CN113061164A - 环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用，属于环脂肽类药物技术领域。本发明环脂肽类化合物，结构式为式Ⅰ所示。本发明结合类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发病原因和环脂肽的抗炎潜能，设计合成了几种新型环脂肽结构化合物，并考察证实了它们的抗RA活性，表明其具有优良的抗RA活性，为RA的治疗提供了更新更广的选择，也为环脂肽类抗RA药物的研发提供了一个新的发展方向，应用前景广泛。

Description

环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用，属于环脂肽类药物技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性关节损伤、功能性障碍和滑膜增生为主要特征的系统性自身免疫性疾病。一般认为，RA由诸多因素引起，包括遗传、免疫调节失衡、环境、感染、内分泌紊乱等。目前，抗RA药物主要包括抗风湿药物、非甾体药物、甾体药物与生物制剂。但是，这些药物只能缓解RA患者的临床症状或病理进展，有时也会伴有副作用。因此，仍需开发具有优异药理活性和高安全性的新型抗RA药物。

环脂肽(cyclic lipopeptides)是一类由脂肪酸和肽片段通过酯键或酰胺键形成的具有两亲性质的环状结构化合物，主要来源于海洋蓝细菌、细菌及放线菌等微生物的次级代谢产物，如达托霉素(daptomycin，dap)、多粘菌素(polymyxins)、表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)等。环脂肽类化合物不仅可以作为生物表面活性剂，还具有抗菌、抗病毒抗肿瘤等活性。

发明人前期研究发现，dap能够治疗RA。药品注射用达托霉素是无菌冻干粉末，2～8℃储存，主成分为dap，还有其他辅料，使用前溶解。但是，随着储存和运输成本的增加或者对部分患者疗效低等情况的出现，依旧需要更多的药理活性优异、高安全性、高稳定性的新型抗RA药物。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种新型结构的环脂肽类化合物，该环脂肽类化合物能用于制备抗RA药物中。

本发明环脂肽类化合物，结构式为式Ⅰ所示：

其中，R为六元氮杂环。

在本发明的一个实施方式中，R为

本发明还提供本发明所述的环脂肽类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。

本发明环脂肽类化合物，细胞毒性低，抗炎活性好，能够用于RA的治疗。

在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射给药剂型、透皮给药剂型或口服给药剂型。

本发明还提供一种抗类风湿关节炎药物。

本发明抗类风湿关节炎药物，其活性成分包括本发明所述的环脂肽类化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明结合RA的发病原因和环脂肽的抗炎潜能，设计合成了几种新型环脂肽结构化合物，并考察证实了它们的抗RA活性，发现其具有优良的抗RA活性，为RA的治疗提供了更新更广的选择，也为环脂肽类抗RA药物的研发提供了一个新的发展方向，应用前景广泛。

与现有的dap相比，本发明化合物的稳定性更高，尤其是其水溶液在-20℃储存时，具有很好的稳定性，保存时间得以延长，为液体制剂的研究奠定了基础。

附图说明

图1为不同浓度环脂肽类化合物处理RAW264.7后的存活率。

图2为不同浓度环脂肽类化合物处理RAW264.7后各炎症因子转录水平变化。

图3为10μg/mL环脂肽类化合物处理RAW264.7后各炎症因子浓度。

图4为10μg/mL环脂肽类化合物处理RAW264.7后各炎症因子转录水平。

图5为10μg/mL环脂肽类化合物处理CIA小鼠后的炎症评分及体重。

图6为环脂肽类化合物在不同温度时的稳定性。

具体实施方式

本发明环脂肽类化合物，结构式为式Ⅰ所示：

其中，R为六元氮杂环。

本发明环脂肽类化合物，其结构为N-[Decanoyl-Trp¹-D-Asn²-Asp³]-Cyclo[Thr⁴-Gly⁵-(N-containing heterocyclic)Orn⁶-Asp⁷-D-Ala⁸-Asp⁹-Gly¹⁰-D-Ser¹¹-(3-Me)Glu¹²-Kyn¹³]。该环脂肽类化合物具有优良的抗RA活性，为RA的治疗提供了更新更广的选择。且该化合物的水溶液在-20℃储存时，稳定性较好，保存时间得以延长，为液体制剂的研究奠定了基础。

在本发明的一个实施方式中，R为

本发明环脂肽类化合物，可以采用本领域常规合成方法进行制备。在本发明的一个实施方式中，采用如下方法进行制备：将含氮杂环类羧酸与三乙胺溶于四氢呋喃中，在0℃及惰性气体保护下向滴加氯甲酸异丁酯，搅拌反应后得到中间产物，再加等体积四氢呋喃混合后，在0℃及惰性气体保护下滴加到环脂肽底物的碳酸氢钠水溶液中，室温搅拌反应后，将粗产物经制备型HPLC纯化，即得纯品。

