGATCGTGGATGGTGGGAAGA^G-? · I	Síntese de ADRc para primário de cadeia leve
2.	5' “GTAGGATGGAGTGGATAGACGGATG-3'	Síntese & AWc para primário de cadeia
s		pesada
3.	5’-GTG0AAGGTTGAGGTGAGGATGG-3’	Primário anterior V-, quimérico
4.	5'-TTGGATGGAGTGAGCTGAGGAGAGTG 'rGA-3’	Primário posterior VT~ quimérico
S	5 ‘agaaagcttcgacgatggattttcaa GTG-3’	primário anterior · quimérico
6.	5,~-G5AGAT0TAa,I10ACGTTTTATTTGC . ·. aac-5'	primário posterior quimérico
7.	5 ’ -AGGAWOGTGTAGTGCGAGGTGAà GTGTAACTTAGATGTATTGG2ACCAG OAG-3’	Primário reestrutu- rado VI CM 1 jj

Número	Sequência	Descrição
8.	5 ’ -OTGO-IGASvTACGACAGATCOAAGOTG ;	Primário reestrutu
	0Tg0gGGTGTGC0AAGC-3't '	rado VT CDB 2
9.	5’-AGOTAGTAGÍGCCAGGAG^GGACTAGTOÁ	Primário reestrutu
	IAT20AGGPICGGGCAA-3'	rado \r GDlí 3 . J4
10.	5 ’ -AGCGGTAGCGAGTACAG0ff ϋOACOAIO- 5 ’	Primário introduzi
	& 5K	do B7il em
11.	5 *AIAQ0IT0ACAI00ACTG-3 ’	Primário para intr duzir 0 S3O5! em BB
12.	5 *-CGAGTGGATTGGCGAGT-3’	Primário para intr
		tusir V48I em BV. i.1
13.	5 *-ilTAAGAGCAAGGOIACCATGAOGGT	Primário para intr
	GG-ACCCICI-3 ’	duzir xí66B,-V67A, L/IV ém tN
14.	5 ‘-GA-IGAGCGTGGACACÒ(Í0T-3 ’	Primário para intr duzir B71V ®m NB .·. n
	Iara càda região variável do AD	nc, concebem-sc de

preferência dois primários. Bos primários anteriores, utilizam-se 15 bases na extremidade 3’ do primário, para híbridizar 0 primário para o ADN modelo, enquanto a extremidade 5’ ~ í do primário contém um sítio ilind III e a sequência Kozak.

Os primários posteriores têm uma concepção semelhante, com 15 bases na extremidade 3', utilizadas xiara hibridizar 0 pri mário para 0 ADN modelo e a extremidade 5' do primário contém um sítio BamHI e um sítio de divisão do doador. No caso do primário posterior de cadeia leve, utiliza-se um sítio Bgl II em lugar do sítio Bamdl, porque 0 código ADNc para a V_Ti possui w sítio BamHI interno (Bigura 2). dealiza-se a reacção PCE de preferência conforme se descreve conforme se descreve nos Exemplos.

ADN com a região modificada pelo PCR é clonado nos sítios Hind III-BamHI do vector de expressão de cadeia leve HCMV, como fragmento de Hind III-Bgl II. 0 referido vector posui ja a região genómica humana constante K com o necessário sítio de aceitador de divisão, e sítios poli (A'). Todo o fragmento modificado pela PCR é sequenciado usando-se dois primários que se recozem para originar sitios que formam os flancos do sítio de clonaçao no vector de expressão. A sequênciaçao confirma que nenhuns erros foram incorporados durante a fase operacional da PCR. 0 ADN modificado pela pela PCR e clonado para o vector de expressão de cadeia pesada HCMV como um fragmento de Hind III-BamHI e também sequen_ ciado para confirmar a ausência de erros PCR. Um fragmento contendo a região constante gama-1 genómica humana é inserido no vector de HCMV-CV^. no lado 3' da região . Este fragmento possui o necessário sítio de divisão do aceitador para que ocorra a divisão V-C in vivo, e o sítio poli (A+) que ocorre naturalmente.

Os vectores de expressão contendo as regiões quiméri^ cas 425 e sao cotransfectadas para as apropriadas células eucarióticas, de preferência células COS. Depois duma expressão de transiçao durante cerca de 72 horas, ensaia-se o meio de cultura das células por meio de ELISA, para a produção de IgG humano e para ligar à proteína do EGFR. As quantidades de IgG humano detectadas nos· meios^- variam entre 100 e400g/ml. 0 anticorpo quimérico produzido liga-se bem à proteína . do EGFR num ELISA modelo de ligaçao ao antigénio, confirmando assim que as regiões variáveis correctas do rato foram clonadas e sequenciadas.

Concepção inicial, construção e expressão das cadeias leves e pesadas 425 humanas reestruturadas;

Ao conceber um anticorpo 425 humano reestrutprado, dá-sc a máxima ênfase à região V , visto que esta zona á mui tas vezes muitíssimo importante'na ligação do antigênio (Amit et al., 1986; Verhoeyen et al., 1988). Para escolher as FR humanas nas quais se enxertam as CDRs.de rato, as FRs da região do máb 425 são comparadas com as FEs provenientes das sequências de consenso para todos os subgrupos das regiões Vhumanas (Kabat et al·, 19θ7)· Esta comparação mostra que as FKs da V._T mab 425 de rato são muito semelhantes às FRs do sub grupo I da V.^ humana, tendo cerca de 73% de identidade nas Flis e cerca de 65% de identidade de todas as regiões V-.

Uma outra comparação da região 425 do rato com outras regiões V do rato de alguns subgrupos de Kabat e efec · “ tuada para identificar quaisquer resíduos FR. que são caracte rísticos do mAb 425 θ podem, portanto, ser implicados na ligação do antigénio. 0 resíduo na posição 94 da região kAb 425 de rato é uma serina, enquanto noutras regiões V, do sub-11 .

grupo II (B) de rato e também do subgrupo humano I, o resíduo 94 é uma arginina (Kabat et al., 1987). A mencionada substituição de aminoácido é pouco usual e, dado que a posição 94 é adjacente à ODR3, está numa posição surpreendentemente importante. Por estas razões, a região Vg 425 humpna reestrutu rada baseia-se, de preferência, nas ODRs do íiab 425 de rato e nas PRs derivadas da sequência de consenso para as FRs do subgrupo I humano (conforme definido por Kabat et al., 1987) A posição 94 na FRJ ê uma serina, conforme se encontra no ilAb 425 de rato. Em posições na sequência de consenso para as FRs do subgrupo I humano em que não está nenhum aminoácido isola do, escolhe-se 0 aminoácido que ocorre mais geralmente nessa posição. Se nao existir nenhum aminoácido preferido numa determinada posição na sequência de consenso humana, escolhe-se 0 aminoácido que se encontra nessa posição na sequência da V,.

i.

kAb 425 de rato. A sequência de aminoácido resultante compre- 35 -

end© a primeira versão (versão a”) do V_, 42$ humano reestru turado V- 425 humano reestruturado (Figura 3). Sodas as ver, sões subsequentes do V-- 425 humáno reestruturado sãõmodifiIX cações desta primeira versão.

por exemplo, do anticorpo HG3O1. (hechavi et 1987). 0 fragmento de ADI sintético possui também sinal um al a ,

5‘, do

Concebe-se e sintetizasse um fragmento de ADL· 454 bp que codifica a região 425 humana reestruturada, confor me se descreve anteriormente (veja-se os Exemplos e a Figura

3)« Além das sequências do ADN com o código para os aminoáci dos da região 425 V._{ humana reestruturada, o referido fragme to de ADN contém também as sequências coia 0 código para uma sequência humana principal. A sequência humana principal pode ser tomada, por exemplo, do anticorpo HG3C1. (hechavi et a 1 ·, de tradução eucariótica na extremidade 5’ (Kozak, 1987)_? sítio de divisão do doador na extremidade 3’ (Breatlinach. et

