CZ283717B6 - Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek - Google Patents
Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283717B6 CZ283717B6 CZ963337A CZ333796A CZ283717B6 CZ 283717 B6 CZ283717 B6 CZ 283717B6 CZ 963337 A CZ963337 A CZ 963337A CZ 333796 A CZ333796 A CZ 333796A CZ 283717 B6 CZ283717 B6 CZ 283717B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ser
- human
- thr
- gly
- ala
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/867—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody produced via recombinant dna technology
Abstract
Chimerická monoklonální protilátka obsahující místa vázající antigen, CDR, nehumánního původu, úseky základní struktury, FR, nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky: i/ váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptoru EGF, ii/ konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa, iii/ její oblasti CDR reprezentující místa vázající antigen zahrnují sekvence aminokyselin uvedené v nároku 1 iv/ její úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům vázajícím antigen, zahrnují aminokyselinové sekvence uvedené v nároku 1. Expresní vektor obsahující sekvence DNA kódující variabilní a konstantní oblst lehkého řetězce této chimerické monoklonální protilátky, který nese označení pCVL425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338. Expresní vektor obsŕ
Description
(57) Anotace:
Chimérická monoklonální protilátka, obsahující místa, vázající antigen, CDR, nehumánního původu, úseky základní struktury, FR, nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky: 1/ váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptoru EGF, 11/ konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa, 111/ její oblasti CDR, reprezentující místa, vázající antigen, zahrnují sekvence aminokyselin, uvedené v nároku 1, iv/ její úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům, vázajícím antigen, zahrnují aminokyselinové sekvence, uvedené v nároku 1. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast lehkého řetězce této chimérické monoklonální protilátky. který nese označeni pCVL425 a Je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast těžkého řetězce této chimérické monoklonální protilátky, který nese označení pCVH425 a Je uložen ve sbírce DSM poc přírůstkovým číslem DSM 6337. Farmaceutický prostředek, obsahující tuto chimérickou monoklonální protilátku. Výše uvedené protilátky st používá k terapeutickým a diagnostickým účelům při léčení nádorů.
Chimérická monokionální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Vynález se týká nových chimérických monoklonálních protilátek, které obsahují umělou modifikovanou konvenční sekvenci, přinejmenším úseků základní struktury ve variabilní oblasti těžkého řetězce humánních imunoglobulinů.
Vynález se dále týká chimérických monoklonálních protilátek, které se vážou kepitopům epidermálního růstového faktoru. Vynález zveřejňuje sekvence aminokyselin odpovídajícího místa, vázajícího antigen pro tento receptor.
Dále se vynález týká farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky. Tyto farmaceutické přípravky se hodí pro léčbu nádorů, jako jsou melanomy, gliomy a karcinomy. Protilátek podle vynálezu je také možno používat při diagnostických aplikacích, při nichž se zjišťuje povaha a umístění těchto nádorů in vitro nebo in vivo.
V popisu se používá několika technických termínů, které budou nyní vysvětleny:
Pod pojmem „humanizované“ protilátky se rozumějí protilátky, které obsahují úseky základní struktury variabilních oblastí a konstantních oblastí aminokyselin, umístěných v lehkém a těžkém řetězci, které pocházejí z humánních zdrojů. Naproti tomu, jejich hypervariabilní oblasti pocházejí z nehumánních zdrojů.
Pod pojmem „chimérické“ protilátky se rozumějí protilátky, obsahující variabilní a hypervariabilní oblasti, které pocházejí z nehumánních zdrojů, zatímco jejich konstantní oblasti jsou humánního původu.
Úseky základní struktury protilátky jsou v dalším textu označovány zkratkou FRs (framework regions). FRs se nacházejí ve variabilních oblastech. V těchto oblastech dochází k určité alteraci aminokyselin.
Zkratkou CDRs (complementarity determining regions) se označují oblasti, určující komplementaritu či „hypervariabilní“ oblasti protilátky. CDRs se nalézají ve variabilních oblastech. Tyto oblasti představují specifické místo vázající antigen a vykazují nesmírně velkou výměnu aminokyselin CDRs jsou především zodpovědné za vazebnou afinitu antigenů.
Pod pojmem „konvenční sekvence“ se rozumí sekvence aminokyselin, která se nevyskytuje v přírodě, jako variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce. Konvenční sekvence se používá jako náhrady za původně přítomné variabilní oblasti nehumánního těžkého nebo lehkého řetězce. Konvenční sekvence je syntetická a jedná se tedy o umělou sekvenci nejběžnějších aminokyselin určité třídy nebo podtřídy, či podskupiny těžkých nebo lehkých řetězců humánních imunoglobulinů.
Zkratkou „EGF“ se označuje epidermální růstový faktor a zkratkou „EGFR“ se označuje receptor epidermálního růstového faktoru.
Pod pojmem „VL“ oblasti se rozumějí variabilní oblasti lehkého řetězce.
Pod pojmem „Vh“ oblasti se rozumějí variabilní oblasti těžkého řetězce.
-1 CZ 283717 B6
Dosavadní stav techniky
Monoklonální protilátka z Muridae 425 (Mab 425) byla vypěstována proti humánní buněčné linii karcinomu A431 a zjistilo se, že se váže k polypeptidovému epitopu na vnější doméně receptorů humánního epidermálního růstového faktoru (EGFR), Tato protilátka inhibuje vazbu epidermálního růstového faktoru (EGF) na místech EGFR jak s nízkou, tak s vysokou afinitou (Murthy a další (1987), Arch. Biochem. Biophys. 252, 549). Ke zvýšené expresi EGFR dochází u maligní tkáně různého původu, což činí z Mab 425 možnou látku pro diagnostiku a léčbu humánních nádorů. Skutečně se zjistilo, že Mab 425 vykazuje cytotoxicitu vůči nádorům in vitro a potlačuje růst nádorových buněk z buněčných linií, odvozených od epidermoidního a colorectálního karcinomu in vitro (Rodeck a další (1987), Cancer Res. 47, 3 692). Také bylo prokázáno, že se Mab 425, značená radioizotopem, váže ke xenoroubům humánních maligních gliomů u myší (Takahashi a další (1987), Cancer Res. 47, 3 847).
EGF je polypeptidovým hormonem, který je mitogenní pro epidermální a epithelové buňky. Při interakci EGF se senzitivními buňkami dochází kjeho vazbě na membránové receptory; komplexy receptor-EGF se shlukují a potom jsou pojmuty do endocytotických váčků. Tím dochází k úkazu, označovanému termínem regulace směrem dolů („down-regulation“). Vazba EGF indukuje tyrosin kinázovou aktivitu receptorové molekuly a indukuje syntézu DNA.
Receptor EGF je transmembránovým glykoproteinem o velikosti přibližně 170 000 Dalton (Cohen (1982), J. Biol. Chem. 258, 1523). Je genovým produktem c-erb-B proto-onkogenu (Downward a další, Nátuře, sv. 307, strana 521 až 527, 1984). Tento receptor se vyskytuje ve dvou kinetických formách, které jsou označovány jako receptor s nízkou afinitou a receptor s vysokou afinitou.
Buněčná linie karcinomu A431 exprimuje na povrchu svých buněk velké množství receptorů EGF, a proto jí bylo použito při mnoha studiích pro tvorbu protilátek anti-EGF-receptor. Receptory na A 431 se však liší od receptorů na jiných typech buněk v uhlovodíkových zbytcích, které jsou připojeny k polypeptidu. Mnohé protilátky, vypěstované proti membránám A431, jsou proto zaměřeny proti uhlovodíkům, které nejsou společné pro všechny formy receptorových molekul (viz například Schreiber (1983) J. Biol. Chem., 258, 846).
Jiné molekulární protilátky jsou reaktivní vůči proteinovému zbytku receptorů EGF. Při vazbě kreceptorům EGF vykazují tyto protilátky různé vlastnosti, o nichž se předpokládá, že jsou závislé na konkrétní části vázané receptorové molekuly a na izotypu protilátky. Některé protilátky napodobují některé účinky EGF (agonisty) a některé tyto účinky inhibují (antagonisty).
V průběhu růstu nádoru se předpokládá exprese receptorů EGF. Zjistilo se, že gen pro tyto receptory je buněčným analogem ptačího virového onkogenu v-erb-B (Ulrych a další (1984), Nátuře, 309, 418). Kromě toho bylo nalezeno spojení mezi pozdními stadii vývoje melanomu a kopiemi, navíc chromozomu, nesoucího receptorový gen (Koprowski a další, Somatic Cell and Molecular Genetics, sv. 11, str. 297 až 302, 1985).
Jelikož receptory EGF jsou exprimovány v celé řadě tuhých nádorů, poskytují vhodný cíl pro protinádorovou léčbu. Existuje však nutnost nalézt vhodnou protireceptorovou protilátku. Mnohé ze známých protilátek mají vlastnosti, které by při jejich použití jako protinádorových činidel byly škodlivé. Tak například protilátky, které napodobují účinky EGF, by mohly stimulovat růst nádorů, místo aby jej zastavovaly. Jiné protilátky, které se vážou k receptorům s vysokou nebo nízkou afinitou, by mohly mít účinnost nižší, než je účinnost optimální, poněvadž EGF by ještě mohl projevovat svůj účinek prostřednictvím nevázaných receptorů. Ještě další protilátky mění receptory s nízkou afinitou na receptory s vysokou afinitou, což by mohlo mít za následek
-2CZ 283717 B6 výrazné posílení růstu nádoru namísto jeho inhibice. Existuje tedy v tomto oboru potřeba nalézt protilátku proti receptoru EGF, která by byla vhodná pro protinádorovou léčbu.
Protilátek MAb (z Muridae) se sice používalo pro léčbu lidí, vyvolávaly však imunologickou odpověď (Giorgi a další, (1983) Transplant. Proč. 15, 639; Jaffers a další, (1986), Transplantation 41, 572). Pro překonání tohoto problému se několik skupin snažilo „humanizovat“ protilátky z Muridae. Přitom lze použít dvou přístupů. Jednak lze domény z konstantních oblastí jak v lehkém, tak v těžkém řetězci Muridae nahradit humánními konstantními oblastmi. Takové „chimérické“ murinohumánní protilátky byly úspěšně zkonstruovány z několika murinních protilátek, změřených proti antigenům, které jsou spojeny s humánními nádory (Sun a další (1987), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 214; Whittle a další (1987), Protein Eng., 1, 499; Liu a další (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 3439; Gillies a Wesolowski (1990), Hum. Antibod. Hybridomas 1, 47). Při tomto přístupu se úplně zachová místo, vázající antigen murinní protilátky a tedy i afinita pro antigen, a současně se dodají humánní izotypové a efektorové funkce. Při druhém přístupu se pouze roubují oblasti, určující komplementaritu (CDRs), z myších variabilních oblastí spolu s humánními úseky základní struktury (FRs) z variabilních domén z jak lehkého, tak těžkého řetězce (VL a VH). Argumentuje se, že při této technice se převede kritická a hlavní část místa, vázajícího antigen, do humánní protilátky (Jones a další (1986), Nátuře, 321, 14).
Roubování CDR bylo prováděno u několika monoklonálních protilátek, pocházejících z hlodavců (Jones a další (1986) Nátuře, 321, 14; Reichmann a další (1988), Nátuře 322, 21; Verhoeyen a další (1988), Science 239, 18; Queen a další (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029; Co a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2 869; Gorman a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 4 181; Maeda a další (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124; Tempest a další (1991), Biol. Technology 9, 266). Všechny si zachovaly svou schopnost vázat antigen, přesto že jejich afinita byla obvykle snížena. Ve většině případů bylo zapotřebí vyměnit určité aminokyseliny v humánních úsecích základní struktury (FRs). Při klinickém zkoušení se jak chimérická, tak CDR roubovaná protilátka ukázala být lepší než myší protilátky (Hale a další (1988), Lancet, ii, 1394; LoBuglio a další (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 4 220; Mathieson a další (1990) N. Eng. J. Med. 323, 250). V žádném případě však není znám obecný poznatek, které aminokyseliny mají být vyměněny a takovou výměnu nelze ani úplně předvídat.
V EP 088 994 je navržena konstrukce vektorů rekombinantní DNA, které obsahují sekvenci DNA, kódující variabilní doménu lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinu, specifického pro předem určený ligand. V této citaci se nepředpokládají variace v sekvenci variabilní domény.
V EP 102 634 se popisuje klonování a exprese genů, kódujících celý polypeptid humánního těžkého řetězce IgG nebo jeho část v bakteriálních hostitelských organismech. Ani zde se nepředpokládají variace v sekvenci polypeptidu.
V EP 239 400 se navrhuje, že humanizované protilátky lze získat tím, že se místo, vázající antigen (hypervariabilní oblasti) jakékoliv humánní protilátky, nahradí místem, vázajícím antigen nehumánní, například myší nebo krysí protilátky, prostřednictvím metod genového inženýrství.
Podle této citace je tedy možno vyrábět humánní nebo humanizované protilátky, obsahující specifická místa, vázající antigen, která až dosud nebyla k dispozici v protilátkách, pocházejících z lidí.
Chimérické protilátky je možno získat tak, že se nahradí nejen CDRs, ale celé variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce. Chimérické protilátky mohou však ještě být imunogenní. Chimérické protilátky jsou však velmi užitečné pro diagnostické účely a pro optimalizaci humanizovaných protilátek.
-3CZ 283717 B6
Bylo by možno ukázat, že afinitu míst, vázajících antigen, lze ovlivnit selektivní výměnou některých jednotlivých aminokyselin ve variabilních oblastech, které přímo nejsou součástí CDRs (Reichmann a další (1988), Nátuře, 322, 21).
Postupuje-li se podle údajů, uvedených v EP 239 400, může v nejhorším případě dojít k úplné ztrátě vazebné afinity pro antigen. Tuto skutečnost jsou schopni demonstrovat původci tohoto vynálezu, kterým se nepodařilo zkonstruovat odpovídající humanizovanou protilátku, zaměřenou na epitopy receptoru EGF.
Je proto třeba vzít v úvahu, že úspěšnost takové humanizace závisí na složení a konformaci použitých variabilních oblastí a jejich interakcí s odpovídajícím místem, vázajícím antigen. Nelze tedy úplně předvídat, zda nebo které modifikace ve variabilních doménách protilátky je zapotřebí modifikovat, aby se dosáhlo vazby antigenu k protilátce, nebo aby se tato vazba zlepšila.
Podstata vynálezu
Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout humanizovanou monoklonální protilátku, která je zaměřena zejména na receptory EGF a která obsahuje místo, vázající antigen nehumánního původu, a úseky základní struktury (FRs) z variabilních oblastí a konstantních oblastí humánního původu, které jsou, v případě potřeby, modifikovány takovým způsobem, aby specifita vazebného místa zůstala zachována, nebo se regenerovala.
Úkolem tohoto vynálezu je především charakterizovat hypervariabilní oblasti místa, vázajícího antigen protilátky proti receptoru EGF, a zavést tyto CDRs do humanizované monoklonální protilátky, definované výše.
Tato protilátka a její chimérická varianta může hrát důležitou úlohu jako terapeutické nebo diagnostické činidlo, sloužící k potlačování nádorů, jako jsou melanomy, gliomy nebo karcinomy.
Zjistilo se, že účinné a specifické humanizované monoklonální protilátky je možno snadno získat za použití konvenční sekvence přinejmenším z variabilních oblastí těžkého řetězce humánních imunoglobulinů. Vhodné jsou zejména všechny takové konvenční sekvence, které vykazují dobrou identitu (alespoň ze 60 až 70 %, zejména ze 65 až 70 %) ve srovnání s variabilními oblastmi původních nehumánních protilátek.
Dále se zjistilo, že tyto konvenční sekvence musí být modifikovány pouze v malém rozsahu, zatímco za použití variabilních oblastí přírodních humánních protilátek je třeba někdy provádět mnohem více modifikací. Často není nutno provádět žádné modifikace, nebo je nutno provádět jen málo modifikací v sekvenci aminokyselin, aby se podle vynálezu dosáhlo dobré specifické vazby antigenu. Je tedy třeba vyměnit pouze několik aminokyselin pro dosažení perfektní vazby receptoru EGF k přednostní humanizované protilátce podle tohoto vynálezu. Podle poznatků, uvedených v EP 239 400, nelze v tomto případě dosáhnout vazby. Stupeň modifikace, kterého je podle vynálezu zapotřebí, je možno charakterizovat výměnou aminokyselin v rozsahu od 0 do 10 %, přednostně od 1 do 5 %.
Humanizovaná monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu má následující výhody: Konvenční sekvenci, což je sekvence, odpovídající nejčastějšímu výskytu aminokyselin v určité poloze řetězce humánního imunoglobulinu z definované třídy, podtřídy nebo podskupiny, je možno bez problémů syntetizovat jako celek nebo jako část. Není zde závislost na podrobné znalosti nebo dostupnosti určitých individuálních protilátek nebo jejich fragmentů. To znamená, že je možno pokrýt široký rozsah individuálně a přírodně se vyskytujících fragmentů protilátky
-4CZ 283717 B6 prostřednictvím velmi omezeného počtu konvenčních sekvencí, které se klonují do odpovídajících expresních vektorů. Konvenční sekvence může být příznivá, pokud se týče imunogenicity, ve srovnání s individuálními přírodními sekvencemi, o nichž je známo, že se někdy jedná o epitopy pro jiné protilátky (například anti-idiotypické protilátky).
Ačkoliv bylo skutečně realizováno jen jedno přednostní provedení, poskytuje tento vynález obecné základní poznatky. Vzhledem k velkému počtu možných sekvencí a kombinací sekvencí ve variabilní a hypervariabilní doméně není pouhou náhodou, že se na základě popsaných poznatků, vztahujících se ke konvenční sekvenci, podařilo zkonstruovat humanizovanou protilátku, zaměřenou na receptory EGF.
Dále se zjistilo, že těžké řetězce variabilních domén dodávají větší příspěvek místu, vázajícímu antigen, ve srovnání s odpovídajícími lehkými řetězci. Není proto nutno modifikovat stejným způsobem lehký řetězec humanizované protilátky, obsahující konvenční sekvenci. Tento aspekt je zajímavý, poněvadž je známo, že lehké řetězce hrají u některých známých přírodních protilátek důležitější úlohu než odpovídající těžké řetězce (viz Williams a další (1990) Tibtech. 8, 256).
Podle vynálezu je konečně možno poprvé provést pomocí genetického inženýrství charakterizaci, klonování a amplifikaci místa, vázajícího antigen murinní protilátky proti receptorů EGF (MAb 425). Tento aspekt vynálezu je nejdůležitější. Je možno syntetizovat odpovídající oligonukleotidy, kódující toto místo, vázající antigen a celou variabilní doménu humanizované a chimérické monoklonální protilátky. Předmětem vynálezu jsou dále také odpovídajícím způsobem účinné expresní vektory, kterých lze používat pro transformaci vhodných eukaryotických buněk.
Předmětem vynálezu je tedy chimérická monoklonální protilátka, obsahující místa, vázající antigen, CDR nehumánního původu, úseky základní struktury FR nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky:
i) váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptorů EGF, ii) konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa, iii) její oblasti CDR, reprezentující místa, vázající antigen, zahrnují následující sekvence aminokyselin lehký řetězec
CDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-V al-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrtěžký řetězec
CDR-l -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyr- iv) jejími úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům vázajícím antigen, zahrnují následující aminokyselinové sekvence
-5CZ 283717 B6 lehký řetězec
FR-1 -Gln-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Iie-Met-Ser-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-LysV al-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-GIn-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Ser-Leu-ThrIle-Ser-Arg-Met-Glu-Ala-Glu-Asp-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lystěžký řetězec
FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Ala-SerVal-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-Thr-Ala-Tyr-Met-Gln-Leu-SerSer-Leu-Thr-Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala^SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-Val-Ser-SerPředmětem vynálezu je dále expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast lehkého řetězce výše uvedené chimérické monoklonální protilátky, který nese označení pCVL425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338.
Předmětem vynálezu je dále expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast těžkého řetězce výše uvedené chimérické monoklonální protilátky, který nese označení pCVH425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6337.
Konečně je předmětem vynálezu také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše uvedenou chimérickou monoklonální protilátku.
Všechny citace patentů a publikací, uvedené výše a dále v tomto textu, představují náhradu za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Mikroorganismy a plazmidy, použité při provádění vynálezu
a) pRVL425 (= HCMV-RVib425-k) uložen 1. února 1991 v souladu s Budapeštskou dohodou v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6340. Expresní vektor obsahuje sekvence hypervariabilních oblastí (CDRs) murinní protilátky 425 a FRs variabilní oblasti a konstantní (kappa) oblasti lehkého řetězce humanizované protilátky. Symbol R znamená „přetvořený“ (reshaped).
b) pRVH425 (= HCMV-RVHg425-gamma), uložen 1. února 1991 v souladu s Budapeštskou dohodou v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6339. Tento expresní vektor obsahuje sekvence hypervariabilních oblastí (CDRs) murinní protilátky 425 a RFs variabilní oblasti a konstantní (gamma-1) oblasti těžkého řetězce humanizované protilátky. Symbol R znamená „přetvořený“ (reshaped).
c) pCVL425 (= HCMV-CVL425-k), uložen 1. února 1991, v souladu s Budapeštskou dohodou, v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6338. Tento expresní vektor obsahuje sekvence FRs a hypervariabilních oblastí (CDRs) variabilní oblasti lehkého řetězce murinní protilátky 425 a konstantní (kappa) oblasti lehkého řetězce humánního imunoglobulinu. Symbol C znamená „chimérický“.
d) pCVH425 (= HCMV-CVH425-gamma), uložen 1. února 1991 v souladu s Budapeštskou dohodou v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6337. Tento
-6CZ 283717 B6 expresní vektor obsahuje sekvence FRs a hypervariabilních oblastí (CDRs) variabilní oblasti lehkého řetězce murinní protilátky 425 a konstantní oblasti lehkého řetězce humánního gamma—1 imunoglobulinu. Symbol C znamená „chimérický“.
e) Hybridoma buněčná linie 425, uložena 26. února 1988 v souladu s Budapeštskou dohodou v americké sbírce Američan Type Culture Collection (ATCC) pod přírůstkovým číslem HB 9629. Tato buněčná linie produkuje murinní protilátku 425, která je zaměřena na receptor EGF.
Jiné biologické materiály:
jiné mikroorganismy, buněčné linie, plazmidy, promotory, markéry rezistence, replikační počátky nebo jiné fragmenty vektorů které jsou uvedeny v tomto popisu, jsou obchodně nebo jinak obecně dostupné. Pokud není v tomto popisu uvedeno jinak, používá se jich pouze jako příkladů a jejich konkrétní volba není při provádění vynálezů důležitá, takže je možno nahradit je jinými vhodnými prostředky a biologickými materiály.
Pro amplifikaci odpovídajících sekvencí DNA se přednostně používá bakteriálních hostitelů. Jako příklad takových hostitelů je možno uvést E. coli nebo Bacillus.
Při výrobě humanizovaných a chimérických protilátek podle tohoto vynálezu se dává přednost eukaryotickým buňkám, jako je COS (CV1 původ SV 40), nebo buňkám zvaječníků čínského křečka (CHO), nebo kvasinkám. Obzvláštní přednost se dává buňkám COS a CHO.
Obecné postupy výroby:
Technologie, které jsou pro provádění tohoto vynálezu podstatné, jsou podrobně uvedeny v tomto popisu.
Jiné technologie, které nejsou podrobně popsány, odpovídají známým standardním technologiím, které jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru, nebo které jsou popsány podrobněji v uvedených literárních odkazech, patentových přihláškách a standardní odborné literatuře.
Přehled obrázků na výkrese
Na obr. 1 jsou schematicky znázorněny vektory, používané pro expresi chimérických a přetvořených humánních protilátek. Restrikční místa, používaná při konstrukci expresních plazmidů, jsou označena. Sekvence, kódující variabilní oblast, jsou znázorněny černými úseky, konstantní oblasti jsou znázorněny bílými úseky, promotor HCMV a zesilovač transkripce (enhancer) šrafovanými úseky a nukleotidový fragment z plazmidu pSVneo je znázorněn tečkovanými úseky. Směry transkripce jsou znázorněny šipkami.
Na obr. 2 jsou znázorněny sekvence nukleotidů a aminokyselin VH425 (A) a VL425 (B) cDNA, klonované do pUC18. Aminokyseliny, přispívající k vedoucí sekvenci (leader), jsou podtrženy a CDRs jsou označeny závorkami. Místa sestřihu mezi variabilními oblastmi a konstantními oblasti jsou také znázorněna. Také jsou zde znázorněny přední a zadní PCR-primary a jejich místa teplotní hybridizace (annealing sites), použitá při konstrukci genů, kódujících chimérické protilátky.
Na obr. 3 jsou uvedeny sekvence nukleotidů a aminokyseliny syntetizovaného genového fragmentu, kódujícího přetvořenou humánní VHa425. Vedoucí sekvence je podtržena a rezidua, přispívající k CDRs, jsou v závorkách.
-7CZ 283717 B6
Na obr. 4 je uvedeno srovnání sekvence aminokyselin myší a přetvořené humánní variabilní oblasti 425. Panel A ukazuje sekvenci myší VL (VL425) a přetvořené humánní VLS (RVLa425 a RVLb425). Panel B ukazuje sekvence myší VH (VH425) a přetvořené humánní VHS (RVHa425, RVHb425, RVHc425, RVHd425, RVHe425, RVHf425, RVHg425, RVHh425, RVHi425 a jsou označeny FRs a CDRs. Aminokyseliny jsou číslovány podle Kabat a další /1987/ Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Govemment Printing Offíces.
Na obr. 5 je znázorněn molekulární model variabilních oblastí myší MAb 425.
Na obr. 6 je znázorněna detekce vazby k EGFR pomocí metody ELISA. Aktivita vazby antigenu se stanovuje ve zředěných supematantech transfektovaných COS buněk a vynáší se do grafu jako optická hustota při 450 nm proti koncentraci IgG (zjištěná metodou ELISA, viz část popisu „Materiály a metody“). Všechny verze přetvořených humánních VH oblastí se kontrafektují sRVLa425 a jsou reprezentovány následujícími grafickými symboly: RVHa425 A, RVHb425 0, RVHc425 Δ, RVHd425 ®, RVHe425 □, RV»f425 El, RVHg425 □, RVHh425 o, RVHi425 Θ, RVHb425 ko-transfektovaný s RVLb425 je reprezentován symbolem ♦. Produkty kotransfekce chimérického VL425 a VH425 jsou reprezentovány symbolem ·.
Na obr. 7 je znázorněna konkurence při vazbě k antigenu. V okénku A je znázorněna konkurence mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) chimérickou protilátku 425 (·), produkovanou buňkami COS po kotransfekci s HCMV-CVL425-kappa a HCMV-CVH425-gamma-l. V okénku B je znázorněna konkurence mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) přetvořenými humánními protilátkami 425, produkovanými buňkami COS po kotransfekci s HCMV-RVLa425-kappa a HCMV-RVHi425-gamma-l (o) a s HCMV-RVLa425-kappa a HCMV-RVHg425-gamma-l (□). Ve všech případech se na horizontální osu vynáší koncentrace inhibitoru v ng/ml. Na vertikální osu se vynáší procento inhibice vazby.
Na obr. 8 jsou znázorněny účinky různých přetvořených humánních oblastí VL na vazbu antigenu. V okénku A je ukázána vazba antigenu přetvořenými humánními protilátkami, produkovanými v buňkách COS transfektovaných HCMV-CVL425-kappa a HCMV-CVH425gamma-1 (·), HCMV-RVLa425-kappa a HCMV-RVHg425-gamma-l (□), HCMV-RVLb425kappa a HCMV-RVHg425-gamma-l (), HCMV-RVLa425-kappa a HCMV-RVhc425gamma-1 (Δ) a HCMV-RVLb425-kappa a HCMV-RVHc425-gamma-l (♦). V okénku B je znázorněna konkurence o vazbu k antigenu mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) přetvořenými humánními protilátkami 425, produkovanými v buňkách COS kotransfektovaných HCMV-Vja425-kappa a HCMV-VHg425gamma-1 (□) a HCMV-VLb425-kappa a HCMV-VHg425-gamma-l (). V okénku A se na vertikální osu vynáší optická hustota při 450 nm (OD450) a na horizontální osu se vynáší koncentrace IgG v ng/ml. V okénku B se na horizontální osu vynáší koncentrace inhibitoru v ng/ml a na vertikální osu procento inhibice vazby.
Na obr. 9 je v okénku A znázorněna analýza přetvořených (dráhy 1 a 2), chimérické (dráha 3) a murinní (dráha 4) Mabs 425 metodou SDS-PAGE za neredukujících podmínek (a), a za redukujících podmínek (b). Dráhy 7 a 8 odpovídají přetvořeným, dráha 9 chimérické a dráha 10 murinní protilátce. Dráhy 5, 6, 11 a 12 představují markéry molekulové hmotnosti. V okénku B je znázorněna purifikace přetvořené MAb 425 gelovou filtrací na Superose 12. Pík 2 odpovídá IgG.
Na obr. 10 je znázorněna konkurence mezi murinní, chimérickou a přetvořenými Mabs 425 o receptor EGF (EGFR). Na vertikální osu se vynáší poměr mezi vázanou (MAb) a celkovou
-8CZ 283717 B6 (MAb) v procentech (% vázaná/celkem). Na horizontální osu se vynáší koncentrace protilátky (mol/1 /log/). Používá se následujících symbolů:
V znamená MAb 425 murinní, o znamená MAb 425 chimérickou, ·, ♦ znamená MAb 425 přetvořené.
Na obr. 11 je znázorněna konkurence mezi EGF a protilátkami o receptory EGF. Na vertikální osu se vynáší % vázaná/celkem (MAb). Na horizontální osu se vynáší koncentrace protilátky /mol/1 /log//). Symbol o znamená MAb 425 murinní a symboly Δ, V, □, znamenají MAb 425 přetvořené.
Následuje podrobný popis vynálezu.
Klonování a sekvenování genů variabilní oblasti MAb 425
Ze syntézy cDNA a klonování za použití primeru s kappa řetězcem se pro skríning přednostně vezme 300 až 400 kolonií. Ze syntézy cDNA a klonování za použití primeru gamma-2a se přednostně pro skríning vezme 200 až 300 kolonií. Po skríningu hybridizaci za použití dvou odpovídajících klonovacích primerů poskytuje 20 až 30 kolonií s lehkým řetězcem a 10 až 20 kolonií s těžkým řetězcem silné signály. Z těchto kolonií se izoluje plazmidová DNA aanalýzuje obvyklým způsobem štěpení obchodně dostupnými restrikčními enzymy, aby se stanovila velikost inzertů cDNA. Jako kandidáti pro sekvenování se zvolí klony zřejmě obsahující inzert 400 až 500 bp v případě VL klonování, a 500 až 600 bp v případě VH klonování. Tři VL klony a tři Vh klony se sekvenují na obou vláknech za použití univerzálních a reverzních sekvenačních primerů Ml3. Ze tří možných VL klonů, které byly sekvenovány, jeden kóduje úplnou variabilní oblast a ostatní kódují peptidy, které k ní nemají vztah. Dva z VH klonů kódují identické VH oblasti, zatímco ostatní kódují Vh oblast s intronem mezi vedoucí sekvencí a ještě přítomným FR-1. Vedle intronu třetí Vh klon obsahuje kódující sekvenci, která je identická se sekvencemi prvních dvou klonů. Pro ověření sekvence VL oblasti se sekvenují tři další cDNA klony, které obsahují inzerty vhodné velikosti. Dva z nich poskytují sekvence, které jsou v souhlasu s prvním VL klonem. Třetí představuje napodobenou DNA sekvenci.
V sekvenovaných klonech nejsou přítomny všechny původní sekvence primeru. Rozsah delecí se mění od klonu ke klonu. Tyto delece, k nimž pravděpodobně dochází v průběhu syntézy cDNA a klonování, mohou snížit účinnost skríningu kolonie.
Geny VL a VH MAb 425 jsou znázorněny na obr. 2. Sekvence aminokyselin VL a VH oblasti 425 se porovnává s jinými myšími variabilními oblastmi v Kabátově databázi (Kabat a další, (1987) Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Govemment Printing Offices). Oblast VL je možno zatřídit do podskupiny IV nebo VI myších variabilních oblastí s řetězcem kappa. V úsecích základní struktury (FRs) vykazuje oblast 425 Vl přibližně 86% identitu s konvenční sekvencí myší kappa podskupiny IV a přibližně 89% identitu s podskupinou VI. Zdá se, že oblast 425 VL používá segmentu JK4. Při zkoumání VH oblasti se zjistí přibližně 98% identita s FRs konvenční sekvence myšího těžkého řetězce z podskupiny II (B).
Správná volba vhodné třídy nebo podskupiny humánního imunoglobulinu je závislá na stupni identity s řetězcem, který je v nehumánní protilátce původně přítomen. Identita dedukované konvenční sekvence podle tohoto vynálezu by měla být vyšší než 65 až 70 %, při srovnávání se sekvencí původního nehumánního řetězce.
Dává se přednost konvenčním sekvencím těžkých řetězců, zejména však konvenční sekvenci humánního těžkého řetězce z podskupiny I. Pro jiné protilátky jsou však vhodné konvenční
-9CZ 283717 B6 sekvence jiných humánních těžkých řetězců. Přednostní konveční sekvence jsou modifikované. Možná výměna aminokyselin činí podle vynálezu 0 až 10 %, přednostně 5 až 10 %.
Konstrukce a exprese chimérické protilátky 425
Dříve než je možno použít při konstrukci chimérické protilátky 425 cDNA pro kódování Vl a VH oblastí, je zapotřebí zavést několik modifikací do 5’- a 3’- konce. Tyto modifikace zahrnují zvědění vhodných míst pro restrikční enzymy tak, aby bylo možno sekvence, kódující variabilní oblast, snadno subklonovat do expresních vektorů HCMV. Je nutno znovu vytvořit donomí sestřižená místa v 3’- lemujících oblastech pro správný a účinný sestřih variabilních oblastí ke konstantním oblastem.
Také 5’- lemující oblasti se modifikují, aby obsahovaly sekvenci, která by vytvořila účinná iniciační místa pro translaci eukaryotickými ribosomy (Kozák a další (1987), J. Mol. Bio., 196, 947). Tyto modifikace se zavádějí za použití PCR příměrů. Použité příměry jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka I
Oligonukleotidy, použité pro klonování cDNA, konstrukci chimérik a mutagenezi. Podtržené úseky označují báze, které se tepelně hybridizují k humánní struktuře.
číslo | sekvence | dodís |
1. | 5 ’-GTAGGATCCTGGATGGTGGGAAGATG-3 ’ | primer lehkého řetězce pro syntézu cDNA |
2. | 5 ’-GTAGGATCC AGTGGATAGACCGATG-3 ’ | primer těžkého řetězce pro syntézu cDNA |
3. | 5’-CTCCAGCTTGACCTCACCATGG-3 ’ | přední primer chimérické oblasti VH |
4. | 5’-TTGGATCCACTCACCTGAGGAGACTGTGA-3’zadní primer chimérické | |
oblasti VH | ||
5. | 5 ’-AGAAAGCTTCCACCATGGATTTTC AAGTG- | -3’přední primer chimérické |
oblasti VL | ||
6. | 5 ’-GTAGATCTACTCACGTTTTATTTCC AAC-3 ’ | zadní primer chimérické oblasti VL |
7. | 5 ’-ACC ATC ACCTGTAGTGCAGCTC AAGTG | CDR-1 primer přetvořené |
TA ACTT ACATGTATTGGTACCAGC AG-3 ’ | oblasti VL | |
8. | 5 ’-CTGCTGATCTACGAC ACATCCAACCTGGC | CDR-2 primer přetvořené |
TTCTGGTGTGCC AAGC-3 ’ | oblasti VL | |
9. | 5’-ACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCA- | - CDR-3 primer přetvořené |
C ATATTC ACGTTCGGCC AA-3 ’ * | oblasti VL | |
10. | 5 ’-AGCGGTACCGACTAC ACCTTC ACC ATC-3 ’ | primer pro zavádění |
♦ * | F71YdoRVL | |
11. | 5 ’-ATACCTTC AC ATCCC ACTG-3 ’ | primer pro zavádění |
* * | S30T do RVh | |
12. | 5 ’-CGAGTGGATTGGCGAGT-3 ’ | primer pro zavádění V48I do RVh |
-10CZ 283717 B6
Tabulka I (pokračování) číslo sekvence popis * ♦ *
13. 5’-TTTAAGAGCAAGGCTACCATGACCGTGGA- primer pro zavádění
CACCTCT-3 ’ R66K, V67A a L71V do RVH *
14. 5’-CATGACCGTGGACACCTCT-3’ primer pro zavádění
L71VdoRVH
Pro každou variabilní oblast cDNA se přednostně vytvoří dva primery. V předních příměrech se použije 15 bází na 3’-konci primeru pro hybridizaci primeru ktemplátové DNA, zatímco 5’konec primeru obsahuje místo HindUI a „Kozákovu sekvenci“. Zadní primery mají podobné složení. Posledních 15 bází u 3’- konce se použije pro hybridizaci primeru ktemplátové DNA a 5’-konec primeru obsahuje místo BamHI donomí místo pro sestřih. V případě zadního primeru lehkého řetězce se používá místa Bgin místo místa BamHI, poněvadž cDNA, kódující Vl, obsahuje interní místo BamHI (viz obr. 2). Reakce PCR se přednostně provádí způsobem, popsaným v příkladech.
DNA VL oblasti modifikovaná PCR se klonuje do míst HindlII a BamHI expresního vektoru lehkého řetězce HCMV, jakožto HindlII-BglII fragment. Tento vektor již obsahuje humánní genomovou konstantní oblast kappa s potřebným akceptorovým místem pro sestřih a místy poly(A+). Celý PCR-modifikovaný VL fragment se sekvenuje za použití dvou primerů, které se tepelně hybridizují k místům, lemujícím klonovací místo expresního vektoru. Sekvenování potvrzuje, že v průběhu stupně PCR nebyly uvedeny žádné chyby. PCR-modifikovaná VH DNA se klonuje do expresního vektoru těžkého řetězce HCMV jako HindlII-BamHI fragment a také se sekvenuje, aby se potvrdilo, že během PCR nebyly zavedeny žádné chyby. Fragment BamHI, obsahující humánní genomovou konstantní oblast gamma-1, se vloží do vektoru HCMV-CVh na 3’-straně oblasti VH. Tento fragment obsahuje potřebné akceptorové místo pro sestřih V-C, který má proběhnout in vivo a přírodní místo poly(A+).
Expresní vektory, obsahující chimérické oblasti 425 VL a VH, se kotransfektují do vhodných eukaryotických buněk, přednostně buněk COS. Po přibližně 72 hodinách přechodné exprese se médium buněčné kultury zkouší metodou ELISA na přítomnost produkovaného humánního IgG a na vazbu k EGFR proteinu.
Množství humánního IgG, detekovaného v médiu, kolísá v rozmezí od 100 do 400 ng/ml. Vyrobená chimérická protilátka se dobře váže k proteinu EGFR při standardní zkoušce vazby antigenu ELISA, čímž se potvrdí, že byly klonovány a sekvenovány správné myší variabilní oblasti.
Počáteční navržení, konstrukce a exprese přetvořených humánních lehkých a těžkých řetězců 425
Při návrhu přetvořené humánní protilátky 425 se největší důraz klade na oblast VH, poněvadž tato doména je často při vazbě antigenu nejdůležitější (Amit a další (1986), Science 233, 747; Verhoeyen a další (1988) Science 239, 18). Při volbě humánních FRs, na nichž se mají roubovat myší CDRs, se FRs myší VH oblasti MAb 425 porovnávají s FRs konvenčních sekvencí ze všech podskupin humánních oblastí VH (Kabat a další, (1987) viz shora uvedená citace). Toto porovnání ukazuje, že FRs oblastí VH myší protilátky MAb 425 jsou nejpodobnější FRs humánních oblastí VH podskupiny I. Je zde 73% identita mezi FRs a přibližně 65% identita mezi celými oblasti VH.
- 11 CZ 283717 B6
Provede se další srovnávání myší oblasti Vh 425 sjinými myšími oblasti V» ze stejných Rabatových podskupin, aby se identifikovaly všechny zbytky FR, které jsou charakteristické pro MAb 425 a mohly by se tedy podílet na vazbě antigenu. Zbytek v poloze 94 myší oblasti VHMAb 425 je serin, zatímco v jiných oblastech Vh myší podskupiny II (B) a také humánní podskupiny I je zbytkem 94 arginin (Rabat a další, (1987), viz shora uvedená citace). Tato substituce aminokyseliny je neobvyklá a poněvadž poloha 94 přiléhá k CDR-3, jedná se o překvapivě důležitou polohu. Z těchto důvodů se přetvořená oblast VH humánní 425 přednostně navrhuje tak, že je založena na CDRs myší protilátky MAb 425 a FRs, odvozených z konvenční sekvence humánních FRs z podskupiny I (podle definice Kabata a dalších (1987), viz shora uvedená citace). Polohy 94 ve FR-3 se obsadí serinem, jako je tomu u myší protilátky MAb 425. V polohách konvenční sekvence FRs z humánní podskupiny I, kde nejsou uvedeny jednotlivé aminokyseliny, se zvolí aminokyselina, která se nejčastěji vyskytuje v této poloze. Jestliže se v určité poloze humánní konvenční sekvence nevyskytuje žádná aminokyselina přednostně, volí se jako aminokyselina ta aminokyselina, která se v této poloze sekvence nalézá v oblasti VH myší MAb 425. Výsledná aminokyselinová sekvence obsahuje první verzi (verzi „a“) přetvořené humánní oblasti Vh 425 (viz obr. 3). Všechny následující verze přetvořené oblasti Vh humánní 425 jsou modifikacemi této první verze.
Navrhne se a syntetizuje (viz příklady a obr. 3) 454bp fragment DNA, který kóduje přetvořenou VH oblast humánní 425, jak je to popsáno výše. Kromě sekvencí DNA, kódujících aminokyseliny přetvořené VH oblasti humánní 425, obsahuje tento fragment vedoucí sekvence může být vzata například z protilátky HG3 CL (Rechavi a další, (1983), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 855), což je člen humánní oblasti Vh z podskupiny I (Kabat a další (1987), viz shora uvedená citace). Fragment syntetické DNA také obsahuje eukaryotické translační signály na 5’- konci (Kozák (1987), J. Mol. Bio. 196, 1947), donomí místo pro sestřih na 3’- konci (Breathnach a další (1978), Proč. Nati. Acad. Sci USA 75, 4853), a místo HindlII na 5’- konci a místo BamHI na 3’konci, pro subklonování do expresního vektoru HCMV.
Podobného postupu se také použije pro sestrojení přetvořené oblasti VL humánní 425. Úseky FRs myší VL oblasti protilátky MAb 425 se porovnají s konvenčními sekvencemi všech podskupin humánních oblastí VL (Kabat a další (1987), viz shora uvedená citace). U FRs se zjistí přibližně 71% totožnost mezi oblastí VL myší 425 a humánní oblastí VL kappa z podskupiny III, a přibližně 70% identita s humánní oblastí VL kappa z podskupiny I. DNA, kódující humánní FRs humánní oblasti VL kappa z podskupiny I, je již dostupná z přetvořené humánní oblasti VL D1.3 (EP 239 400, Winter) a přetvořené humánní Campath-1 (Reichmann a další (1988), Nátuře 322, 21). Návrh přetvořených humánních oblastí VL v těchto dvou humánních protilátkách je založen na strukturně vyřešeném humánním imunoglobulinovém proteinu REI (Epp a další (1975), Biochemistry 14,4943). Z těchto důvodů se také používá humánních FRs z oblasti VL z přetvořené humánní protilátky Dl.3 a CAMPATH-1H v přetvořené humánní oblasti VL 425. Srovnání FRs myší oblasti Vl 425 sFRs jiných myších protilátek z podobných podskupin neukazuje žádné podstatné rozdíly ve zbytcích aminokyselin ve funkčně důležitých polohách. Z těchto důvodů nejsou zapotřebí žádné změny v humánních FRs. Sekvence aminokyseliny přetvořené humánní oblasti VL425 verze „a“ je ukázána na obr. 4.
Pro konstrukci přetvořené humánní VL oblasti 425 se sestrojí tři oligonukleotidy, obsahující interní sekvence DN, kódující tři CDRs myší VL oblasti 425, a 12 bází na 5’- a 3’- koncích, které jsou určeny pro hybridizaci se sekvencemi DNA, které kódují humánní FRs v přetvořené humánní Vl oblasti protilátky Dl.3 (viz oligonukleotidy 7 až 9 v tabulce I). Roubování CDR se provádí způsobem popsaným v příkladech. Po sekvenování DNA pravděpodobných pozitivních klonů ze skríningu je celkový výtěžek trojnásobného mutantu 5 až 15 %, přednostně 9 až 10 %. Přetvořená Vl oblast humánní 425, která neobsahuje žádné PCR omyly, se klonuje jako fragment HindlII - BamHI do expresního vektoru lehkého řetězce za vzniku plazmidu HCMV-RVLa425kappa (viz obr. 1).
- 12CZ 283717 B6
Dva expresní vektory, nesoucí přetvořené oblasti Vl 425 a VH 425 , se nyní kotransfektují do vhodných buněk (viz výše), za účelem hledání přechodné exprese funkční přetvořené humánní protilátky 425. Přibližně po 72 hodinách se buněčné supematanty sklidí a metodou ELIS A se v nich stanovuje humánní IgG. Humánní IgG může být stanoven na úrovni v rozmezí od 100 do 5 500 ng/ml, avšak při zkoušce ELISA, zaměřené na stanovení vazby antigenu, není vazba k EGFR s překvapením detekovatelná. Jestliže se buňky kotransfektují HCMV-RVLa425-kappa/HCMVCVH425-gamma-l, vyrobí se humánní IgG, který se váže kEGFR. Jestliže se však buňky kotransfektují HCMV-CVL425kappa/HCMV-RVHa425-gamma-l, vyrobí se humánní IgG, který se však na detekovatelné úrovni neváže k EGFR. Z těchto neočekávatelných výsledků je io zřejmé, že je zapotřebí dalších modifikací s charakterem vynálezu ve FRs přetvořené humánní oblasti VH 425, aby se získalo funkční místo, vázající antigen.
Modifikace FRs přetvořené oblasti VH humánní 425
Na základě molekulárního modelu domén myších variabilních oblastí 425 se provedou další změny ve FRs přetvořené humánní VH oblasti 425. Prozkoumají se smyčky CDR přetvořené humánní oblasti VH, aby se zjistilo, jak se shodují s kanonickými strukturami, které popsali Chothia a další (1989), nátuře 342, 877. Na základě této analýzy se provedou ve FRs určité změny. Provedou se také jiné změny FRs, které jsou založeny na funkční přetvořené humánní 20 protilátce anti-Tec, která byla rovněž sestrojena na základě humánních FRs z podskupiny I (Queen a další (1989), Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 10 029). S překvapením bylo zjištěno, že oblast VH myší protilátky anti-Tec je přibližně ze 79 % identická s VH oblastí myší protilátky 425. Nyní se podle vynálezu vytvoří molekulární model variabilních oblastí myší protilátky 425 (obr. 5). Model je založen na struktuře HYHEL-5, což je protilátka s vyjasněnou strukturou, 25 jejíž variabilní oblasti vykazují vysoký stupeň homologie s oblastmi myší protilátky 425. Na základě této analýzy se zbytky aminokyselin v polohách 30, 48, 67, 68 a 71 v přetvořené humánní oblasti VH protilátky 425 změní tak, aby byly identické se zbytky aminokyselin, které se vyskytují v těchto polohách v myší oblastí VH protilátky 425. Pro ozřejmění individuálních účinků těchto změn se prováděné změny při konstrukci podle vynálezu různě kombinují a potom 30 zkoušejí.
Celkem se zkonstruuje 8 nových verzí přetvořené oblasti VH humánní protilátky 425 (viz obr. 4). Z verzí, které se vytvoří způsoby, podrobně popsanými v příkladech, se další verze vyrobí rekombinací malých fragmentů DNA z dřívějších verzí. Když jsou již všechny požadované verze 35 sestaveny, přednostně vpUC18, přenesou se přetvořené Vh oblasti humánní protilátky 425 ve formě fragmentů HindlII-BamHI do expresního vektoru HCMV-Vh za vzniku verzí „b“ až „i“ plazmidů HCMV-RVH425-gamma-l (obr. 4).