本发明还提供本发明所述的环脂肽类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。

本发明环脂肽类化合物，细胞毒性低，抗炎活性好，能够用于RA的治疗。在治疗RA时，可以采用单独给药或者与其他药物联合使用，可以通过单独、同时或序贯给药实现这种联合使用。

在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射给药剂型、透皮给药剂型或口服给药剂型。

本发明还提供一种抗类风湿关节炎药物。

本发明抗类风湿关节炎药物，其活性成分包括本发明所述的环脂肽类化合物。

本发明抗类风湿关节炎药物，可以由活性成分和常用的辅料组成，所述辅料为药学上可接受的辅料，比如，赋形剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂等。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中所用实验材料来源为：

小鼠巨噬细胞RAW264.7：源自ATCC，保存于四川大学生物治疗国家重点实验室。

细胞培养基、胎牛血清、胰酶：购自Hyclone公司。

青霉素-链霉素双抗：购自碧云天生物技术有限公司。

脂多糖：购自Sigma-Aldrich公司。

细胞RNA提取试剂盒：购自成都福际生物技术有限公司。

逆转录试剂盒：购自南京诺维赞生物科技有限公司。

qPCR荧光定量试剂盒：购自Bio-Rad公司。

鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1ELISA检测试剂盒：购自R&D公司。

牛II型胶原、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂：购自Chondrex公司。

DBA/1小鼠：购自北京华阜康生物科技有限公司。

实施例1环脂肽类化合物的制备

按照以下工艺流程合成环脂肽类化合物：

d1：

d2：

d3：

d4：

d5：

将66mg各杂环类羧酸与65mg三乙胺(TEA，0.64mmol)溶解于10mL四氢呋喃(THF)中，在0℃及氩气保护下向其中滴加80mg氯甲酸异丁酯(isobutyl carbonochloridate，0.59mmol)，保持温度并搅拌0.5h，得到中间产物1。将400mg脂肽底物(Substrate，0.25mmol)和114mg碳酸氢钠(NaHCO₃，1.36mmol)溶于10mL水中，将中间产物1与等体积四氢呋喃混合，在0℃及氩气保护下向含DAP的溶液中滴加10mL中间产物1的四氢呋喃溶液，室温(rt)搅拌3h后，粗产物经制备型HPLC纯化，得纯品d1-d5。

环脂肽d1：淡黄色粉末，得率：22.4％。¹³C NMR(DMSO-d₆):164.8(C＝O),151.7(C-2’),151.2,148.4(C-6’),136.0,134.9(C-4’),134.3,131.1,130.0(C-3’),127.2,123.7,123.4(C-5’),120.8,118.4,118.1,116.9,116.1,114.3,111.2,109.9.¹H NMR(DMSO-d₆):8.99(s,H-2’),8.68(d,J＝4.4Hz,H-6’),8.17(d,J＝3.6Hz,H-4’),7.48(m,H-5’).HRMS m/z:1725.7474[M+H]⁺.

环脂肽d2：淡黄色粉末，得率：32.8％。¹³C NMR(DMSO-d₆):163.8(C＝O),151.1,150.0(C-2’),148.3(C-6’),137.7(C-4’),136.0,134.2,131.1,127.3,126.4(C-5’),123.6,121.8(C-3’),120.7,118.4,118.1,116.9,116.0,114.2,111.2,110.0.¹H NMR(DMSO-d₆):8.79(m,H-6’),8.63(d,J＝4.0Hz,H-3’),8.41(m,H-4’),8.18(m,H-5’).HRMSm/z:1725.7394[M+H]⁺.

环脂肽d3：淡黄色粉末，得率：19.1％。¹³C NMR(DMSO-d₆):164.6(C＝O),151.1,150.1(C-2’,6’),141.5(C-4’),136.0,134.2,131.1,127.3,123.6,121.2(C-3’,5’),120.7,118.4,118.1,116.9,116.1,114.3,111.2,110.0.¹H NMR(DMSO-d₆):8.71(d,J＝5.6Hz,H-2’,6’),7.75(d,J＝5.6Hz,H-3’,5’).HRMS m/z:1725.7352[M+H]⁺.

