CN101696235A - 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法 - Google Patents

达托霉素类似物及其全固相合成制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101696235A
CN101696235A CN200910218669A CN200910218669A CN101696235A CN 101696235 A CN101696235 A CN 101696235A CN 200910218669 A CN200910218669 A CN 200910218669A CN 200910218669 A CN200910218669 A CN 200910218669A CN 101696235 A CN101696235 A CN 101696235A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
blocking group
alpha
reaction
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200910218669A
Other languages
English (en)
Inventor
钦传光
任锦
牛卫宁
丁焰
王秋雨
徐春兰
尚晓娅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern Polytechnical University
Original Assignee
Northwestern Polytechnical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern Polytechnical University filed Critical Northwestern Polytechnical University
Priority to CN200910218669A priority Critical patent/CN101696235A/zh
Publication of CN101696235A publication Critical patent/CN101696235A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种达托霉素类似物及其全固相合成制备方法，技术特征在于：将第一个侧链带有羧基的Fmoc氨基酸(其α-羧基被选定的基团保护)连接到固相树脂载体上，再继续依次连接七个Fmoc氨基酸，期间依次脱Fmoc；连接第九个侧链带有羟基(巯基或氨基)并被选择性基团保护的Fmoc氨基酸并脱Fmoc，再继续依次连接后面的三个Fmoc氨基酸并脱Fmoc；连接脂肪酸后，再选择性地脱去第九个氨基酸侧链羟基(巯基或氨基)上的保护基团，然后将其与最后一个Fmoc氨基酸的羧基进行反应，脱Fmoc；再脱去第一个氨基酸α-羧基的保护基团后，直接在固相树脂上进行环合；最后将产物从树脂上剪切下来，经冷乙醚沉淀，收获产品。

Description

达托霉素类似物及其全固相合成制备方法
技术领域
本发明涉及一种达托霉素类似物及其全固相合成制备方法，属于抗生素达托霉素(Daptomycin)及其类似物的分子设计策略和一种全固相合成方法。
背景技术
随着高致病耐药菌，如MRSA、VRE、PRSP的不断涌现，临床上对新的抗生素需求越来越迫切，而达托霉素的成功应对上述耐药菌且具有良好疗效、制剂简单、毒全副作用小使其成为新抗生素药研究的热点。其化学结构与作用机理与已有的抗生素均不同，是近40年来应用于临床的唯一新结构类别的抗生素。
达托霉素从其作用方面可以作为一类小分子抗菌肽，具有广谱性、高效性、稳定性等特点，其本身不易产生耐药性。从结构方面可以称为环脂肽，由肽环与脂肪烃组成，具有表面活性剂的基本结构与性质，其除了具有化学表面活性剂的特点外，且比合成表面活性剂更具潜在的优势，如具有生物兼容性高、安全无毒性、可被生物降解、不会对环境造成不利影响等优点。随着环保意识的增强和食品安全级别的提高，此类生物表面活性剂在食品、医药、化妆品、洗涤剂和石油化工等领域，展示了其独特的应用前景；人类环保意识的增强，更加快了生物面活性剂取代合成表面活性剂的发展进程。
达托霉素是由Lily公司最初研究，Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。因应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。上个世纪八十年代从玫胞链霉菌发酵产物中分离得到了达托霉素。中国科学院上海有机化学研究所的徐红岩博士等巧妙地设计了达托霉素的固液相合成策略，该方法被证明可快速合成目标分子。但是由于专利保护等原因，玫胞链霉菌不易得到，且固液相合成方法中采用的液相环合后再剪切的方法使得产物产率和纯度低，且作为单体的犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然来源稀少，其化学合成又非常困难。因此，希望通过对达托霉素的主骨架设计出一系列结构相对简单的衍生物，以期能找到与达托霉素相似或更强生物活性的化合物，供临床前的筛选。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种达托霉素类似物及其全固相合成制备方法，是针对新型抗生素达托霉素及其类似物的分子设计策略并提供其的一种全固相合成方法。主要解决现有方法中步骤繁琐、耗能费时、成本高等问题。
