JP2012095604A - 組換え枯草菌 - Google Patents
組換え枯草菌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012095604A JP2012095604A JP2010246270A JP2010246270A JP2012095604A JP 2012095604 A JP2012095604 A JP 2012095604A JP 2010246270 A JP2010246270 A JP 2010246270A JP 2010246270 A JP2010246270 A JP 2010246270A JP 2012095604 A JP2012095604 A JP 2012095604A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- bacillus subtilis
- gene
- base sequence
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失した枯草菌変異株の、malA遺伝子を削除又は不活性化させ、更に異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製した組換え枯草菌。
【選択図】なし
Description
(1) prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株に、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製される組換え枯草菌であって、malA遺伝子が削除又は不活性化された組換え枯草菌。
(2) 前記枯草菌変異株が、更に以下の領域のうちの1つ又は2つ以上が欠失したゲノム構造を有する、上記(1)記載の組換え枯草菌:
ybbU−ybfI領域、ydjM−cotA領域、yefA−yesX領域、yfiB−yfiX領域、yhcE−yhcU領域、yhaU−yhaL領域、yjbX−yjlB領域、xkdA−ykcC領域、bpr−ylmA領域、flgB−cheD領域、ynfF−ppsA領域、yoxC−yobO領域、spoVAF−spoIIAA領域、spoIIIAH−yqhV領域、ytvB−ytqB領域、yteA−ytaB領域、yuaJ−yugO領域、yusJ−mrgA領域、gerAA−yvrI領域、yvaM−yvbK領域、araE−yveK領域、yvdE−yvcP領域、gerBA−ywsC領域、ywrK−ywqM領域、spoIIID−ywoB領域、slp−ylaF領域、licH−sigY領域、yqeF−yrhK領域、yuzE−yukJ領域及びyncM−yndN領域。
(3) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域が作動可能に連結されている、上記(1)又は(2)に記載の組換え枯草菌。
(4) 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が作動可能に連結されている、上記(1)から(3)のいずれか1つに記載の組換え枯草菌。
(5) 前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、上記(3)又は(4)記載の組換え枯草菌。
(6) 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である、上記(4)記載の組換え枯草菌。
(7) 前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、上記(1)から(6)のいずれか1つに記載の組換え枯草菌。
(8) 前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるDNA断片である、上記(7)記載の組換え枯草菌。
(9) 上記(1)から(8)のいずれか1つに記載の組換え枯草菌を用いる異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
malA遺伝子(配列番号1)はmalA−glvR−malPオペロンの先頭に位置する遺伝子であり、本遺伝子を欠失する際には、malAの下流遺伝子であるglvR及びmalPの発現に影響を与えない形で欠失株の構築を行わなければならない。そこで、本発明においては、malAの構造遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子のORF(open reading frame)と置換する方法により、malA遺伝子欠失株を構築した。枯草菌MGB874株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表3に示したmalAFW1とmalA/neof2.R、及びmalA/neor2.FとmalA RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のmalA遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片(A)、及び下流に隣接する1.0kbp断片(B)をそれぞれ調製した。また、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpUB110(Plasmid 15:93−103.(1986))を鋳型として、表3に示したneof2及びneor2のプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子(C)を調製した。次に、得られた(A)、(B)及び(C)の3断片を混合して鋳型とし、malA FW2とmalA RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、3断片を(A)−(C)−(B)の順になるように結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た(図1参照)。このDNA断片を用いて、上述したコンピテントセル法により、枯草菌168株及びMGB874株を形質転換し、ネオマイシン(10mg/L)及びマルトース(1g/L)を含むLB寒天培地上で生育したコロニーを形質転換体として単離した。マルトース存在下でmalA−glvR−malPオペロンの発現が誘導されるため(J.bacteriol.,183,17,5110,(2001))、形質転換体ではネオマイシン耐性遺伝子が発現し、ネオマイシンを含むLB寒天培地上でも生育可能となる。
実施例1にて得られた168ΔmalA株、874ΔmalA株及び対照として、親株である枯草菌168株、MGB874株に、アルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌 KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のS237セルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報参照)(配列番号3)をコードするDNA断片(3.1kb;配列番号3の塩基番号13〜3124)を鋳型として、表4に示されるプライマーEgl−S237.F及びプライマーEgl−S237.Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY−S237を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
Claims (9)
- prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株に、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製される組換え枯草菌であって、malA遺伝子が削除又は不活性化された組換え枯草菌。
- 前記枯草菌変異株が、更に以下の領域のうちの1つ又は2つ以上が欠失したゲノム構造を有する、請求項1記載の組換え枯草菌:
ybbU−ybfI領域、ydjM−cotA領域、yefA−yesX領域、yfiB−yfiX領域、yhcE−yhcU領域、yhaU−yhaL領域、yjbX−yjlB領域、xkdA−ykcC領域、bpr−ylmA領域、flgB−cheD領域、ynfF−ppsA領域、yoxC−yobO領域、spoVAF−spoIIAA領域、spoIIIAH−yqhV領域、ytvB−ytqB領域、yteA−ytaB領域、yuaJ−yugO領域、yusJ−mrgA領域、gerAA−yvrI領域、yvaM−yvbK領域、araE−yveK領域、yvdE−yvcP領域、gerBA−ywsC領域、ywrK−ywqM領域、spoIIID−ywoB領域、slp−ylaF領域、licH−sigY領域、yqeF−yrhK領域、yuzE−yukJ領域及びyncM−yndN領域。 - 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる1以上の領域が作動可能に連結されている、請求項1又は2記載の組換え枯草菌。
- 異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が作動可能に連結されている、請求項1から3のいずれか1項記載の組換え枯草菌。