环脂肽d4：淡黄色粉末，得率：18.6％。¹³C NMR(DMSO-d₆):162.8(C＝O),151.2,147.4(C-6’),144.8(C-2’),143.5(C-3’),143.3(C-5’),136.0,134.2,131.1,127.6,123.6,120.7,118.4,118.1,116.9,116.1,114.4,111.2,110.0.¹H NMR(DMSO-d₆):9.18(s,H-3’),8.85(d,J＝2.0Hz,H-5’),8.72(brs,H-6’).HRMS m/z:1726.7281[M+H]⁺.

环脂肽d5：淡黄色粉末，总得率：23.2％。¹³C NMR(DMSO-d₆):163.0(C＝O),159.9(C-2’),155.8(C-4’,6’),151.1,136.0,134.2,131.1,127.9(C-5’),127.3,123.6,120.7,118.4,118.1,116.9,116.1,114.3,111.2,110.0.¹H NMR(DMSO-d₆):9.30(s,H-2’),9.16(s,H-4’,6’).HRMS m/z:1726.7258[M+H]⁺.

实施例2环脂肽类化合物对细胞毒性的检测

各环脂肽类化合物以DMSO配制成30mg/mL的储备液，-20℃储存备用。每次使用前，用DMEM培养基稀释至适当浓度。

收集对数生长期小鼠巨噬细胞RAW264.7，接种至96孔板，使每孔有细胞悬液100μL、细胞数5000个，37℃、5％CO₂细胞培养箱培养24h后，再加入100μL稀释至不同浓度的含环脂肽类化合物的培养基，使最终测试浓度分别为3、5、10、20和30μg/mL；继续培养24h后，以CCK-8评价各待测化合物在不同浓度下对RAW264.7的细胞毒性，结果见图1。

从图中可以看出，当测试浓度小于等于30μg/mL时，这些环脂肽类化合物对RAW264.7细胞生长无影响。

实施例3体外抗炎活性

1、测试浓度的筛选

为了选择合适的环脂肽类化合物的处理浓度，初步设定3、5和10μg/mL三个测试浓度，以q-PCR检测各炎症因子的相对表达量。

向6孔板每孔加入3mL处于对数生长期的巨噬细胞RAW264.7的细胞悬液，细胞数为3×10⁵个/孔，培养18-24h后弃掉上清，重新加入3mL含脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的DMEM培养基，其中LPS的终浓度为1μg/mL。继续培养4h后加入各待测化合物，使得各化合物的终浓度分别为3、5和10μg/mL。再培养24h后分别收集细胞，-80℃保存备用或直接提取RNA后进行逆转录(依照说明书进行操作)，得到稳定的cDNA模板。设计不同炎症因子相应的引物，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行q-PCR检测，以actin的表达量为参照，计算各炎症因子的相对表达量，检测结果见图2。

从图中可以看出，各待测环脂肽类化合物对IL-6的转录水平影响最为明显。与LPS组相比，当测试浓度为5μg/mL和10μg/mL时，各待测环脂肽类化合物均可以显著抑制IL-6的转录水平(p<0.01、p<0.001或p<0.0001)。对TNF-α和IL-1β而言，部分化合物在10μg/mL时具有较好的转录抑制作用。因此选择10μg/mL为后续测试浓度。

2、抗炎活性

同样以1μg/mL的LPS诱导巨噬细胞株RAW264.7 4h，再以10μg/mL的不同化合物处理细胞24h，分别收集上清和细胞。上清液-80℃保存备用或者直接离心(3000rpm×15min，4℃)后取上清并分装，ELISA检测各样品中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β和细胞因子MCP-1的含量；细胞-80℃保存备用或者直接提取RNA后逆转录，q-PCR检测IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的转录水平，结果见图3和图4。

从图3和图4可以看出，所有待测环脂肽类化合物均可以显著抑制IL-6的分泌量和转录水平(p<0.0001或p<0.01)；环脂肽化合物d2可以显著抑制TNF-α的转录水平(p<0.05)；d5可以显著抑制IL-1β的分泌量(p<0.05)，d1、d3和d5则可以显著抑制IL-1β的转录水平(p<0.05)；除d3外，其他待测化合物可以显著抑制MCP-1的分泌量(p<0.05或p<0.01)。

实施例4体内抗RA活性评价

以DBA/1小鼠为实验小鼠，建立牛II型胶原诱导关节炎(Collagen-inducedarthritis，CIA)模型，尾静脉注射给药一段时间后评价这些化合物的体内抗关节炎活性，以甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)为阳性对照。

1、CIA小鼠模型的建立

(1)造模剂的准备

牛II型胶原溶液与完全弗氏佐剂等体积混合、并在4℃低温下完全乳化，即为造模剂1；牛II型胶原溶液与不完全弗氏佐剂等体积混合、并在4℃低温下完全乳化，即为造模剂2。