Modifikace ve FRs přetvořené oblasti VL humánní protilátky 425
Ačkoliv odpovídající buňky, kotransfektované vektory, exprimujícími přetvořený lehký řetězec humánní protilátky 425, verzí „a“ a chimérickým těžkým řetězcem protilátky 425, skutečně produkují protilátku, která se váže k EGFR, protilátka s přetvořeným lehkým řetězcem humánní protilátky 425 se neváže tak dobře, jako chimérická protilátka 425. Prozkoumáním oblastí VL 45 myší protilátky 425 a přetvořené humánní verze „a“ protilátky 425 ukazuje, že zbytek 71, který je součástí kanonické struktury CDR-1 (LI), není zachován ve verzí „a“ (Chothia a další (1989), Nátuře 342, 877). Pro zavedení změny Phe na Tyr v této poloze se přednostně použije PCRmutageneze (Kamman a další (1989), Nucleic Acids Res. 17, 5404). Fragment HindlII- BamHI, vzniklý touto mutagenezí, se zavede do expresního vektoru HCMV-VL pro vytvoření HCMV50 RVLb425-kappa (viz obr. 4).
- 13 CZ 283717 B6
Analýza nových verzí přetvořené oblasti VH humánní protilátky 425
Expresní vektory, obsahující přetvořené humánní verze Vh „a“ až „i“, se kotransfektují do shora uvedených buněk s expresním vektorem, obsahujícím přetvořenou humánní Vl oblast verze „a“. Po asi 3 dnech se buněčné supematanty analyzují metodou ELISA na produkci humánního IgG. Úroveň produkce kolísá v rozmezí od 50 do 400 ng/ml. Potom se vzorky analyzují metodou ELISA na humánní IgG, který je schopen se vázat kEGFR. Různé verze přetvořených humánních oblastí VH mají za následek mnoho různých úrovní vazby antigenů (viz obr. 6). Při tomto testu ELISA na vazbu antigenů se mohou různé přetvořené humánní protilátky 425 přímo porovnávat s chimérickou protilátkou 425, ale nikoliv s myší protilátkou 425. Je tomu tak proto, že protilátkou, použitou pro detekci vazby k antigenů, je antihumánní protilátka IgG. Devět verzí přetvořené humánní oblasti VH je možno rozdělit do skupin podle jejich schopnosti vazby k EGFR. Verze „g“ a „i“ přetvořené humánní oblasti VH poskytují nejvyšší úrovně vazby, potom následující verze „c“, „f‘ a ,Ji“, načež následuje verze „b“. Při některých pokusech poskytuje verze „e“ nízkou, ale detekovatelnou úroveň vazby. Verze „a“ a „d“ nikdy neposkytují detekovatelnou úroveň vazby.
Pro přímé porovnání přetvořených humánních protilátek 425, obsahujících verze „g“ a „i“ VH, a chimérické protilátky 425 s myší protilátkou 425 se použije konkurenčního vazebného testu (viz obr. 7). Jelikož protilátky v buněčných supematantech nejsou purifikovány a proto jsou kvantifikovány metodou ELISA, je třeba považovat výsledky konkurenčního vazebného testu za hodnoty relativní úrovně vazby, spíše než za přesnou kvantifikaci afinity. Konkurenční vazebné testy se vzorky ze 4 pokusů, například v buňkách COS, poskytují konzistentní výsledky, pokud se týče relativní úrovně vazby k antigenů. Chimérická protilátka 425 dobře soutěží se značenou myší protilátkou 425 a poskytuje procentuální inhibici vazby, která je právě o něco nižší, než je inhibice při konkurenčním testu za použití neznačené myší protilátky 425, která soutěží se značenou myší protilátkou 425 (viz obr. 7, okénko A). Přetvořená humánní protilátka s oblastí VLa a VHi (viz obr. 7, okénko B). Porovnání bodů, které odpovídají „plato“ na křivkách vazby, ukazuje, že přetvořená humánní protilátka s oblastí VHg soutěží se značenou myší protilátkou 425 ze 60 až 80 % tak dobře, jako to činí neznačená myší protilátka 425 při stejném testu. Když se zprůměrují výsledky za použití vzorků ze 4 nezávislých pokusů, například za použití buněk COS nebo CHO, dospěje se ke zjištění, že přetvořená humánní protilátka, obsahující oblast VLa a VHg, poskytuje vazbu, která odpovídá 60 až 80 % vazby myší protilátky 425.
Na základě těchto výsledků je možno komentovat relativní příspěvky jednotlivých zbytků ve FRs struktuře k vazbě antigenů. Nejsignifikantnější jednotlivá změna v této studii je změna L71V. Bez této změny s překvapením nelze detekovat žádnou vazbu k antigenů (srovnej verze „a“ a „b“ VH). Pro vazbu jsou s překvapením důležité také změny R67K a V68A (srovnej verze „b“ a „c“ a verze „i“ a „h” Vh). Zatímco zavedení samotné změny V48KI a změn V48I a S30T společně nemá za následek signifikantní vazbu antigenů, změny v těchto polohách skutečně zvyšují vazbu antigenů. Změna S30T má s překvapením vyšší účinek než změna V48I (srovnej verze „g“ a „i“ a verze „f“ a „i“ VH).
Analýza nové verze přetvořené oblasti VL humánní protilátky 425
Expresní vektor, obsahující RVLb425, se kotransfektuje do vhodných, přednostně eukaryotických buněk s expresním vektorem, obsahujícím verze „b“, „c“ nebo „g“ přetvořené humánní oblasti VH. Sklidí se buněčné supematanty a zkouší na produkci humánního IgG a potom na humánní IgG, který je schopen vazby k EGFR (viz obr. 8, okénko A). Tyto výsledky ukazují, že verze „b“ VL oblasti přetvořené humánní protilátky 425 zvyšují vazbu k antigenů. Potom se provede konkurenční vazebný test za účelem porovnání přetvořených humánních protilátek 425 s oblastí VLa plus VHg a VLb plus VHg s myší protilátkou 425. Přetvořená humánní protilátka MAb 425s verzí „b“ oblasti VL má vyšší afinitu pro antigen. Změna F71Y v oblasti Vl tedy
- 14CZ 283717 B6 zvyšuje vazbu antigenu. Přetvořená humánní protilátka MAb 425 s oblastí VLb a VHg vykazuje afinitu pro antigen, která činí 60 až 80 % afinity murinní protilátky MAb 425.
Z jiných experimentů za použití přetvořené humánní protilátky, obsahující kombinaci VLb plus VHg (viz příklady 10 a 11), je zřejmé, že vazebná potence k EGFR je podobná pro chimérickou, přetvořenou a murinní protilátku.
Z vynálezu je zřejmé, že poměrně konzervativní změny ve FR zbytcích mohou silně ovlivnit vazbu antigenu.
Molekulární model variabilních oblastí myší protilátky 425 jasně ukazuje, že tento zbytek v poloze 30 VH je na povrchu této molekuly v sousedství CDR-1. Ve skutečnosti H1 podle definice, kterou provedli Chothia a Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196, 901, zasahuje od zbytku 26 do zbytku 32, takže zahrnuje zbytek v poloze 30. Když se zbytek v poloze 30 v protilátce CAMPATH-1H změní ze Ser na Thr, nemá to žádný vliv na vazbu antigenu. Když se poloha 30 změní ze Ser na Thr v přetvořené humánní oblasti VH425, zlepší se vazba k antigenu. Ukazuje se, že aminokyselina v poloze 30 skutečně hraje určitou úlohu při vazbě antigenu při této konkrétní interakci protilátky s antigenem. Jelikož změna S30T zlepšuje vazbu antigenu pouze nepatrně a jelikož tato změna není pro vazbu antigenu podstatná, vykazuje Thr v poloze 30 pouze slabou interakci s antigenem.
Změna zbytku v poloze 71 ve Vh silně ovlivňuje vazbu antigenu. Tato skutečnost je překvapující, poněvadž dva zbytky, které byly zkoušeny v této poloze, tj. Val a Leu, se liší pouze jednou methylskupinou. H2 myší protilátky 425 je členem H2 skupiny 2 kanonických struktur, definovaných Chothiou a dalšími (1989), Nátuře 342, 877. HyHEL-5 má H2 se sekvencí aminokyselin podobnou té, kterou má H2 myší protilátky 425. V HyHEL-5 Pro v poloze 52A v CDR-2 se sbalí do dutiny, vytvořené malou aminokyselinou (Ala) v poloze 71 FRs. V modelu variabilních oblastí myší protilátky 425 existuje podobná interakce mezi Pro-52A a Val-71. Ve VH myší protilátky 425 je sice Pro v poloze 52A schopen sbalit se do dutiny, vytvořené Val v poloze 71, nahrazení Val-71 Leu však způsobuje molekulární kolizi, která může změnit konformaci smyčky CDR2. Z tohoto důvodu změna V71L v přetvořené VH oblasti humánní protilátky 425 znovu vytváří interakci CDR-2-FR, kjaké dochází v oblasti Vh myší protilátky 425. To s překvapením velmi zlepšuje vazebné vlastnosti pro antigen přetvořených humánních protilátek 425 (srovnej přetvořené humánní protilátky s verzemi „a“ a „b“ VH na obr. 6).
Změna v poloze 71 VL pravděpodobně ovlivňuje konformaci CDR poněvadž zbytek 71 je členem navrhované kanonické struktury pro LI (CDR-1) (Chothia a další (1989), viz shora uvedená citace). Zbytek 29 v CDR-1 je „pohřbený zbytek“ (buried residue) a má styk se zbytkem 71 ve FRs. V myší protilátce 425 je zbytkem 71 ve Vl Tyr. V humánních FRs, používaných pro konstrukci přetvořených humánních oblastí VL, je zbytkem 71 Phe. Ukazuje se, že hydroxyskupina, která je přítomna v Tyr, ale nikoliv ve Phe, má úlohu při udržování správné konformace CDR-1.
Z molekulárního modelu variabilních oblastí myší protilátky 425 je zřejmé, že Lys-66 vytváří solný můstek s Asp-86. Zavedení většího zbytku Arg do polohy 66 by tuto strukturu rozbilo. Ala-67 může interagovat s CDR-2 a současná výměna zbytků 66 a 67 na Arg a Val, jako ve VHa425, by mohla mít nepříznivý sterický účinek na CDR-2. Zbytek v poloze 48 je, jak známo, zbytek „pohřbený“ (Chothia a Lesk (1987), viz shora uvedená citace) a model tuto skutečnost potvrzuje. Změna zbytku 48 z Ile, který se nalézá v myší protilátce 425, na Val, který se nalézá v humánních oblastech VH podskupiny I, by mohl ovlivnit vazbu antigenu obecně tím, že by došlo k rozbití této struktury. Také aminokyselina v poloze 48 je blízko CDR-2 a může mít malý sterický účinek na smyčku CDR-2.
- 15CZ 283717 B6
Ze studií konkurenční vazby je zřejmé, že nejlepšími přetvořenými humánními oblasti VL a VH jsou oblasti VLb a VHg. VHg obsahuje všech pět změn FR, diskutovaných výše, a zároveň změnu v poloze 94, která je zahrnuta v první verzi v oblasti Vh přetvořené humánní protilátky 425. FRS ve verzi „b“ oblasti VL přetvořené humánní protilátky 425 jsou ze 70 % identické s FRS v oblasti VL myší protilátky 425. FRS ve verzi „g“ oblasti Vh přetvořené humánní protilátky 425 jsou z 80 % identické s příslušnými oblastmi myší protilátky.
Terapeutické a diagnostické použití protilátek podle vynálezu
Protilátky podle vynálezu je možno podávat humánním pacientům z terapeutických nebo diagnostických důvodů v souladu s postupy, známými z dosavadního stavu techniky. Obvykle se protilátka nebo její fragmenty podávají ve formě parenterálních injekcí, přednostně intraperitoneálně. Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu se však také mohou podávat intravenózně.
Stanovení vhodných titrů protilátky pro podávání je v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru. Obvykle se při podávání monoklonálních protilátek podle vynálezu používá tak velkého rozmezí dávkování, aby se jím dosáhlo požadovaného účinku při potlačování nádorů. Dávkování by nemělo být tak vysoké, aby způsobovalo nepříznivé vedlejší účinky, jako jsou nežádoucí křížové reakce, anafylaktické reakce apod. Dávkování se bude obvykle lišit v závislosti na stáří, zdravotním stavu, pohlaví a rozvoji choroby u pacienta a je v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru. Ošetřující lékař může dávkování upravit v případě jakýchkoliv kontraindikací, imunologické tolerance nebo podobných stavů. Dávkování může kolísat v rozmezí od 0,1 do 70 mg/kg, přednostně od 0,1 do 50 mg/kg, přičemž tato dávka se může podávat jednou nebo několikrát denně po dobu jednoho nebo více dnů.
Přípravky pro parenterální podávání zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Jako příklady nevodných rozpouštědel je možno uvést propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako olivový olej, a organické estery, které je možno podávat injekčním způsobem, jako je ethyloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, vodně-alkoholické roztoky, emulze nebo suspenze, včetně fyziologického roztoku a tlumených médií. Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátované Ringerovy přípravky nebo stabilní oleje. Intravenózní vehikula zahrnují přípravky doplňující kapalinu a živiny, nebo elektrolyt, jako jsou přípravky na bázi Ringerovy dextrózy apod. Také mohou být přítomny konzervační látky a jiné přísady, jako například antimikrobiální látky, antioxidanty, chelatační činidla, inertní plyny apod.
Protilátky mohou být konjugovány k toxinu, jako je ricinová podjednotka A, toxin diphteria, nebo k toxickému enzymu. Alternativně mohou být označeny radioaktivním izotopem v souladu se známými metodami tohoto oboru. Protilátka podle tohoto vynálezu však vykazuje vynikající cytotoxicitu za nepřítomnosti toxinu a za přítomnosti efektorových buněk, jako jsou humánní monocyty.
Tuhé nádory, které je možno detekovat a léčit za použití způsobů podle tohoto vynálezu, zahrnují melanomy, gliomy a karcinomy. Rakovinné buňky, které neexprimují receptory EGFR ve velkém rozsahu, je možno indukovat, aby tak činily, za použití lymfokinových přípravků. Lymfokinové přípravky mohou také způsobovat homogennější expresi receptorů EGF v buňkách nádoru, což vede k účinnější léčbě.
Lymfokinové přípravky, které se hodí v této souvislosti pro podávání, zahrnují interferongamma, faktor nekrózy nádorů a jejich kombinace. Lze je podávat intravenózně. Vhodná dávka lymfokinu činí 10 000 až 1 000 000 jednotek na pacienta.
-16CZ 283717 B6
Pro diagnostické účely je možno protilátku konjugovat k radio-opaknímu barvivu, nebo je možno ji značit radioizotopem. Přednostní metodou značení je Jodogenová metoda (Fraker a další (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849). Pro diagnostické účely se protilátka přednostně podává ve formě fragmentů F(ab’)2- To zajišťuje dosažení vynikajících výsledků, 5 takže není nutno odečítat pozadí. Fragmenty je možno připravovat známými postupy (viz například Herlyn a další (1983), Cancer Res. 43, 2731). Obvykle se provádí štěpení pepsinem při kyselém pH a fragmenty se oddělují od nerozštěpeného IgG a fragmentů těžkého řetězce chromatografií na Protein A-Sepharose<R\ ío Přetvořené humánní protilátky 425 podle tohoto vynálezu způsobují u lidí imunologickou odpověď s nižší pravděpodobností, než myší nebo chimérické protilátky 425. Afinita nej lepší verze přetvořené humánní protilátky 425, která tvoří nej lepší provedení tohoto vynálezu, je stejná, jako afinita myší nebo chimérické protilátky 425. Vazebné studie ukazují, že schopnost soutěžit s EGF o vazbu k EGFR za optimálních podmínek je u chimérické, přetvořené i murinní protilátky stejná. Kromě toho, přetvořené humánní protilátky 425 jsou při terapeutickém použití u lidí účinnější než myší nebo chimérická protilátka 425. Díky velkému snížení imunogenicity vykazuje přetvořená humánní protilátka 425 v lidském těle delší poločas životnosti a pravděpodobnost, že u humánního pacienta způsobí nežádoucí imunologickou odpověď, je snížena na nejnižší míru.
Výsledky dosažené s definovanou protilátkou MAb 425 ukazují, že humanizované monoklonální protilátky, obsahující umělou konvenční sekvenci, nezpůsobují pozoruhodnou minimální odpověď. Další výhody vynálezu jsou popsány výše.
Na základě výše uvedeného popisu je možno konstatovat, že hodnota nových protilátek pole vynálezu pro terapeutické a diagnostické účely je mimořádně vysoká.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Molekulární klonování a sekvenování
Z buněčné linie W 425-15 (ACCT HB 9629), která produkuje protilátku MAb 425, se izoluje veškerá RNA. Pro produkci veškeré RNA se použije přibližně 9,6 x 107 buněk, za použití metody s guanidinium-CsCl (Chirgwin a další (1979), Biochemistiy 18, 5294). Supematanty z buněk, které byly použity pro izolaci veškeré RNA, se zkoušejí metodou ELISA, aby se zajistilo, že buňky produkují ve vysokých množstvích správnou protilátku MAb. Připraví se poly(A+)RNA (viz Aviv a Leder (1972), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69, 1408).
Dvouvláknová cDNA se syntetizuje v podstatě způsoby, popsanými v publikaci Gubler a Hoffman (1983), Gene 25, 263, pouze stím rozdílem, že se pro zahájení syntézy prvního vlákna použije primerů, které jsou homologické s 5’- oblastmi myších kappa a gamma2a’imunoglobulinových konstantních oblastí (viz Levý a další (1987), Gene 54, 167). Primer 50 lehkého řetězce je 26-mer (oligonukleotid 1, tabulka I), který byl sestrojen na základě publikovaných dat (Levý a další (1987), Gene 54, 167; Kaariten a další (1983), J. Immunol. 130, 937). Primer těžkého řetězce je 25-mer (oligonukleotid 2, tabulka I), který byl sestrojen na základě publikovaných dat (Kaariten a další (1983) J. Immunol. 130, 937; Kabat a další (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US
- 17CZ 283717 B6
Govemment Printing Offices. Primery byly navrženy a syntetizovány pomocí zařízení Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer a přečištěny na močovino-akiyl-amidových gelech. Po syntéze druhého vlákna se tupě zakončené cDNA klonují do Smal-štěpeného pUC18 (obchodně dostupný produkt) a transformují do kompetentních buněk E. coli, například DH5-alfa (obchodně dostupný produkt). Kolonie se pomocí mřížky přenesou na agarové misky a provede se skríning hybridizací za použití 32P-značených primerů pro syntézu prvního vlákna (Carter a další (1985), Oligonucleotide Sitedirected Mutagenesis in M 13, an Experimental Approach Manual, Angian Biotechnology Ltd. Colchester). Sekvenování dvouvláknové plazmidové DNA se provádí za použití Sequenase (United States Biochemical Corporation).
Příklad 2
Konstrukce chimérických genů
Pro každou variabilní oblast se syntetizuje přední 5’a zadní 3’primer pro PCR reakci (řetězová reakce pomocí polymerázy) (oligonukleotidy 3 až 6, víz tabulka I). Reakce PCR se provádí za použití 1 ng DNA z plazmidu pUC18, obsahující klonovanou cDNA, předního a zadního PCR příměru, z nichž každý je přítomen v konečné koncentraci 1 μΜ, vždy 200 μΜ DNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCI a 0,1 g/I želatiny. Na každé stanovení se přidá 2,5 jednotky polymerázy DNA Amplitaq (Perkin Elmer Cetus). Po počátečním 1,5 minutovém tavení při 94 °C se provede 25 cyklů amplifikace při 94 °C po dobu 1 minuty, 45 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 3 minut. Závěrečný prodlužovací stupeň při 72 °C se provádí po dobu 10 minut. PCR reakční směsi se dvakrát extrahují směsí fenolu a chloroformu, provede se srážení ethanolem a potom štěpení produktu HindlII a BamHI. Fragment PCR, kódující oblast VL nebo Vh, se potom klonuje do expresního vektoru. Tento vektor obsahuje enhancer a promotor z HCMV (humánní cytomelovirus), bakteriální neo gen a počátek replikace SV40. Vloží se 2,0Kb BamHI fragment genomové DNA, kódující humánní gamma-1 konstantní oblast (Takahashi a další (1982), Cell 29, 671), ve správné orientaci ve směru za Vh oblastí fragmentu (viz HCMV-CVH425-gamma-l na obr. 1). Tento vektor se později přizpůsobí odstraněním místa BamHI u 3’- konce fragmentu konstantní oblasti, čímž se umožní, aby byly variabilní oblasti přímo vloženy do expresního vektoru těžkého řetězce, jako HindlII-BamHI fragmenty (Maeda a další (1991), Hum, Antibod. Hybridomas 2, 124). Fragment, kódující oblast VL, se vloží do podobného HCMV expresního vektoru, který v tomto případě obsahuje BamHI fragment genomové DNA, přibližně o velikosti 2,6 Kb, který kóduje humánní kappa konstantní oblast a obsahuje akceptorové místo pro sestřih a poly-(A+) (Rabbitts a další (1984), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113, 166) (viz HCMV-CVL-425-kappa na obr. 1).
Příklad 3
Molekulární modelování VL a Vh MAb 425
Molekulární model variabilních oblastí murinní protilátky MAb 425 byl vytvořen na základě vyřešené struktury vysoce homologické anti-lysosymové protilátky HyHEL-5 (Sheriff a další (1987), Proč. Nati. Acad. Sci USA 84, 8075). Variabilní oblasti protilátek MAb 425 a HyHEL-5 vykazují přibližně 95% homologii.
Model byl vytvořen na zařízení Silicon Graphics Iris 4D workstation running UNIX za použití programovacího balíku pro modelování molekul „QUANTA“ (Polygen Corp). Identické zbytky ve struktuře byly zachovány a neidentické zbytky byly nahrazeny za použití maximálního překrývání („maximum overlap“, Snow a Amzel (1986)), které bylo zavedeno do zařízení pro modelování proteinů „QUANTA“. Konformace hlavního řetězce tří N-terminálních zbytků
-18CZ 283717 B6 v těžkém řetězci byly nahrazeny zhomologické protilátkové struktury (HyHEL-10, Padlan a další (1989), Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 5938), poněvadž jejich teplotní faktory byly abnormálně vysoké (vyšší než střed plus tři směrodatné odchylky, měřeno od teplotních faktorů hlavního řetězce) a poněvadž ovlivňovaly sbalování V» CDR-3 (H3) (Martin (1990), disertační práce na doktorát filosofie na Oxfordské univerzitě). Sekvence CDR-1 (LI) a CDR-2 (L2) oblasti VL a sekvence CDR-1 (Hl) a CDR-2 (H2) oblasti VH z protilátky MAb 425 odpovídají kanonickým formám, které postulovali Chothia a další (1989), Nátuře 342, 877). Hlavní úhly torze řetězců těchto smyček byly udržovány tak jako v HyHEL-5. Sekvence CDR-3 (L3) oblasti VL a sekvence CDR-3 (H3) oblasti VH z protilátky MAb 425 neodpovídají kanonickým strukturám, a proto byly modelovány odlišným způsobem. Bylo použito počítačového programu Martina a dalších (1989), Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 9268) pro extrakci smyček z Brookhavenovy databanky (Bemstein a další, (1977), J. Mol. Bio 112, 525). Smyčky byly potom vytříděny na základě podobnosti sekvence, energie a zbytků, určujících strukturu (Sutcliffe (1988), disertační práce na doktorát filosofie na Londýnské univerzitě). Kvalitní smyčky byly kontrolovány na grafice a nej lepší z nich byly vybrány na základě vizuálního pozorování. H3 byl modelován na hovězí glutathion peroxidase (Epp a další (1983), Eur. J. Biochem. 133, 51) v oblasti zbytků 92 až 103. L3 byl modelován na murinní IgA (J539) Fab fragmentu (Suh a další (1986), Proteins 1, 74) v oblasti zbytků 88 až 96 lehkého řetězce.
Model byl podroben minimalizaci energie nejstrmějšími poklesy a konjugátovými gradienty za použití potenciálu CHARm (Brooks a další (1983), J. Comp. Chem. 4, 187), zakomponovaným do QUANTA, aby se odstranily nežádoucí kontakty atomů a aby se optimalizovaly Van der Waalsovy a elektrostatické interakce.
Příklad 4
Konstrukce genů humanizované protilátky
Konstrukce první verze lehkého řetězce přetvořené humánní protilátky 425 byla prováděna za použití CDR-roubovacího postupu, který se podobá postupu, popsanému v Reichmann a další (1988), Nátuře 322, 21; Verhoeyen a další (1988), Science 239, 18). Jednovláknová templátová DNA byla připravena z vektoru M13mpl8 (který je obchodně dostupný), obsahujícího fragment HinDIII-BamHI, kódující humánní anti-lysosymovou oblast VL (EP 239 400, G. Winter). FRs tohoto lehkého řetězce jsou odvozeny z krystalograficky vyřešeného proteinu REI. Byly navrženy tři oligonukleotidy, které sestávaly ze sekvencí DNA, kódujících každou CDR lehkého řetězce myší protilátky MAb 425, lemelových na každém konci 12 bázemi DNA, komplementární sekvencím DNA, kódujícím sousední FRs humánního REI (oligonukleotidy 7 až 9 v tabulce I). Oligonukleotidy byly syntetizovány a purifikovány shora uvedeným způsobem. Všechny tři oligonukleotidy byly fosforylovány a současně použity v systému pro mutagenezi in vitro, zaměřenou na oligonukleotidy. Použitý systém je složen na metodách, které vypracovali Eckstein a jeho spolupracovníci (Taylor a další (1985), Nucleic Acids Res, 13, strana 8749 a 8764; Nakamaye a Eckstein (1986), Nucleic Res. 14, 9679; Sayers a další (1988), Nucleic Acids Res. 16, 791). Až do exonukleázového III štěpícího stupně bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Potom byla reakční směs extrahována směsí fenolu a chloroformu, produkt byl sražen ethanolem a resuspendován ve 100 μΐ TE. Objemu 10 μΐ bylo použito jako templátové DNA při 100 μΐ PCR amplifíkační reakci za použití univerzálního primeru M13 a reverzního sekvenačního primeru až do koncové koncentrace každé z těchto látek 0,2 μΜ. Pufrovací a termocyklové podmínky byly stejné jako v příkladu 2 s výjimkou toho, že bylo použito hybridizační teploty 55 °C. Reakční směs byla dvakrát extrahována směsí fenolu a chloroformu, produkt byl sražen ethanolem a potom štěpen HindlII a BamHI a subklonován do pUC18. Předpokládané pozitivní klony byly identifikovány hybridizací k 32P - značeným mutagenním primerům (Carter a další (1987), viz výše uvedená citace). Klony byly potvrzeny jako pozitivní
-19CZ 283717 B6 sekvenováním. Oblast VL, obsahující všechny tři roubované CDR, byla klonována jako fragment HindlII-BamHI do expresního vektoru VL, za vzniku plazmidu HCMV-RVLa425-kappa.
Verze „b“ přetvořené oblasti VL byla konstruována za použití metody PCR mutageneze (Kammann a další (1989), Nucleic Acids Res. 17, 5404) s menšími modifikacemi. Templátovou DNA byla RVL a subklonovaná do pUC18. První PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 50 μΐ a reakční směs obsahovala jeden μg templátu, Ml3 reverzní sekvenační primer a primer 10 (tabulka I) o konečné koncentraci 1 μΜ, 200 uM každé dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,1 g/1 želatiny. Ke každému stanovení byla přidána jedna jednotka DNA polymerázy Amplitaq. Reakce byla prováděna se třemi replikacemi. Po 1,5 minutovém tavení při 94 °C následovalo 40 reakčních cyklů 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 37 °C a 2 minuty při 72 °C. Nakonec bylo provedeno prodlužování po dobu 10 minut při 72 °C. Reakční produkty byly spojeny a extrahovány směsí fenolu a chloroformu. Před izolací PCR produktu z TAE agarosového gelu byl produkt sražen ethanolem. Jedné desetiny prvního PCR reakčního produktu se potom použilo jako jednoho z primerů při druhé PCR reakci. Druhá reakce byla stejná jako první, s výjimkou použití prvního reakčního produktu a 20 pmol univerzálního primerů M13. Cyklování bylo prováděno způsobem, popsaným v publikaci Kammann a další (1989) Nucleic Acids Res 17, 5404). Fragment HindUI-BamHI byl klonován do p-UC18 a sekvenován. Fragment DNA, nesoucí požadovanou změnu, byl subklonován do VL expresního plazmidu za vzniku plazmidu HCMV-RVLb425-kappa.
První verze přetvořené humánní oblasti VH protilátky 425 byla syntetizována chemicky. Byla sestrojena DNA sekvence, kódující požadovanou sekvenci aminokyselin a obsahující potřebné lemovací sekvence DNA (viz výše). Použití kodonu bylo optimalizováno pro savčí buňky zabudováním užitečných míst pro restrikční enzymy do sekvencí DNA, kódujících FRs. Byl syntetizován úsek o velikosti 454 bp a subklonován do pUC18, jako EcoRI-HindlII fragment. Potom byl HindlII-BamHI fragment, kódující těžký řetězec přetvořené humanizované protilátky 425, přenesen do VH expresního vektoru, za vzniku plazmidu HCMV- RVHa—425-gamma-l.
Různými způsoby byly zkonstruovány další verze (celkem 8) přetvořených humanizovaných těžkých řetězců. Fragment HindlII-BamHI, kódující verzi „a“ těžkého řetězce, byl přenese do M13mpl8 a byla připravena jednovláknová DNA. Za použití oligonukleotidů 11 až 13 (viz tabulka I) byla výše popsanou PCR-prizpůsobenou M13 mutagenezí, popsanou výše, připravena DNA, kódující verze „d“, „e“, „f‘ a „g“ oblastí VH přetvořené humánní protilátky 425 v pUC18. Tyto verze byly subklonovány do expresního vektoru těžkého řetězce jako fragmenty HindlIIBamHI, za vzniku plazmidů HCMV-RVHd425-gamma-l, HCMV-RVHe425-gamma-l, HCMV-RVHf425-gamma-l a HCMV-RVHg425-gamma-l.
Verze „b“ a „c“ oblastí VH přetvořené humánní protilátky 425 byly vytvořeny za použití PCR mutageneze, kterou popsali Kammann a další (1989), viz výše uvedená citace. Jako templátová DNA bylo použito verze „a“ oblasti VH humánní protilátky 425, subklonované do pUC18, a jako mutagenního primerů bylo při první PCR reakci použito buď primerů 13 nebo 14 (viz tabulka I). Po mutagenezi a sekvenování byly sekvence, nesoucí požadované změny, subklonovány do expresního plazmidu těžkého řetězce, za vzniku plazmidů HMCV-RVHb425-gamma-l a HCMV-RVHc425-gamma-l.
Přetvořené verze „h“ a „i“ těžkého řetězce byly zkonstruovány z klonů existujících verzí na bázi pUC. 0,2 Kb fragment HindlII-Xhol z verze „e“ byl ligován k 2,8 Kb fragmentu Xhol-HindlII buď z verze „b“ nebo „c“, za vzniku nových verzí ,Ji“ a „i“. Fragmenty HindlII-BamHI, kódující tyto verze, byly subklonovány do expresního faktoru těžkého řetězce za vzniku HCMVRVHh425-gamma-l a HCMV-RVHi425-gamma-l.
-20CZ 283717 B6
Příklad 5
Transfekce DNA do buněk COS
Buňky COS byly elektroporovány vždy 10 pg expresního vektoru, nesoucího jednak gen, kódující těžký řetězec, a jednak gen, kódující lehký řetězec. Krátce řečeno, 10 pg každého plazmidu bylo přidáno k 0,8 ml alikvotního dílu suspenze buněk COS vPBS o koncentraci 1 x 107 buněk na ml. Bylo použito zařízení Bio-Rad,R) Gene Pulser pro dodání pulzu 1900 V s kapacitou 25 pF. Buňky byly ponechány zotavit se v průběhu 10 minut při teplotě místnosti a potom byly naneseny na misky do 8 ml DMEM s obsahem 10 % fetálního telecího séra. Po 72 hodinách inkubace byla média shromážděna, zbavena úlomků buněk odstředěním a před provedením analýzy metodou ELISA byla uložena za sterilních podmínek krátkou dobu při 4 °C nebo delší dobu při -20 °C.
Příklad 6
Transfekce DNA do buněk CHO byla prováděna způsobem popsaným v příkladu 5.
Příklad 7
Kvantifikace produkce IgG a detekce vazby antigenů
Humánní IgG, přítomný v supematantech z buněk COS, byl detekován metodou ELISA. Při stanovení humánního IgG testem ELISA byly plotny s 96 jamkami povlečeny kozím antihumánním IgG (celé molekuly) a humánní IgG ve vzorcích, který se navázal na plotny, byl detekován za použití alkalickou fosfatázou konjugovaného kozího anti-humánního IgG (specifického vůči gamma-řetězcům). Jako standardu bylo použito zakoupeného přečištěného humánního IgG. Vazba antigenů, rozpoznaná protilátkou MAb 425, byla stanovena druhým testem ELISA. Plotny byly povlečeny EGFR proteinovým přípravkem (který lze získat například způsobem, popsaným v publikaci Rodeck a další (1987), Cancer Res. 47, 3692), a protilátky, vázající se kEGFR, byly detekovány za použití buď anti-humánní IgG (specifického vůči gamma-řetězcům) peroxidázového konjugátu (v případě chimérických a přetvořených humánních protilátek), nebo za použití anti-myší IgG (celá molekula) peroxidázového konjugátu (v případě myší protilátky MAb 425). Oba konjugáty byly dodány firmou Sigma. Purifikovaná murinní protilátky MAb 425 bylo použito jako standardu.
Příklad 8
Konkurenční vazebná zkouška
Murinní protilátka MAb 425 byla biotinylována za použití odpovídající soupravy, která je k dostání na trhu. Plotny pro test ELISA byly povlečeny EGFR proteinem v optimálním zředění. Zředěné supematanty buněk COS v objemu 50 pl byly smíseny s 50 pl biotinylované murinní protilátky MAb 425 (o koncentraci podle testu ELISA 1,75 pg/ml). Každý supematant z buněk COS byl zkoušen dvakrát. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě místnosti. Vázaná biotinylovaná murinní protilátka MAb 425 byla detekována přídavkem komplexu streptavidinperoxidáza z ředkve, kterýžto komplex je k dostání na trhu. Kontrolní pokus, při němž není přítomna žádná konkurenční látka, vedl k hodnotě procenta inhibice nebo blokování, již lze vypočítat pro každý supematant buněk COS pole následujícího vzorce:
-21 CZ 283717 B6
100 - [(OD450 vzorku/OD45o kontrolního vzorku) x 100]
Příklad 9
Různé vzorky murinní, přetvořené a chimérické protilátky MAb 425 byly analyzovány metodou SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide-Gelspaceelectrophoresis), kterou popsali Laemmli a další. Do každé jamky bylo naneseno 2,5 pg každého vzorku jak za neredukujících, tak za redukujících podmínek. Protein byl vizualizován barvením Coomassie. Obr. 9 (A) ukazuje, že vzorky měly podobnou čistotu. Rozmezí molekulové hmotnosti protilátek bylo 180 000 až 200 000.
Příklad 10
Přetvořená protilátka MAb 425 byla purifíkována gelovou prostorovou filtrací na Superose 12(R) (Pharmacia Corp., Švédsko) za použití standardních metod. Protilátka byla eluována pomocí PBS (pH 7,4, 0,8 M NaCl) (0,1 M). Je možno získat jediný pík (při 5 minutách) (obr. 9 (B)).
Příklad 11
Biotinem značené protilátky MAb 425 bylo použito jako konkurentu neznačené protilátky MAb 425 nebo jejích derivátů při vazbě kEGFR. Značení biotinem bylo provedeno standardními metodami. EGFR byl převeden do roztoku z membrán A431 standardními metodami. Buňky A 431 byly zakoupeny na trhu. Detekce byla prováděna po inkubaci s POD-konjugovaným streptavidinem a substrátem. Z těchto dat byly sestrojeny inhibiční křivky (obr. 10). Křivky ukazují, že vazba různých protilátek je srovnatelná.
Příklad 12
Různé vzorky purifikované murinní, chimérické a přetvořené MAb 425 byly zkoušeny na svou schopnost soutěžit s EGF o vazbu k EGFR. Zkouška byla prováděna za použití 125I-značeného EGF (Amersham Corp., Velká Británie) a různých protilátek, které značenému EGF konkurují při vazbě na EGF-receptor pozitivní membrány (A431). Zkušební systém je založen na technologii SPA. Konkurenční křivky murinní a přetvořených protilátek (3 vzorky) jsou téměř identické (obr. 11).
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Chimérická monoklonální protilátka, obsahující místa, vázající antigen, CDR, nehumánního původu, úseky základní struktury, FR, nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky:i) váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptorů EGF, ii) konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa,-22CZ 283717 B6 iii) její oblasti CDR, reprezentující místa, vázající antigen, zahrnují následující sekvence aminokyselin lehký řetězecCDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2-Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrtěžký řetězecCDR-1 -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2-Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3-Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyr- iv) její úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům vázajícím antigen, zahrnují následující aminokyselinové sekvence lehký řetězecFR-1 -Gln-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Met-Ser-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-LysV al-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-Leu-Leu-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Ser-Leu-ThrIle-Ser-Arg-Met-Glu-Ala-Glu-Asp-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lystěžký řetězecFR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Aia-Glu-Leu-Val-Lys-Pro-Cily-Ala-SerVal-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-Ala-Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp-Ile-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-Thr-Ala-Tyr-Met-Gln-Leu-SerSer-Leu-Thr-Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-Val-Ser-Ser-
- 2. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast lehkého řetězce chimérické monoklonální protilátky podle nároku 1, který nese označení pCVL425 aje uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338.
- 3. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast těžkého řetězce chimérické monoklonální protilátky podle nároku 1, který nese označení pCVH425 aje uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6337.
- 4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP91103389 | 1991-03-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ333796A3 CZ333796A3 (cs) | 1998-06-17 |
CZ283717B6 true CZ283717B6 (cs) | 1998-06-17 |
Family
ID=8206486
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ963337A CZ283717B6 (cs) | 1991-03-06 | 1992-03-04 | Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek |
CS923327A CZ282603B6 (cs) | 1991-03-06 | 1992-03-04 | Humanizované a chimerické monoklonální protilátky |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS923327A CZ282603B6 (cs) | 1991-03-06 | 1992-03-04 | Humanizované a chimerické monoklonální protilátky |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5558864A (cs) |
EP (2) | EP1362868A3 (cs) |
JP (1) | JP3854306B2 (cs) |
KR (1) | KR100240308B1 (cs) |
AT (1) | ATE247168T1 (cs) |
AU (1) | AU658396B2 (cs) |
CA (1) | CA2082160C (cs) |
CZ (2) | CZ283717B6 (cs) |
DE (1) | DE69233153T2 (cs) |
DK (1) | DK0531472T3 (cs) |
ES (1) | ES2204890T3 (cs) |
HU (1) | HU219537B (cs) |
IE (1) | IE920705A1 (cs) |
MX (1) | MX9201016A (cs) |
PT (1) | PT100195B (cs) |
SK (2) | SK281142B6 (cs) |
TW (1) | TW222279B (cs) |
WO (1) | WO1992015683A1 (cs) |
ZA (1) | ZA921661B (cs) |
Families Citing this family (323)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CU22545A1 (es) * | 1994-11-18 | 1999-03-31 | Centro Inmunologia Molecular | Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
US6750325B1 (en) | 1989-12-21 | 2004-06-15 | Celltech R&D Limited | CD3 specific recombinant antibody |
GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
US5994510A (en) * | 1990-12-21 | 1999-11-30 | Celltech Therapeutics Limited | Recombinant antibodies specific for TNFα |
AU662311B2 (en) * | 1991-02-05 | 1995-08-31 | Novartis Ag | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
US6800738B1 (en) * | 1991-06-14 | 2004-10-05 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
LU91067I2 (fr) | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
CA2143621C (en) * | 1993-06-29 | 2008-02-19 | Sadaaki Iwanaga | Horseshoe crab amebocyte lysate factor g subunit a and dna encoding thereof |
UA40577C2 (uk) * | 1993-08-02 | 2001-08-15 | Мерк Патент Гмбх | Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин |
ATE207366T1 (de) * | 1993-12-24 | 2001-11-15 | Merck Patent Gmbh | Immunokonjugate |
GB9401182D0 (en) * | 1994-01-21 | 1994-03-16 | Inst Of Cancer The Research | Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect |
US6448077B1 (en) * | 1994-02-10 | 2002-09-10 | Imclone Systems, Inc. | Chimeric and humanized monoclonal antibodies specific to VEGF receptors |
US20030108545A1 (en) * | 1994-02-10 | 2003-06-12 | Patricia Rockwell | Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist |
US5968753A (en) * | 1994-06-14 | 1999-10-19 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
ATE208633T1 (de) * | 1994-09-16 | 2001-11-15 | Merck Patent Gmbh | Immunokonjugate |
US6551593B1 (en) | 1995-02-10 | 2003-04-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam |
US7803904B2 (en) * | 1995-09-01 | 2010-09-28 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Mucosal vascular addressing and uses thereof |
IT1277827B1 (it) * | 1995-03-01 | 1997-11-12 | Ministero Uni Ricerca Scient E | Anticorpo monoclonale chimerico murino/umano o un suo frammento specifico per il recettore egf (egf-r) |
EP0739984A1 (en) * | 1995-04-26 | 1996-10-30 | San Tumorforschungs-Gmbh | Bivalent polypeptides containing at least two domains |
US20050241006A1 (en) * | 1995-04-27 | 2005-10-27 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
JP4312259B2 (ja) * | 1995-04-27 | 2009-08-12 | アムジェン フレモント インク. | 免疫したゼノマウス(XenoMouse)に由来するヒト抗体 |
US20050287630A1 (en) * | 1995-04-27 | 2005-12-29 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5641751A (en) * | 1995-05-01 | 1997-06-24 | Centocor, Inc. | Tumor necrosis factor inhibitors |
DE69616651D1 (de) * | 1995-05-26 | 2001-12-13 | Merck Patent Gmbh | Antiidiotypische Antikörper die eine Immunantwort gegen den Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor induzieren |
EP0745612B1 (en) * | 1995-05-26 | 2001-11-07 | MERCK PATENT GmbH | Anti-idiotypic antibodies which induce an immune response against epidermal growth factor receptor |
US7060808B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-13 | Imclone Systems Incorporated | Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody |
US6410690B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-06-25 | Medarex, Inc. | Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies |
EP0781847A1 (en) | 1995-11-06 | 1997-07-02 | MERCK PATENT GmbH | Humanized monoclonal antibody |
AR005035A1 (es) * | 1995-12-11 | 1999-04-07 | Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung | Procedimiento para preparar proteinas recombinantes en e. coli, mediante fermentacion con gran concentracion de celulas. |
WO1997046589A2 (en) | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Neorx Corporation | Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods |
US7147851B1 (en) * | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
AU4208897A (en) * | 1996-09-16 | 1998-04-02 | Merck Patent Gmbh | Oligocistronic expression system for the production of heteromeric proteins |
KR100643058B1 (ko) * | 1996-12-03 | 2006-11-13 | 아브게닉스, 인크. | 복수의 Vн 및 Vк 영역을 함유하는 인간 면역글로불린 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 포유동물 및 이로부터 생성된 항체 |
AU743758B2 (en) * | 1997-04-07 | 2002-02-07 | Genentech Inc. | Anti-VEGF antibodies |
US20020173629A1 (en) * | 1997-05-05 | 2002-11-21 | Aya Jakobovits | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
DE19722888A1 (de) * | 1997-05-28 | 1998-12-03 | Thomas Prof Dr Huenig | Human-CD28 spezifische monoklonale Antikörper zur antigenunspezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten |
US7052692B1 (en) | 1997-09-02 | 2006-05-30 | Advanced Research & Technology Institute | Role of tyrosine phosphorylation of a cellular protein in adeno-associated virus 2-mediated transgene expression |
AU2469299A (en) * | 1998-01-23 | 1999-08-09 | Cornell Research Foundation Inc. | Purified populations of stem cells |
US20030224001A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-12-04 | Goldstein Neil I. | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors |
CA2327505A1 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Smithkline Beecham Corporation | Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity |
ZA200007412B (en) * | 1998-05-15 | 2002-03-12 | Imclone Systems Inc | Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases. |
EP1096955B9 (en) | 1998-07-13 | 2006-07-05 | Board of Regents, The University of Texas System | Uses of antibodies to aminophospholipids for cancer treatment |
EP1119349B1 (en) * | 1998-08-18 | 2008-07-02 | The Regents Of The University Of California | Epidermal growth factor receptor antagonists for treating hypersecretion of mucus in the lungs |
AU782994C (en) * | 1999-05-14 | 2006-08-24 | Imclone Llc | Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor antagonists |
GB0002952D0 (en) * | 2000-02-09 | 2000-03-29 | Pharma Mar Sa | Process for producing kahalalide F compounds |
US20010051147A1 (en) * | 2000-03-27 | 2001-12-13 | Van De Winkel Jan G.J. | Methods for immunostimulation using binding agents for the Fc receptor of immunoglobulin A |
AU9500201A (en) * | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Imclone Systems Inc | Treatment of hyperproliferative diseases with epidermal growth factor receptor antagonists |
PL206142B1 (pl) * | 2001-01-09 | 2010-07-30 | Merck Patent Gmbhmerck Patent Gmbh | Kompozycja i zestaw farmaceutyczny do leczenia nowotworów i przerzutów nowotworowych oraz ich zastosowanie |
EP1361893B1 (en) * | 2001-02-19 | 2012-10-24 | Merck Patent GmbH | Modified anti-egfr antibodies with reduced immunogenicity |
AU2002250236A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-19 | Medimmune, Inc. | Cd2 antagonists for treatment of autoimmune or inflammatory disease |
US20080008704A1 (en) * | 2001-03-16 | 2008-01-10 | Mark Rubin | Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies |
WO2002085405A2 (en) | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Merck Patent Gmbh | COMBINATION THERAPY USING ANTI-ANGIOGENIC AGENTS AND TNF$g(a) |
PL363322A1 (en) * | 2001-05-08 | 2004-11-15 | Merck Patent Gmbh | Combination therapy using anti-egfr antibodies and anti-hormonal agents |
US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
ES2552281T3 (es) | 2001-05-11 | 2015-11-26 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Proteínas de unión específica y usos de las mismas |
US20020193569A1 (en) * | 2001-06-04 | 2002-12-19 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells |
JP2005508298A (ja) * | 2001-06-20 | 2005-03-31 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | アテローム性動脈硬化症及び他の炎症性疾患を処置する方法 |
EP1399484B1 (en) * | 2001-06-28 | 2010-08-11 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
US20050271663A1 (en) * | 2001-06-28 | 2005-12-08 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
WO2004058821A2 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
EP1423012B1 (en) * | 2001-08-10 | 2007-11-14 | Imclone Systems, Inc. | Medical use of stem cells expressing vegfr-1 |
EP1435959A2 (en) * | 2001-10-09 | 2004-07-14 | University of Cincinnati | Inhibitors of the egf receptor for the treatment of thyroid cancer |
SI2336184T1 (sl) | 2002-02-25 | 2015-04-30 | Biogen Idec Ma Inc. | Dajanje sredstev za zdravljenje vnetij |
US20090042291A1 (en) * | 2002-03-01 | 2009-02-12 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US7662925B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
JP2005526506A (ja) * | 2002-03-04 | 2005-09-08 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Kdrに特異的なヒト抗体及びその利用 |
AU2003231293A1 (en) | 2002-05-02 | 2003-11-17 | Wyeth Holdings Corporation | Calicheamicin derivative-carrier conjugates |
GB0210121D0 (en) * | 2002-05-02 | 2002-06-12 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
US20040033543A1 (en) * | 2002-05-20 | 2004-02-19 | Gisela Schwab | Treatment of renal carcinoma using antibodies against the EGFr |
US7893218B2 (en) | 2003-06-16 | 2011-02-22 | Stowers Institute For Medical Research | Antibodies that specifically bind SOST peptides |
US9321832B2 (en) * | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