技术方案
一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
Figure G2009102186697D00021
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10AA11，AA12，AA13为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的R＝H，CnH2n+1-或CnH2n-1-，其中n＝0-17。
一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的R＝H，CnH2n+1-或CnH2n-1-，其中n＝0-17。
一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
Figure G2009102186697D00031
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
所述的AA9为侧链带有巯基的氨基酸Cys，侧链巯基采用S-Trt、S-Mmt或S-tButhio基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
所述的AA9为侧链带有氨基的氨基酸Arg、His、Lys、Orn，侧链氨基采用N-Mtt、N-Mmt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
一种制备下述达托霉素类似物的方法，
Figure G2009102186697D00032
其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaiser test检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法依次连接AA9，AA11，AA12，AA13R；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMF in脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀后过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的固相合成法连接R时，肽树脂∶R∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8∶8，反应3～4小时；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％ TFA in DCM containing 1-5％ TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例：肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后依次用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例为肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
一种制备下述达托霉素类似物的方法，
Figure G2009102186697D00051
其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去α-氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaiser test检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法依次连接AA9，R；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMF in脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的固相合成法连接R时，肽树脂∶R∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8∶8，反应3～4小时；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％TFA in DCM containing 1-5％TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在肽树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从肽树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例：肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
一种制备下述达托霉素类似物的方法，