1978) e sítios Hind III e BamHI nas extremidades. 5’ respectivamente,

HCMV· e

para subclonação no vector de expressão realiza-se uia processo semelhante para a concepção 425 humana reestruturada. As Ffís da região 425 rato'são comparadas com as sequências d© consenso da A para todos os subgrupos das regiões humanos (líabat et al* 1987). Nas FRs, encontra-se uma identidade de cerca de,71% entre a V& 425 de rato e 0 subgrupo III de L humano e cer ca de 70% de identidade com o subgrupo I da ’Vh E. humana. 0 código do ADN para as F'As humanas do subgrupo I da £ já se pode obter da região Dl,3 humana reestruturada (patente europeia SC? 239 400, Ninter) © da CAmPAlU-1 humana reestr turada (Reichmann ©t al*, 1988). A concepção das regiões V_r humanas reestruturadas nestes dois anticorpos humanos baseia-se na proteína da imunoglobulina humana BEI estrutural-mente dissolvida (Bpp et al., 1975)· Por estas razões* as FHs da humanas, provenientes das Dl,3 humana e CAmPATh-1 n são tam'1

- -

bém utilizadas na região 4-25 humana reestruturada. Uma com paração entre as FRs da região 425 de rato com as FE.s de outros anticorpos de rato provenientes de subgrupos similares não revela nenhumas diferenças significativas nos resíduos dos aminoácidos em posições funcionalmente importantes, portanto, não são necessárias nenhumas mudanças nas FRs. A sequência de aminoácido da região 42'5 humana reestruturada, versão a, encontra-se ilustrada na Figura 4.

Para construir a região 425 humana reestruturada, concebem-se três oligonucleótidos que possuem as sequências de ADN interiores com o código para as três CDRs da região V 425 de rato e também contém. 12 bases nas extremidades 5’ e 5’, concebidas para hibridizarem as sequências de ADN que codificam as FRs humanas na região Dl,5 humana reestruturada (vejam-se os oligonucleótidos 7 a 9 na Tabela I). Realiza-se o enxerto em CDR conforme se descreve nos Exemplos. Depois da sequenciação do ADN dos supostos clones positivos provenientes da selecção, o rendimento geral do mutante triplo está compreendido entre 5 ^e 15%, de preferência entre 9 ^e 10%. Uma região 425 humana reestruturada que não possui nenhuns erros PCR é clonada como -um 'fragmento de Hind III - BamHI para o vector de expressão de cadeia le^ve, para produzir o plasmído UCMV-RV^a 425-K (Figura 1).

Os dois vectores de expressão portadores das regiões 425 V_T e Vr_T são então cotransfectados para as células apropriadas (ver acima) para procurar a expressão de transição dum anticorpo 425 funcional humano reestruturado. Depois de cerca de 72 horas, colhem-se as camadas sobrenadantes nas . células e ensaiam-se por ELISA para se obter o IgG humano. Pode-se detectar o IgG humano em níveis compreendidos entre 100 e 500 ng/ml, no entanto, no ensaio ELISA sobre a ligação do antigénio, é surpreendente que a ligação ao EGFR não seja detectável. guando as células são cotransfectadas com HCMVX

-ÊV_Ta 425-K/lOW-QV^ 425-gama-l ₄ produz-se 0 IgC· humano e 11 ga-se ao ílGRõ. $0* entanto, quando-as células são co-transfec tadas com hGxiV-OVj 425-^/^^-2¹^ 425-gama-l» produz-se o IgG humano, perante e..,U sárias romana para a más ele não se liga ao aGJ?£; em níveis detectáveis :s resultados inesperados ê evidente que são nece mais modificações inventivas nas PL.s da região ¥ 425 rêestruturada, a fim de se obter um sítio funcionai ligação do antigene.

...odificações nas Ris da região 425 V,._: humana r^estruturada:

...ais alterações nas da região 425 estruturada baseiam-se num .modelo molecular das gião variável 425 do rato. Às laçadas de.JDX. da mana reestruturada são examinadas para verificar como elas se adaptam às estruturab canónicas descritas por Ghothia et al., (1989). O resultado desta análise © que se fazem certas mudanças nas FHs. nfectuam-se outras alterações nas jtrs com base num anticorpo funcional anti-Sac humano reestruturado, que também foi concebido com base nas FRs Lumar-as õo sul .rupo j. ^.^ueen al., Ijoy)» Qurpre^núexxtemente, a r^gxao v do anticorpo anbi-rac d® rato © idêntica em cerca de 79/' à região V. _do anticorpo do rato 425» Agora, de acordo com a invenção, fás-se um modelo molecular das regiões variáveis 425 do rato ;j?igura 5) · C modelo é baseado na estrutura -5» um anticorpo estruturalmente dissolvido, cujas regiões variáveis possuem um elevado grau de homologia às regiões va piáveis do anticorpo 425 do rato* Gomo resultado uas análise acima descritas, alteram—se os resxuuos de aminoácidos nas posições 5C, 48, 67» 63’ e 71 ha região 42/ V humana reastru tarada, para serem idênticos aos sas posições na região 425 V- cio tos individuais das citadas alterações, .Zj'

Lí resíduos de região 42/ . _ aiaxnoácidos que ocorrem nes rato. rara dissectar os constrói-se usa varia dade de combinações das referidas alterações e ensaiam-se de acordo com a invenção.

Eo total constroem-se 8 novas versões da região 42 p V,, humana reestruturada (ver a Figura 4) · A partir das versões produzidas pelos processos descritos com pormenores nos Exemplos, fazem-se outras versões por recombinação de pequenos fragmentos de ABE provenientes de versões anterioras· ye pois de estarem montadas todas as versões pretendidas, de pr ferSncia em pU018, transferem-se as regiões 425 V.,· humanas reestruturadas como fragmentos Hind III-3amhX para o vector tOnV-ν,ρ produzindo assim as versões ”b” até ”1 .OiW-BVv 425-gama-l (Figura 4).

de expressão do plasmido (t modificações nas FKs da região 42$ V~ humana reestruturada:

Embora as correspondentes células cotransfectadas expressam a cadeia leve, versão a, 425 tu a,e com vectores que mana reformulada e a cadeia pesada 425 quimérica produzam de facto um anticorpo que se liga ao m&FH, o anticorpo com a ca deia leve 425 humana reestruturada não parece ligar-se tão bem como o anticorpo quimérico 425· 0 exame das regiões v_f do 425 de rato e da versão ”a do 425 humana reestruturada revelam que o resíduo 71, que é parte da estrutura canónica para a Ctíl-il (X»l) não é retido na versão ⁿa” (Chõthia et al·, 1987; 0 processo de mutagénese em 2011 (Kamman et al,, 1989) é o pre ferível.para introduzir uma mudança de phe para í.^!vr nesta posição. 0 fragmento Hind III-Banuu, produzido pela referida mu tagénese, é introduzido no vector de expressão rnOmV-V^ pura tar origem a nOmV-RV^b 425-Xí* ·, 1989).

Análise das novas versões da região 425 V,.- humana reestrutu_ ' xi.