AU2003247869C1 (en) | 2002-07-15 | 2009-12-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Selected antibodies binding to anionic phospholipids and aminophospholipids and their use in treating viral infections and cancer |
EP2364996B1 (en) | 2002-09-27 | 2016-11-09 | Xencor Inc. | Optimized FC variants and methods for their generation |
RU2354402C2 (ru) * | 2002-10-10 | 2009-05-10 | Мерк Патент Гмбх | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА РЕЦЕПТОРЫ ErbB1 |
GB0228832D0 (en) * | 2002-12-10 | 2003-01-15 | Novartis Ag | Organic compound |
GB0304367D0 (en) * | 2003-02-26 | 2003-04-02 | Pharma Mar Sau | Methods for treating psoriasis |
EP1629090B1 (en) * | 2002-11-06 | 2014-03-05 | iBio, Inc. | Expression of foreign sequences in plants using trans-activation system |
US7683238B2 (en) | 2002-11-12 | 2010-03-23 | iBio, Inc. and Fraunhofer USA, Inc. | Production of pharmaceutically active proteins in sprouted seedlings |
US7692063B2 (en) * | 2002-11-12 | 2010-04-06 | Ibio, Inc. | Production of foreign nucleic acids and polypeptides in sprout systems |
US20040147428A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-07-29 | Pluenneke John D. | Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor |
US7276589B2 (en) * | 2002-11-26 | 2007-10-02 | Pdl Biopharma, Inc. | Chimeric and humanized antibodies to α5β1 integrin that modulate angiogenesis |
US7285268B2 (en) * | 2002-11-26 | 2007-10-23 | Pdl Biopharma, Inc. | Chimeric and humanized antibodies to α5β1 integrin that modulate angiogenesis |
EP1575516B1 (en) | 2002-11-26 | 2012-05-30 | Abbott Biotherapeutics Corp. | Chimeric and humanized antibodies to alpha5 beta1 integrin that modulate angiogenesis |
ES2531125T3 (es) | 2003-02-03 | 2015-03-10 | Ibio Inc | Sistema para la expresión de genes en plantas |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US20090010920A1 (en) * | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
EP1622941A2 (en) * | 2003-03-20 | 2006-02-08 | ImClone Systems Incorporated | Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor |
CA2520121A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-21 | Protein Design Labs, Inc. | Inhibitors of integrin alpha5beta1 and their use for the control of tissue granulation |
EP1664322B1 (en) | 2003-05-22 | 2013-07-10 | Fraunhofer USA, Inc. | Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides |
CN1972712A (zh) | 2003-06-09 | 2007-05-30 | 塞缪尔·瓦克萨尔 | 用胞外拮抗物和胞内拮抗物抑制受体酪氨酸激酶的方法 |
GB0321066D0 (en) * | 2003-09-09 | 2003-10-08 | Pharma Mar Sau | New antitumoral compounds |
US9714282B2 (en) | 2003-09-26 | 2017-07-25 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US8101720B2 (en) | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
EP2292664B1 (en) | 2003-10-16 | 2016-11-23 | Amgen Research (Munich) GmbH | Multispecific deimmunized CD3-binders |
DE10355904A1 (de) | 2003-11-29 | 2005-06-30 | Merck Patent Gmbh | Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern |
US20100190150A1 (en) * | 2004-01-07 | 2010-07-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators |
CN1922306B (zh) * | 2004-02-20 | 2010-10-06 | 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 | 用于植物中克隆表达的系统和方法 |
TW200533339A (en) * | 2004-03-16 | 2005-10-16 | Bristol Myers Squibb Co | Therapeutic synergy of anti-cancer compounds |
JP4734319B2 (ja) * | 2004-03-19 | 2011-07-27 | イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ヒト抗上皮成長因子受容体抗体 |
ES2376556T3 (es) * | 2004-03-24 | 2012-03-14 | Abbott Biotherapeutics Corp. | Utilización de la anticuerpos anti-alfa5beta1 para inhibir la proliferación de las células cancerosas. |
GB0410627D0 (en) * | 2004-05-12 | 2004-06-16 | Scancell Ltd | Specific binding members |
CN103351434B (zh) | 2004-07-15 | 2015-09-30 | 赞科股份有限公司 | 优化的Fc变体 |
US8546543B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-10-01 | Xencor, Inc. | Fc variants that extend antibody half-life |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US9200079B2 (en) | 2004-11-12 | 2015-12-01 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
PL3540062T3 (pl) | 2004-11-16 | 2021-12-27 | Humanigen, Inc. | Wymiana kasety dla regionu zmiennego immunoglobuliny |
EP2377555A3 (en) * | 2004-11-18 | 2011-11-23 | Imclone LLC | Antibodies against vascular endothelial growth factor receptor-1 |
ES2755976T3 (es) | 2005-02-07 | 2020-04-24 | Roche Glycart Ag | Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican y usos de las mismas |
US8735394B2 (en) * | 2005-02-18 | 2014-05-27 | Abraxis Bioscience, Llc | Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy |
ATE531365T1 (de) | 2005-02-18 | 2011-11-15 | Abraxis Bioscience Llc | Kombinationen und modi zur verabreichung therapeutischer mittel und kombinationstherapie |
US20070166388A1 (en) | 2005-02-18 | 2007-07-19 | Desai Neil P | Combinations and modes of administration of therapeutic agents and combination therapy |
CN101228189A (zh) * | 2005-05-09 | 2008-07-23 | 格黎卡特生物技术股份公司 | 具有修饰的fc区域和改变的与fc受体的结合的抗原结合分子 |
WO2006124451A2 (en) * | 2005-05-11 | 2006-11-23 | Centocor, Inc. | Anti-il-13 antibodies, compositions, methods and uses |
JP2009502207A (ja) * | 2005-08-03 | 2009-01-29 | フラウンホーファー ユーエスエー, インコーポレイテッド | イムノグロブリンの産生のための組成物および方法 |
EP2500357A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-24 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
KR20140053410A (ko) | 2005-08-19 | 2014-05-07 | 아보트 러보러터리즈 | 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
US20090215992A1 (en) * | 2005-08-19 | 2009-08-27 | Chengbin Wu | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US8129114B2 (en) * | 2005-08-24 | 2012-03-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators |
CA2624189A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized fc receptor binding properties |
EP1934599A1 (en) | 2005-10-11 | 2008-06-25 | Merck Patent GmbH | Egfr dependent modulation of chemokine expression and influence on therapy and diagnosis of tumors and side effects thereof |
JP2009515552A (ja) * | 2005-11-17 | 2009-04-16 | ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | α4β7インテグリン反応性ヒト化免疫グロブリン |
EP1957536A2 (en) * | 2005-12-01 | 2008-08-20 | Domantis Limited | Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1 |
AU2006332212B8 (en) * | 2006-01-04 | 2013-05-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Combination therapy using anti-EGFR and anti-HER2 antibodies |
WO2007095320A2 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Fraunhofer Usa, Inc. | Hpv antigens, vaccine compositions, and related methods |
WO2008048344A2 (en) * | 2006-02-13 | 2008-04-24 | Fraunhofer Usa, Inc. | Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods |
JP2009526526A (ja) | 2006-02-13 | 2009-07-23 | フラウンホーファー ユーエスエー, インコーポレイテッド | インフルエンザ抗原、ワクチン組成物、および関連する方法 |
EP2163563A1 (en) | 2006-03-31 | 2010-03-17 | Massachusetts Institute of Technology | Treatment of tumors expressing mutant EGF receptors |
AR062223A1 (es) * | 2006-08-09 | 2008-10-22 | Glycart Biotechnology Ag | Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas |
CA2672618C (en) | 2006-12-14 | 2021-03-02 | Abraxis Bioscience, Llc | Breast cancer therapy based on hormone receptor status with nanoparticles comprising taxane |
MX2009006696A (es) * | 2006-12-22 | 2009-06-30 | Novelix Therapeutics Gmbh | Tratamiento de diabetes con al menos un anticuerpo especifico del receptor del factor de crecimiento epidermico o uin derivado de este. |
FI3345607T3 (fi) | 2006-12-29 | 2022-11-30 | Menetelmiä luun kasvun muuttamiseksi antamalla SOST- tai WISE-antagonistia tai antagonistia | |
WO2008091701A2 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Dana-Farber Cancer Institute | Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease |
PL2132229T3 (pl) * | 2007-03-01 | 2016-12-30 | Kompozycje rekombinowanych przeciwciał anty-receptor czynnika wzrostu naskórka | |
MX2009009782A (es) | 2007-03-15 | 2010-09-10 | Ludwig Inst Cancer Res | Metodo de tratamiento que utiliza anticuerpos egfr e inhibidores de src y formulaciones relacionadas. |
BRPI0810865A2 (pt) * | 2007-04-28 | 2017-05-09 | Fraunhofer Usa Inc | antígenos de tripanossoma, composições vacinais, e métodos relacionados |
NZ580530A (en) | 2007-06-06 | 2012-04-27 | Domantis Ltd | Anti vegf polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
US20090074780A1 (en) | 2007-06-25 | 2009-03-19 | David Urech | Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties |
CA2692933C (en) | 2007-07-11 | 2016-10-18 | Fraunhofer Usa, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
CA2693863C (en) * | 2007-07-17 | 2017-10-03 | Merck Patent Gmbh | Engineered anti-alpha v- integrin hybrid antibodies |
AU2008282331A1 (en) * | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Facet Biotech Corporation | Pharmaceutical combinations comprising a tyrosine kinase inhibitor and an antibody against integrin alpha 1 beta 5 (CD49E) |
CN108424454B (zh) | 2007-08-14 | 2022-05-31 | 路德维格癌症研究所有限公司 | 靶向egf受体的单克隆抗体175及其衍生物和用途 |
CA2696764A1 (en) * | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Fraunhofer Usa, Inc. | Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods |
BRPI0817108B8 (pt) | 2007-09-21 | 2021-05-25 | Univ California | composição compreendendo uma proteína de fusão, kit compreendendo a referida composição e uso da mesma. |
AU2008312400A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Improved antitumoral treatments |
EP4098661A1 (en) | 2007-12-26 | 2022-12-07 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
US20100323021A1 (en) * | 2008-01-30 | 2010-12-23 | Pharma Mar, S.A. | Antitumoral treatments |
JP2011513370A (ja) * | 2008-03-07 | 2011-04-28 | ファルマ・マール・ソシエダード・アノニマ | 改善された抗腫瘍治療法 |
US9029508B2 (en) | 2008-04-29 | 2015-05-12 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
EP3002299A1 (en) | 2008-06-03 | 2016-04-06 | AbbVie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CN102112494A (zh) | 2008-06-03 | 2011-06-29 | 雅培制药有限公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
KR20110031369A (ko) | 2008-07-08 | 2011-03-25 | 아보트 러보러터리즈 | 프로스타글란딘 e2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
US8663640B2 (en) | 2008-08-29 | 2014-03-04 | Symphogen A/S | Methods using recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions |
US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
KR102100066B1 (ko) | 2008-10-14 | 2020-04-10 | 제넨테크, 인크. | 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도 |
EP2373692A4 (en) * | 2008-12-04 | 2013-11-20 | Abbvie Inc | IMMUNOGLOBULINE WITH DOUBLE VARIABLE DOMAIN AND ITS USE |
RU2015132478A (ru) | 2009-03-05 | 2015-12-10 | Эббви Инк. | Связывающие il-17 белки |
US20100247484A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-09-30 | Heinrich Barchet | Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3 |
AU2010230346A1 (en) * | 2009-03-31 | 2011-07-28 | Roche Glycart Ag | Treatment of cancer with a humanized anti-EGFR IgG1antibody and irinotecan |
WO2010115553A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-14 | Roche Glycart Ag | Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies |
EP2427479B1 (en) | 2009-05-07 | 2018-11-21 | The Regents of The University of California | Antibodies and methods of use thereof |
WO2011015918A2 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Avesthagen Limited | Vectors and compounds for expression of recombinant cetuximab |
JP2013503607A (ja) | 2009-09-01 | 2013-02-04 | アボット・ラボラトリーズ | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
CA2776144C (en) | 2009-09-29 | 2020-10-27 | Fraunhofer Usa, Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods |
AR078651A1 (es) | 2009-10-15 | 2011-11-23 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
UY32979A (es) * | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
EP2494070A2 (en) | 2009-10-30 | 2012-09-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance |
WO2011097527A2 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Xencor, Inc. | Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions |
US20110189178A1 (en) * | 2010-02-04 | 2011-08-04 | Xencor, Inc. | Immunoprotection of Therapeutic Moieties Using Enhanced Fc Regions |
WO2011097633A2 (en) * | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Egf receptor mimicking peptides |
US20110200595A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-08-18 | Roche Glycart | TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR |
EP2542692B1 (en) | 2010-03-04 | 2016-08-24 | Carpén, Olli | Method for selecting patients for treatment with an egfr inhibitor |
PL2552415T3 (pl) | 2010-03-29 | 2017-03-31 | Abraxis Bioscience, Llc | Sposoby leczenia nowotworu |
CA2794708C (en) | 2010-03-29 | 2021-11-16 | Zymeworks Inc. | Antibodies with enhanced or suppressed effector function |
CN105147613A (zh) | 2010-03-29 | 2015-12-16 | 阿布拉科斯生物科学有限公司 | 增强药物递送和治疗剂有效性的方法 |
ES2635594T3 (es) | 2010-05-14 | 2017-10-04 | Abbvie Inc. | Proteínas de unión a IL-1 |
US8071093B1 (en) * | 2010-05-17 | 2011-12-06 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Fully human anti-epidermal growth factor receptor antibodies |
MY162903A (en) | 2010-06-04 | 2017-07-31 | Abraxis Bioscience Llc | Methods of treatment of pancreatic cancer |
WO2011156617A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-egfr antibodies |
WO2012006500A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
UY33492A (es) | 2010-07-09 | 2012-01-31 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
DK3029066T3 (da) | 2010-07-29 | 2019-05-20 | Xencor Inc | Antistoffer med modificerede isoelektriske punkter |
NZ607480A (en) | 2010-08-03 | 2014-10-31 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
WO2012024659A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Antibody-based constructs directed against tyrosine kinase receptors |
EP2608803A4 (en) | 2010-08-26 | 2014-01-15 | Abbvie Inc | IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF |
US8790649B2 (en) | 2010-10-29 | 2014-07-29 | Immunogen, Inc. | EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof |
US9238690B2 (en) | 2010-10-29 | 2016-01-19 | Immunogen, Inc. | Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof |
WO2012121775A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-09-13 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CA2827052C (en) | 2011-02-11 | 2022-08-16 | Merck Patent Gmbh | Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of prostate cancer |
WO2012143497A2 (de) | 2011-04-21 | 2012-10-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung |
GB201106870D0 (en) | 2011-04-26 | 2011-06-01 | Univ Belfast | Marker |
UA116189C2 (uk) | 2011-05-02 | 2018-02-26 | Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. | КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА |
US10040855B2 (en) | 2011-05-02 | 2018-08-07 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation for anti-α4β7 antibody |
CN103857699B (zh) | 2011-05-24 | 2016-08-31 | 泽恩格尼亚股份有限公司 | 多价和单价多特异性复合物及其用途 |
EP2537933A1 (en) | 2011-06-24 | 2012-12-26 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines |
US9464288B2 (en) | 2011-07-11 | 2016-10-11 | Yale University | Compositions and methods for making selenocysteine containing polypeptides |
WO2019071023A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Yale University | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING POLYPEPTIDES CONTAINING SELENOCYSTEINE |
EP2732269B1 (en) | 2011-07-12 | 2017-10-18 | Epitomics, Inc. | Facs-based method for obtaining an antibody sequence |
WO2013022855A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
CA2852099C (en) | 2011-10-10 | 2020-12-08 | City Of Hope | Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof |
CA3182462A1 (en) | 2011-10-10 | 2013-04-18 | Xencor, Inc. | A method for purifying antibodies |
US20140309229A1 (en) | 2011-10-13 | 2014-10-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors |
TW201323440A (zh) | 2011-10-24 | 2013-06-16 | Abbvie Inc | 抗骨硬化素(sclerostin)之免疫結合物 |
EA201700111A1 (ru) | 2011-10-28 | 2018-02-28 | Тева Фармасьютикал Австралия Пти Лтд | Полипептидные конструкции и их применение |
RU2014121820A (ru) | 2011-11-21 | 2015-12-27 | Иммьюноджен, Инк. | Способ лечения опухолей, устойчивых к анти-egfr терапиям, с помощью конъюгата антитела egfr с цитотоксическим средством |
EP2797955A2 (en) | 2011-12-30 | 2014-11-05 | AbbVie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17 |