(2)建模

待实验小鼠适应环境后，在小鼠尾根部1cm左右处多点(2-4个点)皮下注射100μL造模剂1，空白对照组注射100μL完全弗氏佐剂。第21天再注射100μL造模剂2进行第二次造模，以加强小鼠的炎症反应，空白对照组注射100μL不完全弗氏佐剂。

(3)观察

从第二次建模后每4d观察一次小鼠的精神状态、饮食情况和活动情况，并对所有小鼠称重和关节炎指数(Arthritis index，AI)评分。评分标准：无症状记为0分，一趾明显肿胀记为1分，肢体轻度肿胀或两趾以上肿胀并伴有红斑记为2分，肢体明显肿胀及红斑记为3分，肢体重度肿胀及红斑、关节功能明显障碍、关节强直记为4分。四肢均需评分，AI值为四肢评分之和，当AI值≥4分可判定为建模成功。

2、CIA小鼠分组及给药

将建模成功的小鼠随机平均分为8组，每组5-6只，自由饮水饮食，饲养环境：22±1℃。所有操作严格按照国家健康卫生准则执行。①对照组(Normal组)：只注射佐剂，药物处理时只注射生理盐水；②模型组(CIA组)：已建成CIA模型，药物处理时只注射生理盐水；③阳性药物组(MTX组)：给药剂量为0.5mg/kg，每3d腹腔注射一次；④-⑧药物处理组：环脂肽d1、d2、d3、d4和d5给药剂量均为10mg/kg，每2d尾静脉注射给药一次，连续给药20次。

3、结果与分析

从第二次建模起，每4d检测一次小鼠的体重，同时对炎症状况进行评分，给药结束后的结果见图5。从图5中的a图中可以看出，所有药物处理组的炎症评分均明显下降，说明上述环脂肽处理CIA小鼠后可以有效缓解小鼠关节炎症状。其中，d1、d2和d4与阳性药物MTX的治疗效果一致，均与模型组之间存在极显著差异(p<0.01)；d3和d5与模型组之间存在显著差异(p<0.05)。从图5中的b图中可以看出，与正常组小鼠相比，模型组小鼠体重下降极其显著(p<0.005)；阳性药物MTX组和d2给药组体重与正常组体重无差异；d1和d5给药组小鼠体重与正常组体重存在明显差异(p<0.05)；同时d1和d2组与阳性药物组体重接近，三者与模型组相比体重下降较少、且存在显著性差异(p<0.05)。而且给药结束后，正常组小鼠精神状态良好、毛发光亮、食欲较强；模型组小鼠精神萎靡、毛发疏松且光泽差、进食减少，足部关节处肿胀明显、有溃疡及出血点，行动迟缓；MTX组和所有药物处理组小鼠精神状态、毛发光泽度和食欲较好，关节处略有红肿。

综上，上述新环脂肽可以有效减轻CIA小鼠的发病程度，为RA的治疗提供了更广阔的选择性和开拓性。

实施例5稳定性评价

为评价本发明环脂肽类化合物的稳定性，分别设置37℃、25℃、4℃和-20℃四个储存温度，利用高效液相色谱(HPLC)法检测各自水溶液(浓度为100～109μg/mL)的稳定性。

1、检测条件

Agilent 6400高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent SB-C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(体积比为45:55)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为223nm，进样体积为20μL。

2、结果与分析

检测发现，温度越低，其稳定性越好。其中，4℃和-20℃的检测结果如图6所示，图6中的a图为4℃储存条件下的检测结果，图6中的b图为-20℃储存条件下的检测结果。图中，dap为达托霉素，d1、d2、d3、d4和d5为本发明实施例1制备的环脂肽类化合物。从图中可以看出，在4℃储存时，只有d4的稳定性较好，且与dap及其他化合物的稳定性存在显著性差异(p<0.05)；在-20℃储存时，d1、d2、d3、d4和d5的稳定性均比dap的稳定性好、且存在极显著性差异(p<0.0001)。说明新合成的环脂肽类化合物d1、d2、d3、d4和d5比达托霉素原药具有稳定性优势，同时也具有开发成抗RA药物的潜力和优势。

Claims (5)

1.环脂肽类化合物，其特征在于，结构式为式Ⅰ所示：

其中，R为六元氮杂环。

2.根据权利要求1所述的环脂肽类化合物，其特征在于：R为

3.权利要求1或2所述的环脂肽类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的环脂肽类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型为注射给药剂型、透皮给药剂型或口服给药剂型。

5.一种抗类风湿关节炎药物，其特征在于：其活性成分包括权利要求1或2所述的环脂肽类化合物。

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