— · ¹ ----iiii ι, ι T.··· ¹¹ 'ι - i-rr—'.· ’.i ll--i '-i '.*·ι· ι .-· ι j—ι τ--·|ι·· --11-1,-1 inin.r—fir ,.1./. 7-1 ri - - ---= -.-,-- -· -- ..· _t -· ·, _L—*rj jj. _ _ :..,-.·.ιτ i.n r...:i. .•um/iiiVtrft^iteMwrniί,γιιι 1 um' τ'· rada:

Os vectores de. expressão contendo as vergões ”a*^s

- 37 5

até ”i” da região T. humana reestruturada são cotransfectado3 para as células caracterizados anteriormente, em que 0 vector de* expressão contendo a versão ”a” da região V^ humana rees* truturada. Passados cerca de 5 dias, as camadas sobpenandantes das células são analisadas por 1SLISA, para a produção de IgG humano. Os níveis de produção variam entre cerca de 50 e 500 ng/ral_s Analisa»*se as amostras por *ilI»A, para se obter uma IgG humana, capaz de se ligar ao EGPS.» As versões diferentes das regiões V, humana r©estruturadas resultam numa arn pia variedade de níveis de ligação do antigene (figura 6) * ICesto ensaie ui-IOA para a ligação de antigene, os diversos anticorpo© 425 humanos reestruturados podes ser comparados' directumente com 0 anticorpo 425 quimérico, mas não com 0 an ticorpo 425 de rato. Isto é devido ao facto de 0 anticorpo utilizado para detectar a ligação ao antigene ser um anticor po IgG anti-humano. As nove versões da região V. humana rees “ · .,£ — tx-uturaãa podem ser agrupadas de acordo coxa a sua capacidade de se ligar ao AGfh. As versões;“g” e ^Mi·'·· da região V_g humana reestruturada proporcionam os níveis mais elevados de ligação, seguida pelas versões c”, ”£” e ^<!li” e depois seguida pela .versão ^Mb”. mm alguns experimentos, a versão ”e’^! produz níveis baixos,, mas detectáveis, de ligação. As versões ”a” e ”d” nunca produzem níveis de ligação detestáveis.

Aealiza-se um ensaio de competição de ligação para comparar directamente os anticorpos 425 dos contendo as versões ”g” e ^lsiⁿ de V.

Al quimérico, para 0 anticorpo 425 de rato os anticorpos nas camadas sobrenadantes humanos roestruturae o anticorpo 425 (figura 7). Visto qu nas células não são purificados e são, portanto, quantificados pôr nLIoA, os resultados obtidos com 0 ensaio de ligação na competição são considerados como dando níveis relativos de ligação em vez duna quantificação exacta da afinidade. Os ensaios de ligaçãí na competição com amostras provenientes de quatro experimentos, por exeplo em células COS, proporcionam resultados consistentes em relaçao aos níveis relativos de ligaçao ao antigénio. 0 anticorpo 425 quimérico compete bem como o anticorpo 425 de rato marcado e dá uma inibição de percentagem de ligaçao justamente ligeira inferior a percentagem obtida quando o anticorpo 425 de rato nao marcado compete com o anticorpo 425 do rato marcado (Figura 7, painel A). 0 anticorpo humano reestruturado, com as regiões V^a e V^g é melhor do que o anticorpo com as regiões V^^a e Á (Figura 7, painel B) . Uma comparaçao dos pontos superiores das curvas sobre a ligaçao indica que o anticorpo humano reestruturado com a região Vgg compete com o anticorpo 425 de rato marcado, em 60 a 80%, as sim como faz o anticorpo 425 de rato nao marcado no mesmo ensaio. Quando se fizeram as médias dos resultados utilizando amostras de quatro experimentos independentes, por exemplo em células COS ou CHO, o anticorpo humano reestruturado contendo V_La e V de rato.

Com base nos mencionados resultados, é possível comentar acerca das contribuições relativas dos resíduos individuais na obtenção das FRs para fazer a ligaçao do antigénio· A mudança individual mais significativa neste., estudo é a mudança L7IV. Sem esta mudança, surpreendentemente, nao.é detectavel nenhuma ligaçao ao antigénio (comparar as versões a e b da V^). Surpreendentemente, as mudanças R67K e V68A são também importantes para a ligaçao (comparar as versões b e c e as versões i e h de V_LI). Embora a introdução de soΠ mente a mudança V48I, e das mudanças V48I e S30T em conjunto, falham na produção duma significativa ligaçao de antigénio, as alterações nestas posiçoes intensificam realmente a ligaçao de antigénio. A mudança ·830Τ parece ter, surpreendentemeii te, um maior efeito do que a mudança V48I (comparar as versões g” e i e as versões f e i da .

„g da uma ligaçao que e de 60 a 80% a do anticorpo 425

Análise da nova versão da região 425 humana reestruturada:

vector de expressão contendo o RV^b 425 foi cotransfectado para as células apropriadas, de preferência as células eucarióticas, contendo o citado vector de expressão as versões b, c ou g” da região humana reestruturada. As camadas sobrenadantes nas células sao escolhidas e ensaia das para a produção da IgG humana e depois para a IgG humana capaz de se ligar ao receptor EGFR (Figura 8, painel A). Estes resultados mostram que a versão b da região 425 humana reestruturada aumenta a ligaçao ao antigénio. Realiza-

-se então um ensaio de ligação em competição, para comparar anticorpos 425 humanos reestruturados com as regiões a mais V^g e V^b mais V^g, com o anticorpo 425 do rato.O 425 humano reestruturado com versão da região tem maior avidez por antigénios. Assim, uma alteraçao F71Y na mAb uma região aumenta a ligaçao de antigénios. 0 anticorpo monoclonal mAb 425 humano · rêestruturado, com as règioes V^b e g tem uma avidez por antigénios que é de 60 a 80% da avidez do anticorpo MAb 425 murino.

A partir de outros ensaios, usando qm anticorpo humji no reestruturado contendo V^b mais V^g (Exemplos.. 10, 11), pode-se demonstrar que a capacidade de ligaçao ao EGFR é semelhante para anticorpos reestruturados quiméricos e murinos.

A invenção demonstra que modificações relativamente conservadoras nos resíduos da FR podem influenciar fortemente a ligaçao ao antigénio.

modelo molecular das regiões variaveis de 425 do rato mostra claramente o mencionado resíduo na posição 30 em Vj*, estando na superfície da molécula, na vizinhança da CDR1. De facto, Hl conforme e definido por Chotia e Lesk (1987), prolonga-se desde os resíduos 26 a 32, compreendendo assim o resíduo na posição 30. Quando o resíduo na posição 30 é alte40 -

rado de Ser para Thr no anticorpo 0AMPATH-1H, ele não tem ne nhum efeito sobre a ligação do antigénio· Quando a posição 30 ê modificada de Ser para Thr no anticorpo V_H 425 humano rees truturado, intensifica-se a ligação ao antigene. Parece que o aminoácido na posição 30 desempenha .de facto uma função na ligação ao antigénio nesta interacção especial anticorpo-antigénio. Visto que a alteração S30T aperfeiçoa apenas ligeira mente a ligação ao antigénio e dado que a mudança não 6 essen ciai para a ligação ao antigene, o Thr na posição 30 tem sómente uma interacção fraca ηο'antigene.

A mudança de resíduo na posição 71 na região Vg in fluência fortemente a ligação ao antigénio., Isto é surpreendente, visto que dois resíduos ensaiados nesta posição, Vai e Leu, diferenciam-se apenas por um grupo metilo. 0 H2 do an ticorpo 425 de rato é um elemento de H2, estruturas canónicas do grupo 2, conforme definidas por Chothia et al., (1989). HyHEL-5 tem um H2 com uma sequência de aminoácido semelhante à do H2 do anticorpo 425 de rato. Em HyHEL-5, um aminoácido Pro na posição 52A na 0DR2 entra numa cavidade produzida pelo aminoácido pequeno (Ala) na posição 71 nas FRs, No modelo das regiões variáveis 425 do rato, existe uma interacção semelhante .entre Pro-52A e Vai-71» Ainda que na Vg 425 de rato, o Pro na posição 52-A seja capaz de se inserir na cavidade produzida pela Vai na posição 71» a substituição do Val-71 por um Leu provoca um embate molecular, que poderia alterar a configuração da laçada da 0DR2. Por esta razão, a mudança

V71E em Vg 425 humano reestruturado reestabelece a interacção 0DR2-FR conforme ela ocorre na V^ 425 do rato. Surpreendente mente, isto intensifica grandemente as propriedades de ligação ao antigénio dos anticorpos 425 humanos reestruturados (com parar os anticorpos humanos reestruturados com as versões e ”b” da V^ na Figura 6).