EP2859017B1 (en) | 2012-06-08 | 2019-02-20 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
UY34905A (es) | 2012-07-12 | 2014-01-31 | Abbvie Inc | Proteínas de unión a il-1 |
SG11201501464TA (en) | 2012-08-31 | 2015-03-30 | Sutro Biopharma Inc | Modified amino acids comprising an azido group |
SG11201503412RA (en) | 2012-11-01 | 2015-05-28 | Abbvie Inc | Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
EP2914626A2 (en) | 2012-11-01 | 2015-09-09 | Abbvie Inc. | Stable dual variable domain immunoglobulin protein formulations |
CA2890190A1 (en) | 2012-11-12 | 2014-05-15 | Redwood Bioscience, Inc. | Compounds and methods for producing a conjugate |
WO2014078733A1 (en) | 2012-11-16 | 2014-05-22 | The Regents Of The University Of California | Pictet-spengler ligation for protein chemical modification |
US9310374B2 (en) | 2012-11-16 | 2016-04-12 | Redwood Bioscience, Inc. | Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate |
EA031184B1 (ru) | 2012-11-21 | 2018-11-30 | Янссен Байотек, Инк. | БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА |
WO2014095088A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Sykehuset Sørlandet Hf | Egfr targeted therapy of neurological disorders and pain |
EP2943511B1 (en) | 2013-01-14 | 2019-08-07 | Xencor, Inc. | Novel heterodimeric proteins |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US9738722B2 (en) | 2013-01-15 | 2017-08-22 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
US9302005B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-04-05 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for treating cancer |
EP2970494B1 (en) * | 2013-03-14 | 2017-12-13 | The Board of Regents of The University of Texas System | Her3 specific monoclonal antibodies for diagnostic and therapeutic use |
EP3424530A1 (en) | 2013-03-15 | 2019-01-09 | Zyngenia, Inc. | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
CA2906927C (en) | 2013-03-15 | 2021-07-13 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
MX2015013166A (es) | 2013-03-15 | 2015-12-11 | Abbvie Inc | Proteinas de union especificas duales dirigidas contra il-1 beta y/o il-17. |
CN105143257B (zh) | 2013-03-15 | 2020-10-27 | 艾伯维生物医疗股份有限公司 | Fc变体 |
US11401312B2 (en) | 2013-04-19 | 2022-08-02 | Cytune Pharma | Cytokine derived treatment with reduced vascular leak syndrome |
US11117975B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-09-14 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B |
CA2909952C (en) | 2013-04-29 | 2021-10-12 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. | Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b |
US9764039B2 (en) | 2013-07-10 | 2017-09-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
WO2015035044A2 (en) | 2013-09-04 | 2015-03-12 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Fc VARIANTS WITH IMPROVED ANTIBODY-DEPENDENT CELL-MEDIATED CYTOTOXICITY |
CA2922562A1 (en) | 2013-09-12 | 2015-03-19 | Halozyme, Inc. | Modified anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof |
US10259875B2 (en) | 2013-10-01 | 2019-04-16 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods for treating cancer in patients with elevated levels of BIM |
US9840493B2 (en) | 2013-10-11 | 2017-12-12 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
WO2015070972A1 (en) | 2013-11-12 | 2015-05-21 | Atlab Pharma | Human igg1 derived antibody with pro-apoptotic activity |
WO2015073721A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Zymeworks Inc. | Monovalent antigen binding constructs targeting egfr and/or her2 and uses thereof |
CA3178867A1 (en) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Redwood Bioscience, Inc. | Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate |
RU2698697C2 (ru) | 2013-12-23 | 2019-08-29 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | Конъюгаты связующего (ADC) с ингибиторами KSP |
EP2915569A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-09 | Cytune Pharma | IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method |
MX2016012578A (es) | 2014-03-28 | 2017-04-13 | Xencor Inc | Anticuerpos biespecificos que se unen a cd38 y cd3. |
UA119352C2 (uk) | 2014-05-01 | 2019-06-10 | Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд | Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину |
WO2015179654A1 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Distinguishing antagonistic and agonistic anti b7-h1 antibodies |
WO2015187428A1 (en) | 2014-06-06 | 2015-12-10 | Redwood Bioscience, Inc. | Anti-her2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof |
ES2779974T3 (es) | 2014-06-13 | 2020-08-21 | Tenboron Oy | Conjugados que comprenden un anticuerpo anti-egfr1 |
EP3171896A4 (en) | 2014-07-23 | 2018-03-21 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | Targeting dna-pkcs and b7-h1 to treat cancer |
KR20170055540A (ko) | 2014-09-17 | 2017-05-19 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 뼈 전이 질환 치료 방법, 그에 따른 약제, 및 뼈 전이 질환 치료의 임상 결과 예측 방법 |
KR20170052690A (ko) | 2014-09-17 | 2017-05-12 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 고형암 및/또는 이의 전이 치료 방법, 그에 따른 약제, 및 고형암 및/또는 이의 전이 치료의 임상 결과 예측 방법 |
EP4218810A3 (en) | 2014-10-02 | 2023-08-09 | City of Hope | Multivalent meditopes, meditope-binding antibodies and uses thereof |
EP3209769B1 (en) | 2014-10-24 | 2020-08-05 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance |
WO2016065409A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | INTERFERON α2B VARIANTS |
WO2016081455A1 (en) | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Pelican Therapeutics, Inc. | Human tnfrsf25 antibody |
LT3223845T (lt) | 2014-11-26 | 2021-08-25 | Xencor, Inc. | Heterodimeriniai antikūnai, kurie suriša cd3 ir cd20 |
EA037065B1 (ru) | 2014-11-26 | 2021-02-01 | Ксенкор, Инк. | Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
EP3237449A2 (en) | 2014-12-22 | 2017-11-01 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
US10227411B2 (en) | 2015-03-05 | 2019-03-12 | Xencor, Inc. | Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
SG11201710639YA (en) | 2015-06-22 | 2018-01-30 | Bayer Pharma AG | Antibody drug conjugates (adcs) and antibody prodrug conjugates (apdcs) with enzymatically cleavable groups |
WO2017060322A2 (en) | 2015-10-10 | 2017-04-13 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Ptefb-inhibitor-adc |
WO2017075045A2 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Antibodies to b7-h1 |
US20190209697A1 (en) | 2015-11-05 | 2019-07-11 | The Regents Of The University Of California | Cells labelled with lipid conjugates and methods of use thereof |
US20190144547A1 (en) | 2015-11-23 | 2019-05-16 | Merck Patent Gmbh | Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders |
KR20180085800A (ko) | 2015-12-07 | 2018-07-27 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체 |
GEP20217232B (en) | 2016-03-14 | 2021-03-25 | I Oslo Universitetet | Engineered immunoglobulins with altered fcrn binding |
WO2017161206A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Halozyme, Inc. | Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use |
SG11201808167VA (en) | 2016-03-24 | 2018-10-30 | Bayer Pharma AG | Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups |
JP6961625B2 (ja) | 2016-06-09 | 2021-11-10 | ペリカン セラピューティクス,インコーポレイテッド | 抗tnfrsf25抗体 |
AU2017285218A1 (en) | 2016-06-14 | 2018-12-06 | Xencor, Inc. | Bispecific checkpoint inhibitor antibodies |
EP3919518A1 (en) | 2016-06-15 | 2021-12-08 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies |
WO2017218698A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same |
EP4050032A1 (en) | 2016-06-28 | 2022-08-31 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2 |
EP3487522A4 (en) | 2016-07-19 | 2020-04-01 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | ANTI-CD47 COMBINATION THERAPY |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
SG11201903302UA (en) | 2016-10-14 | 2019-05-30 | Xencor Inc | Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments |
WO2018078143A1 (en) | 2016-10-28 | 2018-05-03 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Means and methods for determining efficacy of anti-egfr inhibitors in colorectal cancer (crc) therapy |
US11433140B2 (en) | 2016-12-21 | 2022-09-06 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Specific antibody drug conjugates (ADCs) having KSP inhibitors |
WO2018114798A1 (de) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen |
IL291308B1 (en) | 2016-12-21 | 2024-03-01 | Bayer Pharma AG | Drug-antibody conjugates with enzymatically cleavable groups |
EP3604340A4 (en) | 2017-03-24 | 2021-01-06 | Zenyaku Kogyo Co., Ltd | ANTI-IGM / B-CELL SURFACE ANTIGEN-BISPECIFIC ANTIBODY |
MA49517A (fr) | 2017-06-30 | 2020-05-06 | Xencor Inc | Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène |
CN112272563A (zh) | 2017-11-08 | 2021-01-26 | Xencor股份有限公司 | 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
MA51291A (fr) | 2017-12-19 | 2020-10-28 | Xencor Inc | Protéines de fusion il-2 fc modifiées |
CA3096052A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein |
JP2021520829A (ja) | 2018-04-18 | 2021-08-26 | ゼンコア インコーポレイテッド | IL−15/IL−15RA Fc融合タンパク質およびTIM−3抗原結合ドメインを含む、TIM−3標的化ヘテロ二量体融合タンパク質 |
CN112867734A (zh) | 2018-04-18 | 2021-05-28 | Xencor股份有限公司 | 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途 |
US20210186880A1 (en) | 2018-08-03 | 2021-06-24 | Brown University | Oral formulations with increased uptake |
CA3115096A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Xencor, Inc. | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
CN113329769A (zh) | 2018-10-11 | 2021-08-31 | 斯克里普斯研究学院 | 具有反应性精氨酸的抗体化合物及相关的抗体药物缀合物 |
JP2022512748A (ja) | 2018-10-19 | 2022-02-07 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 大腸癌の治療のためのアビツズマブ |
WO2020154475A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains |
US11472890B2 (en) | 2019-03-01 | 2022-10-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3 |
JP2022536490A (ja) | 2019-06-10 | 2022-08-17 | ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド | 5H-ピロロ[3,2-d]ピリミジン-2,4-ジアミノ化合物およびその抗体コンジュゲート |
CN114746420A (zh) | 2019-06-17 | 2022-07-12 | 苏特罗生物制药公司 | 用于癌症治疗和诊断的作为Toll样受体(TLR)7/8激动剂的1-(4-(氨基甲基)苄基)-2-丁基-2H-吡唑并[3,4-c]喹啉-4-胺衍生物及相关化合物以及其抗体药物偶联物 |
WO2021041300A2 (en) * | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Ab Therapeutics, Inc. | Bispecific antibodies and uses thereof |
EP4114852A1 (en) | 2020-03-03 | 2023-01-11 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
KR20220001106A (ko) * | 2020-06-29 | 2022-01-05 | (주)메디톡스 | 고농도 항-vegf 항체 제제 및 이에 사용하기 위한 항-vegf 항체 |
WO2022103983A2 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Fluorenylmethyloxycarbonyl and fluorenylmethylaminocarbonyl compounds, protein conjugates thereof, and methods for their use |
KR20230156079A (ko) | 2021-03-09 | 2023-11-13 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체 |
JP2024509274A (ja) | 2021-03-10 | 2024-02-29 | ゼンコア インコーポレイテッド | Cd3及びgpc3に結合するヘテロ二量体抗体 |
EP4356926A1 (en) | 2021-06-14 | 2024-04-24 | Centro de Inmunologia Molecular | Use of monoclonal antibodies against the epidermal growth factor receptor in the treatment of patients with acute hypoxaemic respiratory failure |
WO2023010060A2 (en) | 2021-07-27 | 2023-02-02 | Novab, Inc. | Engineered vlrb antibodies with immune effector functions |
WO2023164487A1 (en) | 2022-02-22 | 2023-08-31 | Brown University | Compositions and methods to achieve systemic uptake of particles following oral or mucosal administration |
WO2024006272A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-01-04 | Sutro Biopharma, Inc. | β-GLUCURONIDE LINKER-PAYLOADS, PROTEIN CONJUGATES THEREOF, AND METHODS THEREOF |
WO2024015229A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Sutro Biopharma, Inc. | Protease/enzyme cleavable linker-payloads and protein conjugates |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) * | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
DE68909441T2 (de) * | 1988-02-12 | 1994-02-10 | British Tech Group | Modifizierte Antikörper. |
IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
-
1992
- 1992-03-04 US US07/946,421 patent/US5558864A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 AT AT92905860T patent/ATE247168T1/de active
- 1992-03-04 DE DE69233153T patent/DE69233153T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 DK DK92905860T patent/DK0531472T3/da active
- 1992-03-04 CZ CZ963337A patent/CZ283717B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 ES ES92905860T patent/ES2204890T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 CA CA002082160A patent/CA2082160C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 SK SK3327-92A patent/SK281142B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 JP JP50595192A patent/JP3854306B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 HU HU9203484A patent/HU219537B/hu unknown
- 1992-03-04 EP EP03018303A patent/EP1362868A3/en not_active Ceased
- 1992-03-04 SK SK360-99A patent/SK281143B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 CZ CS923327A patent/CZ282603B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 EP EP92905860A patent/EP0531472B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-04 KR KR1019920702755A patent/KR100240308B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-03-04 WO PCT/EP1992/000480 patent/WO1992015683A1/en active IP Right Grant
- 1992-03-04 AU AU13403/92A patent/AU658396B2/en not_active Expired
- 1992-03-05 IE IE070592A patent/IE920705A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 ZA ZA921661A patent/ZA921661B/xx unknown
- 1992-03-05 PT PT100195A patent/PT100195B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 MX MX9201016A patent/MX9201016A/es unknown
- 1992-03-09 TW TW081101780A patent/TW222279B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2204890T3 (es) | 2004-05-01 |
PT100195B (pt) | 1999-09-30 |
AU658396B2 (en) | 1995-04-13 |
SK281142B6 (sk) | 2000-12-11 |
CA2082160C (en) | 2003-05-06 |
ZA921661B (en) | 1992-11-25 |
DE69233153D1 (de) | 2003-09-18 |
HU219537B (hu) | 2001-05-28 |
TW222279B (cs) | 1994-04-11 |
CZ282603B6 (cs) | 1997-08-13 |
EP0531472A1 (en) | 1993-03-17 |
SK332792A3 (en) | 1996-07-03 |
EP1362868A2 (en) | 2003-11-19 |
CA2082160A1 (en) | 1992-09-07 |
JP3854306B2 (ja) | 2006-12-06 |
MX9201016A (es) | 1993-08-01 |
AU1340392A (en) | 1992-10-06 |
HUT65687A (en) | 1994-07-28 |
WO1992015683A1 (en) | 1992-09-17 |
EP0531472B1 (en) | 2003-08-13 |
US5558864A (en) | 1996-09-24 |
EP1362868A3 (en) | 2004-02-11 |
JPH05506157A (ja) | 1993-09-16 |
CZ333796A3 (cs) | 1998-06-17 |
SK281143B6 (sk) | 2000-12-11 |
PT100195A (pt) | 1993-05-31 |
KR100240308B1 (ko) | 2000-01-15 |
HU9203484D0 (en) | 1993-01-28 |
DE69233153T2 (de) | 2004-05-27 |
CZ332792A3 (en) | 1994-02-16 |
IE920705A1 (en) | 1992-09-09 |
DK0531472T3 (da) | 2003-12-01 |
ATE247168T1 (de) | 2003-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ283717B6 (cs) | Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek | |
IE83807B1 (en) | Humanized monoclonal antibodies | |
Kettleborough et al. | Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR–grafting: the importance of framework residues on loop conformation | |
JP4421779B2 (ja) | 改善された生産性を有するFAPα−特異的抗体 | |
US6410690B1 (en) | Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies | |
CA2163151C (en) | Humanized and chimeric monoclonal antibodies that recognized epidermal growth factor receptor (egf-r). use diagnostic and therapeutic | |
ES2262186T5 (es) | Inmunoglobulina humanizada reactiva con integrina alpha4beta7 | |
FI117509B (fi) | Humanisoituja vasta-aineita leukosyyttitarttumismolekyyliä VLA-4 vastaan | |
TWI338009B (en) | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof | |
JPH09512705A (ja) | E−セレクチンに対する抗体 | |
KR20010043470A (ko) | Cd23에 대한 항체, 이의 유도체 및 이들의 치료적 용도 | |
JPH08511421A (ja) | 人化抗体 | |
GB2216126A (en) | Antibodies to Campath-1 | |
KR100693260B1 (ko) | 항혈전제 및 인간화 항-폰빌레브란트 인자 모노클로날 항체 | |
Hoogenboom et al. | Cloning and expression of a chimeric antibody directed against the human transferrin receptor. | |
US20020150574A1 (en) | Antibodies against SEMP1 (p23) | |
CA3067597C (en) | Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases | |
MXPA99001462A (es) | Inmunoglobulina humanizada reactiva con (alfa4beta7) integrina | |
JPH09183799A (ja) | ヒト化モノクローナル抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120304 |