其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去α-氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaisertest检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法连接AA9；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMF in脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％ TFA in DCM containing 1-5％ TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在肽树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从肽树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例为肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例为肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：脱掉AA9的α-氨基保护基团后，向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
本发明中常用的缩写具有以下意义：
Trp：色氨酸；DSer：D-丝氨酸；Gly：甘氨酸；Asp：天冬氨酸；DAla：D-丙氨酸；
Orn：鸟氨酸；Glu：谷氨酸；Thr：苏氨酸；Tyr：酪氨酸；Cys：半胱氨酸；
Arg：精氨酸；Gln：谷氨酰胺；His：组氨酸；Asn：天冬酰胺；Ser：丝氨酸；
Lys：赖氨酸；Ala：丙氨酸；3MeGlu：3-甲基谷氨酸；Kyn：犬尿氨酸；
AAn(n＝1-13)：氨基酸；cyclo-：环-；
HOBT::1-羟基苯并三氮唑；DIC：二异丙基碳二亚胺；DMF：二甲基甲酰胺；
DCC：N，N-二环己基碳二亚胺；DMAP：二甲氨基吡啶；
THF：四氢呋喃；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；NMP：N-甲基吡咯烷酮；TFA：三氟乙酸；
TIS：苯甲硫醚；DCM：二氯甲烷；MeOH：甲醇；氯仿：CHCl3；
N2H4：肼(Hydrazine)；TBP：磷酸三丁酯；propanol：丙醇；
TFE：三氟代乙醇；AcOH：乙酸；AA：氨基酸；ESI：电喷雾质谱仪；
RP-HPLC：反相高效液相色谱法；SPPS：多肽固相合成；eq.：当量；aq.：溶剂；
DBU：1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7；Pd(0)：钯(0)。
有益效果
本发明提出的达托霉素类似物及其全固相合成制备方法，通过对达托霉素的主骨架设计出一系列结构相对简单的衍生物，以期能找到与达托霉素相似或更强生物活性的化合物，供临床前的筛选。
附图说明
图1：达托霉素合成路线图，其中：a/b：SPPS；c：脱Trt保护基团；d：酯化反应；e：脱Fmoc保护基团；f：脱Dmab保护基团；g：环合；h：剪切；
图2：达托霉素类似物合成路线；
图3：达托霉素及其类似物的结构图；
图4：达托霉素类似物(1)实例
cyclo-[Trp-Gln-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-Orn-Gly-Ser]-Asp-Asn-Trp-CO-C9H19的结构图；
图5：达托霉素类似物(2)实例
cyclo-[Trp-Gln-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-Orn-Gly-Ser]-CO-C9H19的结构图；
图6：达托霉素类似物(3)实例
cyclo-[Trp-Gln-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-Orn-Gly-Ser]的结构图；
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
合成达托霉素类似物(1)实例：AA1选择Fmoc-Glu-ODmab，AA9选择Fmoc-L-Ser(Trt)-OH，R选择C10H20O2(正葵酸)。序列为：
其结构图见说明书附图4
具体合成步骤：
1.配制溶液
1)脱除Fmoc保护基团(Deprotection)溶液
20％哌啶的DMF溶液，V/V
2)Kaiser Test溶液
A.5％茚三酮乙醇溶液，W/V
B.80％苯酚乙醇溶液，W/V
C.2％1mmol/L氰化钾吡啶溶液，V/V
2.树脂活化
准确称取100mg Rink Amide-AM Resin(0.28mmol/g，100～200mesh)加入2mL的Bio Spin空柱中，加入1mL三氯甲烷(CHCl3)充分混匀，置旋转混合仪上旋转浸泡30min以上，使树脂充分活化，然后将液体抽干，分别用氯仿和DMF洗涤树脂，抽干备用。
3.脱除α-氨基Fmoc保护基团
将1mL Deprotetion溶液加入到已经活化的树脂中，旋转混合仪上反应15min后，抽干，用DMF洗涤3～5次，再加入1mL Deprotetion溶液重复反应15min，抽干后，用DMF洗涤3～5次。挑取少许树脂进行Kaiser Test检验。
4.Kaiser Test检验
每次取5颗左右的树脂于试管中，加入Kaiser Test溶液各60μL，将试管置于120℃的干式加热器上1～2min后，试管口有冷凝回流，取出试管，观察树脂的颜色，进而判断反应得进行程度。
5.连接第一个氨基酸残基Fmoc-Glu-ODmab到树脂上(HOBT/DIC法).
称取76.2mg(0.112mmol)Fmoc-Glu-ODmab，15.1mg(0.112mmol)HOBT加入1.5mL离心管中，加入1mL DMF溶解反应10min后，加入活化好的树脂中，再加入12μL DIC(0.112mmol)，反应2h后，抽干液体，然后用DMF洗涤数次，做Kaisertest检测，反应阴性直接脱保护Fmoc保护基团，阳性重复连接该次氨基酸。反应呈阴性直接加入1ml脱保护溶液于树脂中，旋转反应15min，2次，再做Kaiser test检测，反应阳性直接连接下一个氨基酸，反应阴性重复脱Fmoc保护基团。
6.肽链的延长
脱去树脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保护以后，依次用Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、C10H20O2(正葵酸)代替Fmoc-Glu-ODmab重复上述的偶联及脱Fmoc保护的反应，共进行13次反应，至13个氨基酸残基全部偶联完为止。正葵酸连接完后，无需进行脱Fmoc保护基团步骤。
7.Trt保护基团的脱除
将带有线性九肽的树脂用DCM浸泡5min后，抽干液体，加入1mL1％TFA inDCM containing 5％ TIS的溶液反应2min，抽干，用DCM洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
8.酯化反应
先将已连接有十三肽的树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，称取47.8mg(0.112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH，23.1mg(0.112mmol)，DCC，7.6mg(0.112mmol)HOBT，1.4mg(0.112mmol)DMAP，先将DCC，氨基酸，HOBT溶于1ml 45％的DMF in THF(脱水)溶液中预反应30分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到树脂中室温旋转反应3小时，结束后再重复反应一次。
9.Dmab保护基团的脱除
Fmoc-Trp(Boc)-OH的N端Fmoc脱保护后，将带有线性十肽的树脂用DMF浸泡5min后，抽干液体，加入1mL 2％的肼(N2H4)的DMF溶液反应3min，抽干，用DMF洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
10.环合
称取116.6mg PyBOP(0.224mmol)、30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mL NMP溶解反应10min，期间，将带有线性十四肽的树脂用NMP浸泡5min，抽干液体，将溶解反应好的环合液加入树脂中，再加入37μL DIEA(0.224mmol)，反应48h，使之充分环合，抽干液体，然后依次用NMP，DMF洗涤数次。再称取30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mLDMF溶解反应10min，，将此液体加入到树脂中，再加入29μLDIC(0.224mmol)，继续反应48h，环合完后，抽干液体，然后依次用NMP、DMF、DCM、MeOH、DCM洗涤数次，真空干燥。
11.剪切
将1mL剪切溶液(TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2)加入到载有环肽的干燥树脂中，反应2～3h，滤出液体，并用剪切溶液洗涤树脂3次，合并滤液，用氮气吹干TFA，加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上静置15min后，离心(12000rpm，4℃，15min)，重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物(1)实例样品。
合成达托霉素类似物(2)实例：AA1选择Fmoc-Glu-ODmab，AA9选择Fmoc-L-Ser(Trt)-OH，R选择C10H20O2(正葵酸)。序列为：
其结构图见说明书附图5。
Figure G2009102186697D00121
具体合成步骤：
1.配制溶液
1)脱除Fmoc保护基团(Deprotection)溶液
20％哌啶的DMF溶液，V/V
2)Kaiser Test溶液
A.5％茚三酮乙醇溶液，W/V
B.80％苯酚乙醇溶液，W/V
C.2％1mmol/L氰化钾吡啶溶液，V/V
2.树脂活化
准确称取100mg Rink Amide-AM Resin(0.28mmol/g，100～200mesh)加入2mL的Bio Spin空柱中，加入1mL三氯甲烷(CHCl3)充分混匀，置旋转混合仪上旋转浸泡30min以上，使树脂充分活化，然后将液体抽干，分别用氯仿和DMF洗涤树脂，抽干备用。
3.脱除α-氨基Fmoc保护基团
将1mL Deprotetion溶液加入到已经活化的树脂中，旋转混合仪上反应15min后，抽干，用DMF洗涤3～5次，再加入1mL Deprotetion溶液重复反应15min，抽干后，用DMF洗涤3～5次。挑取少许树脂进行Kaiser Test检验。
4.Kaiser Test检验
每次取5颗左右的树脂于试管中，加入Kaiser Test溶液各60μL，将试管置于120℃的干式加热器上1～2min后，试管口有冷凝回流，取出试管，观察树脂的颜色，进而判断反应得进行程度。
5.连接第一个氨基酸残基Fmoc-Glu-ODmab到树脂上(HOBT/DIC法).
称取76.2mg(0.112mmol)Fmoc-Glu-ODmab，15.1mg(0.112mmol)HOBT加入1.5mL离心管中，加入1mL DMF溶解反应10min后，加入活化好的树脂中，再加入12μL DIC(0.112mmol)，反应2h后，抽干液体，然后用DMF洗涤数次，做Kaisertest检测，反应阴性直接脱保护Fmoc保护基团，阳性重复连接该次氨基酸。反应呈阴性直接加入1ml脱保护溶液于树脂中，旋转反应15min，2次，再做Kaiser test检测，反应阳性直接连接下一个氨基酸，反应阴性重复脱Fmoc保护基团。
6.肽链的延长
脱去树脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保护以后，依次用Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(Trt)-OH、C10H20O2(正葵酸)代替Fmoc-Glu-ODmab重复上述的偶联及脱Fmoc保护的反应，共进行10次反应，至10个氨基酸残基全部偶联完为止。正葵酸连接完后，无需进行脱Fmoc保护基团步骤。
7.Trt保护基团的脱除
将带有线性十肽的树脂用DCM浸泡5min后，抽干液体，加入1mL1％ TFA inDCM containing 5％ TIS的溶液反应2min，抽干，用DCM洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
8.酯化反应
先将已连接有十肽的树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，称取47.8mg(0.112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH，23.1mg(0.112mmol)，DCC，7.6mg(0.112mmol)HOBT，1.4mg(0.112mmol)DMAP，先将DCC，氨基酸，HOBT溶于1ml 45％的DMF in THF(脱水)溶液中预反应30分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到树脂中室温旋转反应3小时，结束后再重复反应一次。
9.Dmab保护基团的脱除
Fmoc-Trp(Boc)-OH的N端Fmoc脱保护后，将带有线性十一肽的树脂用DMF浸泡5min后，抽干液体，加入1mL 2％的肼(N2H4)的DMF溶液反应3min，抽干，用DMF洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
10.环合
称取116.6mg PyBOP(0.224mmol)、30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mLNMP溶解反应10min，期间，将带有线性十一肽的树脂用NMP浸泡5min，抽干液体，将溶解反应好的环合液加入树脂中，再加入37μL DIEA(0.224mmol)，反应48h，使之充分环合，抽干液体，然后依次用NMP，DMF洗涤数次。再称取30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mLDMF溶解反应10min，，将此液体加入到树脂中，再加入29μLDIC(0.224mmol)，继续反应48h，环合完后，抽干液体，然后依次用NMP、DMF、DCM、MeOH、DCM洗涤数次，真空干燥。
11.剪切
将1mL剪切溶液(TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2)加入到载有环肽的干燥树脂中，反应2～3h，滤出液体，并用剪切溶液洗涤树脂3次，合并滤液，用氮气吹干TFA，加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上静置15min后，离心(12000rpm，4℃，15min)，重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物(2)实例样品。
合成达托霉素类似物(3)实例：AA1选择Fmoc-Glu-ODmab，AA9选择Fmoc-L-Ser(Trt)-OH。序列为：
其结构图见说明书附图6。
Figure G2009102186697D00151
具体合成步骤：
1.配制溶液
1)脱除Fmoc保护基团(Deprotection)溶液
20％哌啶的DMF溶液，V/V
2)Kaiser Test溶液
A.5％茚三酮乙醇溶液，W/V
B.80％苯酚乙醇溶液，W/V
C.2％1mmol/L氰化钾吡啶溶液，V/V
2.树脂活化
准确称取100mg Rink Amide-AM Resin(0.28mmol/g，100～200mesh)加入2mL的Bio Spin空柱中，加入1mL三氯甲烷(CHCl3)充分混匀，置旋转混合仪上旋转浸泡30min以上，使树脂充分活化，然后将液体抽干，分别用氯仿和DMF洗涤树脂，抽干备用。
3.脱除Fmoc保护基团
将1mL Deprotetion溶液加入到已经活化的树脂中，旋转混合仪上反应15min后，抽干，用DMF洗涤3～5次，再加入1mL Deprotetion溶液重复反应15min，抽干后，用DMF洗涤3～5次。挑取少许树脂进行Kaiser Test检验。
4.Kaiser Test检验
每次取5颗左右的树脂于试管中，加入Kaiser Test溶液各60μL，将试管置于120℃的干式加热器上1～2min后，试管口有冷凝回流，取出试管，观察树脂的颜色，进而判断反应得进行程度。
5.连接第一个氨基酸残基Fmoc-Glu-ODmab到树脂上(HOBT/DIC法).
称取76.2rng(0.112mmol)Fmoc-Glu-ODmab，15.1mg(0.112mmol)HOBT加入1.5mL离心管中，加入1mL DMF溶解反应10min后，加入活化好的树脂中，再加入12μL DIC(0.112mmol)，反应2h后，抽干液体，然后用DMF洗涤数次，做Kaisertest检测，反应阴性直接脱保护Fmoc保护基团，阳性重复连接该次氨基酸。反应呈阴性直接加入1ml脱保护溶液于树脂中，旋转反应15min，2次，再做Kaiser test检测，反应阳性直接连接下一个氨基酸，反应阴性重复脱Fmoc保护基团。
6.肽链的延长
脱去树脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保护以后，依次用Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(Trt)-OH代替Fmoc-Glu-ODmab重复上述的偶联及脱Fmoc保护的反应，共进行9次反应，至9个氨基酸残基全部偶联完为止。Fmoc-L-Ser(Trt)-OH连接完后，不需进行脱Fmoc保护基团步骤。
7.Trt保护基团的脱除
将带有线性九肽的树脂用DCM浸泡5min后，抽干液体，加入1mL1％ TFA inDCM containing 5％ TIS的溶液反应2min，抽干，用DCM洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
8.酯化反应
先将已连接有九肽的树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，称取47.8mg(0.112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH，23.1mg(0.112mmol)，DCC，7.6mg(0.112mmol)HOBT，1.4mg(0.112mmol)DMAP，先将DCC，氨基酸，HOBT溶于1ml 45％的DMF in THF(脱水)溶液中预反应30分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到树脂中室温旋转反应3小时，结束后再重复反应一次。
9.Dmab保护基团的脱除
Fmoc-Trp(Boc)-OH的N端Fmoc脱保护后，将带有线性十肽的树脂用DMF浸泡5min后，抽干液体，加入1mL 2％的肼(N2H4)的DMF溶液反应3min，抽干，用DMF洗涤3～5次。重复3次。然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM充分洗涤树脂，真空干燥。
10.环合
称取116.6mg PyBOP(0.224mmol)、30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mL NMP溶解反应10min，期间，将带有线性十肽的树脂用NMP浸泡5min，抽干液体，将溶解反应好的环合液加入树脂中，再加入37μL DIEA(0.224mmol)，反应48h，使之充分环合，抽干液体，然后依次用NMP，DMF洗涤数次。再称取30.2mg HOBT(0.224mmol)加入1mLDMF溶解反应10min，，将此液体加入到树脂中，再加入29μL DIC(0.224mmol)，继续反应48h，环合完后，抽干液体，然后依次用NMP、DMF、DCM、MeOH、DCM洗涤数次，真空干燥。
11.剪切
脱掉AA9的α-氨基Fmoc保护基团后，将1mL剪切溶液(TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2)加入到载有环十肽的干燥树脂中，反应2～3h，滤出液体，并用剪切溶液洗涤树脂3次，合并滤液，用氮气吹干TFA，加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上静置15min后，离心(12000rpm，4℃，15min)，重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物(3)实例样品。

Claims (8)

1.一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
Figure F2009102186697C00011
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，AA11，AA12，AA13为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的R＝H，CnH2n+1-或CnH2n-1-，其中n＝0-17。
2.一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
Figure F2009102186697C00012
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的R＝H，CnH2n+1-或CnH2n-1-，其中n＝0-17。
3.一种达托霉素类似物，其特征在于序列如下：
Figure F2009102186697C00013
其中：所述的AA1为侧链带羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，侧链羧基未被保护，α-羧基采用O-Dmab基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护；所述的AA9为侧链带有羟基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，侧链羟基采用O-Trt，O-2-ClTrt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，为任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
4.根据权利要求1～3所述的任一种达托霉素类似物，其特征在于：所述的AA9为侧链带有巯基的氨基酸Cys，侧链巯基采用S-Trt、S-Mmt或S-tButhio基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
5.根据权利要求1～3所述的任一种达托霉素类似物，其特征在于：所述的AA9为侧链带有氨基的氨基酸Arg、His、Lys、Orn，侧链氨基采用N-Mtt、N-Mmt基团保护，α-氨基采用Fmoc基团保护，α-羧基未被保护。
6.一种制备权利要求1或4或5所述的任一种达托霉素类似物的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaiser test检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法依次连接AA9，AA11，AA12，AA13，R；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMF in脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀后过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的固相合成法连接R时，肽树脂∶R∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8∶8，反应3～4小时；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％TFA in DCM containing 1-5％TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例：肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后依次用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例为肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
7.一种制备权利要求2或4或5所述的任一种达托霉素类似物的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去α-氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaisertest检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法依次连接AA9，R；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMF in脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的固相合成法连接R时，肽树脂∶R∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8∶8，反应3～4小时；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％TFA in DCM containing 1-5％TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在肽树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从肽树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例：肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
8.一种制备权利要求3或4或5所述的任一种达托霉素类似物的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：以Rink amide树脂为载体，按照固相合成法连接第一个侧链羧基未被保护的氨基酸AA1，脱掉α-氨基的保护基团，继续按照固相合成法依次连接具有保护基团的氨基酸，连接期间依次脱去α-氨基保护基团，得到保护的肽树脂；所述的固相合成法是：将氨基酸和HOBT溶于DMF中预反应10～15分钟，加入到Rink amide树脂中混合，再加入DIC反应2～3小时；所述的Rink amide树脂∶氨基酸∶HOBT∶DIC＝1∶4∶4∶4；
所述的具有保护基团的氨基酸α-氨基使用Fmoc基团保护；
所述的脱去α-氨基保护基团的步骤为：先做第一次Kaiser test检测，若第一次Kaiser test检测反应为阴性直接脱α-氨基的保护基团，加入哌啶∶DMF＝2∶8(v/v)混合溶液室温下旋转反应10～15分钟，再重复1次；脱α-氨基的保护基团结束后继续做第二次Kaiser test检测，若第二次Kaiser test检测反应为阳性直接连接下一个氨基酸，若第二次Kaiser test检测反应为阴性重复进行脱α-氨基的保护基团；
若第一次Kaiser test检测反应为阳性重复连接该次氨基酸，再进行第一次Kaisertest检测；
步骤2：按照固相合成法连接AA9；连接完后脱掉AA9侧链的保护基团，得到肽树脂；将肽树脂用三氯甲烷溶胀半个小时以上，将DCC，氨基酸，HOBT溶于45％的DMFin脱水THF中预反应30～40分钟，出现沉淀，过滤，再将滤液与DMAP混合加入到肽树脂中反应5～6小时；所述的肽树脂∶氨基酸∶HOBT∶DCC∶DMAP＝1∶4∶2∶4∶0.4；
所述的脱掉AA9侧链的保护基团：若侧链的保护基团为O-Trt，S-Trt，O-2-ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在1％TFA in DCM containing 1-5％TIS条件下脱除；若侧链的保护基团为S-tButhio，在3eq.TBP in propanol aq.or TFE aq.条件下脱除；若侧链的保护基团为N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM＝1∶2∶7条件下脱除；
步骤3：脱掉AA10的α-氨基保护基团，然后脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab，然后第一次环合；环合时采用在肽树脂上直接先环合再用剪切液将环肽从肽树脂上剪切下来的方法；将PyBOP和HOBT采用NMP溶剂溶解，在室温下预反应10～15分钟，然后加入到肽树脂中，再加入DIEA，室温下旋转反应48小时，所述的第一次环合的环合液比例为肽树脂∶PyBOP∶HOBT∶DIEA＝1∶8∶8∶8；
然后用NMP、DMF洗涤，加入第二次环合液继续室温下环合反应48小时；所述的第二次环合的环合液比例为肽树脂∶HOBT∶DIC＝1∶8∶8；
所述的脱掉AA1的α-羧基的保护基团O-Dmab在2％Hydrazine in DMF条件下脱除；
步骤4：脱掉AA9的α-氨基保护基团后，向肽树脂中加入剪切液反应2～3h，收集滤液，用氮气吹使得TFA挥发，加入冷乙醚，在冰中静置15min以上，高速离心，条件为12000rpm，4℃，15min，高速离心重复两次，收集沉淀，置真空干燥塔内完全干燥，即得达托霉素类似物；所述的剪切液为TFA∶TIS∶苯酚∶水＝95∶1∶2∶2。
CN200910218669A 2009-10-29 2009-10-29 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法 Pending CN101696235A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910218669A CN101696235A (zh) 2009-10-29 2009-10-29 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910218669A CN101696235A (zh) 2009-10-29 2009-10-29 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101696235A true CN101696235A (zh) 2010-04-21

Family

ID=42141372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910218669A Pending CN101696235A (zh) 2009-10-29 2009-10-29 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101696235A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102276696A (zh) * 2010-06-09 2011-12-14 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 达托霉素的纯化方法
CN107266531A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 北京大学深圳研究生院 Teixobactin及其制备方法
US10377699B2 (en) * 2013-11-06 2019-08-13 The University Of Hong Kong Daptomycin analogues and a method for the preparation of daptomycin or a daptomycin analogue
CN113061164A (zh) * 2021-03-29 2021-07-02 四川大学 环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102276696A (zh) * 2010-06-09 2011-12-14 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 达托霉素的纯化方法
CN102276696B (zh) * 2010-06-09 2014-11-05 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 达托霉素的纯化方法
US10377699B2 (en) * 2013-11-06 2019-08-13 The University Of Hong Kong Daptomycin analogues and a method for the preparation of daptomycin or a daptomycin analogue
CN107266531A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 北京大学深圳研究生院 Teixobactin及其制备方法
CN107266531B (zh) * 2017-07-28 2020-04-07 北京大学深圳研究生院 Teixobactin及其制备方法
CN113061164A (zh) * 2021-03-29 2021-07-02 四川大学 环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用
CN113061164B (zh) * 2021-03-29 2023-01-10 四川大学 环脂肽类化合物及其在抗类风湿关节炎药物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2421887T3 (en) A process for the preparation of degarelix
JPH05163298A (ja) 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
CN101357936B (zh) 固相多肽合成曲普瑞林的制备方法
CN103351428B (zh) 一种固相片段法合成地加瑞克
CN102702327B (zh) 一种阿拉瑞林的固液相合成法
CN107573408B (zh) 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法
CN101759777B (zh) 一种戈舍瑞林的合成方法
CN106167514A (zh) 一种利那洛肽的合成和纯化方法
CN105254701A (zh) 一种德舍瑞林的合成方法
CN104004064B (zh) 一种布舍瑞林的制备方法
CN101696235A (zh) 达托霉素类似物及其全固相合成制备方法
CA2068327C (en) Polypeptide and anti-hiv drug prepared therefrom
CN101085809B (zh) 巴替非班及其类似物的合成与制备工艺
CN101195654B (zh) 一种美拉诺坦-ⅱ的固相合成方法
CN107778351B (zh) 一种全固相合成奥曲肽的方法
CN106084015B (zh) 一种合成卡贝缩宫素的方法
CN112062829A (zh) 依降钙素的制备方法
CN103172704A (zh) 一种抗肿瘤小肽FpAT的制备方法
CN105820215A (zh) 一种高效合成Stylissatin A天然环七肽的制备方法
CN106397580A (zh) 一种比伐卢定的合成方法
CN112279891A (zh) 一种改进的曲普瑞林的固相合成方法
CN107778353B (zh) 一种合成特利加压素的方法
EP0541662B1 (en) Synthetic peptides that antagonize neurokinin a, their salts and their manufacturing processes
CN110885360A (zh) 一种固相合成帕瑞肽的制备方法
CN109912709A (zh) 一种酸敏感离子通道抑制剂的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20100421