A mudança na posição 71 na V-&

afecta provavelmente

a configuração C'DP porque o resíduo 71 é um elemento da estro, tura 1,1 (CDR1) (Chothia et al., 1989). O resíduo 29 na cm & um resíduo enterrado e tem um contacto com o resíduo 71 nas Ffts. MO anticorpo 42$ do rato, 0 resíduo 71 na V^ é 0 Tyr. Has FFfS humanas'utilisadas na construção V._r. s humano reestruturcado, o citado resíduo é um Phe. Parece que 0 grupo hidroxilo encontrado em Tyr, mas não em lhe, tem importância na manutenção <*a configuração correcta da OSIll.

â partir do modelo molecular das regiões variáveis 425 0.0 nato, parece que Lys-66 forma uma ponte de sal com Asp-86. A introdução ãum resíduo Arg maior na posição 66 íris romper a estrutura., 0 Ala-67 pode interactuar com a. GDB2 e, simultaneamente·, os resíduos da mudança 66 e 67 para Arg e Val, como em V_;ja 425, poderiam, ter um efeito estérico prejudicial na ksaòe-se que o resíduo na posição 48 fica enterrado (Ohothia e Lesk, 1987) e 0 modelo confirma isto. O resíduo ,de mudança 48 proveniente de um Ile, conforme se encontra no anticorpo 425 do rato, para um Val’, conforme se er. contra nas regiões V humanas do subgrupo I, poderiam afectar a ligação ao áhfcigene pelo rompimento geral da estrutura. O aminQácido nã posição 48 está também perto da 0ΰκ2 e pode te; um ©feito ejtérico subtil da laçada na 0DA2.

ros estudos sobre ligação em competição, as melhores regiões e V._T humanas r©estruturadas são V_Tb e V_i{g. A região V, g teve·todas as 5 mudanças de IA descritas no texte acima, mai& a mudança na posição 94 que é incluída na primei ra versão úa região 425 V~ humana reestruturada* As B-ls na versão ”b^M da região 425 V& humana reestruturada são idênticas em 70 a 80% às da região 425 V^ do rato. As Mis na versão' ”g” da região 425 V- humana reestruturada são 80 a 80% «M » idênticas às da região 425 V_;.· do rato.

utilização,ηθ,diagnóstico e na terapia dos anticorpos;

'ϊ

Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados a pacientes humanos para terapia ou diagnóstico de acordo com processos já conhecidos* Tipicamente, o anticorpo ou fragmentos dum anticorpo serão injectados de forma parentérica, de preferência por via intrapcritoneal. mo entanto, Os anticorpos monoclonals da invenção podem também ser administrados por via intravenosa.

A determinação dos títulos apropriados de anticorpos a serem administrados está dentro da capacidade do estado actual da técnica. Geralmente, os intervalos de dosagem na dministração de anticorpos monoclonais são bastanves grau des para produzir o desejado efeito da supressão do tumor. / dosagem não deve ser tão grande que provoque efeitos colaterais prejudiciais, tais como indesejáveis reacções cruzadas, reacções anafiláticas e semelhantes. Geralmente, a dosagem irá variar consoante a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um técnico especialista, A dosagem pode ser ajustada pelo médico do paciente na eventualidade de existirem quaisquer cortraindicações, condições, de tolerância à imunidade ou semelhantes * A dosagem pode variar entre 0,1 mg/£g e. /0 mg/ng, de preferência entre 0,1 mg/Kg e 500 mg/Kg/dose, numa ou mais administração diárias, durante um ou mais dias.

As composições para administração por via parentérica incluem soluções esterilizadas, aquosas ou não-aquosas, suspensões e emulsões. dxemplos de dissolventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como olus to de etilo. Os agentes veiculares aquosos incluem água, soluções aquoso/alcéoliças, emulsões ou suspensões, inclusive os meios salinos e taáponados. Os agentes veiculares para uma administração por via parentérica compreendem uma solução de cloreto de sódio, dextrose de Binger, dextrose e cloreto de

sódio, óleos de Einger lactados ou óleos fixos. Cs agentes veiculares para a administração por via intravenosa compreen dem agentes veiculares fluidos e nutritivos, electrólitos, tais como os baseados na dextros© de Binger e semelhantes, •lambém podem estar presentes os agentes preservativos ® outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, agentes antioxidantes, tes quelantes © gases inertes e seaelhantds.

*

anticorpos podem, ser conjugados a uma toxina ta como subunidade A de sicina., toxina de difteria ou uma enzima tóxica, domo alternativa podem·ser marcados com radio ue acordo coa processos'já conhecidos no estado da técnica, fodavia, o anticorpo da presente invenção possui uma excelen te citotóxicidade, na ausência de toxina, na px^esença de células efectivas, isto é, monócitos humanos.

(•a tumores sólidos que podem ser cletectados e traçados mediante a aplicação dos processos. da presente invençãs compreendem o melanoma, o glioma e o carcinoma. As células cancerosas que não expressão muito os receptores de Mi? pode: ser introduzidas a fazê-lo utilizando composições de linfo quina. também as composições de linfoquina podem causar uma expressão mais homôgéna dos receptores MI? entre as células dum. tumor, proporcionando uma terapia mais eficaz.

As composições d® linfoquina apropriadas para admi nistração compreendem interferon-gama, factor de necrose do tuicor e suas combinações. Elas podem ser administradas por via intravenosa. As dosagens adequadas da linfoquina estão compreendidas entre 10.000 e 1.000.000 unidades por paciente _-a?a fins de diagnóstico, o anticorpo pode ser con jugado a uma tinta radio-opaca ou pode ser marcado com radio (Jm processo do marcação preferido ó o processo iodogénico (Praker et al., 1978). iref erenôialmente, o anticorpo será administrado como fragmentos Ftab'^ para fins de diagnóstico. Isto proporciona melhores resultados, de forma dé não é necessária uma subtracção. Podem-se preparar os fragmentos por processos conhecidos (por exemplo, Herlyn et al., 1983). Geralmente realiza-se a digestão da pepsina num pH ácido e separam-se os fragmentos da IgG pesada mediante a (marca registada). Os anticorpos 425 invenção têm menos quer de rato, imunidade anticorpo quimérico Estudos : competir com optimizadas reestruturados e nos

425 ι nas sobre não digerida e os fragmentos de cadeia cromatografia da proteína A-Sepharose humanos réestruturados de acordo com a probabilidades do que os anticorpos 425 quiméricos, quer seres humanos. A humano é igual à melhores formas a ligação

EGF para a mesma murinos.

de provocar uma resposta de avidez da melhor versão do do anticorpo 425 de rato ou de realização da invenção, mostram que a capacidade de ligação ao EGFR em condições para anticorpos quiméricos, Além disso, os anticorpos 425 humanos reestruturados são mais eficazes quando são utilizados de maneira terapêutica nos seres humanos, do que os anticorpos 425, quer do rato, quer quiméricos. Devido à grande redução na imunogenicidade, o> anticorpo 425 humano reestruturado tem uma semi-vida mais longa nos seres humanos e tem menos probabilidade de provocar qualquer resposta de imunidade prejudicial no paciente humano.

Os resultados com anticorpo MAb 425 acima definido mostram que os anticorpos monoclonais humanizados, tendo uma sequência de consenso artificial não suscitam uma resposta mínima notável. Outras vantagens estão descritas acima, no parágrafo entitulado: Sumário da Invenção. Portanto, é elevado o valor dos novos anticorpos de acordo com a invenção, para fins de terapia e de diagnóstico.

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3lonação e.....sequsnciaçãp molecular;

130 • Isolou-se o Ajilí total dtíma linha de células '£425“ -15 (ATCÇ Lm 9629), a qual 'produz o Wib 425· utilizaram-se cerca ._:e 9,6x10' de células para produzir ο ΑΠΕ total utilizando o processo guaniãinio-GsQl (CMrgwin et al», 1979)· As camadas sobrenadantes' das células utilizadas para o isolamen do AJ-.ii total foram ensaiadas com uBIBA para assegurar que células estavam a produzir o «JVb certo, em grandes quanti es. f reparou- se o poli (A*) Aliíâ' (Aviv e Leder, 1972). Çint tizou-sé o ADlc de fita dupla 'essencialmente de acordo con processos de Gubler e doffman (1985), excepto pelo facto se utilizar os primários homólogos com ds regiões 5’ das ^v - -------------'.....- - - · _pura primeira fica do primário. (Levy et al., 1937)· ie 'cadeia leve era um 26-mer (oligonucleótido 1,

I) GUtí foi' concebido com base nos dados publicados ia&riten et al., 1983). 0 primário de ca fabela I) e fo

Otí cie rcgiõés constantes'da imuiíoglobulina K e y-2ado rato,

C-A íj Oaj C< Cíí.A primário d

ι.·ao ela (levy et al,, 1987; Kadriten et al., 1983). v ãèia pesada era um 25-mer (oligonucleótido 2, concebido com base' nos dados publicados (Kaariten et al., conceoidos e biossistemas e acrilamiáa.

ADAc de extr

1983; Labat et al., 1987)· Os primários foram sintetizado □. num sintetisador de A Cã 380 B de aplicado e foram purificados em géis de ureia Após uma síitese da segunda fita clonaram-se os

midades rombas em pU018 digerido com Smal existente no comér cio, e transformaram-se nas competentes células de E. coli, por exemplo células DH5-alfa, existentes no comércio. As colónias foram gradeadas em placas de agar e seleccionadas por hibridização utilizando-se primários de síntese de primeira fita marcados 32p (Cárter et al., 1985). A sequenciação do plasmidio de ADN de fita dupla foi realizada com a utilização de sequenase (United States Biochemical Corporation).

Exemplo 2

Construção de genes quiméricos:

Para cada região variável sintetizou-se um primário (PCR) de reacção em cadeia de polimerase anterior 5’ θ poste rior 5' (oligonucleótidos 3-6, tabela I). Estabeleceram-se as reacções PCR utilizando 1 ng do plasmidio de ADN pUC18 con tendo o ADNc clonado, os primários PCR anterior e posterior, numa concentração final de 1JM. cada, 200 de cada dNTP, 10 mM de tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 MgCl e 0,01% de gelatina (peso/volume). Adicionou-se uma polimerasa de ADJ Amplitaq (Perkin Elener Cetus) a 2,5 unidades por ensaio. De pois duma fusão inicial a 94°C durante 1,5 minutos, efectuaram-se 25 ciclos de amplificação na temperatura* de 94°C duras te 1 minuto, a 45°C durante 1 minuto e 72°C durante 3 minuto

Efectuou-se uma operação de extensão final a 72°C durante 10 minutos. As reacçoes PCR foram extraídas duas vezes em fenol /clorofórmio e precipitadas em etanol antes da digestão com Hind III e Bam Hl. 0 fragmento de PCR que codifica a região

s.

^VL ^{Ou V}H foi depois clonado num vector de expressão. 0 referido vector contém o agente intensificador e promotor de HCM7 ( citomelovirus humano), o neogene bacteriano e a origem SV40 de réplica. Um fragmento de Bam Hl de 2,0 Kb do ADN genómico que codifica a região constante gama-1 humana (Takahashi et al., 1982) foi inserido na orientação correcta e jusante do “ *9 -

fragmento da região V (ver 425-gama-l na Figura 1).

O referido vector foi mais tarde adaptado para remover o sítio Saia :I na extremidade 3* do fragmento da região constante, permitindo assim que as regiães variáveis sejam inseridas diroçóaxaente no vector de expressão de cadeia pesada, como fragmentos de-hind IÍI-3am. il (haedã.et al., 1991). C fragmen to oue codifica a região V- foi inserido nom vector de exores

JL· ' — são -5.,...7 semelhante, contendo neste caso um fragmento de Bam ΐ do Au?· genómioo, tendo-uma dimensão de cerca dc 2,6 Kb, com o código para a região constante K. humana e contendo um sítio de receptor de divisão e um poli(A)* (Rabbitts et al., 19'84) (ver o _: iCj/V-OV,. 425-K na Figura 1).

jxçjiplp 3 oldaçãó molecular dc mÀb 425 V_T

Um modelo molecular das regiões variáveis do anticorpo monoclonal íULb 425 murino foi construído sobre a estru tura ‘dissolvida do.anticorpo anti-lisosima altamente homóloga, .-y-.úiks CSheriff et al., 19.87). As regiões variáveis do xAb 425 e têm cerca de 90% de comologia.

Construiu-se o modelo numa estação operacional de gráficos ue silicone íris 4C que elabora (JRXf.e utiliza o pa cote de moldação molecular ”-dAEiiS. (Polygen Oorp.). Hetivé ra.ft-se os .resíduos idêncicos na estmtra5 os resíduos desi guais foram substituídos usando-se a máxima sobreposição (Snow et imzel, 1936) incorporada no sistema de moldação de proteína de jJAhlA. A formação de cadeia principal, dos três resíduos com F-t ensinais na cadeia pesada.foram substituídos a ^artir da estrutura do anticorpo homólogo (Ay-Gb-lO (Padlan et al», 1989)), visto que os seus factores de temperatura eram anorBialm./nte elevados (maiores do que a média mais três desvios-padrão dos factores de temperatura da estrutura principal) e

eles influenciam o acondicionamento da Vg CDR3 (H3) (Martin, 1990).

As sequências 0DR1 (Ll) e GDR2 (L2) da região V^, e as sequências GDR1 (Hl) e GDR2 (H2) da região Vg provenien tes do anticorpo monoclonal mAb 425 córrespondiam a forma ca nónicas reveladas por Ch.oth.ia et al., (1989). Os ângulos de torsão da cadeia principal das referidas laçadas foram manti dos como em HyHEL-5· A sequência GDR3 (L3) da região Vg e a sequência CDR3 (H3) da região Vg, provenientes do anticorpo mAb 425 não correspondiam às estruturas canónicas e, portanto, foram moldadas duma maneira diferente. 0 programa de com putador segundo Martin et al., (1989) foi utilizado para extrair as laçadas do banco de dados de Brookhaven (Bernstein et al., 1977)· Depois encurtaram-se as laçadas com base na semelhança das sequências, energia e resíduos determinantes da estrutura (Sutcliffe, 1988). Inspeccionaram-se as laçadas das filas superiores nos gráficos e escolheram-se visualmente as melhores. Moldou-se a H3 em peroxidase de glutationa bovina (Epp et al., 1983) na região dos resíduos 92-103. Mol dou-se a L3 no fragmento de IgA (J539) Fab (Suh et al., 1986) na região dos resíduos 88-96 da cadeia leve.

Submeteu-se o modelo a gradientes de 'descidas com a máxima inclinação e conjugados de minimização de energia usando o potencial CHARMm (Brooks et al., 1983) conforme implementados nos QUANTOS, a fim de retirar os contactos atómi cos desfavoráveis e para optimizar as interacções electrostá ticas e de Van der Waals.

Exemplo 4

Construção de genes de anticorpos humanizados;

A construção da primeira versão da cadeia leve 425 reestruturada humana foi efectuada usando uma abordagem de

enxerto. 3ΏΚ semelhante à que foi descrita por Eeichmann et al., (1988) e por Verhoeyen et al*, (1988)* Preparou-se um A3E modelo de fita única a partir de um vector dé L113mpl8 (existente no comércio) contendo um fragmento Aind IXI-Bam .1, codificando

4CC, G ..inter).

leve deriva^! da fica* «z0n.ceueraxii—

a re dão V~ de anti-nisozima humana (GP 0239 η

As regiões variáveis jffis ãa referida cadeia proteina Sxd dissolvida de forma cristalográ i-se três oligonucleótidos que eram formados ,or sequências de ADE que codificam cada uma das O.Uíys de -cadeia lc-ve ao anticorpo mAb 425 de rato, flanqueadas em cada extremidade por 12 bases de ADR complementar às sequências de AUu que codificam as regiões variáveis Pãs adjacentes da proteína Ital humaná (oligonucleôtidos 8-9 na Tabela I). Gs oligOnucleótidõs foram sintetizados e purificados como anteriormente. iodos os três oligpnucleôticLos foram fosforilados e utilizados simultaneamente num sistema de mutagénese in vitro” dirigido ao oligonucleétido, baseado nos processos de xckstein e osus colaboradores (Taylor et₍al., 1985; hakamaye e cckstein, 1985; e Sayers et al., 1983). oeguiraa-se as ing trações do fabricante através da operação de digestão da exo nuclease 1X1. A reacção foi.então extraída com fenol/clorofó mio, precipitada em etanol e ressuspensa em 100 de X. lisou-se um volume, de 10 jjL como ADE modelo, numa reacção de amplificação de 100 /d. de B31’ contendo um primário .13 e um primário úe sequenciação reversa, até uma ção final dc 0,2-yu.. cada. As condições de ttuipão e ciclização foram as já descritas no Exemplo u, com excepção da utilização duma temperatura de recozímento de 55°G· A ção do Xdli foi extraída duas vezes com. fenol/clorofórmio e precipitada em etanol antes da digestão com iíínd III e dam. II e subclonação. em plTOlÔ,. Identificaram.-se os presumíveis clones positivos por hibridização para primários mutagénicos mar cados 32 p. (Cárter et al., 198?). Gonfirmou-se que os clonea

Aj · . cada. As universal concentra de termoreas eram positivos mediante a sequenciação. Uma região contendo todas as três CDRs exertadas foi clonada com um

fragmento	de	Hind III-Bam Hl, para	dentro do	vector de
expressão 425-K.	da	VL·' a	fim de	produzir	o plasmido	HCMV-RVT a L·
A versão	b	da	VT reestruturada	foi construída com

utilização do processo de mutagénese de Kammann et al., (1989), com modificações mínimas. 0 ADN modelo era o RV_La

subclonado para o PUC18. Iniciou-se a primeira reacção de PCR num volume total de 50 *Ί e continha 1 ng de modelo, primário de sequência reversa e primário 10. (tabela I), em concentrações finais de 1 M, 20 M dNTPs, 10 M de tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KC1, 1,5 mM de MgCl e 0,01% (peso/volume) de gelatina. Adicionou-se a polimerase de ADN Amplitaq, numa concentração de 1 unidade por ensaio. A reacção iniciou-se em triplicado. Depois duma fusão a 94°C durante 1,5 minutos, as reacções passaram por ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 37°C e 2 minutos a 72°C, durante 40 ciclos, seguindo-se uma extensão a 72°C durante 10 minutos. Reuniram-se as reacções, extrairam-se com fenol/clorofórmio e precipitaram-se em etanol, antes de se isolar o produto de PCR dum gel de agarose de TAE. Utilizou-sê então um décimo da primeira reacção da PCR como um dos primários na segunda reacção do PCR. A segunda reacção do PCR. A segunda reacção foi igual à primeira reacção excepto pelo facto de se utilizar o produto da primeira reacção e 20 pmoles do primário universal M13. A ciclização efectuou-se conforme foi descrito por Kammann et al., (1989). 0 fragmento de ADN portador da mudança pretendida foi subclonado no plasmido de expressão V_T , para produzir o plasmídio HCMV-RVj^b 425-K.

A primeira versão da região 425 V„ humana reestruturada n foi sintetizada quimicamente. Concebeu-se uma sequência de

ADN que codifica a pretendida sequência de aminoácido e possui as necessárias sequências de ADN de flanqueamento (ver acima). A utilização do cordão foi optimizado para as células de mamíferos com sítios uteis para as enzimas de restrição, elaborados nas sequências , de ADN com o código das FRs. 0 454 bp foi sintetizado e subclonado em pUC18 como um fragmento para EcoRI-Hind III. Um fragmento de Hind III-Bam Hl que codifica a cadeia pesada 425 humanizada reestruturada foi depois transferido para o vector de expressão V_H, pafa produzir o plasmídio HCMV-RV_Ha 425-gama-l.

Construiram-se outras oito versões das cadeias pesadas, humanizadas reestruturadas, consoante uma variedade de processos. 0 fragmento Hind III-Bam Hl que codifica a versão a da cadeia pesada foi transferido para o M13mpl8 e foi preparado o ADN de fita unica. Com o emprego dos oligonucleótidos 11-13 (Tabela I), utilizou-se a mutagénese M13 adaptada ao PCR conforme se- descreveu anteriormente, para produzir o ADN que codifica as versões d, e, f e g, em pUC18, das regiões 425 humanos reestruturadas. As mencionadas versões foram subclonadas no vector de expressão de cadeia pesada como, fragmentos Hind III - Bam Hl para produzir os plasmidos HCMV-RV_Hd 425-gama-l, HCMV-RV„ e 425-gama-l, HCMV-RV_tTf 425-gama-l e

Γ1 π

HCMV-RV_Hg 425-gama-l.

Produziram-se as versões b e c das regiões 425 V_H humanas reestruturadas utilizando-se o processo de mutagénese de PCR de acordo com Kammann et al., (1989) conforme se descreveu anteriormente. 0 ADN modelo era a região 425 V_rT humana reestruturada, versão a, subclonada em pUC18, e o primário mutagénico utilizado na primeira reacção PCR foi o primário 13 ou o primário 14 (Tabela I). Após a mutagénese e a sequenciação,

as sequências portadoras das desejadas mudanças foram subclç? nadas no plasmido de expressão de cadeia pesada para produzis⁵ os plasmidos ACxuV-BV-b 425-gama-l e EOMV-WpC 425-‘gama-l.

Construiram-se as versões h.” sada reestruturada, a partir dos clones í ϊ í—

baseados em pUw úas

versões existentes. Um fragmento de 0,2 kb do ninei. 111-^h.o X da versão ^,!e foi ligado a ura fragmento de η,β kb de lho 1-uind IX2 proveniente ou da versão ”b” ou da versão e”, ^ro duzindo as novas versões ”h” e i, respeôtivamente. Os fragmentos ...xin··’ III-BambúX,. com o código para as referidas versões, foram subclon&dos no vector de expressão de cadeia pesada, para produzir os plasmidos li 425-gama-1 θ

-EV. i 425-gama-l.

jhceiaplo 5

IransfeGQãq dq AW nas céhilas 003:

As células 303 foram cada uma electroporadas com ICyi-g dos vectores de expressão portadores de genes com o có digo das cadeias leves.e pesadas. _mi resumo, adicionara -ee 10 de caoa plasmidio a uma aliquota do C,8 ml duma suspen são de 1x1 c/ células/ml do células 103 em X-fíd. utilizou-se um pilsor ô.« genes Bio-Rad para emitir um pulso de 19GC V, com uma capaôitância de 25/d?. As células foram aeitaias para recuperação à temperatura ambiente durante ir minutos. antes de serem colocadas-em placas com 8 ml de n./i- contendo 10'·.; de saro de feto de vitelo, depois duma incubação de 72 horas, reuniram-se os meios, centrifugaram-ee para remover os resíduos celulares e armazenaras-se em condições estéreis ns temperatura de 4°o, por .curtos períodos, ou na temperatura âe -2C°U por períodos mais longos, antes da análise por nxí--.>A.

nxemplo 6

A transfecção com ADE para as células 0’10 foi feit

de acordo com o hxemplo 5,

Axemplo 7

Puantif icacão da, prndu.çãp detecção Χί.3^&<?^^η, g&tigene:

A IgG humana presente nas camadas sobrenadantes das células foi detectada por mLISâ.» lo ensaio- mLI-.-A sobre, a IgG- humana, revestiram-se placas com 96 .oll, co^ igG anti-humana de-cabra (molécula inteira) edetectou-se a 1-6

humana nas amestras junto das placas utilizando a xgG ar..ti-huiaana ae cabra conjugada com fnsfatase alcalina (especíliça da. cadeia gama). -Utilizou-se a IgG humana purificada o-dLs tente no Srcin- como -modelo» determinou-se a ligação ao aa tigene recoí b.eeido pelo anticorpo màb 425 num segundo ensaio LLIJA. deves tiram-se as placas com. uma - preparação -de -proteína IG-FR (auo se pode obter,· por-exemplo_T de acordo-cnm-Roâeck et al», (1939) e deteotaram-se «s anticorpos ligaúns ao _.yy -, utilizando-se quer-uma IgG anti-humana (específica da cadeia-gama) conjugada com. peroxldase (para anticorpos quimérico,-.; e humanos reestraturados)- ou uma IgG anti-rato (molécula-in teira) conjugada co^perodixase-^pára o anticorpo.de rato-Mb

425) (ambos conjugados fornecidos pela Sigma)v Com* modelo lizou-se o anticorpo murino Mb 425 purificado.

ligeniplo 8 djçsaio .sobre a ligação _; em competição;

. ^A·-anticorpo murino mAb 425 foidbiotinilado pelo uc<dum conjunto-correspondente, existente-no comércio, âs-placas· para « ensaio ,.LIM foram revestidas com uma diluição óptima da proteína iGFR. >, isturaram-se as diluições das camadas sobrenadastes de células 0^'3,-num volume de 5ⁿ/*.1» cem pT /*1 éc anticorpo murino MB 425 bintinilado (calculado, por meio do

ensaio ELISA, como sendo 1,75 g/ml). Οθ-da camada sobrenadam te de células COS foi ensaiada em duplicado. Incubaram-se as placas à temperatura ambiente, durante a noite. Detectou-se o anticorpo murino mAb 425 biotinilado ligado, por adição dua. 'complexo de peroxidase e rábano picante e estreptavidina. Um controlo sem qualquer competidor presente permitiu que se cal cuiasse um valor em percentagem de inibição ou de bloqueio para cada camada sobrenadante de células 008, como se segues

100- de amostra/OS^Q de controlo)xlOO .

jBxgmplo 9

Analisaram*se diferentes amostras de anticorpo mAb 425 murino reestruturado e quimérico por electroforese SDS poliacrilamida-gel (SDS-FAGE) de acordo com Laémmli et al.. Aplicaram-se 2,5 g de cada amostra a cada caso, em condiçõe redutora assim como em condições não redutoras. A proteína foi visualizada pelo manchamento de Ooomassie* A Figura 9(A) mostra que as amostras têm uma pureza semelhante*

Gama MW dos anticorpos;

180.000 - 200.000.

Exemplo 10

Furificou-se o anticorpo mAb 425 reestruturado por filtração em gel sobre Superose 12 (marca registada) (Pharma cie Qorp., Suécia) de acordo com processos convencionais. ns colheu-se o anticorpo com FBS (pH 7»4, 0,8 M WaOl). Rode-se obter um único pico (aõs 5 minutos) (Figura 9(B)).

Exemplo 11

Utilízou-se o anticorpo mAb 425 marcado com biotina, para competir com o anticorpo mAb 425 não marcado, ou de rivados, para se ligar ao EGFR. Obteve-se a marcação çom bio

- 7? -

tina de acordo com, processos convencionais· Adquiriram-se no comércio as células A431. Realizou-se a detecção apôs a incu bação com estreptavidina conjugada com POD e substrato. A par tir destes dados, formaram-se curvas (Figura 10). As curvas mostram que as ligações dos vários anticorpos são comparáveis.

Exemplo 12

Ensaiaram-se diferentes amostras de anticorpos mAb 425 murinos, quiméricos e reestruturados purificados* sobre a sua capacidade em competir com o factor EGF em relação à sua ligação ao EGFR, 0 ensaio foi realizado por competição do EGF marcado 125J (Amersham Oórp,, GB) e diversos anticorpos para ligação às membranas positivas dõ receptor do EGF (A43X). 0 sistema de ensaio baseou-se na tecnologia SPA (Amer sham). As curvas da competição dos anticorpos murino e reestruturado ($ amostras) são quase idênticas (Figura 11),

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES:

   la. Anticorpo monoclonal humano compreendendo sítios de ligação de antigénios (CDR) de origem não-humana, e as FR da região variável e das regiões constantes de cadeias pesadas e leves de origem humana, caracterizado pelo facto de pelo menos as FR da região variável da cadeia pesada compreenderem uma sequência de consenso modificada de diferentes regiões variáveis duma classe distinta ou dum subgrupo duma imunoglobulina humana,
2. 2a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as FR da sequência de consenso ter uma homologia igual a pelo menos 7Q% em comparação com a sequência de aminoácidos das FR das regiões variáveis do anticorpo não-humano do qual provêm os sitios de ligação dos antigénios.
3. 3a. Anticorpo monoclonal humano, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de ter as seguintes propriedades (a) liga-se a receptores do factor de crescimento da epiderme (EGF) humano;

   (b) inibe a ligação do EGF a receptores de EGF;

   (c) inibe a actividade da tirosina quinase dependente do EGF, do receptor de EGF;

   (d) inibe o crescimento de células sensíveis a EGF.
4. 4a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de as regiões hipervariáveis dos sítios de ligação dos antigéneos compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos cadeia leve:

   CDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrcadeia pesada:

   CDR-1 -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-Asn -Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyr-.
5. 5a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de as FR da região variável que não está relacionada com os sítios de ligação dos antigénios, compreenderem a seguinte sequência de aminoácidos cadeia leve:

   FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-AlaSer-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Lys-Ala-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile, -TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Tyr(Phe, Trp, His)-Tyr-Phe-Tyr-Ile-Ser-Ser-Leu-Pro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Tyr-ValFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-Lyscadeia pesada

   FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys-Pro-Gly-Ala-ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Thr-Phe-Thr(Ser)-;

   FR-2 -Trp-Val-Arg(His) -Gln-Ala (Lys ,Hi.s) -Pro (Vai) 60

   ί.

   r

   -Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile(Vai,Leu)-GlyFR-3 -Arg,(His)-Ala,(Val,Pro,Gly)-Thr-Met-Thr-Val(Ala,Lys,-Pro,-Gly)-Asp-Thr-Ser-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu(Asn)-Leu-Ser-Ser-Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser., em que os aminoâcidos que nas listas estão indicados dentro de parênteses constituem aminoâcidos alternativos.
6. 6a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo facto, de as regiões constantes da cadeia pesada compreenderem a sequência de aminoâcidos duma cadeia gama—1 e as regiões constantes de cadeia leve compreenderem a sequência de aminoâcidos duma cadeia K duma imunoglobulina humana.
7. 7a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com qualquer das reivindicações 3 ou 6, caracterizado pelo facto de compreenderem um derivado duma sequência de aminoâcidos modificados por uma anulação, substituição, adição ou inversão dum aminoâcidos dentro das regiões variáveis e regiões constantes em que se conserva a função biológica da ligação específica dos antigénios.
8. 8a. Vector de expressão adequado para a transformação de células hospedeiras, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de ADN que codifica as regiões variáveis e/ou as regiões constantes das cadeias leves e/ou pesadas dum anticorpo humano de acordo com as reivindicações 1 a 7.
9. 9a. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de as sequências do ADN codificarem uma proteína de um anticorpo de acordo com um dos anticorpos das reivindicações 3 a 7.
10. 10a. Vector de expressão tendo a designação pRVL 425, depositado na DSM sob o Numero de Acesso DSM 6340.
11. 11a. Vector de expressão tendo a designação pRVH 425, depositado na DSM sob o Numero de Acesso DSM 6339.
12. 12a. Anticorpo monoclonal humano ou quimérico, compreendendo regiões hipervariáveis (CDR) de sítios de ligação dos antigénios de origem murina e das -.FR das regiões variáveis de origem humana ou murina, e regiões constantes de cadeias leves e pesadas de origem humana, caracterizado pelo facto de as regiões hipervariáveis compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos cadeia leve:

    CDR-1 -Sèr-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrcadeia pesada:

    CDR-1 -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg~Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyre as regiões constantes da. cadeia pesada compreenderem a sequência de aminoácido duma cadeia gama-1 e as regiões constantes da cadeia leve compreenderem a sequência de aminoácido duma cadeia K duma imunoglubina humana.
13. 13a. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de as FR da região variável, que não está relacionada com os sítios de ligação dos antigénios, serem de origem humana e compreenderem a seguinte sequência de aminoácidos cadeia leve:

    FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-.

    FR-2 -ΤΓρ-ΤγΓ-σΐη-ΟΙη-Ιγδ-ΡΓΟ-ΟΙγ-Εγθ-Αίθ-ΡΓΟ-Εγδ-Βθυ-Σθυ-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Tyr(Phe, Trp, His)-Thr-Phe-Thr-Ile-Ser-Ser-Leu-Gln-Pro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-Lyscadeia pesada

    FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe—Thr(Sér)-;

    FR-2 -Trp-Val-Arg(His)-Gln-Ala(Lys,His)-Pro(Vai)-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile(Vai,Leu)-GlyFR-3 -Lys-Arg,(His)-Ala,(Val,Pro,Gly)-Thr-Met-Thr-Val(Ala,Pro,-Gly)-Asp-Thr-Ser-Thr-Asn-Thr-Ala-Tyr-Met-Glu(Asn)-Leu-Ser—Ser-Leu-Arg-Ser-Glu“Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser.
14. 14a. Anticorpo monoclonal quimérico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de as FR da região variável que não está relacionada com o s„ítio de ligação dos antigénios serem de origem murina e compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos cadeia leve:

    FR-1 -Gln-lle-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Met-Ser-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Lys-Val-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Ile-TyrGly-Val-Prõ-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Arg-Met-Glu-Ala-Glu-Asp-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-3

    FR-4 Phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lyscadeia pesada

    FR-1 -Gln-Va1-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu-Va1-Lys’ -Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-Ala -Ser-Gly-Tyr—‘Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-Tht-Ala-Tyr-Met-Gln-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Ser-Glu-Asr-Ser-Ala-Val—Tyr-Typ-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-Val-Ser-Ser-.
15. 15a. Vector de expressão adequado para a transformação de células hospedeiras, caracterizado pelo facto de compreender sequências de ADN que codificam as regiões variáveis e constantes das cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo monoclonal humano de acordo com as reivindicações 12 ou 13, ou de um anticorpo monoclonal quimérico de acordo com as reivindicações 12 ou 14.
16. 16a. Vector de expressão tendo a designação pCVL 425, depositado na DSM sob o Número de Acesso DSM 6338.
17. 17a. Vector de expressão tendo a designação pCVH 425, depositado na DSM sob o Número de Acesso DSM 6337.
18. 18a, Processo para a preparação dum anticorpo monoclonal humano, compreendendo regiões hipervariáveis (CDR) de sítios de ligação dos antigénes de origem não humana, e as FR das regiões variáveis e regiões constantes das cadeias leves e pesadas de origem humana por cultura de células hospedeiras transformadas num meio de cultura e purificação e isolamento das proteínas dos anticorpos expressas, caracterizado pelo facto de

    a) se sintetizar ou se sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótidos que codifica uma sequência de consenso de aminoácidos das diferentes FR das regiões variáveis (FR-1 a FR-4) duma cadeia pesada duma classe ou dum subgrupo duma imunoglobulina humana, em que a sequência de consenso utilizada possui uma homologia de pelo menos 70% em comparação com a sequência de aminoácidos das FR das regiões variáveis do anticorpo não humano, do qual provêm os sítios de ligação dos antigénios e em que se modifica a sequência de consenso por meio de alterações de no máximo 10% dos aminoácidos a fim de preservar a capacidade de ligação dos antigénios com as regiões hipervariáveis;

    b) se sintetizar ou se sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótidos que codifica uma sequência de consenso de aminoácidos nas condições indicadas em a) de diferentes FR das regiões variáveis (FR-1 a FR-4) duma cadeia leve duma classe ou dum subgrupo duma imunoglobulina humana, ou, como alternativa, que codifica uma correspondente sequência de aminoácidos que ocorrem naturalmente;

    c) em cada caso, se sintetizar ou se sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos das regiões hipervariáveis (CDR) das cadeias leves e pesadas que correspondem às regiões hipervariáveis do anticorpo básico não humano;

    d) em cada caso, se sintetizar ou se sintetizar parcialmente ou isolar uma sequência de oligonucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos das regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada duma imunoglobulina humana;

    e) se construir um ou mais vectores de expressão compreendendo em cada caso pelo menos um promotor, uma origem da replicação e as sequências de ADN que codificam de acordo com a) a d), em que as sequências de ADN que codificam as cadeias leves e pesadas podem estar presentes em conjunto num, dois ou mais vectores diferentes;

    e finalmente

    f) se tranformarem as células hospedeiras com um ou mais vectores de expressão de acordo com e).
19. 19a. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se utilizarem sequências de adn que codificam as seguintes sequências de aminoácidos, as quais representam as regiões hipervariáveis (CDR) cadeia leve:

    CDR-l -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrcadeia pesada:

    CDR-l -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyr-.
20. 20a. Processo de acordo com as reivindicações 18 ou 19, caracterizado pelo facto de se utilizarem sequências de ADN que codificam as seguintes sequências de aminoácidos, as quais representam as FR das regiões variáveis cadeia leve:

    FR-1 -Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Thr-Ile-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Asp-Tyr(Phe, Trp, His)-Thr-Phe-Thr-Ile-Ser-Ser-Leu-Gln-Pro-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Lys-Val-Glu-Ile-Lyscadeia pesada

    FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Val-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys--Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Val-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr(Ser)

    FR-2 -Trp-Val-Arg(His)-Gln-Ala(Lys,His)-Pro(Vai)-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Val(Ile,Leu)-GlyFR-3 -Lys(Arg,His)-Ala(Vai),Pro,Gly-Thr-Met-Thr-Val (Ala, Pro, Gly) -Asp-Thr-Ser-Asn-Thr-Ala-rTyr-Met-Glu(Asn)-Leu-Ser-Ser—Leu-Arg-Ser-Glu-Asp-Thr-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser.
21. 21a. Processo para a preparação dum anticorpo monoclonal quimérico, tendo a função biológica de ligação a épitopos dos receptores de EGF, compreendendo regiões hipervariáveis (CDR) dos sítios de ligação dos antigénios e as FR das regiões variáveis de origem murina e as FR das regiões constantes das cadeias leves e pesadas de origem humana por cultura de células hospedeiras transformadas num meio de cultura e purificação e isolamento das proteínas de anticorpos expressas, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras serem tranformadas com vectores de expressão de acordo com um dos vectores de expressão das reivindicações 15 a 17.
22. 22a. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo monoclonal humano de acordo com um dos anticorpos das reivindicações 1 a 7 ou 12 a 13.
23. 23a. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo monoclonal quimérico de acordo com um dos anticorpos das reivindicações 12 ou 14.
24. 24a. Utilização de um anticorpo quimérico ou humano de acordo com um dos anticorpos das reivindicações 3 a 7 ou

    12 a 14, para a produção dum medicamento para o tratamento de tumores.
25. 25a. Utilização de um anticorpo quimérico ou humano de acordo com um dos anticorpos das reivindicações 3 a 7 ou 12 a 14, para o diagnóstico da localização e avaliação do desenvolvimento de tumores,
26. 26a. Anticorpo monoclonal quimérico ou humano purificado 'caracterizado pelo facto de derivar do murino MAb-425.