- 前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域由来のものである、請求項3又は4記載の組換え枯草菌。
- 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である、請求項5記載の組換え枯草菌。
- 前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、請求項1から6のいずれか1項記載の組換え枯草菌。
- 前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と70%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるDNA断片である、請求項7記載の組換え枯草菌。
- 請求項1から8のいずれか1項記載の組換え枯草菌を用いる異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010246270A JP5829802B2 (ja) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 組換え枯草菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010246270A JP5829802B2 (ja) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 組換え枯草菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012095604A true JP2012095604A (ja) | 2012-05-24 |
JP5829802B2 JP5829802B2 (ja) | 2015-12-09 |
Family
ID=46388307
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010246270A Active JP5829802B2 (ja) | 2010-11-02 | 2010-11-02 | 組換え枯草菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5829802B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012135214A (ja) * | 2010-12-24 | 2012-07-19 | Kao Corp | 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005151983A (ja) * | 2003-11-07 | 2005-06-16 | Kao Corp | 組換え微生物 |
JP2007130013A (ja) * | 2005-10-13 | 2007-05-31 | Kao Corp | 新規枯草菌変異株 |
JP2009171886A (ja) * | 2008-01-23 | 2009-08-06 | Kao Corp | 新規枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法 |
-
2010
- 2010-11-02 JP JP2010246270A patent/JP5829802B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005151983A (ja) * | 2003-11-07 | 2005-06-16 | Kao Corp | 組換え微生物 |
JP2007130013A (ja) * | 2005-10-13 | 2007-05-31 | Kao Corp | 新規枯草菌変異株 |
JP2009171886A (ja) * | 2008-01-23 | 2009-08-06 | Kao Corp | 新規枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6015000200; Yamamoto H. et al.: Journal of Bacteriology Vol.183, No.17, 2001, pp.5110-5121 * |
JPN6015000202; Hatfield D. et al.: Journal of Bacteriology Vol.98, No.2, 1969, pp.559-567 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012135214A (ja) * | 2010-12-24 | 2012-07-19 | Kao Corp | 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5829802B2 (ja) | 2015-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006296268A (ja) | 組換え微生物 | |
JP5753419B2 (ja) | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 | |
JP5294666B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4915728B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5513759B2 (ja) | タンパク質又はポリペプチドの生産方法 | |
JP5735775B2 (ja) | 改変プロモーター | |
JP4832153B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4509743B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5881352B2 (ja) | σD因子抑制解除株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 | |
JP5829802B2 (ja) | 組換え枯草菌 | |
JP2006345860A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
EP1680502B1 (en) | Recombinant microorganism | |
JP5739113B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5841749B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5361428B2 (ja) | 枯草菌変異株 | |
JP4676848B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4676847B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4643999B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2009038985A (ja) | 微生物及びこれを用いたタンパク質又ポリペプチドの製造方法 | |
JP5474448B2 (ja) | 変異バチルス属細菌 | |
JP5739114B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP5828634B2 (ja) | 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 | |
JP6085190B2 (ja) | 変異微生物及びそれを用いた有用物質の生産方法 | |
JP5732209B2 (ja) | 遺伝子発現方法 | |
JP2013009688A (ja) | 組換え微生物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130918 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150311 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150728 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150916 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20150928 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151020 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151023 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5829802 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |