KR880001757B1 - 알파 인터페론 정제에 효과가 있는 단일항체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

알파 인터페론 정제에 효과가 있는 단일항체의 제조방법

제1도는 정제된 단일항체의 순도를 나타내는 것이며,

제2도는 정제된 단일항체를 이용하여 인터페론을 정제한 예를 나타내는 것이다.

본 발명은 림프아세포 혹은 박테리아로부터 알파인터페론을 정제함에 있어서 탁월한 효과를 나타내는 단일항체의 제조에 관한 것이다.

단일항체를 이용하여 정제된 알파인터페론은 생물학적 및 면역학적 성질을 그 특징으로하고 있음이 밝혀진바 있다.

일반적으로 인터페론의 생물학적 효과로는 바이러스의 생장억제, 세포생장억제 또는 분화된 세포기능의 촉진 내지는 억제등을 열거할 수 있으며, 면역학적 효과로서는 B cell의 항체생산능력억제, 마이토젠(Mitogen)이나 항원에 의하여 유발되는 림파구 분화억제, 연기형과민반응촉진 및 NK세포(Natural Killer), T Cell, Macrophage 혹은 항체에 의한 세포독성(Cytotoxicity)을 유발시키는 것등을 들수 있다.

이러한 결과들은 인터페론의 의학적인 면에서 매우 중요한 것임을 나타내는 것으로써 앞으로 암치료 및 바이러스성질활등의 치료제로 널리 사용될 수 있는 가능성을 시사하고 있는 것으로 현재 제약계에서는 인터페론의 고순도정제 및 대량생산이 커다란 문제로 대두되고 있는 실정이다.

일반적으로 인터페론의 정제에는 수지흡착 혹은 겔(Gell)분획 등의 방법이 사용되어 왔으나, 분자량이나 등전점등이 유사한 이종단백질의 혼입을 제거할 수 없어 치료제로서의 인터페론 사용을 어렵게 하여 왔다.

그러나, 최근에는 인터페론에만 특이적으로 반응하는 단일성질의 항체 즉, 단일클론항체를 생산하는데 성공하므로써 항원 항체 반응에 의한 흡착 및 용리를 통하여 고순도의 인터페론을 생산할 수 있게 되었다.

단일항체의 생산에는 여러가지 방법등이 있으나, 공지의 방법중 일례를 들면, 인터페론으로 면역된 Balb/c 생쥐의 비장세포와 8-아조구아닌(8-AZO Guanine) 내성을 갖고있는 형질세포종(NS-O)를 혼합한 후, 50% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용약을 부가하여 세포융합반응을 시키고, 융합 후 세포들을 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine)와 20% 소태아혈청이 첨가된 배양액에서 키워 약2주 경과후에 잡종세포의 성장여부를 검토한 다음, 항원에 대한 단일 항체의 생산여부를 일라이자(ELISA)방법에 의하여 측정하는 것이다.

또한, 단일항체를 생산하는 클론들은 서브크로닝(Subcloning) 과정을 거쳐 유일한 단일항체를 만들어내는 단일잡종세포로부터 성장한 단일클론들만을 선별한다.

상술한 바와 같은 종래의 방법은 표1에서와 같이 융합빈도가 낮아 극히 소량의 단일합체를 분비하는 클론들이 얻어지며 이로부터 정제된 항체들이라도 항원 항체간의 다양한 결합력의 차이를 나타내므로 선별된 항체가 컬럼물질에 흡착된 후, 안정성에 차이를 보여 단일항체에 의한 인터페론의 공업적 생산을 어렵게 하였다. 따라서 본 발명에서는 이와 같은 종래의 문제점들을 해결하기 위하여, 1) 세포융합반응시 조건을 변화시켰으며, 2) 혈청에 대한 클론 생성도를 시험하여 가장 우수한 효과를 나타내는 혈청만을 사용하였고, 3) 서브크로닝의 방법 및 4) 항체 정제의 방법을 개량하였다.

이들 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

가. 세포 융합반응시의 조건 :

공지의 방법에서는 폴리에틸렌글리콜을 50%로 사용하고 pH를 7.2-7.8로 유지하였으나, 본 발명에서는 pH를 9로 유지하며 50% PEG이외에도 20%의 DMSO를 첨가한다.

나. 잡종세포의 배양액에 사용된 혈청 :

통상적으로는 열을 가하여 불활성화시킨(56℃, 30분) 소태아혈청을 20% 사용하나, 본 발명에서는 여러 혈청들의 클론생성도를 시험한 후, 가장 좋은 효과를 나타내는 혈청들을 배합사용한다.

조성은 열처리하지 않은 소태아혈청 10%, 송아지혈청 5%, 말혈청 5%를 혼합하여 배양액으로 사용한다. 소태아혈청은 가격이 매우 고가이므로 본 발명에서는 다른 혈청들을 혼합사용하므로써, 인터페론 생산시 비용을 경감시킬 수 있는 잇점이 있다.

다. 서브크로닝 과정중 개량사항 :

단일항체생산을 검토하기 위한 제 1 차 검색과정으로는 특이항체를 만들어내는 클론들을 이들이 자라는 Microwell로부터 가능한 신속하게 단세포를 하나의 Microwell에서 자랄 수 있도록 서브크로닝 과정으로 들어가 다른 세포의 과잉성장에 의해 항체 생산세포의 선별기회를 놓치치 않도록 하여야 한다.

이를 위해 통상적으로 제한희석(limiting-dilution)방법이나 아가로스크로닝(Agarose Cloning)방법을 사용한다.

융합한지 얼마안되는 잡종세포는 강한밀도 의존성 생장현상을 나타내므로 공지된 방법에서는 Spleen Cell이나 Peritoneal Cell을 공급세포(feeder cell)로써 5×10⁴-1×10⁵/ml를 첨가해 주는 것이 보통이나, 본 발명에서는 소프트-아가로스(soft-agarose) 방법을 사용하였고 배양액으로는 잡종세포가 자란시기의 배양액(Conditioned media)을 채취하여 사용한다.

본 발명에 의한 조건을 사용한 결과 표1에서와 같이 통상의 방법보다 2배이상의 융합빈도를 나타내어 1000개 이사의 제 1 차 잡종세포를 얻었으며, 이로부터 30여개의 알파인터페론에 대한 단일 항체를 생산하는 클로들을 얻었다. 다음 서브크로닝과정에 들어가서도 이들 제 1 차 잡종세포들은 높은 제 2 차 잡종세포형성 빈도를 나타냄이 관측되었고, 이들중에서 무작위로 20개씩 골라 다시 알파인터페론에 대한 특이항체생산여부를 판별하였다.

라. 항체정제방법증 개량사항 :

본 발명에서는 제 2 차 잡종세포클론들 중 단일항체를 안정성있고 높은 역가로 생산하는 클론들만을 선별하고 이들중 다시 IgG 2a 나 IgG 2b형을 생산하는 클론들만을 선택하여 다음 항체정제과정에 들어간다.

이는 상술한 형들이 Protein A에 대한 흡착도가 높아 항체정제를 용이하게하는 잇점이 있기 때문이다.

또한, 많은 항체가 포함된 원액을 손쉽고 저렴하게 얻기 이하여 단일클론세포들을 Balb/C 생쥐복강에 주사하였다.

이로부터 얻어진 생쥐복강액의 항체함량은 표2에서 알수 있는 바와 같이 이미 공지된 복강액의 항체함량과 비교하여 볼때 우수한 결과를 나타냄이 밝혀졌다.

생쥐복강액으로부터의 항체정제를 위하여는 생쥐복강액을 트리스(Tris) 완충용액(pH 8.0)으로 3배이상 해석한 다음 Protein A-Sepharose CL-4B컬럼(Pharmacia사)에 통과시켰다.

항원 항체 특이반응을 제외한 비특이성 흡착단백질을 제거하기 위하여 0.5M NaCl이 포함된 트리스완충용액으로 컬럼을 세척한 다음, 흡착된 항체는 아세트산으로 용리하였다.

공지의 방법에서는 다음 단계로 1M 아세트산으로 직접 용리하나, 본 발명에서는 강산이 항체의 활성을 저해하는 것을 방지하기 위해 가능한한 약산(0.2M 아세트산)으로 용리하였다.

첨부된 제 1 도에서와 같이 본 발명의 과정을 거쳐 추출된 항체는 95% 이상의 순도와 회수율을 보였으며, ELISA결과에 의하면 월등한 항체 항원간의 결합력을 나타내었다.

ELISA 결과후 얻은 항체들의 역가는 표1에 나타난 수치와 같다.

[표 1]

공지의 방법과 본 발명에 의해 조작된 단일클론들의 비교

* 안정성은 항체가 컬럼물질에 부착된 정도와 항원-항체간 결합력의 안정도를 의미한다.

실시예 : 단일항체클론생산 및 항체의 정제 Balb/C 알파인터페론으로 Balb/C생쥐들을 제 1 차 면역시킨 다음, 한달후 제 2 차 면역을 시행하고 3일후 생쥐로부터 비장세포를 약 10³가량취하여 20%의 소태아혈청을 포함하지 않은 배양액(DMEM)으로 세척하고 동시에 8-아조구아닌(8-Azoguanine) 내성을 나타내는 형질세포종(NS-O)을 약 3.8×10⁷정도 채취, 동일 배양액으로 세척하였다. 이들 2종의 세포를 혼합한 다음, 50% PEG용약(pH9.0) 0.5ml로 30초동안 처리한후, 이어서 50% PEG와 20% DMSO의 혼합용액 0.5ml로 30초 처리하여 세포융합반응을 실시하였다. 다음 원심분리에 의하여 수거된 세포들을 일정량의 HAT가 첨가된 배양액에 혼합하고 96-Well 배양플레이트에 Welle당 2.5×10⁴개의 형질세포종을 첨가하였다.

이때 배양액은 DMEM을 사용하였으며 10%의 소태아혈청, 5%의 송아지혈청과 5%의 말혈청을 첨가하였다.

본 발명에서의 잡종세포는 알파인터페론에 대한 특이항체를 만들어내는 세포이므로 세포융합반응후 2주일째부터 각 Well내의 배양액에서 알파인터페론에 대한 특이항체의 존재 여부를 검색하였고, 이를 위한 검색방법으로는 극소량의 항체를 검출할수 있는 공지의 ELISA방법을 사용하였다.

표1에 기재된 바와 같이 1000개 이상의 잡종세포를 얻었으며, 이로부터 30여개의 알파인터페론에 대한 단일항체를 높은 역가로 생산하는 클론들을 얻었다.

이와 같이 얻어진 제 1 차 클론들은 여러 잡세포들의 혼합이므로 클론들이 자라는 Microwell로부터 가능한 신속히 단세포를 하나의 Well에서 자랄 수 있도록 제 1 차 서브클로닝 과정으로 들어가서 다른 세포의 과잉성장에 의한 항체생산 잡종세포들의 선별기회를 놓치지 않도록 유의하였다.

본 발명에서는 서브크로닝의 방법으로 소프트-아가로스(soft-agarose)방법을 사용하였다. 0.8%의 아가로스를 HAR가 포함된 잡종세포가 자랄때 쓰던 배양액에 녹이고 제 1 차 클론들을 첨가하고 다시 2주일간 배양하였다.

그 결과 높은 제 2 차 잡종세포형성빈도를 나타냄이 관측되었으며(90%이상), 이들 제 2 차 잡종세포들중 20개씩을 무작위로 선정하여 ELISA방법에 의하여 알파인터페론에 대한 특이항체 생산여부를 확인하였다.

상기 과정을 거쳐 형성된 단일클론을 만들어내는 제 2 차 잡종 세포들이 장기간에 걸친 분열끝에 단일항체 생산능력을 소실하는 예가 있으므로 이들 세포들을 다시 제 2 차 서브크로닝과정 및 ELISA방법을 통하여 선별하였다.

그 결과 약 20%의 제 3 차 잡종세포들이 항체생산능력을 상실하는 것이 관측되었고, 나머지 단일클론들은 6개월이상 높은 역가로 항체분리를 자극하였으며, 이들중 IgG2a 나 IgG2b형을 분비하는 클론들을 선별, Balb/C 생쥐복강에 5×10⁶정도 주입시키고 약 1주일후 복강액의 형성을 관측하였으며, 형성된 복강액을 이후 매일 2-3ml씩 약 1주일간 채취하였다. 채취된 복강액은 다시 ELISA방법에 의하여 역가를 측정하였으며, 이들중 10⁵역가 이상을 나타내는 복강액을 혼합하고 다음에 Protein A-Sepharose CL-4B컬럼에 의한 항체정제과정에 들어갔다.

[표 2]

제 1 차 서브크로닝과정후 선별된 클론의 특성

한편, 표2에 기재된 크론들의 명칭은 본 발명자등이 임의로 명명한 것으로 즉, Eugene 41은 IgG2a형에 속하는 클론으로 선별작업중 제548군에 포함된 클론에서 46번째로 선별된 것이고, Eugene 46은 IgG2a형에 속하는 클론으로 제548군중에서 46번째로, Eugene 22은 IgG2b형에 속하는 클론으로 제432군중에서 22번째로 선별된 것이며, Eugene 12은 IgG2b형에 속하는 클론으로 제625군중에서 12번째로, Eugene 59은 IgG2b형에 속하는 클론으로 제460군중에서 59번째로 선별된 클론들을 의미하는 것이다.

표2에서와 같이 0.2M아세트산에 의한 용리액은 많은 량의 항체를 포함하는 것으로 관측되었으며, 제1도와 같이 95%이상의 순도를 나타내는 것이었다.

이렇게 얻어진 항체를 이용 단일항체클론을 얻었으며 단일항체를 이용하여 정제된 인터페론은 95%이상의 순도와 회수율을 나타냄을 보였다.(제2도 참조)

그러므로 본 발명은 단일항체를 이용하여 정제된 알파인터페론의 임상실험화할 수 있는 가능성을 시사하고 있으며, 표2와 같은 단일항체들은 인터페론의 대량생산 및 상품화를 위한 공업적인 사용을 가능케할 것이다.

Claims (1)

1. 알파인터페론에 특이적으로 반응하는 단일항체의 제조방법에 있어서, 세포융합시 PEG의 pH를 9.0DMSO농도를 15-20%로하고 융합세포를 배양하는 배양액에 열처리를 하지 않은 소혈청, 송아지혈청 및 말혈청을 혼합사용하여 선별한 단일클론으로부터 단일항체를 생산함을 특징으로 하는 알파인터페론정제에 효과가 있는 단일항체의 제조방법.

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